Tutkimus kalsitriolin ikääntymistä estävistä vaikutuksista ihmisen luonnollisiin tappajasoluihin in vitro

ABSTRAKTI

D-vitamiinin katsotaan yleisesti säätelevän immuunijärjestelmää. Jotkut kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että kysyntäD-vitamiini lisääntyy iän myötä. Kalsitrioli on sen biologisesti aktiivinen muotoD-vitamiini. Sen vaikutus ihmisen luonnollisiin tappajasoluihin (NK) on kuitenkin edelleen epäselvä. Siksi tässä tutkimuksessa tutkimme kalsitriolin ikääntymistä estäviä ja immunomoduloivia vaikutuksia NK-soluihin käyttämällä useita immunologisia menetelmiä tutkiaksemme sen tärkeää roolia synnynnäisessä immuniteetissa. Havaitsimme, että kalsitrioli käänsi ikääntymiseen liittyvien biomarkkerien ilmentymisen NK-soluissa ja esti niiden laajentumisen pitämällä nämä solut G1-vaiheessa ilman apoptoosia ja uupumusta. Kalsitrioli tukahdutti tulehdukseen liittyvien sytokiinien, kuten interleukiini-5 (IL-5), interleukiini-13 (IL-13), gamma-interferoni (IFN- ), vapautumisen, ja tuumorinekroositekijä-alfa (TNF-). Kalsitrioli vähensi NK-solujen degranulaatiota, kun näitä soluja viljeltiin yhdessä K562-kasvainsolujen kanssa. Havaitsimme myös, että kalsitrioli säätelee ikääntymiseen liittyvää sirtuiini 1- proteiini/kinaasi R:n kaltaista endoplasmista retikulumkinaasi (SIRT1/pERK) reittiä ja SIRT1-deltaExon8 (SIRT1-∆Exon8) ilmentymistä. aktivoimalla D-vitamiinireseptoria (VDR). Lisäksi kalsitrioli voisi olla NK-solujen mahdollinen negatiivinen säätelijäapoptoosijamitokondrioiden inaktivaatiojoka johtuuoksidatiivista stressiä. Siten kalsitriolia esiintyyikääntymistä estäviä vaikutuksiaihmisen NK-soluihin in vitro aktivoimalla SIRT{0}}PERK-akseli javastustaa oksidatiivista vanhenemista.

Napsauta tästä saadaksesi Cistanchen ikääntymistä estäviä lisäravinteita

1. Esittely

Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että ikääntyminen vaikuttaa suoraan useisiin sairauksiin, kuten tartuntatauteihin, sydän- ja verisuonisairauksiin, hermostoa rappeuttaviin sairauksiin, autoimmuunisairauksiin ja syöpään. Elimistön ikääntymiseen liittyy immunosensenssi. Ikääntymisen yhteisiä piirteitä ovat pääasiassa tulehduksellinen ikääntyminen ja krooninen matala tulehdus [1], genomin epävakaus, proteiinien ilmentymisen epätasapaino, mitokondrioiden inaktivoituminen, solujen vanheneminen ja muutokset solujen välisessä viestinnässä [2]. Synnynnäisen immuniteetin pääkomponenttina NK-soluilla on tärkeä rooli infektioiden ja kasvainten vastaisissa vaikutuksissa sekä immuunijärjestelmän säätelyssä [3]. NK-solut voivat eliminoida kohdesolut suoraan tai vasta-aineista riippuvaisen solusytotoksisuuden (ADCC) kautta sen sijaan, että niillä olisi antigeeni- tai vasta-ainespesifisiä vasteita [4]. NK-soluihin liittyy myös yliherkkyysreaktioita ja autoimmuunisairauksia [5]. Immuunijärjestelmän ikääntyessä pintaaktivaatioreseptorien, kuten luonnollisen tappajaryhmän 2 jäsenen D (NKG2D) [6], tappaja-immunoglobuliinin kaltaisen reseptorin (KIR), erilaistumisen pintamarkkeriklusterin 57 (CD57) ilmentymisen ilmeneminen [7] , erilaistumisklusteri 16 (CD16) [8] lisääntyi. Tämä molekyyli voi aktivoida NK-solujen tappamistoiminnon, mikä voi johtaa solujen epätasapainoon ja tulehdukseen vanhuksella. Samaan aikaan NK-solujen, kuten luonnollisen tappajaryhmän 2 jäsenen A (NKG2A), luonnollisen tappajaryhmän 2 jäsenen C (NKG2C) ja luonnollisten sytotoksisuusreseptorien (NCR) [6], estomolekyylit vähenivät. Muita NK-solujen ikääntymiseen liittyviä markkereita ovat T-solujen immunoglobuliini- ja musiinidomeenia sisältävä proteiini 3 (TIM3) ja lisääntynyt ohjelmoitu solukuolema-1 (PD-1). PD-1:n ja TIM3:n lisääntyminen immunosensenssin aikana voi estää NK-solujen toimintaa ja johtaa NK-solujen ehtymiseen [9].

Toinen immunosensenssiin johtava tekijä on immuunitulehdus [10]. NK-solujen vapauttamien tulehduksellisten sytokiinien korkean tason on raportoitu aiheuttavan DNA-vaurioita, oksidatiivista stressiä ja solujen vanhenemista. Lisäksi NK-solujen solujen epätasapaino ja tulehdustila voivat johtaa autoimmuunisairauteen [11]. Interleukiini-1 (IL-1), interleukiini-4 (IL-4), interleukiini-6 (IL-6), interleukiinitasot -10 (IL-10) ja tuumorinekroositekijä-alfa (TNF-) ovat korkeampia iäkkäillä ihmisillä [12]. Vaikka immuunisolujen kokonaismäärä väheni ikääntymisen myötä, NK-solupopulaatio kasvoi huomattavasti, mikä saattaa johtua tulehdussolujen tunkeutumisesta [13].

D-vitamiinia on ihmiskehossa kahdessa aktiivisessa muodossa: D2-vitamiini (ergokalsiferoli) ja D3-vitamiini (kalsitrioli). D-vitamiinin ensisijainen tehtävä on edistää kalsiumin ja fosforin imeytymistä. D-vitamiini säätelee myös immuunijärjestelmän toimintaa [14]. Vaikka monet raportit ovat keskittyneet sen infektioiden ja kasvainten vastaisiin toimintoihin [15], kalsitriolilla on myös anti-inflammatorisia vaikutuksia [16]. D-vitamiinireseptori (VDR) ilmentyy erilaisissa immuunisoluissa [17]. Tulehduksellisten sytokiinien tuotannon väheneminen edistää tulehdusreaktioiden vähenemistä. Kalsitriolin tiedetään estävän TNF-, interleukiini-1 (IL-1), interleukiini-2 (IL-2), gamma-interferoni (IFN-) ja muut tulehdukselliset sytokiinit B- ja T-soluissa. Se voi myös vapauttaa anti-inflammatorisia sytokiineja, kuten IL-4 ja IL-10 [18] ja säädellä autofagiaa tulehdussolujen infiltraatiota vastaan ​​[19].

Kalsitriolin antioksidanttisia ominaisuuksia on raportoitu masennuksessa, rasvamaksasairauksissa [20], sydän- ja verisuonitaudeissa ja muissa tulehdukseen liittyvissä sairauksissa. Vapaat radikaalit ja reaktiiviset happilajit (ROS) kerääntyvät myös soluihin ja kudoksiin ikääntymisen aikana. Julkaistut tiedot ovat osoittaneet, että oksidatiivinen stressi vaikuttaa useisiin solujen signalointireitteihin [21], mukaan lukien SIRT1-, mitogeeniaktivoitu proteiinikinaasi (MAPK) ja ydintekijä-KB (NF-KB) -reitit. SIRT1-geeniä pidetään pitkäikäisyysgeeninä, ja tämän geenin suppressio johtaa proteiinien ilmentymiseen, solusykliin ja aineenvaihduntaan liittyviin häiriöihin [22]. SIRT1-ΔExon8 on SIRT1:n uusi isoformi, joka esiintyi nisäkkäissä vaihtoehtoisen silmukoinnin kautta. SIRT1-ΔExon8 pidettiin myös täyspitkän SIRT1:n yhteissäätelytekijänä [23].

Toistaiseksi hyvin harvat tutkimukset keskittyvät ikääntymisen ja oksidatiivisen vanhenemisen vaikutuksiin NK-soluihin. Kalsitriolin vaikutuksia SIRT{0}}ΔExon8:aan ei myöskään ole raportoitu. Siksi tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia kalsitriolin vaikutuksia NK-solujen ikääntymiseen ja oksidatiiviseen vanhenemiseen, koska nämä solut ovat keskeisessä asemassa ihmisen synnynnäisessä immuunijärjestelmässä.

2. Materiaalit ja metodit

2.1 Soluviljely ja reagenssit

Kolme ihmisen ääreisverenäytettä otettiin luovuttajilta, joilla ei ollut aktiivista autoimmuunisairautta, akuuttia tai kroonista tulehdussairautta, syöpää tai muita immuunijärjestelmään liittyviä sairauksia. Luovuttajien ikä vaihteli 48–65 vuoden välillä. Perifeerisen veren mononukleaarisolut (PBMC:t) eristettiin käyttämällä Lymphoprep Ficollia. NK-soluja laajennettiin ja ylläpidettiin käyttämällä NK Cell Culture Kit -pakkausta (MoreCell, Shenzhen, Kiina) 37 asteessa/5 % C02:ssa.

2.2 Virtaussytometrinen analyysi

Kalsitriolilla 72 tunnin käsittelyn jälkeen NK-solut värjättiin anti-ihmis-FITC-CD3:lla, PerCp-CD56:lla, APC-CD16:lla, PE-NKG2A:lla, PE-TIM3:lla, PE-PD1:llä ja PE-KIR:llä (BioLegend, Kalifornia, USA). Kaikki FACS-määritykset suoritettiin käyttämällä DxFLEX Flow Cytometeriä (Beckman, Kalifornia, USA).

2.3 Solujen laajenemismittaus, sytokiinien vapautuminen ja solusyklin määritys

Solujen laajeneminen määritettiin käyttämällä Cell Counting Kitiä-8 [24] (CCK8; Beyotime, Shanghai, Kiina). NK-soluja käsiteltiin kalsitriolilla 48 tuntia ja supernatantti kerättiin sytokiinien vapauttamismääritystä varten. Sytokiinitasot tutkittiin käyttämällä LEGEND Plex Human Inflammation Panel -paneelia (BioLegend, Kalifornia, USA). Ensin sytokiinin sieppaushelmiä inkuboitiin standardien tai näytteiden kanssa ja sitten inkuboitiin edelleen biotinyloitujen detektiovasta-aineiden kanssa. Biotinyloitu detektiovasta-ainetta sitova liuos, streptavidiini (SA)-PE, lisättiin myöhemmin fluoresoivan signaalin aikaansaamiseksi [25]. Nämä signaalit analysoitiin sitten käyttämällä FACS-määritystä.

Solusykli mitattiin käyttämällä Cell Cycle Detection Kit -sarjaa (Beyotime, Shanghai, Kiina). NK-soluja käsiteltiin kalsitriolilla 72 tunnin ajan. Nämä solut kiinnitettiin 70-prosenttisessa jääkylmässä etanolissa ja värjättiin sitten ribonukleaasi A:lla (RNaasi A) ja propidiumjodidilla (PI) (Beyotime, Shanghai, Kiina) [26].

2.4 NK-solujen tappamismääritys

Ihmisen erytroleukemiasoluja, K562-soluja (ATCC, Virginia, USA), inkuboitiin 10 uM 3,3 -dioktadekyylioksakarbosyaniinin (DIOBeyotime, Shanghai, Kiina) kanssa 15 minuuttia ja lisättiin sitten kalsitriolilla käsiteltyihin NK-soluihin. eri suhteilla (E/T'=1:1, 5:1 ja 10:1) 4 tunnin ajan, vastaavasti (27]).

2.5 Oksidatiivisen vanhenemisen induktio ja X-gal-värjäysanalyysi

In vitro NK-solujen ikääntymismalli vetyperoksidilla (H2O2). Kalsitriolin hapettumista estävän vaikutuksen määrittämiseksi NK-soluja käsiteltiin ensin kalsitriolilla ja sitten altistettiin 100 µM H2O2:lle 24 tunnin ajan. -galaktosidaasin aktiivisuus mitattiin käyttämällä 5-bromi-4-kloori-3-indolyyli- -D-galaktopyranosidi (X-gal) -värjäystä. Käsitellyt solut kiinnitettiin 4-prosenttisessa paraformaldehydissä ja värjättiin -galaktosidaasivärjäysliuoksella (Beyotime, Shanghai, Kiina) yön yli 37 asteessa [28]. Sitten värjätyt solut suspendoitiin PBS:ään ja kuvat näistä soluista otettiin käyttämällä Leica-fluoresenssiinversiomikroskooppijärjestelmää. Kolme mikroskooppista kuvaa kerättiin satunnaisesti eri kohdista 40-kertaisella suurennuksella jokaisesta ryhmästä. X-gal-värjäytyneiden solujen prosenttiosuus laskettiin ja sitä käytettiin solujen ikääntymisen arvioimiseen käyttämällä ImageJ-ohjelmistoa V.1.45S.

2.6 Mitokondrioiden kalvopotentiaalin värjäys ja analyysi

Kloorimetyyli-X-Rosamiinia (CMXRos) ja Hoechstia (Beyotime, Shanghai, Kiina) käytettiin mitokondrioiden kalvopotentiaalin arvioimiseen. Soluytimet (sininen) paikannettiin Hoechst-värjäyksellä, kun taas mitokondrioiden kalvopotentiaali määritettiin mitokondrioiden spesifisyydellä, joka ilmaisee fluoresoivaa väriainetta, CMXRos. Hoechst plus CMXRos-solut (merkitty valkoisilla nuolilla) osoittivat alhaista aktiivisuutta. Suhteellinen fluoresenssitaso laskettiin jakamalla Hoechst-positiivisten solujen lukumäärä CMXRos-positiivisilla soluilla [29]. Soluja inkuboitiin 200 nM CMXRos:n ja Hoechstin kanssa (30 min, 37 astetta) ja havaittiin käyttämällä Leica-käänteismikroskooppia viritysaallonpituuksilla 579 nm ja 350 nm. Hoechst plus CMXRos plus -solujen prosenttiosuus laskettiin osiossa 2.5 kuvatulla tavalla.

2.7 Western blottaus

Solut hajotettiin käyttämällä radioimmunosaostusmäärityksen (RIPA) lyysipuskuria (Beyotime, Shanghai, Kiina) fosfataasi-inhibiittorilla PhosSTOP (Roche, Basel, Sveitsi) ja 1 µM fenyylimetyylisulfonyylifluoridilla (PMSF) (Beyotime, Shanghai, Kiina). Kokonaisproteiini määritettiin käyttämällä Bradford Protein Assay Kit -sarjaa (TAKARA, Tokio, Japani). Proteiininäytteet erotettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) ja siirrettiin 0,22 μm polyvinylideenifluoridi (PVDF) -kalvoille (Immobilon-P kalvo; Millipore, Massachusetts, USA). Salpauksen jälkeen kalvot tutkittiin primaarisilla vasta-aineilla ja inkuboitiin sekundaaristen vasta-aineiden kanssa [30]. Kalvot havaittiin käyttämällä Odyssey-järjestelmää (LI-COR, Nebraska, USA).

2.8 Tilastollinen analyysi

Tiedot analysoitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA) käyttäen GraphPad Prismia ja esitettiin keskiarvona ± keskihajonta (SD). 6846 W. LI ET AL. Erot katsottiin tilastollisesti merkittäviksi, kun P < 0,05. Tulokset analysoitiin myös GraphPad-ohjelmistolla.

Kysy lisää:

Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950