Elinkykyiset ja lämmön aiheuttamat probioottikannat parantavat suun immuniteettia nostamalla IgA-pitoisuutta suun limakalvossa

Abstrakti

Suun ja nenän limakalvon immuniteetilla on ratkaiseva rooli kehon suojelemisessa bakteerien ja virusten tunkeutumiselta. Turvallisia probioottisia tuotteita on käytetty parantamaan ihmisen vastustuskykyä ja suun terveyttä. Tässä tutkimuksessa vahvistimme Lactobacillus salivarius subsp. salicinius AP-32, Bifdobacterium animalis subsp. lactis CP-9 ja Lactobacillus paracasei ET-66, ja lämpötaptetut probioottitabletit, jotka koostuvat L. salivarius subsp. salicinius AP-32 ja L. paracasei ET-66, suun immuniteetista 45 terveen osallistujan keskuudessa. Osallistujat jaettiin satunnaisesti elinkelpoisiin probioottiryhmiin, lämmöllä tapettuihin probiootteihin ja lumelääkeryhmiin. Hoito kesti 4 viikkoa. Sylkinäytteet kerättiin viikoilla 0, 2, 4 ja 6, ja Lactobacillus-, Bifidobacterium- ja Streptococcus mutans -populaatiot ja IgA-pitoisuus mitattiin. IgA-pitoisuudet ja TGF-beetan ja IL-10 tasot PBMC-soluissa kvantifioitiin ELISA-menetelmällä. Tulokset osoittivat, että syljen IgA-tasot nousivat merkitsevästi, kun annettiin molempia elinkykyisiä (119,30±12,63%, ***P<0.001) and heat-killed (116.78±12.28%, ***P<0.001) probiotics for 4 weeks. Among three probiotic strains, AP-32 would effectively increase the levels of TGF-beta and IL-10 in PBMCs. The oral pathogen Streptococcus mutans was significantly reduced on viable probiotic tablet administration (49.60±31.01%, ***P<0.001). The in vitro antibacterial test confirmed that viable probiotics effectively limited the survival rate of oral pathogens. Thus, this clinical pilot study demonstrated that oral probiotic tablets both in viable form or heat-killed form could exert beneficial effects on oral immunity via IL-10, TGB-beta mediated IgA secretion. The effective dosage of viable probiotic content in the oral tablet was 109 CFUs/g and the heat-killed oral tablet was 1× 1010 cells/g.

cistanche-lisäaine hyödyttää - lisää vastustuskykyä

Johdanto

Suun ja nenän limakalvo, portti kosketukseen sisäänhengitettävien antigeenien kanssa, on ihmisen immuunijärjestelmän etulinjan puolustus [1, 2]. Yleensä patogeeniset virukset tai bakteerit tunkeutuvat suu-nenäontelon limakalvopinnoille taistelemalla paikallista immuunijärjestelmää ja tervettä mikrobiotaa vastaan ​​[3]. Tulehdukset ja oireet, mukaan lukien yskä, kurkkukipu, nenä ja kuume, kehittyvät immuunivasteiden vuoksi invasiivisia patogeenisia viruksia ja bakteereja vastaan ​​[4]. Lisäksi immunoglobuliini A (IgA) on tärkein immuunitekijä syljessä ja säätelee suun mikrobiston homeostaasia [5]. Useat tutkimukset ovat raportoineet erittävän IgA:n kyvystä suojata kehoa viruspatogeenien, mukaan lukien hengitysteiden synsyyttiviruksen [6], rotaviruksen [7] ja influenssaviruksen [7], aiheuttamalta infektiolta. Erittävä IgA toimii limakalvon epiteelin suojaajana. Nicolas Millet et ai. havaitsi, että limakalvon IgA voi estää kommensaalista Candida albicansin dysbioosia suuontelossa [8]. Se estää myös plakkia aiheuttavan suun patogeenin Streptococcus mutansin aggregoitumista [9].

Lisäksi tutkijat havaitsivat, että suun mikrobiota ja sen metaboliitit voivat paikallisesti vaikuttaa immuniteettiin suun esteessä [10]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet probioottien tehokkuuden nostaessaan IgA-pitoisuutta suun limakalvossa [11]. Ericson et ai. osoitti, että Lactobacillus reuteria sisältävä purukumi osallistui terveiden koehenkilöiden adaptiiviseen immuunivasteeseen nostamalla syljen IgA-tasoja [12]. Ihmisillä immuunisytokiinit TGF-beeta ja IL-10 korreloivat IgA:n tuotannon kanssa [13].

On kuitenkin edelleen epäselvää, nostiko suun mikrobiota erittäviä IgA-tasoja sytokiinien TGF-beetan ja IL-10 kautta. Lisäksi suun patogeeneihin kuuluvat S. mutans, P. gingivalis ja F. nucleatum subsp. polymorfismi ja A. actinomycetemcomitans osoittivat korkean korrelaation parodontaalisen sairauden ja pahanhajuisen hengityksen kanssa [14]. Probioottituotteet voisivat olla mahdollinen vaihtoehto hoitomuoto parodontiittille estämällä suun patogeenejä Fusobacterium nucleatum, mutta Porphyromonas gingivalis ja Aggregatibacter actinomycetemcomitans eivät osoittaneet merkittävää vähenemistä [15]. Probiootit voivat myös estää patogeenisiä infektioita [16]. On raportoitu, että mikrobiotan keskeiset lajit rajoittivat patogeenisen Streptococcus-keuhkokuumeen kasvua [17]. Siten tasapainoisen mikrobiekosysteemin ylläpitäminen probioottisten kantojen oton kautta voi olla vaihtoehtoinen tapa säädellä suun immuniteettia ja parantaa suun terveyttä. Aiemmat havainnot oraalisten patogeenien estämisestä probioottikannoilla ovat paljastaneet, että Lactobacillus salivarius subsp. salicinius AP-32, Bifdobacterium animalis subsp. lactis CP-9 ja Lactobacillus paracasei ET-66 aikaansaavat erinomaisia ​​antibakteerisia vaikutuksia in vitro; ei kuitenkaan H2O2-pitoisuuksien nousumekanismilla [18]. Probioottisten kantojen tärkeimmät strategiat suun patogeenisen kasvun rajoittamiseksi olivat patogeenien yhteisaggregaatio suun kautta, biosurfaktanttien tuottaminen, suun ympäristön muuttaminen ja antimikrobisten aineiden tuottaminen [19]. Lisäksi in vitro -tutkimus osoitti, että L. salicinius AP-32 välitti tulehdussytokiinin [interleukiini (IL)-8, IL-10] ilmentymistä ihmisen epiteelisoluissa [20]. Siksi tässä tutkimuksessa varmistimme, sekoitettiinko elinkelpoisia probioottisia tabletteja, jotka koostuivat L. salivarius subsp. salicinius AP-32, B. animalis subsp. lactis CP-9 ja L. paracasei ET-66 sekä lämpötapetetut probioottitabletit, jotka koostuvat L. salivarius subsp. Salicinius AP-32 ja L. paracasei ET-66 paransivat immuunitoimintaa TGF-beetan, IL-10 kautta tai nostivat syljen IgA-pitoisuutta. Probioottisten tuotteiden oton antibakteerinen toiminta suuontelossa testattiin.

cistanche-lisän edut - kuinka vahvistaa immuunijärjestelmää

Napsauta tästä nähdäksesi Cistanche Enhance Immunity -tuotteet

【Kysy lisää】 Sähköposti:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Materiaali ja metodit

Osallistujat

Yhteensä 45 tervettä osallistujaa, iältään 20–40 vuotta, rekrytoitiin ja jaettiin satunnaisesti kolmeen alaryhmään: elinkelpoinen probioottinen oraalinen tabletti, lämmöllä tapettu probioottinen oraalinen tabletti ja lumeryhmä. Jokaisessa ryhmässä oli 15 osallistujaa. Osallistujat, joilla oli tupakointi ja betelpähkinän ruokailutottumukset, suljettiin pois. Suun kautta otettavat tabletit määrättiin sokeasti osallistujille. Kaikki osallistujat ottivat suun kautta otettavat tabletit kolmesti päivässä (aamulla, päivällä ja illalla) 4 viikon ajan. Sylkinäytteet (2 ml) kerättiin IgA-pitoisuuden ja mikro-organismipopulaatioiden mittaamiseksi viikoilla 0, 2, 4 ja 6. Kaikilta tähän tutkimukseen osallistuneilta saatiin tietoinen suostumus. Protokollan hyväksyi Taiwanin Chung Shan Medical Universityn (CS19052) Institutional Review Board.

Elinkykyiset probioottitabletit suun kautta

Elinkykyinen probioottinen oraalinen tabletti (1 g) sisälsi kolme elinkykyistä probioottista kantaa, L. salivarius subsp. salicinius AP-32, B. animalis subsp. lactis CP-9 ja L. paracasei ET-66. Sekoitettiin 0.01 g 1011 pesäkemuodostusyksikköä (CFU) yksittäistä probioottia oraaliseen tablettiin. Kunkin yksittäisen probioottisen kannan arvoksi mitattiin noin 0,33 * 109 CFU/g. Oraalisen tabletin probioottien kokonaispitoisuus oli 109 pesäke CFU:ta/g. Probioottisen oraalisen tabletin aktiivinen annostus noudatti aiemmin julkaistuja töitä [18]. Kaikki probioottikannat saatiin Biofag Biotech Co., Ltd.:n (Tainan, Taiwan) laboratoriosta. L. salivarius subsp. salicinius AP-32 eristettiin terveestä ihmisen suolesta ja talletettiin Taiwanin elintarviketeollisuuden tutkimus- ja kehitysinstituuttiin (ID: BCRC 910437) ja Wuhanin yliopistoon Kiinaan (ID: CCTCC-M2011127); B. animalis subsp. maitohappo-CP-9 eristettiin terveestä ihmisen rintamaidosta ja talletettiin elintarviketeollisuuden tutkimus- ja kehitysinstituuttiin Taiwaniin (ID: BCRC 910645) ja Wuhanin yliopistoon (ID: CCTCC-M2014588); L. paracasei ET-66 eristettiin terveestä ihmisen rintamaidosta ja talletettiin elintarviketeollisuuden tutkimus- ja kehitysinstituuttiin Taiwaniin (ID: BCRC 910753) ja Kiinan yleiseen mikrobiologiseen kulttuurin keräilykeskukseen, Peking, Kiina (ID: CGMCC{ {22}}). Lactobacillus. salivarius subsp. salicinius AP-32 ja L. paracasei ET-66 viljeltiin de Man, Rogosa ja Sharpe (MRS) agarmaljoilla (110 660, Merck, Darmstadt, Saksa) ja inkuboitiin fakultatiivisissa anaerobisissa olosuhteissa 37 asteessa. 48 tunnin ajan. B. animalis subsp. Lactis CP-9 viljeltiin MRS-agarilla, johon oli lisätty 0,05 % kysteiiniä, ja inkuboitiin anaerobisesti 37 asteessa 48 tuntia. Pesäkkeiden laskeminen suoritettiin bakteerien CFU:n kvantifioimiseksi probioottisten kantojen viljelyn jälkeen [18].

cistanche-kasveja lisäävä immuunijärjestelmä

Kuumalla tapetut probiootit suun kautta otettavat tabletit

Kuumalla tapetut probioottiset oraaliset tabletit (1 g) koostuivat inaktivoidusta L. salivarius subsp. salicinius AP-32 ja L. paracasei ET-66. Elinkykyisiä kantoja viljeltiin ja inkuboitiin, kuten aiemmin on kuvattu. Sitten AP-32 ja ET-66 inaktivoitiin inkuboimalla eläviä kantoja MRS-elatusaineessa 100 asteessa 1 tunnin ajan. Oraalisen tabletin probioottipitoisuus oli 1 × 1010 solua/g. Lämmöllä tapettujen probioottisten oraalisten tablettien aktiivinen annos seurasi aiemmin julkaistuja in vitro -testejä [11]. Kaikki kokeelliset toimenpiteet suoritettiin Biofag Biotech Co., Ltd.:n (Tainan, Taiwan) laboratoriossa.

Lactobacillus- ja Bifidobacterium-populaatioiden mittaaminen sylkinäytteistä

Sylkinäytteet (2 ml) kerättiin jokaiselta osallistujalta viikoilla 0, 2, 4 ja 6. Sylkinäytteet (100 µL) laimennettiin sarjassa ja lisättiin MRS:ään. levyt. Lactobacillus-populaatioiden mittaamiseksi Lactobacillus viljeltiin ja inkuboitiin MRS-agarmaljoilla fakultatiivisissa anaerobisissa olosuhteissa 37 asteessa 48 tuntia. Bifdobacterium-populaatioiden mittaamiseksi Bifdobacteriumia viljeltiin ja inkuboitiin anaerobisesti MRS-agarilla, johon oli lisätty 0,05 % kysteiiniä, 37 asteessa 48 tunnin ajan. Pesäkkeiden laskeminen suoritettiin bakteeri-CFU:n kvantifioimiseksi probioottisten kantojen viljelyn jälkeen. Lactobacillus- ja Bifidobacterium-populaatioluvut normalisoitiin probioottipopulaatioiden lukumäärään viikolla 0. Viikolla 0 kerättyjen Lactobacillus- ja Bifidobacterium-populaatioasteen katsottiin olevan 100 %. Kokeellinen menetelmä seurasi aiemmin julkaistuja teoksia [18].

IgA-pitoisuuden mittaaminen suun limakalvolla

Sylkinäytteet (2 ml) kerättiin jokaiselta osallistujalta viikoilla 0, 2, 4 ja 6, ja niitä pidettiin 20 asteessa. IgA:n päällystämätöntä ihmisen ELISA-sarjaa (luettelonro 88-50600-88; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA) käytettiin IgA-pitoisuuden analysointiin. Ensin päällystettiin ihmisen IgA-vasta-aineet 96-kuoppalevylle. Näytteessä tai standardissa läsnä oleva syljen IgA lisättiin mikrokuoppaan, ja sitten HRP-konjugoitua anti-ihmis-IgA-vasta-ainetta lisättiin huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan. Pipetoi TMB-substraattia jokaiseen kuoppaan 30 minuutin ajan. Lopuksi IgA-konsertti mitattiin spektrofotometrillä 450 nm:ssä. Kaikki kokeellinen toimenpide suoritettiin kolmena kappaleena valmistajan ohjeiden mukaisesti. Viikolla 0 kerätyn IgA:n pitoisuusasteen katsottiin olevan 100 %. Kokeellinen menetelmä seurasi aiemmin julkaistuja teoksia [18].

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

TGF-Beta- ja IL-10-pitoisuuden mittaus PBMC:ssä

Probioottien aiheuttaman TGF-beeta- ja IL-10-tason nousun testaus edellisen tutkimuksen jälkeen [20]. Perifeerisen veren mononukleaarisolut (PBMC:t) saatiin terveiden luovuttajien verinäytteistä (Tainan Blood Center, Taiwan Blood Services Foundation). Kokoveren sentrifugointi Ficoll-Hypaque-gradientin läpi (Pharmacia, Ruotsi) ja valotiheysfraktio 42,5 %-50 % rajapinnasta eluoitiin. Ympätään 4 x 105 solua uutettuja PBMC-soluja 100 ul:ssa RPMI{12}}, jossa on 1 % FBS:ää (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) kuhunkin 96-kuoppaisten levyjen kuoppaan. Lisää sitten 5 * 105 cfu/20 µl probioottikäsittelyä kuhunkin PBMC:hen kylvettyyn kuoppaan (solut: probioottikannat=1:10). Positiiviset kontrollit lisäsivät 10 µg/ml fytohemagglutiniinia (PHA) (Sigma-Aldrich, München, Saksa) PBMC-soluihin ympättyihin kuoppiin TGF-, IL-10:n tuottamiseksi, vastaavasti [21]. Probioottien yhteisviljely PBMC:iden kanssa 48 tuntia. Sytokiineja IL-10 ja TGF- sisältävän supernatantin mittaaminen entsyymi-immunosorbenttianalyysillä (ELISA) (Thermo Scientific, Carlsbad, CA, USA). Kaikki kokeet mitattiin ja noudatettiin kaupallista protokollaa vähintään kolmena kappaleena.

Antibakteerisen toiminnan arviointi suuontelossa

Streptococcus mutans on yleinen suun terveysuhka, joka aiheuttaa hampaiden kariesta muodostamalla ruttoa tai biofilmiä [22]. Vanupuikoista otettiin Streptococcus mutans -näytteet, joilla keräsimme S. mutansin supragingivaalisesta osasta, ikenistä ja suun limakalvosta viikoilla 0, 2, 4 ja 6. S. mutansia pidettiin tryptissä soijaliemi (TSB, 5 ml) täydennettynä 50 % glyserolilla. S. mutans -elatusaine laimennettiin sarjassa ja lisättiin Mitis Salivarius-Bacitracin Agar (MSBA, 0,2 U/ml) -levylle, jota inkuboitiin 37 asteessa 2 päivää. Lopuksi laskettiin S. mutans -pesäkkeiden lukumäärä kussakin osallistujanäytteessä patogeenisten eloonjäämislukujen laskemiseksi; viikolla 0 kerätyn S. mutansin eloonjäämisasteen katsottiin olevan 100 %. Kokeellinen menetelmä seurasi aiemmin julkaistuja teoksia [18].

Suun kautta otettavien tablettien antibakteerinen vaikutus in vitro

Oral tablets (1 g) that contained viable (AP-32, CP-9, and ET-66; > 109 CFUs) and heat-killed (AP-32 and ET-66,>1010 CFU:ta) probioottikantaa liuotettiin TSB:hen ja aivosydäninfuusioväliaineeseen, vastaavasti, lopulliseksi pitoisuudeksi 0,1 g/ml. Vain väliainetta käytettiin nollaryhmälle, kun taas tabletit (1 g) ilman probioottisia komponentteja liuotettiin vastaaviin plaseboryhmän väliaineisiin. Sitten oraaliset patogeenit (106 CFU:ta) lisättiin tabletiliuoksiin ja niitä inkuboitiin yhdessä 37 asteessa 2 (S. mutans) tai 3 (Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum ja Aggregatibacter actinomy cetemcomitans) d. Patogeenit saatiin BCRC:ltä. Oraalinen patogeenin estoaste (%) laskettiin seuraavasti: (CFU-blank-kontrolli – CFU-kokeellinen ryhmä)/CFU-blank-kontrolli. Kokeellinen menetelmä seurasi aiemmin julkaistua testausta [11].

Tilastollinen analyysi

Kaksisuuntaisen t-testin tulosten tilastolliseen analyysiin käytettiin GraphPad Prism -ohjelmistoa. Tiedot esitettiin keskimääräisenä keskihajontana (SD) tai kahden tai kolmen riippumattoman kokeen tulosten keskiarvona. Tilastollisia eroja pidettiin merkittävinä P-arvolla<0.05.

Tulokset

Probioottitabletit lisäsivät bifidobakteeripopulaatiota suuontelossa

Bifidobacterium-populaatio oli vakaasti kohonnut suuontelossa probioottitabletin annon jälkeen. Hoitojen jälkeiset bakteeripopulaatiot normalisoitiin bakteeripopulaatioilla ennen hoitoja (populaatioprosentti %=hoidon jälkeinen CFU/pre-reaction CFU). Elinkykyisessä probioottiryhmässä populaatioaste nousi merkittävästi 244,14±164,96 prosenttiin viikolla 2 (**P<0.01, Fig. 1a) and 438.41±308.58 at Week 4 (***P<0.001), compared to Week 0. The Bifidobacterium population rate remained high at Week 6 (no administration of viable probiotic tablets for 2 weeks after Week 4, 550.16±448.19%, ***P<0.001), compared to Week 0. The Bifidobacterium population number was significantly different between the viable probiotic and placebo groups at Week 6 (**P<0.01). In the heat-killed probiotic group, the Bifidobacterium population was increased at Weeks 2 (149.92±60.47%, **P<0.01) and 4 (199.87±148.64%, *P<0.05), but was decreased at Week 6 after administration of the heat-killed probiotic tablets was stopped for 2 weeks (182.98±163.73%, Fig. 1a).

Probioottitabletit lisäsivät laktobacilluspopulaatiota suuontelossa

Probioottisten tablettien antamisen aiheuttama muutos oraalisessa Lactobacillus-populaatiossa paljasti samanlaisen kuvion kuin mitä seurasi muutos oraalisessa Bifidobacterium-populaatiossa. Hoidon jälkeiset bakteeripopulaatiot normalisoitiin bakteeripopulaatioilla ennen hoitoja. Elinkykyisessä probioottiryhmässä Lactobacillus-populaatioaste nousi merkittävästi 447,74±337,89 %:iin viikolla 2 (**P<0.01, Fig. 1b) and 982.27±726.66% at Week 4 (***P<0.001), compared to Week 0. The Lactobacillus population rate was higher at Week 6 (no administration of viable probiotic tablets for 2 weeks after Week 4, 727.57±539.76%, ***P<0.001) than at Week 0. The Lactobacillus population number was significantly different between the viable probiotic and placebo groups at Week 6 (***P<0.001). In the heat-killed probiotic group, the Lactobacillus population was increased at Weeks 2 (256.66±183.78%, **P<0.01) and 4 (312.85 ± 279.71%, *P < 0.05). Additionally, the Lactobacillus number remained but showed no significant difference at Week 6 after the administration of heat-killed probiotics was stopped for 2 weeks (208.00±199.50%, Fig. 1b).

Kuvio 1 a Bifidobacterium-populaatioiden mittaus suun limakalvon pinnoilla. V elinkelpoinen probiootti tablettia; H kuumalla tapettu inaktivoitu probiootti tablettia; C-plasebotabletit (kontrolli); ja LAB-maitohappobakteerit. Sylkinäytteet kerättiin ja analysoitiin viikoilla 0, 2, 4 ja 6. Tiedot esitettiin keskimääräisenä standardipoikkeamana (SD). Kaksisuuntaista t-testiä käytettiin tilastollisten erojen analysointiin. Tilastolliset merkitsevuudet merkittiin *P:llä<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. b Measurement of Lactobacillus populations on the oral mucosal surfaces. V viable probiotic tablets; H heat-killed inactivated probiotic tablets; C placebo tablets (control); and LAB lactic acid bacteria. Collection and analysis of salivary samples at Weeks 0, 2, 4, and 6 were performed. Data were presented as the mean standard deviation (SD). A two-tailed t-test was used to analyze statistical differences. Statistical significances were marked with *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

Probioottitabletit, jotka sisältävät AP-32:ta, ET-66:ta ja CP-9:ää, nostivat merkittävästi IgA-pitoisuutta suun limakalvossa

Koska probioottisten tablettien (elinkykyisten tai lämmöllä tapettujen) kulutuksen on osoitettu nostavan Bifidobacterium- ja Lactobacillus-tasoja suuontelossa, analysoimme edelleen probioottisten tuotteiden imeytymisestä johtuvia syljen IgA-pitoisuuden muutoksia. IgA-tasot hoitojen jälkeen normalisoitiin IgA-tasoilla ennen hoitoja. Elinkykyisessä probioottiryhmässä syljen IgA-pitoisuus nousi hieman 103,24 ± 8,10 %:iin viikolla 2 (kuva 2) ja 104,81 ± 13,26:een viikolla 4, mutta ilman tilastollisesti merkittäviä eroja. Kuitenkin syljen IgA-pitoisuus elinkelpoisessa probioottiryhmässä lumeryhmään verrattuna nousi merkitsevästi 119,30 ± 12,63 prosenttiin viikolla 6 (ei elinkykyisiä probioottitabletteja annettu 2 viikkoon viikon 4 jälkeen) verrattuna viikkoon 0 ( ***P<0.001). Furthermore, in the heat-killed probiotic group, the salivary IgA concentration was slightly increased at Weeks 2 (102.51± 7.20%) and 4 (104.35 ± 10.27%). The saliva IgA concentration was increased at Week 6 (116.78 ± 12.28%, ***P < 0.001, Fig. 2), compared to Week 0.

Elinkykyiset kannat nostivat IL-10- ja TGF-beta-tasoja PBMC-soluissa

Positiivinen kontrolli 10 µg/ml fytohemagglutiniinia (PHA) nosti onnistuneesti IL-10 (58,2 ± 7,9 pg/ml, ***P < 0,001, kuva 3a) ja TGF-tasoja. (53,4±8 pg/ml, ***P<0.001, Fig. 3b) in PBMCs by comparing to the negative control (PBMCs treated with medium only). Viable strains of CP-9, AP-32 and ET-66 signifcantly increased the levels of IL-10 in PBMCs to 84.2±9 pg/ml (***P<0.001, ##P<0.01), 303.1±170.9 pg/ml (*P<0.05, ##P<0.01) and 98.2±17.5 pg/ml (***P<0.01, ##P<0.01), respectively. Symbol *indicated a significant difference by comparing to the medium-treated control; symbol #indicated a significant difference by comparing to the PHA control (Fig. 3a). Besides, viable strains of CP-9, AP-32, and ET-66 significantly increased the levels of TGF-beta in PBMCs to 23.2 ± 4.7 pg/ml (***P < 0.001), 130.9 ± 16 pg/ ml (***P < 0.001, ###P < 0.001) and 31.4 ± 5.5 pg/ml (***P<0.01), respectively (Fig. 3b).

Kuva 2 Immunoglobuliini A:n (IgA) pitoisuus sylkinäytteissä. V elinkelpoinen probiootti tablettia; H kuumalla tapettu inaktivoitu probiootti tablettia; C-plasebotabletit (kontrolli); ja LAB-maitohappobakteerit. Sylkinäytteet kerättiin ja analysoitiin viikoilla 0, 2, 4 ja 6. Tiedot esitettiin keskimääräisenä standardipoikkeamana (SD). Kaksisuuntaista t-testiä käytettiin tilastollisten erojen analysointiin. Tilastollinen

AP-32-, ET-66- ja CP-9-proteiinia sisältävät probioottitabletit kielsivät S. mutans -populaation syljessä

Kohonneet Bifidobacterium- ja Lactobacillus-populaatiot ja kohonnut syljen IgA-pitoisuus voivat edistää taistelua suun patogeenisiä mikro-organismeja vastaan. Seuraavassa kokeessa testasimme probioottien interventiosta johtuvaa muutosta oraalisen patogeenin S. mutans -populaatiossa. Hoidon jälkeiset bakteeripopulaatiot normalisoitiin bakteeripopulaatioilla ennen hoitoja. Elinkykyisessä probioottiryhmässä S. mutans -populaatio väheni merkittävästi viikolla 2 (53,55±31,60 %, ***P<0.001), 4 (49.60±31.01%, ***P<0.001), and 6 (55.19±42.72%, **P<0.01, Fig. 4). At week 6, S. mutans was significantly inhibited in the viable probiotic group (55.19±42.72%, ***P<0.001), compared to in the placebo group. Furthermore, in the heat-killed probiotic group, the S. mutans population was slightly decreased at Week 2 (85.81±49.87%) and significantly reduced at Week 4 (58.35 ± 33.17%, ***P<0.001). The S. mutans population level in the heat-killed probiotic group (202.81±167.99%) reverted to that in the placebo group (225.05±127.01%) at Week 6 (no administration of heat-killed probiotic tablets for 2 weeks from Week 4) (Fig. 4).

Kuva 3 Elinkykyiset kannat lisäsivät IL-10- ja TGF-beeta-tasoja PBMC:issä. IL-10:n ja b TGF-beetan taso PBMC:issä testattiin käsittelemällä probioottikantoja. Lisäämällä 5 * 105 cfu/20 µl eläviä CP-9-, AP-32- ja ET-66-kantoja PMBC:ihin 10 µg/ml. Positiivisena kontrollina käytettiin fytohemagglutiniinia (PHA). Negatiivinen kontrolli oli PBMC:itä, joita oli käsitelty vain RMPI-1640-elatusaineella. Testit suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Tiedot esitettiin keskimääräisenä standardipoikkeamana (SD). Kaksisuuntaista t-testiä käytettiin tilastollisten erojen analysointiin. Tilastolliset merkitsevuudet merkittiin P:llä<0.05, P<0.01, P<0.001. The symbol *indicated a significant difference by comparing to the medium-treated control; symbol #indicated significant difference by comparing to the PHA control

Kuva 4 Patogeenisten Streptococcus mutans -populaatioiden mittaus suun limakalvon pinnoilla. V elinkelpoinen probiootti tablettia; H kuumalla tapettu inaktivoitu probiootti tablettia; C-plasebotabletit (kontrolli); ja LAB-maitohappobakteerit. Sylkinäytteet kerättiin ja analysoitiin viikoilla 0, 2, 4 ja 6. Tiedot esitettiin keskimääräisenä standardipoikkeamana (SD). Kaksisuuntaista t-testiä käytettiin tilastollisten erojen analysointiin. Tilastolliset merkitsevuudet merkittiin *P:llä<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

Probioottitablettien kyvyn estää oraalisten patogeenien kasvua varmistus in vitro -testillä

In vitro -tutkimus paljasti, että elinkykyiset probioottitabletit estivät merkittävästi oraalisten patogeenien eloonjäämisastetta (kuvio 5a). Hoidon jälkeiset bakteeripopulaatiot normalisoitiin bakteeripopulaatioilla ennen hoitoja. S. mutansin, P. gingivalisin, F. nucleatumin ja A. actinomy cetemcomitansin eloonjäämisprosentti elinkelpoisessa probioottiryhmässä verrattuna lumelääkeryhmään laski 4,23 prosenttiin (***P < 0 .001, lumelääke=91 %), 8,64 % (***P < 0,001, plasebo=89 %), 5,77 % (**P<0.01, placebo=98%), and 6.23% (**P<0.01, placebo=87%), respectively. However, the heat-killed probiotic tablet exerted weaker antibacterial effects than the viable probiotic tablet (Fig. 5b). The survival rate of S. mutans, P. gingivalis, F. nucleatum, and A. antinomy cetemcomitans in the heat-killed probiotic group, compared to in the placebo group, was slightly decreased without statistical significance (82%, placebo=91%), significantly reduced to 53% (*P<0.05, placebo=89%), not inhibited (96.88%, placebo=98%), and significantly reduced to 80% (**P<0.01, placebo=87%), respectively.

Keskustelu

Lumeryhmään verrattuna Lactobacillus- ja Bifidobacterium-populaatiot lisääntyisivät merkittävästi syöttämällä elinkykyisiä probioottitabletteja tai lämmöllä tapettuja probioottitabletteja 4 viikon ajan. Lisäksi Lactobacillus- ja Bifidobacterium-määrät pysyivät merkittävästi korkeina 2 viikon ajan elinkelpoisten probioottien kulutuksen keskeyttämisen jälkeen (kuviot la ja b). Samoin Camila Casuccio Almeida et ai. osoitti, että neljän viikon probioottihoito voi jatkua ja parantaa laktoosi-intoleranssipotilaiden oireita vähintään 3 kuukauden ajan probioottien käytön lopettamisen jälkeen [23]. Probioottien jatkuvaa vaikutusta pitkäaikaishoidossa tulee kuitenkin arvioida jatkossa. Lisäksi syljen IgA-pitoisuus nousi merkittävästi, kun annettiin elinkykyisiä ja lämmöllä tapettuja probioottitabletteja. Sekä lämmöllä tapetut että elinkelpoiset probioottiryhmät lisäsivät syljen IgA:ta antamalla oraalisia tabletteja 4 viikon ajan, mutta ilman tilastollista eroa lumelääkkeeseen. IgA-konsentraatio lämmöllä tapetuissa ja elinkykyisissä probioottiryhmissä osoitti merkittävää nousua viikolla 6. IgA:n nousun mekanismia sen jälkeen, kun probioottien antaminen keskeytettiin 2 viikoksi, tulisi kuitenkin tutkia tarkemmin (kuvio 2). Braathen et ai. raportoivat samankaltaisista tuloksista probioottisten kantojen immuunijärjestelmää moduloivasta roolista suuontelossa [24]. Lisäksi probioottisten kantojen on raportoitu lisäävän ulosteen IgA-pitoisuutta merkittävästi emakoilla ja porsailla [25]. Tutkimukset IgA:ta lievittävistä oireista ylempien hengitysteiden infektioissa ovat kuitenkin edelleen riittämättömiä. Probioottisten kantojen CP-9, AP-32 ja ET-66 yksityiskohtaista molekyylimekanismia ylempien hengitysteiden infektioiden estämiseksi ja ehkäisemiseksi voitaisiin tutkia tulevissa tutkimuksissa. Tässä tutkimuksessa elävät kannat CP-9, AP-32 ja ET-66 nostavat IL-10- ja TFG-beeta-tasoa PBMC-soluissa. AP-32 osoitti tehokasta kykyä lisätä IL-10- ja TFG-betaa PBMC-soluissa vertaamalla niitä PHA-positiiviseen kontrolliin (kuvat 3a ja b). Se oletti, että elävät kannat CP-9, AP-32 ja ET-66 saattaisivat indusoida B-soluja erittävän IL-10- ja TFG-beetaa lisäämään syljen IgA-tasoja. Syljen IL-10:n, TFG-beetan ja syljen IgA:n välistä korrelaatiota tulisi kuitenkin testata lisää [26]. Lisäksi on edelleen epäselvää, nostivatko lämmöllä tapetut probiootit IgA:ta indusoimalla IL-10- ja TFG-betaa. In vitro -testi osoitti, että lämmöllä tapettu AP-32 lisäsi interferoni- ja IL-12p70-eritystä ja alensi IL-13-tasoja [27]. Tässä kliinisessä tutkimuksessa probioottisten CP-9-, AP-32- ja ET-66-kantojen sekä lämpötappamien AP-32 ja ET-66 kantoja patogeenisten bakteerien estämiseksi suuontelossa validoitiin edelleen (kuvio 4). Elinkykyisillä probioottisilla imeskelytableteilla oli parempi antipatogeeninen kyky kuin lämmöllä tapetut imeskelytabletit, koska ne erittivät orgaanisia happoja, antimikrobisia peptidejä [28], eksopolysakkarideja (EPS) [29] bakteriosiinit [30] (kuviot 5a ja b). Elinkykyisten probioottikannusten tuottamat toiminnalliset antimikrobiset komponentit tulisi tulevaisuudessa havaita korkean suorituskyvyn nestekromatografialla (HPLC) ja nestekromatografialla (LC) -massaspektrometrialla [31]. On raportoitu, että lämmöllä tapetuilla probiootteilla oli elinkelpoisten probioottien tärkeimmät edut, mutta ilman tiettyjä elinkelpoisten probioottikantojen turvallisuusongelmia [32]. Lämmöllä tapettujen probioottien antimikrobiset komponentit tulisi kuitenkin varmistaa tarkemmin.

Kuva 5 Varmistus probioottisten tablettien kyvystä estää oraalisen patogeenin kasvua in vitro -testillä. Elinkykyisten ja lämmöllä tapettujen probioottitablettien kyky estää oraalisten patogeenien, mukaan lukien Streptococcus mutans, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum ja Aggregatibacter actinomycetemcomitans, eloonjäämisaste validoitiin. Tyhjä ryhmä, vain keskikokoinen; lumeryhmä, tabletit (1 g) ilman probioottisia komponentteja. Testit suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Tiedot esitettiin keskimääräisenä standardipoikkeamana (SD). Kaksisuuntaista t-testiä käytettiin tilastollisten erojen analysointiin. Tilastolliset merkitsevuudet merkittiin *P:llä<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

Johtopäätös

Elinkykyiset probioottitabletit, jotka koostuvat L. salivarius subsp. salicinius AP-32, B. animalis subsp. maitohappo-CP-9 ja L. paracasei ET-66 sekä lämpötapetetut probiootit, mukaan lukien L. salivarius subsp. salicinius AP-32 ja L. paracasei ET-66 käyttivät hyödyllisiä toimintojaan nostamalla Lactobacillus- ja Bifdobacterium-populaatioita, vähentämällä S. mutansia suuontelossa ja lisäämällä syljen IgA-pitoisuutta terveillä osallistujilla. In vitro -testitulokset vahvistivat, että elävät probiootit estivät tehokkaasti suun patogeenejä, mukaan lukien S. mutans, P. gingivalis ja F. nucleatum subsp. polymorfismi ja A. actinomycetemcomitans. Suun ja nenän limakalvon immuniteetti on etulinjan puolustus tunkeutuvia mikro-organismeja vastaan, ja tästä on tullut ratkaiseva kysymys. Siten tämä tutkimus tarjoaa vaihtoehtoisen strategian (probioottisen lisäyksen) suun immuniteetin ja suun terveyden ylläpitämiseksi.

cistanche-lisän edut - kuinka vahvistaa immuunijärjestelmää

Viitteet

1. Takaki H, Ichimiya S, Matsumoto M, Seya T (2018) Limakalvojen immuunivaste nenään liittyvässä imukudoksessa intranasaalisesti adjuvanttien antamisen jälkeen. J Innate Immun 10(5–6):515–521

2. Wu RQ, Zhang DF, Tu E, Chen QM, Chen WJ (2014) Limakalvojen immuunijärjestelmä suuontelossa – T-solujen monimuotoisuuden orkesteri. Int J Oral Sci 6(3):125-132

3. Man WH, de Steenhuijsen Piters WAA, Bogaert D (2017) Hengitysteiden mikrobiota: hengitysteiden terveyden portinvartija. Nat Rev Microbiol 15(5):259-270

4. Wald ER, Guerra N, Byers C (1991) Pienten lasten ylähengitysteiden infektiot: komplikaatioiden kesto ja taajuus. Pediatrics 87(2):129–133

5. Marcotte H, Lavoie MC (1998) Suun mikrobien ekologia ja syljen immunoglobuliinin rooli A. Microbiol Mol Biol Rev 62(1):71-109

6. Weltzin R, Traina-Dorge V, Soike K, Zhang JY, Mack P, Soman G et ai. (1996) Intranasaalinen monoklonaalinen IgA-vasta-aine hengitysteiden synsyyttivirukselle suojaa reesusapinoita ylempien ja alempien hengitysteiden infektiolta. J Infect Dis 174(2):256-261

7. Ruggeri FM, Johansen K, Basile G, Kraehenbuhl JP, Svensson L (1998) Antirotavirus-immunoglobuliini A neutraloi viruksen in vitro transsytoosin jälkeen epiteelisolujen läpi ja suojaa vauvahiiriä ripulilta. J virol 72(4):2708-2714

8. Millet N, Solis NV, Swidergall M (2020) Limakalvon IgA estää kommensaalista Candida albicansin dysbioosia suuontelossa. Front Immunol 11:2448

9. Katz J, Harmon CC, Buckner GP, Richardson GJ, Russell MW, Michalek SM (1993) Suojaavat syljen immunoglobuliini A -vasteet Streptococcus mutans -infektiota vastaan ​​nenänsisäisen immunisoinnin jälkeen S. mutansin antigeenillä I/II kytkettynä koleratoksiinin B-alayksikköön . Infect Immun 61(5):1964–1971

10. Moutsopoulos NM, Konkel JE (2018) Kudosspesifinen immuniteetti suun limakalvoesteessä. Trends Immunol 39(4):276–287

11. Lin CW, Chen YT, Ho HH, Hsieh PS, Kuo YW, Lin JH, Liu CR, Huang YF, Chen CW, Hsu CH, Lin WY, Yang SF (2021) Probioottikantoja sisältävät imeskelytabletit parantavat suun immuunivastetta ja terveyttä . Oral Dis. https://doi.org/10.1111/odi.13854

12. Ericson D, Hamberg K, Bratthall G, Sinkiewicz-Enggren G, Ljunggren L (2013) Syljen IgA-vaste probioottisille bakteereille ja mutans-streptokokeille Lactobacillus reuteria sisältävän purukumin käytön jälkeen. Patog Dis 68(3):82–87

13. Defrance T, Vanbervliet B, Briere F, Durand I, Rousset F, Banchereau J (1992) Interleukiini 10 ja transformoiva kasvutekijä beeta tekevät yhteistyötä indusoidakseen anti-CD40-aktivoituja naiiveja ihmisen B-soluja erittämään immunoglobuliini A:ta. J Exp Med 175(3):671-682

14. Papone V, Verolo C, Zafaroni L, Batlle A, Capo C, Bueno L et al (2015) Parodontaalipatogeenien havaitseminen ja esiintyvyys uruguaylaisessa populaatiossa, jolla on krooninen parodontiitti, käyttäen tavanomaista metodologiaa ja metagenomiikkaa. Odontoestomatologia 17(25):23–32

15. Butera A, Gallo S, Maiorani C, Molino D, Chiesa A, Preda C, Scribante A (2021) Probioottinen vaihtoehto klooriheksidiinille parodontaalihoidossa: kliinisten ja mikrobiologisten parametrien arviointi. Mikro-organismit 9(1):69

16. Wang Y, Li X, Ge T, Xiao Y, Liao Y, Cui Y et al (2016) Probiootit lasten hengitystieinfektioiden ehkäisyyn ja hoitoon: systemaattinen katsaus ja meta-analyysi satunnaistetuista kontrolloiduista tutkimuksista. Medicine 95(31):e4509. https://doi.org/10.1097/ MD.0000000000004509

17. Laufer AS, Metlay JP, Gent JF, Fennie KP, Kong Y, Pettigrew MM (2011) Ylempien hengitysteiden mikrobiyhteisöt ja välikorvatulehdus lapsilla. mBio 2(1):e00245-10. https://doi.org/10. 1128/mBio.{7}}

18. Chen YT, Hsieh PS, Ho HH, Hsieh SH, Kuo YW, Yang SF, Lin CW (2020) Elinkykyisten ja lämmöllä tapettujen probioottisten kantojen antibakteerinen aktiivisuus suun patogeenejä vastaan. Lett Appl Microbiol 70(4):310-317

19. Bonifait L, Chandad F, Grenier D (2009) Probiootit suun terveydelle: myytti vai todellisuus? J Can Dent Assoc 75(8):585–90

20. Hsieh PS, An Y, Tsai YC, Chen YC, Chuang CJ, Zeng CT, King AE (2013) Probioottisten kantojen mahdollisuudet moduloida epiteelisolujen ja immuunisolujen tulehdusvasteita in vitro. New Microbiol 36(2):167-179

21. Elrefaei M, Burke CM, Baker CA, Jones NG, Bousheri S, Bangsberg DR, Cao H (2009) HIV-spesifisten CD8+ T-solujen TGF- ja IL{3}} tuotantoa säätelee CTLA{ {5}} signalointi CD4+ T-soluissa. PloS ONE 4(12):e8194

22. Ranganathan V, Akhila CH (2019) Streptococcus mutans: Onko siitä tullut suullisten ilmentymien päätekijä? J Microbiol Exp 7(4):207–213

23. Almeida CC, Lorena SLS, Pavan CR, Akasaka HMI, Mesquita MA (2012) Lactobacillus casei Shirotan ja Bifidobacterium breve Yakultin probioottiyhdistelmän pitkäaikaisen käytön suotuisat vaikutukset voivat jatkua hoidon keskeyttämisen jälkeen laktoosi-intoleranssipotilailla. Nutr Clin Pract 27(2):247–251

24. Braathen G, Ingildsen V, Twetman S, Ericson D, Jørgensen MR (2017) Lactobacillus reuterin esiintyminen syljessä osuu samaan aikaan korkeamman syljen IgA:n kanssa nuorilla aikuisilla probioottisten imeskelytablettien nauttimisen jälkeen. Benef Microbes 8(1):17–22

25. Scharek L, Guth J, Filter M, Schmidt MFG (2007) Probioottisten bakteerien Enterococcus faecium NCIMB 10415 (SF68) ja Bacillus cereus var. sinulle NCIMB 40112 emakoiden ja niiden porsaiden seerumin IgG:n ja ulosteen IgA:n kehittymisestä. Arch Anim Nutr 61(4):223–234

26. Ebrahimpour-Koujan S, Milajerdi A, Larijani B, Esmaillzadeh A (2020) Probioottien vaikutukset syljen sytokiineihin ja immunoglobuliineihin: järjestelmällinen katsaus ja meta-analyysi kliinisistä kokeista. Sci Rep 10(1):1–11

27. Ou CC, Lin SL, Tsai JJ, Lin MY (2011) Lämmöllä tapetut maitohappobakteerit lisäävät immunomoduloivaa potentiaalia vääristämällä immuunivastetta kohti Th1-polarisaatiota. J Food Sci 76(5):M260–M267. https://doi.org/10.1111/j.{14}}.2011. 02161.x

28. Nair MS, Amalaradjou MA, Venkitanarayanan K (2017) Probioottien antivirulenssiominaisuudet mikrobien patogeneesin torjunnassa. Adv Appl Microbiol 98:1–29

29. Wu MH, Pan TM, Wu YJ, Chang SJ, Chang MS, Hu CY (2010) Eksopolysakkaridiaktiviteetit probioottisesta bifidobakteerista: Immunomodulatoriset vaikutukset (J774A.1-makrofageihin) ja antimikrobisia ominaisuuksia. Int J Food Microbiol 144(1):104-110

30. Barefoot SF, Klaenhammer TR (1983) Lactobacillus acidophilus -bakteerin tuottaman bakteriosiinin, laktasiini B:n, havaitseminen ja aktiivisuus. Appl Environ Microbiol 45(6):1808–1815

31. Kim PI, Sohng JK, Sung C, Joo HS, Kim EM, Yamaguchi T, Kim BG (2010) Staphylococcus hominis MBBL 2–9:n tuottaman antimikrobisen peptidin, hominiinin, karakterisointi ja rakenteen tunnistaminen. Biochem Biophys Res Commun 399(2):133-138

32. Piqué N, Berlanga M, Miñana-Galbis D (2019) Lämmöllä tapettujen (Tyndallisoitujen) probioottien terveyshyödyt: yleiskatsaus. Int J Mol Sei 20(10):2534