Vertaileva tutkimus ikääntymistä ehkäisevistä ominaisuuksista ja mekanismista: Resveratroli ja kalorirajoitus Ⅱ

Resveratrolin ja CR:n vaikutus SIRT1:n, p53:n ja Foxo3a:n mRNA-ilmentymiseen ikääntyvien rottien kudoksissa

Oksidatiiviset stressiolosuhteetindusoivat usein SIRT1:n ilmentymistä ja aktiivisuutta. SIRT1 moduloi keskeisten selviytymistekijöiden, mukaan lukien p53 ja Foxo3a, toimintoja [9]. Resveratrolin ja CR:n vaikutuksen määrittämiseksi SIRT1:n, p53:n ja Foxo3a:n mRNA-tasoihin D-Gal-indusoiduissa ikääntymisrotissa suoritettiin kvantitatiivisia RT-PCR-määrityksiä. Verrattuna vastaavaan negatiiviseen kontrolliryhmään SIRT1:n ja Foxo3a:n mRNA:n ilmentymistasot laskivat merkitsevästi, mutta p53-taso kasvoi merkittävästi D-Gal-ryhmässä (P < 0.01; Kuva 9A ja 9B). Lisäksi samanaikainen resveratroli- tai CR-hoito D-galin kanssa nosti rotilla SIRT1- ja Foxo3a-mRNA-ilmentymiä, mutta alensi p53-tasoja verrattuna mallikontrolliryhmään (P < 0,05). Kuitenkin verrattuna CR-hoitoon SIRT1-mRNA:n ilmentymistaso nousi merkittävästi suuren resveratrolia- ja D-gal-annoksen maksassa, p53-mRNA:n ilmentymistaso laski merkittävästi maksassa ja aivoissa suuren resveratrolin ja D-gal-annoksen yhteydessä. gal-ryhmä (P < 0,05).

Napsauta tästä saadaksesi Cistanchen ikääntymistä estäviä lisäravinteita

Resveratrolin ja CR:n vaikutus pääasiallisen SIRT{0}}-proteiinin ilmentymiseen ikääntyvien rottien aivokudoksissa

FOXO3a ja p53, joita SIRT1 säätelee, ovat SIRT1:n alavirran molekyylejä. Samanaikaisesti SIRT1:n aktiivisuutta säätelevät sen ylävirran molekyylit, kuten DBC1 (tunnetaan myös nimellä KIAA1967), AROS (tunnetaan myös nimellä RPS19BP1) ja kasvainsuppressori HuR (tunnetaan myös nimellä ELAVL1) [9, 10] . Resveratrolin ja CR:n vaikutuksen määrittämiseksi p53-, FOXO3a-, HuR-, AROS- ja DBC1-proteiinitasoihin D-Gal-indusoiduissa ikääntymisrotissa suoritettiin Western blot -määritykset. Verrattuna vastaavaan negatiiviseen kontrolliryhmään FOXO3a-, AROS- ja HuR-proteiinien ilmentymistasot laskivat merkitsevästi, mutta p53- ja DBC1-tasot kasvoivat merkittävästi D-gal-ryhmässä (P < 0.01) ; kuva 10). Lisäksi samanaikainen resveratrolin tai CR:n käsittely D-galin kanssa rotilla aiheutti FOXO3a:n, AROS:n ja HuR:n proteiiniekspressioiden lisääntymistä, mutta laski p53- ja DBC1-tasoja verrattuna mallikontrolliryhmään (P < 0,05). Kuitenkin verrattuna CR-hoitoon HuR-proteiinin ilmentymistaso kasvoi merkittävästi, mutta DBC1-taso laski merkittävästi suuren resveratrolin ja D-gal-annoksen ryhmän aivoissa (P < 0,05). P53-, FOXO3a- ja AROS-proteiinin ilmentymistasoissa ei ollut eroja resveratrolin ja D-gal-ryhmän ja CR plus D-gal-ryhmän välillä (P > 0,05).

FOXO3a:n ja p53:n ilmentyminen aivo- ja maksakudoksissa

FOXO3a:n ja p53:n ilmentymistila määritettiin aivo- ja maksakudoksissa immunohistokemialla. FOXO3a:n ja p53:n immunohistokemiallinen analyysi paljasti, että FOXO3a:n ilmentyminen aivo- ja maksakudoksissa väheni merkittävästi ja p53:n ilmentyminen lisääntyi merkittävästi D-Gal-ryhmässä verrattuna negatiiviseen kontrolliryhmään (P < 0.{13} }5, kuva 11). Lisäksi samanaikainen resveratrolin tai CR:n D-gal-hoito rotilla lisäsi FOXO3a:n ilmentymistä, mutta vähensi p53:n ilmentymistä verrattuna mallikontrolliryhmään (P < 0.05). Kuitenkaan ei ollut eroja resveratrolin ja D-gal-ryhmän ja CR plus D-gal-ryhmän välillä p53- ja FOXO3a-ilmentymissä (P > 0,05).

KESKUSTELU

Ikääntymisen taustalla olevaa kemiallista perusprosessia kehitti ensinikääntymisen vapaiden radikaalien teoria[11] jaoksidatiivista stressiäuskotaan olevan ensisijainen tekijä normaalissa ikääntymisprosessissa.Vapaiden radikaalien käynnistäjä AAPHoli tottunutaiheuttaa oksidatiivista stressiäja luoda hapetusmallistressin aiheuttama solujen vanheneminenihmisen IMR-90-soluissa [12, 13]. Tämän menetelmän etuna on, että AAPH hajoaa termisestisynnyttää radikaalejailman biotransformaatioita tai entsyymejä, ja niiden nopeusradikaali sukupolvivoidaan helposti hallita säätämällä initiaattorin pitoisuutta [12]. AAPH havaittiinestää ihmisen lisääntymistäIMR{0}}-soluja pitoisuudesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. Tulokset osoittivat, että 2 vuorokauden inkubaatio AAPH:n kanssa (1 mM) lisäsi merkittävästi SA-Gal-positiivisen suhteen prosenttiosuutta, apoptoottisten solujen populaatiota, vähensi SIRT1:n mRNA-ilmentymistä ja indusoi laajentuneen ja litistyneen morfologian. Nämä osoittivat, että AAPH:n aiheuttama oksidatiivinen stressi johti IMR-90-solut vanhentumaan. Tämän solujen vanhenemismallin perusteella 10 μM resveratrolihoito esti tehokkaammin AAPH:n aiheuttamaa vanhenemista ja apoptoosia kuin CR-hoito.

D-gal-eläinmalli on kansainvälisesti tunnustettu ikääntyvien eläinmalli, ja sitä on käytetty laajasti eläinmallin alallaikääntymistä estävät lääkkeet. D-gal on fysiologinen ravintoaine, joka normaalisti metaboloituu D-galaktokinaasin ja galaktoosi-1-fosfaatin vaikutuksesta eläimissä. Kuitenkin D-galin ylitarjonta, joka ei metaboloidu yllä olevien entsyymien toimesta, vaan kerääntyy soluihin, johtaa oksidatiiviseen stressiin ja soluvaurioihin [14]. Näin ollen D-galin pitkäaikainen anto aiheuttaa muutoksia, jotka muistuttavat luonnollista ikääntymistä eläimissä, kuten lyhentynyt elinikä, kognitiivinen toimintahäiriö, hermoston rappeutuminen, oksidatiivinen stressi, heikentyneet immuunivasteet ja edistynyt glykaation lopputuotteen (AGE) muodostuminen [15]. Tämä tutkimus osoitti mimeettisen ikääntymismallin onnistuneen perustamisen, mikä on osoituksena huomattavasta oppimisen ja muistin heikkenemisestä, MDA:n tuotannosta, lipofussiinin kertymisestä, T-AOC:n ja SOD:n laskusta sekä telomeraasiaktiivisuuden vähenemisestä aivoissa. Samaan aikaan resveratroli- tai CR-hoidot suojasivat D-gal-indusoituja rottia oksidatiiviselta stressiltä nostamalla antioksidanttientsyymien aktiivisuutta, alentamalla lipidiperoksidaatiotuotteiden tasoa ja pitämällä oksidatiivisten ja antioksidanttijärjestelmien tasapainoa. Käyttäytymis- ja telomeraasiaktiivisuustesteissä resveratrolin tai CR:n hoito voi kumota D-gal-indusoidun kognitiivisen heikkenemisen ja telomeraasiaktiivisuuden. Lisäksi ikääntyvien mallirottien, joita hoidettiin suurilla annoksilla resveratrolia, vaikutus käyttäytymiseen oli suhteellisesti merkittävämpi kuin CR:llä hoidetut rotat.

Kuvio 11: Immunohistokemiallinen analyysi p53:n (A, B) ja FOXO3a:n (C, D) ekspressioista ikääntyvien rottien maksa- (A, C) ja aivokudoksissa (B, D). Suurennus oli 20x. NG, negatiivinen kontrolliryhmä; MG, mallin kontrolliryhmä; RESL, pieni annos resveratrolia; RESH, suuri annos resveratrolia; CR, kalorirajoitusryhmä

Tutkimukset ovat osoittaneet, että CR, ravitsevan ruokavalion vähentäminen 10–40 prosenttia, voisihidastaa ikääntymistä ja pidentää elinikää, joten tässä tutkimuksessa CR-ryhmän rotissa sovellettiin yhtä yleisesti käytettyä CR-tasoa (40 prosentin vähennys ravinnonsaannissa). Jotkin tutkimukset paljastivat kuitenkin, että CR:llä ei ole myönteistä vaikutusta luonnollisesti ikääntyneiden kädellisten pitkäikäisyyteen [16]. Vastaavasti vaikka resveratrolihoidon osoitettiin aiheuttavan CR:n kaltaisia ​​vaikutuksiaenergian aineenvaihduntaaja aineenvaihduntaprofiili lihavilla ihmisillä [17], se ei parantanut metabolista toimintaa ei-lihavilla naisilla, joilla oli normaali glukoosinsietokyky [18]. Syy näiden tutkimusten välisiin eroihin ei ole selvä, mutta saattaa olla, että CR ja resveratroli palauttavat homeostaasin metabolisesti heikentyneellä yksilöillä ja vähemmän terveillä yksilöillä, mikä on mahdollista SIRT1:n tunnettujen toimintojen kanssa eläinkokeissa [19]. Siksi D-gal-indusoituja ikääntyvien rottien malleja käytettiin vertaamaan resveratrolin tai CR:n ikääntymistä estäviä aktiivisuuksia luonnollisesti ikääntyneiden rottien mallin sijaan.

SIRT1, (NAD plus ) -riippuvainen deasetylaasi, on saanut paljon huomiota, koska sillä on useita rooleja eliniän pidentämisessä, stressiresistenssissä ja apoptoosin vähentämisessä [20, 21]. Kertyvät tutkimukset ovat osoittaneet vahvasti, että SIRT1 oli resveratrolin ja CR:n keskeinen kohde [22]. On olemassa valtava määrä SIRT1:n alavirran molekyylejä, mukaan lukien p53, Foxo1, Foxo3, Foxo4 ja E2F1, joita SIRT1 säätelee. Samanaikaisesti SIRT1-aktiivisuutta säätelevät sen ylävirran molekyylit, esimerkiksi p53, HIC1, E2F1, DBC1, HuR ja AROS. Akuutti ravinteiden vieroitus aktivoi transkriptio-ohjelman SIRT1-promoottorissa, jota ohjaavat transkriptiotekijät Foxo3a ja p53. Koska p53 tukahduttaa SIRT1-geenin ilmentymisen, sen poistaminen Foxo3a:lla aktivoi SIRT1-transkription [23]. DBC1 ja AROS kuvattiin äskettäin suoriksi negatiivisiksi ja positiivisiksi SIRT1-aktiivisuuden säätelijöiksi, vastaavasti, HuR osoittaa SIRT1:n ilmentymistasoja vähentävän vaikutuksen ikääntyneissä vanhenevissa soluissa [9, 10].

CRhidastaa ikääntymistä ja pidentää mediaani- ja maksimiikääuseissa eri lajeissa, mukaan lukien rotat, hiiret, kalat, kärpäset, matot ja hiiva. Tällaiset tiukat ruokavalio-ohjelmat vapaasti eläville ihmisille ovat kuitenkin herättäneet eettisiä ja metodologisia kysymyksiä [24]. Tällä hetkellä terveyden iän pidentäminen saattaa olla tärkeämpää kuin pelkkä eliniän pidentäminen. Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että resveratroli on yksi tehokkaimmista SIR2-aktiivisuuden käynnistäjistä kaikkien kasvipolyfenolien joukossa [25], ja se vaikuttaa pitkäikäisyyteen samankaltaisten mekanismien kautta kuin kalorirajoituksessa. Nämä tulokset osoittivat, että CR:llä ja resveratrolilla oli samanlainen aktiivisuus SIRT1-mRNA-ilmentymistasojen palauttamisessa, FOXO3a:n, AROS:n ja HuR:n proteiiniekspressioiden lisäämisessä ja p53- ja DBC1-tasojen alentamisessa. Samaan aikaan useat vakuuttavat todisteet osoittavat resveratrolin suotuisat vaikutukset neurologisiin, maksa- ja sydän- ja verisuonijärjestelmiin.

MATERIAALIT JA MENETELMÄT

Soluviljely, stressi ja hoidot

Ihmisen diploidinen fibroblastikanta IMR-90 saatiin ATCC:ltä. Soluja kasvatettiin minimialustassa (MEM) (Gibco, UK), jota oli täydennetty 10 prosentilla naudan sikiön seerumilla (FBS) (Gibco) 37 asteessa 5 prosentissa CO2:ssa. Kun konfluenssi oli saavutettu, solut kylvettiin 6-kuoppaviljelylevyille. Päivää myöhemmin soluja käsiteltiin 48 tuntia 1 mM 2,2'-atsobis(2-amidinopropaani)dihydrokloridilla (AAPH) (Sigma, USA), joka oli laimennettu MEM:iin plus 10 % FBS:ään. 48 tunnin inkubaatio vapaiden radikaalien initiaattorin AAPH:n kanssa muodostaa mallin oksidatiivisen stressin aiheuttamasta solujen vanhenemisesta [12, 13]. Kontrollisoluja inkuboitiin pelkässä elatusaineessa. AAPH-käsittelyn jälkeen IMR-90 pestiin kylmällä fosfaattipuskurisuolaliuoksella (PBS), pH 7,4, ja inkuboitiin tuoreen viljelyalustan tai viljelyalustan kanssa, joka sisälsi resveratrolia (resveratroliryhmä) tai MEM:ää, jota oli täydennetty 3 prosentilla FBS:llä (CR-ryhmä). vielä 48 tuntia ennen sadonkorjuuta.

SA -gal värjäysaktiivisuus

Vanhenemisen biomarkkerien esiintyminen tarkistettiin (proliferatiivisen potentiaalin väheneminen ja SA-gal-värjäytymisen lisääntyminen) [26] hoidon jälkeisestä päivästä alkaen. Sitten solut värjättiin noudattaen valmistajan SA-gal-värjäyssarjan (CST, USA) ohjeita. Värjäyksen jälkeen tutkittiin vähintään 300 solua useilla kentillä ja SA-gal-positiiviset solut laskettiin. Nämä kokeet toistettiin kolme kertaa ja tulokset esitettiin keskiarvoina standardipoikkeamilla (SD). Mahdollisesti solukonfluenssista johtuvan epäspesifisen värjäytymisen välttämiseksi SA-gal histokemiallinen värjäys suoritettiin subkonfluenteilla soluilla.

Pyyhkäisyelektronimikroskooppianalyysi

Soluja kasvatettiin peitinlasien päällä 6-kuoppaviljelylevyillä edellä kuvatulla tavalla. Resveratrolin ja CR:n käsittelyn jälkeen levyiltä poistettiin peitelasit, sitten solut kiinnitettiin 2,5-prosenttisessa fosfaattipuskuroidussa glutaraldehydissä ja jälkikiinnitettiin 1-prosenttisessa puskuroidussa osmiumtetroksidissa. Kiinteät näytteet upotettiin t-butyylialkoholiin dehydraation jälkeen lajiteltujen etanolisarjan läpi. Näytteet pakastekuivattiin t-butyylialkoholista, haihdutuspinnoitettiin kullalla käyttämällä automaattista hienopäällystystä (JFC-1600, JEOC, Japani) ja tutkittiin pyyhkäisyelektronimikroskoopilla (JEOL, JSM{11}). }LV, Japani).

Apoptoottinen analyysi

Resveratrolin tai CR:n inkubaation jälkeen kaikki solut kerättiin trypsiinillä ja pestiin kahdesti PBS:llä, minkä jälkeen ne suspendoitiin uudelleen 400 µl:aan Annexin V -sitoutumispuskuria. Sitten solut värjättiin noudattaen anneksiinin V-FITC-soluapoptoosin havaitsemispakkauksen (BestBio, Kiina) valmistajan ohjeita. FACSCalibur-virtaussytometriä (Becton-Dickinson, San Jose, CA) käytettiin fluoresenssin havaitsemiseen, ja apoptoottisten solujen prosenttiosuus laskettiin FACSCaliburin sisäisellä ohjelmistojärjestelmällä. Noin 104 solua analysoitiin jokaista polkua kohti.

Eläintoimenpiteet

Urospuoliset albiino Wistar-rotat, jotka painoivat noin 200 ± 10 g, saatiin Huazhongin tiede- ja teknologiayliopiston Tongjin lääketieteellisen korkeakoulun Experimental Animal Centeristä (SCXK 2010-0009). Eläimiä sopeutettiin 2 viikkoa ennen annostelua Hubein kiinalaisen lääketieteen yliopiston koeeläinkeskuksessa, jona aikana niillä oli vapaa pääsy ruokaan ja veteen ad libitum. Totuttelun jälkeen valittiin 50 rottaa ja jaettiin viiteen kymmenen hengen ryhmään. Eläimiä pidettiin IAEC:n (Institutional Animal Ethical Committee) hyväksymien kansallisten ohjeiden ja protokollien mukaisesti.

Ryhmän I (negatiivinen kontrolliryhmä) rotat saivat pelkkää vehikkeliä (1 ml/kg ruumiinpainoa 0,9 prosenttia suolaliuosta) 6 viikon ajan. Ryhmän II (mallikontrolliryhmä) rotat saivat D-galia (200 mg/kg ruumiinpainoa, Sigma Chemical, St. Louis, MO) 6 viikon ajan. Ryhmän III (pieni annos resveratrolia sisältävä ryhmä) rotat saivat D-galia ja resveratrolia (50 mg/kg ruumiinpainoa) liuotettuna 5-prosenttiseen dimetyylisulfoksidiin (DMSO) 6 viikon ajan. Ryhmän IV (Suuri annos resveratrolia ryhmä) rotat saivat D-galia ja resveratrolia (100 mg/kg ruumiinpainoa). Ryhmän V (CR-ryhmä) rotat saivat D-galia ja CR:tä (ruokittiin ruokavaliolla, joka oli 40 prosenttia kalorimääräisempi kuin ad libitum -ruokittujen rottien [27]) 6 viikon ajan. D-gal annettiin intraperitoneaalisesti, kun taas resveratrolia annettiin suun kautta koko kokeen ajan. Rotat tapettiin viimeisenä hoitopäivänä, sitten veri, seerumit ja elimet kerättiin välittömästi biotestiä varten tai säilytettiin -80 asteessa myöhempää käyttöä varten.

Käyttäytymistestit

Morris-vesilabyrinttitesti suunniteltiin arvioimaan rottien avaruudellisen oppimisen ja muistin kykyä 6 viikon kuluttua loukkaantumisesta [28]. Morris-vesilabyrinttitesti koostui 4-päivän oppimisesta ja muistin harjoittelusta sekä koetinkokeesta päivänä 5. Eläimiä koulutettiin pyöreässä altaassa (halkaisijaltaan 155 cm) visuaalisilla vihjeillä. Poistumislava (halkaisijaltaan 9.0 cm) upotettiin 1.0 cm allasveden pinnan alapuolelle, jonka lämpötila pidettiin 25 ± 2 asteessa. Alustan sijainti pysyi luoteiskvadrantin keskellä koko 4-päivän harjoitusjakson ajan. Joka päivä rottia koulutettiin yhteen aamulohkoon ja yhteen iltapäivälohkoon. Rotta ui vapaasti, kunnes löysi alustan 120 sekunnissa. Jos se epäonnistui, se asetettiin alustalle 10 sekunniksi. Pakoviive (upotetun pakotason löytäminen) ja uintinopeus tallennettiin. Koetuskoe tehtiin poistamalla alusta ja antamalla jokaisen rotan uida vapaasti 120 sekunnin ajan altaassa. Laiturin ylitysten määrä koulutetussa kvadrantissa (josta laituri poistettiin) tallennettiin tietokoneistetun videojärjestelmän avulla. Vesilabyrintin näkyvää tasoversiota ei suoritettu sen jälkeen, kun D-galilla ja vehikkelillä käsiteltyjen rottien välillä havaittiin merkittävä ero uintinopeudessa.

Oksidatiiviseen stressiin liittyvien biologisten indikaattoreiden havaitseminen

MDA-, SOD- ja T-AOC-tasot veressä ja kudoksissa määritettiin fotometrisesti valmistajan protokollan mukaisesti käyttämällä kaupallisesti saatavia entsymaattisia määrityssarjoja (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing City, PR China). Kaikki tässä osiossa kuvatut kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena keskiarvon ja SD:n saamiseksi.

Lipofussiinin taso määritettiin Sohal-menetelmällä [29]. Lyhyesti sanottuna, punnitsimme 200 mg aivokuorta, lisäsimme 2 ml kloroformi-metanoli (2:1) -uutetta, homogenisoimme ja suodatimme, sitten pestimme jäännöksen uutteella, yhdistimme suodokset, lisäsimme uutteen 5 ml ja mitattiin fluoresenssin intensiteetti fluoresenssispektrometrillä. Emissioaallonpituus oli 435 nm ja viritysaallonpituus 365 nm. Spektrofluorometri standardisoitiin antamaan taipuma 50 edellä mainituilla aallonpituuksilla kiniinibisulfaatin 1 ug/ml liuoksella 0,1 M H2S04:ssä. Tulokset ilmaistiin suhteellisina fluoresoivia yksiköitä/ml kloroformia/g märkäkudoksen painoa.

TE-toiminnan havaitseminen

Telomeraasiuuttoa varten noin 30 mg kudosta pestiin kahdesti jääkylmässä PBS:ssä ja lopuksi homogenisoitiin noin 150 ml:ssa PBS:ää. TE-aktiivisuus mitattiin käyttämällä TE ELISA -pakkauksia valmistajan ohjeiden mukaisesti (Nanjing Sen Beijia Biological Technology Co., Ltd., Nanjing, Kiina). Määritysten herkkyysrajat olivat 0,8 IU/l TE:lle.

RT-PCR-analyysi

SIRT1:n, Foxo3:n ja p53:n mRNA:n ilmentymistasot maksa- ja aivokudoksissa analysoitiin käyttämällä RT PCR -analyysiä. Kokonais-RNA uutettiin käyttämällä Trizolia, ja niiden määrä ja puhtaus arvioitiin ultramikrospektrofotometrillä (Thermo Fisher Scientific, USA) perustuen absorbanssimittauksiin aallonpituudella 260 ja 280 nm. Kvantifioinnin jälkeen cDNA syntetisoitiin käyttämällä FastQuant RT -kittiä (Tiangen Biotech, Peking, Kiina) valmistajan ohjeiden mukaisesti. SIRT1-, Foxo3-, p53-mRNA-ilmentymisen tasot mitattiin RT-PCR:llä käyttämällä TIANGEN SuperReal PreMix Plus -laitetta (Tiangen Biotech, Peking, Kiina) spesifisten alukkeiden kanssa (taulukko 2). Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR suoritettiin LightCycler 480 asteen PCR-järjestelmällä (Roche, Basel, Sveitsi) käyttäen 20 µl kunkin reaktion kokonaistilavuutena. PCR-monistus aloitettiin 15 minuutin denaturaatiolla 95 asteessa, minkä jälkeen seurasi 40 sykliä 95 astetta 10 s, 59–63 astetta (hehkutuslämpötila) 20 s ja 72 astetta 30 s ja lopullinen inkubaatio 72 asteessa. astetta 5 min. Saatu kunkin geenin syklin kynnysluku (Ct-arvo) normalisoitiin suhteellisten muutosten kertaiseksi 2-∆∆CT-menetelmän [30] yhtälön mukaisesti.

Taulukko 2: Pohjusluettelo

Western blot -analyysi

P53:n, FOXO3a:n, HuR:n, RPS19BP1:n ja DBC1:n proteiinin ilmentymistasot aivokudoksissa analysoitiin käyttämällä Western blot -analyysiä. Aivokudosten kokonaisproteiini uutettiin käyttämällä RIPA Lysis Bufferia (Beyotime, Kiina) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Proteiinipitoisuudet määritettiin käyttämällä BCA Protein Assay Kit -sarjaa (Beyotime, Kiina). 5 mg proteiineja erotettiin käyttämällä 12-prosenttisia SDS-polyakryyliamidigeelejä ja siirrettiin PVDF-kalvolle (0,45 μm, Millipore, USA). Blotit blokattiin 5-prosenttisella rasvattomalla maidolla TBS:ssä, minkä jälkeen niitä inkuboitiin yön yli 4 asteessa primaaristen vasta-aineiden sopivalla laimennuksella: anti-p53 (SC- 6243, Santa Cruz Biotechnology), anti-FOXO3a (#12829, Cell) Signaling Technology), anti-HuR (#12582, Cell Signaling Technology), anti-AROS (Ab201091, abcam), anti-DBC1 (#5857, Cell Signaling Technology), anti-- - toiminta (AC004, ABclonal Technology) . Kun kalvot oli pesty ylimääräisten primääristen vasta-aineiden poistamiseksi, kalvoja inkuboitiin 1 tunti huoneenlämpötilassa sopivien sekundääristen vasta-aineiden kanssa laimennuksessa 1:2000-1:5000 (AC004 tai AS003, ABclonal Technology). Kalvot pestiin 3 kertaa ja visualisoitiin sitten käyttämällä Pierce ECL Western Blotting Substratea (Thermo Scientific). -toimintoa käytettiin sisäisenä valvontana.

Immunohistokemia

Kudosnäytteet kiinnitettiin 10-prosenttisessa neutraalilla puskuroidussa formaliinissa 1 tunnin sisällä kirurgisen poiston jälkeen ja upotettiin parafiiniin käyttämällä standardimenetelmiä. Sitten kiinteät parafiiniin upotetut näytteet leikattiin 5- μm:n paksuisiksi osiksi, joista parafiini poistettiin ksyleenissä, hydratoitiin uudelleen etanolissa ja käsiteltiin mikroaaltouunissa antigeenin hakemista varten. Asianmukaisesti laimennettua primaarista vasta-ainetta, anti-p53 (SC-6243, Santa Cruz Biotechnology) ja anti-FOXO3a (#12829, Cell Signaling Technology), inkuboitiin 60 minuuttia huoneenlämpötilassa kosteuskammiossa. Objektilasit huuhdeltiin sitten PBS:ssä ja inkuboitiin sen jälkeen sekundaarisen vasta-aineen kanssa anti-kanin vasta-ainetta ja HRP:n visualisoinnin kanssa (konsentraatio 1:300, #074-1506, KPL). Sitten objektilasit pestiin ja leikkeet kehitettiin entsyymi-substraattidiaminobentsidiiniliuoksessa (DAB, Sigma). Kuvat immunohistokemiallisesti värjätyistä leikkeistä otettiin Olympus-digitaalimikroskoopilla (IX-73P1F, Olympus, Japani).

Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmaistiin keskiarvoina ± SD vähintään kolmen riippumattoman kokeen osalta ja analysoitiin SPSS 18.{1}} -ohjelmistolla. Ryhmäerot pakolatenssissa ja uintinopeudessa Morris-vesilabyrinttiharjoittelutehtävässä analysoitiin käyttämällä kaksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA) toistuvin mittauksin, tekijöinä hoito- ja harjoituspäivä. Muut tiedot analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA:lla, jota seurasi post-hoc Tukey-testi. P:n arvoa alle 0,05 pidettiin merkittävänä.

PÄÄTELMÄT

Resveratroli ja CR osoittivat samanlaisia ​​ikääntymistä estäviä aktiivisuuksia sekä in vitro että in vivo, mikä on osoituksena niiden kyvystä estää AAPH:n aiheuttamaa vanhenemista ja apoptoosia ja palauttaa D-gal:n antamisen aiheuttama ikään liittyvä kognitiivinen heikkeneminen. Heidän ikääntymistä ehkäiseviin mekanismeihinsa kuuluivat TE-toiminnan säätely, oksidatiivisten vaurioiden vähentäminen ja SIRT1-reitin säätely. Kaiken kaikkiaan 10 μM resveratrolia in vitro ja suurella annoksella resveratrolia in vivo osoittivat suhteellisen voimakkaampia ikääntymistä estäviä ja stimuloivia SIRT1-tasoja. Nämä tulokset viittaavat resveratrolin potentiaaliin CR-mimeettina.

Lyhenteet

AAPH, 2,2'-atsobis(2-amidinopropaani)dihydrokloridi; AMPK, adenosiinimonofosfaatilla aktivoitu proteiinikinaasi; ANOVA, varianssianalyysi; AROS, SIRT1:n aktiivinen säädin; CR, kalorirajoitus; DBC1, poistettu rintasyövästä 1; D-gal, D-galaktoosi; FBS, sikiön naudan seerumi; Foxo3a, haarukkalaatikko 3a; HuR, Hu-antigeeni R; MEM, välttämätön vähimmäisväline; PBS, fosfaattipuskuri suolaliuos; PGC-1, peroksisomiproliferaattorin aktivoima reseptori G-koaktivaattori-1; RES, resveratroli; SA-gal, vanhenemiseen liittyvä -galaktosidaasi; SD, standardipoikkeamat; SIRT1, vaimennustietojen säädin; TE, telomeraasi.

Tekijän panokset

Tutkimuksen idea ja suunnittelu: Gang Chen; tiedon hankinta, analysointi ja tulkinta: Juan Li, Xia Chun Zhang, Yi-Mei Liu; rahoituksen saaminen ja käsikirjoituksen kriittinen tarkistaminen henkistä sisältöä varten: Gang Chen, Ke-Li Chen; käsikirjoituksen kirjoittaminen: Juan Li. Kaikki kirjoittajat ovat lukeneet ja hyväksyneet tämän käsikirjoituksen julkaisemisen. KIITOKSET JA RAHOITUS

Tätä työtä rahoitti Kiinan postdochtorisäätiö (2016M601237), Natural Science Foundation -hanke (81373704, 30873292).

ETURISTIRIIDAT

Ei eturistiriitoja kaikilta osallistuvilta tekijöiltä.

VIITTEET

1. Ramis MR, Esteban S, Miralles A, Tan DX, Reiter RJ. Kalorirajoitus, resveratroli ja melatoniini: SIRT1:n rooli ja vaikutukset ikääntymiseen ja siihen liittyviin sairauksiin. Mech Aging Dev. 2015; 146–148:28–41.

2. Colman RJ, Beasley TM, Kemnitz JW, Johnson SC, Weindruch R, Anderson RM. Kalorirajoitus vähentää ikään liittyvää ja kaikista syistä johtuvaa kuolleisuutta reesusapinoissa. Nat Commun. 2014; 5:3557.

3. Sohal RS, Weindruch R. Oksidatiivinen stressi, kalorirajoitus ja ikääntyminen. Tiede. 1996; 273:59–63.

4. Testa G, Biasi F, Poli G, Chiarpotto E. Kalorirajoitukset ja ruokavalion rajoitukset mimeetit: strategia terveen ikääntymisen ja pitkäikäisyyden parantamiseksi. Curr Pharm Des. 2014; 20:2950–77.

5. Lane MA, Roth GS, Ingram DK. Kalorirajoitusmimeetit: uusi lähestymistapa biogerontologiaan. Menetelmät Mol Biol. 2007; 371:143–9.

6. Baur JA, Pearson KJ, Price NL, Jamieson HA, Lerin C, Kalra A, Prabhu VV, Allard JS, Lopez-Lluch G, Lewis K, Pistell PJ, Poosala S, Becker KG, et ai. Resveratroli parantaa korkeakalorisella ruokavaliolla olevien hiirten terveyttä ja selviytymistä. Luonto. 2006; 444:337–42.

7. Lagouge M, Argmann C, Gerhart-Hines Z, Meziane H, Lerin C, Daussin F, Messadeq N, Milne J, Lambert P, Elliott P, Geny B, Laakso M, Puigserver P, et ai. Resveratroli parantaa mitokondrioiden toimintaa ja suojaa aineenvaihduntasairauksilta aktivoimalla SIRT1:n ja PGC-1alfan. Cell. 2006; 127:1109–22.

8. Howitz KT, Bitterman KJ, Cohen HY, Lamming DW, Lavu S, Wood JG, Zipkin RE, Chung P, Kisielewski A, Zhang LL, Scherer B, Sinclair DA. Sirtuiinien pienimolekyyliset aktivaattorit pidentävät Saccharomyces cerevisiaen elinikää. Luonto. 2003; 425:191–6.

9. Kwon HS, Ott M. SIRT1:n ylä- ja alamäkiä. Trends Biochem Sci. 2008; 33:517–25.

10. Brooks CL, Gu W. Miten SIRT1 vaikuttaa aineenvaihduntaan, vanhenemiseen ja syöpään? Nat Rev Syöpä. 2009; 9:123–8.

11. Harman D. Vapaiden radikaalien ikääntymisen teoria. Mutat Re. 1992; 275:257–66.

12. Mayo JC, Tan DX, Sainz RM, Lopez-Burillo S, Reiter RJ. Peroksyyliradikaalien aiheuttama hapettava vaurio katalaasille: toiminnallinen suoja melatoniinilla ja muilla antioksidanteilla. Free Radic Res. 2003; 37:543–53.

13. Hubackova S, Krejcikova K, Bartek J, Hodny Z. IL1- ja TGF-Nox4-signalointi, oksidatiivinen stressi ja DNA-vauriovaste ovat replikatiivisen, onkogeenin ja lääkkeiden aiheuttaman parakriinin "Bystander vanhenemisen" yhteisiä piirteitä '. Ikääntyminen (Albany NY). 2012; 4:932–51. https://doi.org/10.18632/aging.100520.

14. Cui X, Zuo P, Zhang Q, Li X, Hu Y, Long J, Packer L, Liu J. Krooninen systeeminen D-galaktoosialtistus indusoi muistin menetystä, hermoston rappeutumista ja oksidatiivisia vaurioita hiirillä: R{{:n suojaavat vaikutukset 2}}lipoiinihappo. J Neurosci Res. 2006; 84:647–54.

Kysy lisää:

Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950