Pitkittäinen immuuniprofiili paljastaa hallitsevia epitooppeja, jotka välittävät pitkäaikaista humoraalista immuniteettia COVID-19– toipilaisilla yksilöillä

Tausta: Vaikea akuutti hengitystieoireyhtymä koronavirus 2 (SARS-CoV-2) on erittäin patogeeninen ja tarttuva koronavirus, joka on aiheuttanut maailmanlaajuisen pandemian, jossa on tähän mennessä kuollut 5,2 miljoonaa ihmistä. Pitkäaikaisen immuniteetin serologisia piirteitä koskevat kysymykset, erityisesti hallitsevia epitooppeja, jotka välittävät kestäviä vasta-ainevasteita SARS-CoV-2-infektion jälkeen, ovat vielä selvittämättä.

Tavoite: Pyrimme erittelemään immuunivasteiden kinetiikkaa ja kestoa koronavirustauti 2019 (COVID-19) -potilailla sekä epitooppeja, jotka ovat vastuussa pitkäaikaisesta humoraalisesta immuniteetista SARS-CoV-virusta vastaan-2.

menetelmät: Arvioimme SARS-CoV-2-immuunidynamiikan 180–220 päivää taudin puhkeamisen jälkeen 31 henkilöllä, joilla oli pääasiassa kohtalaisia ​​COVID-19-oireita, ja suoritimme sitten proteominlaajuisen profiloinnin hallitsevista epitoopeista, jotka olivat vastuussa jatkuvat humoraaliset immuunivasteet.

Tulokset: Pitkittäinen analyysi paljasti pitkäaikaisia ​​SARS-CoV-2-piikkiproteiinispesifisiä vasta-aineita ja neutraloivia vasta-aineita COVID-19-potilailla sekä sytokiinituotannon aktivoitumista SARS-CoV-2-infektion varhaisessa vaiheessa. Erittäin reaktiivisten epitooppien, jotka kykenivät välittämään pitkäaikaisia ​​vasta-ainevasteita, osoitettiin sijainneen piikki- ja ORF1ab-proteiineissa. SARS-CoV-2-piikkiproteiinin avainepitoopit kartoitettiin S1-alayksikön ja S2-alayksikön N-terminaaliseen domeeniin, ja ihmisen endeemisten koronavirusten välillä oli vaihteleva sekvenssihomologia ja korkea sekvenssi-identtisyys varhaisten SARS-alayksiköiden välillä. CoV-2 (Wuhan-Hu- 1) ja nykyiset kiertävät muunnelmat.

cistanche-lisän edut - kuinka vahvistaa immuunijärjestelmää

Johtopäätös: SARS-CoV-2-infektio indusoi jatkuvaa humoraalista immuniteettia COVID-19-toipuvilla yksilöillä kohdentamalla dominoivia epitooppeja, jotka sijaitsevat piikin kohdalla, ja ORF1ab-proteiineja, jotka välittävät pitkäaikaisia ​​immuunivasteita. Löytömme tarjoavat tien auttamaan järkevää rokotteiden suunnittelua ja diagnostista kehitystä. (J Allergy Clin Immunol 2022;149:1225-41.)

Avainsanat:

SARS-CoV-2, COVID-19, pitkäaikainen immuunivaste, humoraalinen immuniteetti, proteominlaajuinen peptidi-mikrosiru, hallitseva epitooppi

Vaikea akuutti hengitystieoireyhtymä koronavirus 2 (SARS-CoV- 2), meneillään olevan koronavirustauti 2019 (COVID-19) pandemian aiheuttaja, kuuluu Betacoronavirus-sukuun, johon kuuluu kaksi muuta tunnettua erittäin patogeenistä ihmistä. koronavirukset: vakava akuutti hengitystieoireyhtymä (SARS) ja Lähi-idän hengitystieoireyhtymä (MERS) -koronavirukset.1 Ensimmäisen rekisteröidyn tapauksen alkamisen jälkeen joulukuun 2019 lopulla SARS-CoV-2 -infektio on johtanut yli 263 miljoonaan vahvistettuja tapauksia ja 5,2 miljoonaa kuolemantapausta maailmanlaajuisesti marraskuussa 2021, ja niitä on esiintynyt 220 maassa ja alueella viidellä mantereella.2 Infektion jälkeen kliiniset oireet vaihtelevat laajasti, mukaan lukien oireettomat infektiot, lievät tai kohtalaiset oireet tai jopa hengenvaarallinen vaikea keuhkokuume.3 Useiden erityyppisten rokotusmenetelmien saatavuuden vuoksi monet maat kamppailevat edelleen uusien infektioaaltojen hillitsemisessä, ja ilmaantuu virusmuunnelmia, joilla näyttää olevan lisääntynyt tarttuvuus ja vastustuskyky antiviraalisille immuunivasteille. Neutraloivien vasta-aineiden välittämällä tehokkaalla humoraalisella immuunivasteella tulisi olla voimakas ja välttämätön adaptiivinen immuniteetti infektion estämiseksi ja viruspatogeenien eliminoimiseksi. SARS-CoV{20}}-infektion jälkeen infektoituneiden henkilöiden keskuudessa havaittiin korkea serokonversio (yli 90 %) 7–14 päivää taudin alkamisen jälkeen.4-6 Antigeenispesifisen IgA:n, IgG:n, ja SARS-CoV-2 piikkiproteiinin (S) ja nukleokapsidiproteiinin (N) tunnistava IgM oli havaittavissa taudin akuutin vaiheen ja toipumisen varhaisen vaiheen aikana.4,5,7 Neutraloivien vasta-aineiden suuruus näytti liittyy ikään, oireisiin infektioihin ja taudin vakavuuteen. Iäkkäät potilaat ja henkilöt, joilla on vakavia COVID-19-oireita, kehittävät yleensä korkeampia tasoja neutraloivia vasta-aineita.4,8-10 Useat vasta-ainevasteiden pitkäkestoisuutta koskevat tutkimukset ovat paljastaneet, että huolimatta seerumin/plasman reaktiivisuuden heikkenemisestä viruksen suhteen antigeenit ja alenevat neutraloivien vasta-aineiden tiitterit ajan myötä joissakin oireellisissa COVID-19-tapauksissa, kokonaispitkän aikavälin humoraalinen immuniteetin jatkuva taso havaittiin jopa 8–12 kuukauden ajan tartunnan jälkeen COVID-19-toipuvilla yksilöillä .10-13 Lisäksi SARS-CoV-2-antigeenispesifisten muisti-B-solujen määrä pysyi vakaana vähintään 6–12 kuukautta,12,13, samalla kun ekspressoivien B-solukloonien valinta ja kertyminen jatkui. neutraloivia vasta-aineita,12,14 osoittavat jatkuvan humoraalisen immuniteetin säilymisen SARSCoV{49}}-infektion jälkeen.

cistanche-lisäaine hyödyttää - lisää vastustuskykyä

Neutraloivilla vasta-aineilla on perustavanlaatuinen rooli isännän puolustuksessa virusinfektioita vastaan. Sarja erittäin tehokkaita SARS-CoV-2 monoklonaalisia vasta-aineita on tunnistettu,15-17 ensisijaisesti epitooppeihin, jotka sijaitsevat S-proteiinin reseptoria sitovassa domeenissa, joka muodostuu virionin pinnalla trimeereiksi ja helpottaa viruksen sisäänpääsyä. ja fuusio kiinnittämällä angiotensiinia konvertoivan entsyymin 2-reseptorin.18 Muut S-proteiinin alueet, mukaan lukien S1-alayksikön N-terminaalinen domeeni (NTD) ja S2-alayksikkö, sisältävät myös immunogeenisiä epitooppeja, jotka pystyvät indusoimaan neutraloivia vasta-aineita.16 ,19,20 Neutraloinnin lisäksi SARS-CoV-2-vasta-aineet voivat tarjota suojan in vivo Fc-välitteisten efektoritoimintojen, kuten luonnollisten tappajasolujen laukaiseman vasta-aineriippuvaisen fagosytoosin ja monosyyttien tai makrofagien aiheuttaman vasta-aineriippuvaisen sytotoksisuuden kautta. 21,22 Virusinfektioiden torjunnan lisäksi luonnollisen infektion tai rokotuksen tuottamat vasta-aineet voivat helpottaa viruksen patogeneesiä joko lisääntyneen tulehduksen aktivoitumisen tai lisääntyneen viruksen tarttuvuuden kautta antigeenin/vasta-aineen immuunikompleksin muodostumisen tai Fc-riippuvaisten toimintojen kautta,23-25 vaikka pahentunutta virusinfektiota ei ole havaittu SARS-CoV-2:n yhteydessä in vivo. Nämä vasta-ainevasteiden erilaiset roolit edellyttävät SARSCoV-2-epitooppien systemaattista karakterisointia sekä neutraloiviin tai ei-neutralisoiviin epitooppeihin kohdistuvien pitkäkestoisten vasta-aineiden ominaisuuksia. Huolimatta viimeaikaisesta edistymisestä vasta-ainevasteiden kinetiikassa ja kestossa SARS-CoV{27}}-infektion jälkeen, pitkittäisanalyysi merkittävistä epitoopeista, jotka ylläpitävät pitkäaikaista humoraalista immuunivastetta, on edelleen rajallinen. Aiemmat tutkimukset ovat profiloineet vasta-ainevasteen epitooppeja COVID-19-tartunnan saaneilla henkilöillä pääasiassa ELISA-pohjaisilla määrityksillä,26,27-faagi- tai bakteerinäyttöön perustuvilla lähestymistavoilla28-31 ja mikrosirupohjaisilla tekniikoilla.30,{{ 38}} Useita SARS-CoV-2 S-proteiinin immunodominantteja epitooppeja on tunnistettu; useimmin havaitut alueet kartoitettiin S2-alayksikön fuusiopeptidin (FP) lähelle tai kattamaan sen, toiset heptad-toistot S2-alayksikössä ja S1-alayksikön C-terminaalisen domeenin sisällä.26,28-30, 32,33 Lisäksi serologinen seulonta paljasti myös epitooppeja, jotka sijaitsevat muissa SARS-CoV{50}}-proteomin proteomissa, mukaan lukien N-proteiini, kalvoproteiini (M) ja ORF1ab, ORF3a ja ORF7a.{54}}, 34,35 Vaikka aiemmat tutkimukset ovat antaneet tärkeitä tietoja antigeenisistä epitoopeista, nämä tutkimukset ovat suurelta osin keskittyneet COVID{57}}-potilaiden epitooppiprofilointiin varhaisessa toipilasvaiheessa. Kestäviä SARS-CoV{59}}-spesifisiä vasta-ainevasteita välittävät tarkat epitoopit sekä epitooppitunnistuksen dynamiikka ovat vielä selvittämättä. Suoritimme kattavan pitkittäisanalyysin saadaksemme syvällisemmän ymmärryksen humoraalisten immuunivasteiden kinetiikasta ja kestävyydestä COVID{60}}-potilailla, erityisesti epitooppeilla, jotka ovat vastuussa pitkäaikaisesta immuniteetista SARS-CoV-virusta vastaan{63}}. Immuuniprofilointi 31 COVID{65}}-potilaalla 180–220 päivää oireiden alkamisen jälkeen. Antigeeniä sitovien ja neutraloivien vasta-aineiden sekä seerumin sytokiinitasojen arvioinnin perusteella tunnistimme lisäksi joukon epitooppeja, jotka sijaitsevat SARSCoV-2 ORF1ab-, S- ja N-proteiineissa, jotka välittävät pysyviä humoraalisia immuunivasteita peptidin avulla. mikrosiru, joka käsittää SARS-CoV-2:n täydellisen proteomin. Tuloksemme valaisevat pitkäaikaisen immuniteetin piirteitä virusinfektion voittamiseksi ja auttavat kehittämään järkevää rokotesuunnittelua ja kehittämään parempia serologisia diagnostisia työkaluja.

MENETELMÄT

Tutkimukseen osallistujat ja näytteenotto

SARS-CoV-2-ohjattujen immuunivasteiden kinetiikkaa pitkittäin arvioimiseksi kerättiin 101 seeruminäytettä 31 SARS-CoV-2-tartunnan saaneelta henkilöltä, jotka vietiin Nantongin kolmanteen sairaalaan, joka kuuluu Nantongin yliopistoon (Nantong). , Kiina) tammi-maaliskuussa 2020. Kaikilla potilailla diagnosoitiin vahvistettu SARS-CoV-2-infektio käänteistranskription kvantitatiivisella PCR-testillä; sairauden vaikeusaste määriteltiin Kiinan kansantasavallan kansallisen terveyskomission julkaiseman uuden koronaviruskeuhkokuumeen diagnosointi- ja hoitoprotokollan version 7 mukaan lievästä keskivaikeaan (ei vaikea) tai vakavaksi COVID--19. pitkittäissuunnassa 4–8 kuukauden ajan akuutista infektiosta toipumisen jälkeen. Verinäytteet otettiin pitkittäissuunnassa 4–219 päivää oireiden alkamisen jälkeen 20 potilaalta 31 tutkimukseen osallistuneen joukosta (mediaani 4,5 näytettä henkilöä kohden, vaihteluväli 2–8), kun taas kullekin potilaalle suoritettiin näytteenotto yksittäisestä pisteestä. muut 11 henkilöä, jotka olivat myöhäisessä toipilasvaiheessa (päivät 122-214 taudin alkamisen jälkeen). Vastaavasti seerumit (n 5 20) terveiltä iältään ja sukupuoliltaan vastaavilta terveiltä luovuttajilta sisällytettiin myös kontrolliryhmään. Yhdelläkään tutkimukseen osallistuneella ei ollut dokumentoitua SARS- tai MERS-infektiota.

Tutkimuksen hyväksyi Nantongin yliopistoon kuuluvan Nantong Third Hospitalin eettinen komitea (hyväksyntä EL2020006). Jokaiselta tutkimukseen osallistuneelta saatiin kirjallinen tietoinen suostumus. Seerumi erotettiin perifeerisestä verestä seerumigeeliputkissa sentrifugoimalla, muodostettiin eriksi ja säilytettiin 2808 °C:ssa ennen käyttöä.

Solulinjat

HEK293T- ja Huh7-soluja viljeltiin Dulbeccolla modifioidussa Eagle-elatusaineessa (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass), johon oli lisätty 10 % lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (Gibco), 100 U/ml penisilliiniä (Gibco) ja 100 mg/ml. ml streptomysiiniä (Gibco) 378 °C:ssa 5 % C02:lla.

cistanche-edut miehille - vahvistavat immuunijärjestelmää

Napsauta tästä nähdäksesi Cistanche Enhance Immunity -tuotteet

【Kysy lisää】 Sähköposti:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

IgG-vasta-aineen havaitseminen ELISA:lla

Antigeeniä sitovien IgG-vasta-aineiden tasot ihmisen seeruminäytteissä määritettiin ELISA:lla. 96-kuoppaiset ELISA-levyt (Corning, Corning, NY) esipäällystettiin SARS-CoV-2-nukleokapsidiproteiinilla (Sino Biological, Peking, Kiina, luettelonumero 40588-V08B , 50 ng per kuoppa) tai piikkiproteiini (Sino Biological, 40589-V08B1, 100 ng per kuoppa), SARS-CoV piikkiproteiini (Sino Biological, 40634-V08B, 100 ng per kuoppa) kuoppa) tai MERS-CoV-piikkiproteiini (Sino Biological, 40069-V08B, 50 ng per kuoppa) yön yli 48 °C:ssa. 5 % rasvattomalla maidolla fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), joka sisältää 0,05 % Tween 20:tä (PBS-T) salpauksen jälkeen 2 tunnin ajan 378 °C:ssa, 3-kertaa sarjalaimennetut lämpöinaktivoidut seeruminäytteet aloituslaimennuksella 1 :200 lisättiin esipäällystetyille levyille 2 tunnin ajaksi 378 °C:ssa. Kuopat pestiin 3 kertaa kunkin vaiheen välillä PBS-T:llä. Reaktiot visualisoitiin inkuboimalla piparjuuriperoksidaasilla konjugoidulla anti-ihmis-IgG-vasta-aineella (Abcam, Cambridge, Yhdistynyt kuningaskunta, 1:100, 000 laimennus) 1 tunnin ajan 378 °C:ssa, minkä jälkeen lisättiin tetrametyylibentsidiinisubstraattia (Life Technologies, Carlsba). , Kalifornia). Kehitysreaktiot pysäytettiin 2 mol H2S04:lla ja absorbanssi mitattiin 450 nm:ssä korjausaallonpituudella 630 nm (OD450 2 OD630). Sitoutuvien vasta-aineiden päätepistetiitterin laskemiseksi tiedot linearisoitiin piirtämällä seerumilaimennosten log10 verrattuna korjattuihin optisen tiheyden (OD) arvoihin (OD450 2 OD630) käyrän lineaarisen osan sisällä (y 5 kx 1 b). , r2 > 0,99) ja seerumilaimennus, jolla säädetyn OD-arvon (OD450 2 OD630) 5 0 laskettiin antamaan päätepistetiitteri. Antigeenispesifiset IgG-vasta-aineet peptidillä immunisoiduissa hiirissä arvioitiin peptidipohjaisella ELISA:lla. Lyhyesti sanottuna 96-kuoppaiset ELISA-levyt (Thermo Fisher Scientific) päällystettiin 1 mg:lla kuoppaa kohti 4 sekoitettua peptidiä (peptidit 318, 356, 510 ja 530) karbonaattipuskurissa (pH 9,6) yön yli 48 °C:ssa. Kun oli blokattu PBS-T:llä, joka sisälsi 5 % rasvatonta maitoa, kuoppia inkuboitiin 1:40 laimennettujen seeruminäytteiden kanssa 1 tunnin ajan 378 °C:ssa. Tämän jälkeen levyt pestiin ja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasilla konjugoidun anti-hiiri-IgG-vasta-aineen (Abcam) kanssa. Reaktiot visualisoitiin tetrametyylibentsidiinisubstraatilla (Life Technologies), ja absorbanssi 450 nm:ssä mitattiin reaktioiden pysäyttämisen jälkeen 2 mol H2S04:lla.

Pseudovirustuotanto ja titraus

Kodonioptimoitu geeni, joka koodaa SARS-CoV-2 (NC_045512) tai SARS-CoV (AY291315.1) piikkiproteiinia, jossa on C-terminaalinen 19 aa deleetio, tai MERS-CoV (JX{10) }}) piikkiproteiini, joka oli typistetty C-terminaalisella 16 aa:lla, kloonattiin vastaavasti pcDNA3.1(1)-vektoriin. 100 mm:n kudosviljelymaljassa viljellyt HEK 293T-solut kotransfektoitiin 1 mg:lla piikkiproteiinia koodaavaa plasmidia ja 15 mg:lla env-puutteellista, lusiferaasia ekspressoivaa runkorakennetta (pNL4-3.luc.RE) käyttämällä polyetyleeni-imiiniä (Polysciences). , Warrington, Pa). Pseudovirusta sisältävät soluviljelysupernatantit kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen, suodatettiin ja säilytettiin 2808 °C:ssa erissä. Virustiitterien (50 % kudosviljelmän tarttuva annos) määrittämiseksi pseudovirusten sarjalaimennoksia lisättiin 1 3 104 Huh7-soluihin, jotka oli esisiirrostettu 96-kuoppalevyille. 12 tunnin infektion jälkeen virusta sisältävä väliaine korvattiin tuoreella kasvualustalla ja soluja viljeltiin vielä 48 tuntia. Solujen hajoamisen lusiferaasiaktiivisuus mitattiin Steady-Glo Luciferase Assay Systemillä (Promega, Madison, Wisc) käyttämällä mikrolevylukijaa (BioTek Instruments, Winooski, Vt), ja huomioon otettiin kaivoja, jotka tuottivat suhteellisia luminesenssiyksiköitä, jotka olivat korkeampia kuin 10 kertaa keskimääräinen tausta-arvo. positiivinen.

Pseudovirus neutralisaatiomääritys

Lämmöllä inaktivoidut seeruminäytteet COVID-19-potilailta tai terveiltä luovuttajilta laimennettiin 2-kertaisesti ja niitä inkuboitiin 200 pseudoviruksen kanssa 50 % kudosviljelmän tarttuvalla annoksella 1 tunnin ajan 378 °C:ssa. Seokset levitettiin sitten infektoimaan Huh7-soluja, jotka oli esisiirrostettu 96-kuoppalevyille kahtena kappaleena. Kuopat täytettiin tuoreella kasvualustalla 12 tunnin kuluttua infektiosta, ja solujen lusiferaasiaktiivisuus määritettiin 48 tuntia myöhemmin. 50 % neutralointitiitterit (NT50) SARS-CoV-2- ja SARS-CoV-pseudoviruksia vastaan ​​laskettiin epälineaarisella regressiolla käyttämällä GraphPad Prism 8.0 -ohjelmistoa (GraphPad Software, La Jolla, Kalifornia); ja MERS-CoV-pseudoviruksen NT50 määritettiin seerumin korkeimmaksi laimennokseksi, joka johti 50 %:n laskuun suhteellisissa luminesenssiyksiköissä verrattuna viruskontrolliin ilman seeruminäytteitä.

Proteiinimikroarray-pohjainen sytokiinien havaitseminen

Useiden sytokiinien (IL-1a, IL-1b, IL- 4, IL-6, IL-8, IL-10 kvantitatiivinen mittaus IL-13, MCP-1, IFN-g ja TNF-a) seeruminäytteissä suoritettiin käyttämällä multipleksistä ELISA-järjestelmää (RayBiotech, Peachtree Corners, Ga) valmistajan protokollan mukaisesti. Lyhyesti sanottuna sytokiinispesifisillä vasta-aineilla esipäällystetyt lasilevyt estettiin näytelaimentimella huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen lisättiin 60 ml 2--kertaisesti laimennettuja seeruminäytteitä tai sytokiinin standardilaimennoksia. Yön yli 48 °C:ssa inkuboinnin jälkeen objektilasit pestiin 5 kertaa ja värjättiin 80 ml:lla biotinyloitua detektiovasta-aineseosta ja sitten Cy3-ekvivalenttia väriainekonjugoitua streptavidiinia huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan. Fluoresenssin intensiteetti havaittiin InnoScan 300 -mikroarray-skannerilla (Innopsys, Chicago, Ill) aallonpituudella 532 nm, ja tiedot analysoitiin Q-Analyzer-ohjelmistolla (RayBiotech).

Peptidisynteesi ja konjugaatio naudan seerumialbumiinin kanssa

GL Biochem (Shanghai, Kiina) syntetisoi yhteensä 515 peptidiä (pituus 15 aminohappoa, päällekkäin 11 aminohapolla), jotka peittävät SARS-CoV-2 -proteomin SARS-CoV:n aminohapposekvenssin perusteella. -2 kanta Wuhan-Hu-1. Peptidit konjugoitiin naudan seerumialbumiiniin (BSA) käyttämällä silloittajaa Sulfo-SMCC (Thermo Fisher Scientific) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti sanottuna Sulfo-SMCC lisättiin 30--kertaisena mooliylimääränä BSA:han, mitä seurasi dialyysi PBS:ksi. Sen jälkeen kysteiiniä sisältävä peptidi lisättiin suhteessa 1:1 (paino/paino) inkuboitiin 2 tuntia ja dialysoitiin edelleen PBS:llä vapaiden peptidien poistamiseksi.

Peptidimikrosirujen valmistus

Peptidimikrosirujen, SARS-CoV-2-peptidien sekä negatiivisen kontrollin (BSA) ja positiivisten kontrollien (anti-ihmisen IgG- ja anti-ihmisen IgM-vasta-aineet; Sigma-Aldrich, St Louis, Mo) valmistamiseksi , immobilisoitiin PATH-substraattilevyille (Grace Bio-Labs, Bend, Ore) kolmena kappaleena käyttämällä Super Marathon -tulostinta (Arrayjet, Edinburgh, Skotlanti, Yhdistynyt kuningaskunta). Sitten peptidimikrosirut säilöttiin 2808 °C:ssa jatkokäyttöä varten.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Microarray-pohjainen epitooppikartoitus

Microarray-pohjainen seerumianalyysi suoritettiin kuten Li et al,37 pienin muutoksin. Yksittäisten kammioiden luomiseksi identtisille aliryhmille 14-kammion kumitiiviste asennettiin jokaiseen peptidi-mikrosirulevyyn. Objektilasit lämmitettiin huoneenlämpötilaan ennen käyttöä, sitten blokattiin 3 % BSA:lla PBS-T:ssä 3 tunnin ajan. Seeruminäytteet COVID-19-potilailta tai yhdistetyt seerumit 20 terveeltä luovuttajalta (verrokkiryhmä) laimennettiin suhteeseen 1:200 PBS-T:llä useimmille näytteille ja inkuboitiin sitten kunkin alaryhmän kanssa 2 tuntia klo. 48C. Ryhmät pestiin PBS-T:llä ja inkuboitiin Cy3-konjugoidulla vuohen anti-ihmis-IgG:llä ja Alexa Fluor 647-konjugoidulla aasin anti-ihmis-IgM:llä (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa) laimennoksessa 1:1000 kukin 1 tunti huoneenlämmössä. Inkuboinnin jälkeen sarjat pestiin PBS-T:llä ja kuivattiin sitten kokonaan sentrifugoimalla huoneenlämpötilassa. Myöhemmin taulukot skannattiin käyttämällä LuxScan 10K-A -mikrosiruskanneria (CapitalBio, Peking, Kiina), ja FL-fluoresenssin intensiteettitiedot hankittiin ja analysoitiin GenePix Pro 6.0 -ohjelmistolla (Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornia).

KUVA 1. Vasta-ainevasteiden pituussuuntainen dynamiikka COVID-19-potilailla. Kaavio tutkimussuunnitelmasta. Yhteensä 31 SARS-CoV-2-tartunnan saanutta henkilöä ja 20 tervettä luovuttajaa otettiin mukaan tutkimukseen. Seeruminäytteiden keräys suoritettiin pitkittäissuunnassa useissa aikapisteissä 20 potilaalle 31 SARS-CoV-2-tartunnan saaneesta henkilöstä, kun taas näytteenotto suoritettiin yhdessä ajankohtana muilla 11 potilaalla. Osallistujien lukumäärä ja eri määrityksissä käytetyt seeruminäytteet on lueteltu. B ja C. Yhteensä 101 seeruminäytettä 31 COVID-19-potilaalta testattiin ELISA:lla SARS-CoV-2 N-proteiinin (B) ja S-proteiinia (C) sitovien IgG-vasta-aineiden varalta eri ajankohtina. oireiden alkamisen jälkeen (päivää 1-30, n 5 37; päivää 31-61, n 5 18; päivää 100-150, n 5 21; päivää {{21) }}, n 5 25). Seeruminäytteet 20 terveeltä luovuttajalta otettiin mukaan kontrolliryhmään. D, NT50 SARS-CoV-2 pseudoviruksia vastaan ​​ajan kuluessa laskettiin epälineaarisella regressiolla. E, Seerumin neutraloivan aktiivisuuden jakautuminen COVID-19-potilailla ilmoitettuina ajankohtina taudin puhkeamisen jälkeen. Näytteet, joiden NT50-tiitteri oli alle 20, määriteltiin neutraloimattomiksi

Peptidimikrosirutietojen analyysi

IgG- ja IgM-tiedot analysoitiin vastaavasti. Kunkin täplän signaalin intensiteetti määriteltiin etualalla miinus tausta, ja kunkin peptidin kolmoispisteistä laskettiin keskiarvo. COVID{0}}-näytteiden positiivisen peptidivasteen raja-arvoksi määritettiin kaksi kertaa terveen luovuttajan kontrollin signaalin intensiteetti. Peptidit, joiden positiivisuusaste oli yli 80 % testatuista näytteistä kaikilla kolmella näytteenottohetkellä (päivät 10-60, 100-150 ja 180-220 taudin puhkeamisen jälkeen), määriteltiin hallitseviksi ja pysyviksi peptideiksi ja peptideiksi, joilla oli yli 60 %:n positiivisen vasteen esiintymistiheys kaikilla 3-hetkillä katsottiin hallitsevaksi ja pysyväksi. Kunkin peptidin keskimääräinen signaalin intensiteetti 3 näytteenottoaikapisteryhmässä laskettiin; valittiin myös peptidejä, joilla oli korkea signaaliintensiteetti (yli kaikkien testattujen näytteiden signaalin intensiteettien keskiarvo 1 SD). Tietojen käsittely ja analysointi suoritettiin R v3.6.3 -ohjelmistolla (https://www.r-project.org/), ja merkittävät signaalin intensiteetin muutokset eri näytteenottoaikapisteryhmien välillä arvioitiin Limman perusteella. Erot, joiden P < 0,05, katsottiin tilastollisesti merkitseviksi.

Hiiren immunisointi

6 - 8 viikon ikäiset naaraspuoliset BALB/c-hiiret ostettiin Beijing Vitalstar Biotechnologylta (Peking, Kiina). Kaikki hiiret pidettiin erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa tiloissa, ja Tianjinin lääketieteellisen yliopiston (Tianjin, Kiina) Institutional Animal Care and Use Committee hyväksyi eläintutkimuksen. Immunisaatiota varten hiiren ryhmille (n 5 5) injektoitiin lihakseen 25 mg kutakin peptidin annosta kohti (peptidit 318, 356, 510 ja 530 vastaavasti) sekoitettuna 50 mg:aan alunaa (InvivoGen, San Diego, Kalifornia) ja 10 mg CpG-adjuvantteja ja tehostettiin kahdesti 50 mg:lla per annos peptidejä adjuvanttien läsnä ollessa 2-viikon välein. Rokotus pelkästään adjuvanteilla toimi negatiivisena kontrollina. Seerumit kerättiin immunisoiduista hiiristä päivänä 10 tai päivänä 14 toisen ja kolmannen immunisaation jälkeen.

Tilastolliset ja rakenneanalyysit

Kaikki kaaviot piirrettiin GraphPad Prismilla. Tilastolliset vertailut ryhmien välillä kuvioissa 1, 2 ja 4 suoritettiin 1-tavalla ANOVA Tukeyn moninkertaisella vertailulla. Kuvassa 1 esitetyt korrelaatiot kuvassa E9 ja kuvassa E10 online-varastossa, joka on saatavilla osoitteessa www.jacionline.org, määritettiin Pearsonin korrelaatioanalyysillä. Erot, joiden P < 0,05, katsottiin tilastollisesti merkitseviksi. SARS-CoV-2-piikkiproteiinin rakenteet (Protein Data Bank [PDB; http://www.wwpdb.org/] ID: 6VXX ja PDB ID: 6ZGI) ja SARS-CoV{{:n dimerisaatiodomeeni 13}} nukleokapsidiproteiinia (PDB ID: 6YUN) käytettiin piikkiproteiinin ja nukleokapsidiproteiinin dimerisaatiodomeenin identifioitujen epitooppien rakenteellisten yksityiskohtien erottamiseen. Sekvenssikohdistus ja homologia-analyysi erilaisten ihmisen koronavirusten välillä suoritettiin Clustal W -algoritmilla MEGA v10.1.6 -ohjelmistossa.

TULOKSET

SARS-CoV-2-infektio indusoi jatkuvaa antigeenispesifistä sitoutumista ja neutraloivia vasta-aineita

Vasta-ainevasteiden pitkittäisen arvioimiseksi SARS-CoV-2-infektion jälkeen kerättiin 101 seeruminäytettä 31 yksilöltä, joilla oli PCR-varmistettu SARS-CoV-2-infektio (kuva 1, A). Tutkimukseen osallistui 26 potilasta, joilla oli kohtalainen COVID-19, 1 oireeton, 2 lievä sairaus ja 2 vaikeita oireita (katso taulukko E1 online-varastossa, joka on saatavilla osoitteessa www.jacionline.org). Tähän tutkimukseen otetut potilaat vaihtelivat 17–66-vuotiaista (mediaani-ikä 45 vuotta), ja miehiä (51,6 %) ja naisia ​​(48,4 %) oli suunnilleen yhtä paljon. Yleisimmät tutkimukseen osallistuneiden oireet olivat kuume (83,9 %), yskä (67,7 %), lihaskipu (22,6 %) ja vilunväristykset (22,6 %), ja sairauden keston mediaani oli 15 päivää. Yhteensä 90 seeruminäytettä 20 COVID-19-potilaalta kerättiin sairaalahoidon ja kotiutuksen aikana toipumisen jälkeen useaan ajankohtaan asti 219 päivään oireiden alkamisen jälkeen (kuva 1, A ja katso taulukko E2 online-varastossa). Näytteenotto muilta 11 osallistujalta suoritettiin yhdessä ajankohtana myöhäisen toipumisen aikana (päivät 122-214 oireiden alkamisen jälkeen). Lisäksi näytteet 20 terveeltä luovuttajalta, joiden ikä- ja sukupuolijakauma oli sama, sisällytettiin kontrolliryhmään (taulukko E1). Seeruminäytteiden antigeenispesifiset IgG-vasta-aineet määritettiin ELISA:lla, joka oli esipäällystetty SARS-CoV-2 N- tai S-proteiinilla. Terveisiin luovuttajiin verrattuna COVID-19-potilaille kehittyi sekä anti-N- että anti-S IgG-vasta-aineita 30 päivän kuluessa oireiden alkamisesta. Päätepistetiitterin geometrinen keskiarvo oli 4,10 (log10 anti-N IgG) ja 4.20 (log10 anti-S IgG) (kuvat 1, B ja C; ja katso taulukko E3 online-varastossa osoitteessa www. jacionline.org; kuva E1, A ja B; ja kuva E2) aiempien havaintojen kanssa, että serokonversio esiintyy 1-2 viikkoa SARS-CoV-2-infektion jälkeen.5,38 Myöhemmin antigeeniä sitovien vasta-aineiden tiitterit laskivat vaihtelevassa määrin ajan myötä. Nopeasti ja dramaattisesti laskevia anti-N IgG-vasta-ainetasoja havaittiin COVID-19-potilailla, kun taas korkeammat anti-S IgG-tiitterit säilyivät 180–220 päivää taudin alkamisen jälkeen verrattuna terveisiin luovuttajiin (kuva 1, B). ja C). Korrelaatioanalyysi paljasti merkittävän korrelaation log10 anti-N IgG-tiitterien ja anti-S IgG-tiitterien välillä (r 5 0,50 ja P < 0,001; kuvio 1, F). Sitoutuvien vasta-aineiden kvantifioinnin lisäksi funktionaalisten neutraloivien vasta-aineiden dynamiikka yksilöillä, joilla on COVID{80}}, määritettiin edelleen käyttämällä pseudotyyppistä SARS-CoV-2. Yli 95 %:lla potilaiden seeruminäytteistä (35/37), jotka otettiin 4–30 päivää oireiden alkamisen jälkeen, oli voimakasta neutraloivaa aktiivisuutta SARS-CoV-virusta vastaan-2, ja suurella osalla näytteistä oli kohtalaista (NT50 80-320) ) voimakkaaseen (NT50 > 320) neutraloivaan aktiivisuuteen (kuvio 1, D ja E). Huomionarvoista on, että 2 näytettä, joilla ei ollut neutraloivia tiittereitä tai ne olivat alhaiset (NT50 seerumin minimilaimennuksella 1:20), kerättiin varhain virusinfektion jälkeen (päivänä 4 ja päivänä 11 oireiden alkamisen jälkeen) ennen tehokkaiden neutraloivien vasta-aineiden herättämistä (kuva 1). 1, D ja kuva E1, C). Huolimatta COVID-19-potilaiden SARS-CoV{103}} neutraloivien vasta-aineiden pitoisuuksien vähenemisestä ajan myötä, useimmat potilaiden seeruminäytteet (24/25), jotka otettiin 180–220 päivän aikana oireiden alkamisen jälkeen, säilyivät positiivisena neutraloinnissa SARS- CoV-2, jossa NT50-tiitterien geometrinen keskiarvo on 28-kertainen (kuva 1, D ja E; taulukko E3; kuva E3). Kuten odotettiin, anti-N IgG-vasta-aineisiin verrattuna vahvempi korrelaatio SARS-CoV-2 S:tä sitovien IgG-tiitterien ja neutraloivien vasta-ainetiitterien välillä tunnistettiin (r 5 0.61 ja P < .001; kuva 1 , G ja H), on yhdenmukainen havaintojen kanssa, joiden mukaan SARS-CoV-2 S-proteiini on neutraloivien vasta-aineiden pääkohde. SARS-CoV{127}}:n S-proteiinilla on suuri sekvenssin samankaltaisuus erittäin virulentin SARS-CoV:n kanssa (76 % sekvenssi-identtisyys) ja sillä on alhainen sekvenssihomologia MERS-CoV:n kanssa (34 % sekvenssi-identtisyys). Koronavirusten serologista ristireaktiivisuutta on raportoitu; 8, 10, 28, 29 tiedot SARS-CoV-vasta-aineiden ristiinreaktiivisuudesta muita koronaviruksia vastaan ​​ovat kuitenkin edelleen rajallisia. Määritimme ristiin sitoutuvia ja ristiin neutraloivia vasta-aineita SARS-CoV{144}}-tartunnan saaneiden henkilöiden pitkittäisseerumissa. Tulokset osoittivat, että yli 80 % potilaiden seeruminäytteistä sitoutui SARS-CoV:n ja/tai MERS-CoV:n S-proteiineihin kuukauden sisällä oireiden alkamisesta, ja 27 %:lla näytteistä oli kaksinkertainen ristireaktiivisuus (kuva 1, I). Reaktiivisuus SARS-CoV S -proteiinille oli suurempi (73 %) kuin MERS-CoV (35 %) varhaisessa vaiheessa (1-30 päivää taudin alkamisen jälkeen) testatuissa näytteissä (Kuva 1, I). Kaksinkertaisesti ristiinsitoutuvien ja SARS-CoV-ristisitoutumien vasta-aineiden määrä väheni asteittain ajan myötä, ja vain 8 % kaksinkertaisesti ristisitoutuvista ja 20 % SARS-CoV yksittäisistä ristisitoutuvista näytteistä 180-220 päivää taudin alkamisen jälkeen (Kuva 1 , I; online-varastossa, joka on saatavilla osoitteesta www.jacionline.org, katso kuva E4, A, kuva E5, A ja kuva E6 tämän artikkelin online-varastossa osoitteessa www.jacionline.org). Mielenkiintoista on, että MERS-CoV S -proteiinin kanssa reaktiivisten vasta-aineiden positiivisuus pysyi suhteellisen vakiona ajan myötä (kuva 1, I). Poikkeaa korkeasta ristisitoutumiskyvystä, vain pieni määrä potilaiden seeruminäytteitä ristineutralisoi SARS-CoV- ja/tai MERS-CoV-pseudovirukset (kuva 1, I; kuva E4, B; kuva E5, B; ja katso kuva E7 Online-varasto). Noin 27 %:lla näytteistä, jotka oli kerätty 1–30 päivää oireiden alkamisen jälkeen, esiintyi ristiinneutraloivaa aktiivisuutta, ja tämä määrä putosi 20 prosenttiin 180–220 päivän kohdalla, jolloin SARS-CoV:n ristiinneutralointiaktiivisuus muuttui dramaattisemmin (Kuva 1, I ). Suurempi osa näytteistä ristineutralisoi SARSCoV:n kuin MERS-CoV:n 30 päivän kuluessa taudin alkamisesta. On syytä huomata, että huolimatta SARS-CoV- ja MERS-CoV-ristineutraloinnin osoittavien näytteiden samanlaisista osuuksista, MERS-CoV:n NT50-arvot olivat paljon alhaisemmat kuin SARSCoV-arvot ristineutralointipositiivisten seeruminäytteiden joukossa (kuva E4, B; kuva E5, B; kuva E7).

cistanche-kasveja lisäävä immuunijärjestelmä

SARS-CoV-2-infektio johtaa sytokiinituotannon aktivoitumiseen

SARS-CoV-2-infektion jälkeisten immunologisten muutosten kattavaa karakterisointia varten arvioimme edelleen muutoksia sytokiinitasoissa COVID{2}}-potilaiden seerumeissa. Viisikymmentäviisi pitkittäistä seeruminäytettä, jotka kerättiin kahden ensimmäisen kuukauden aikana oireiden alkamisesta, käytettiin sytokiinituotannon havaitsemiseen proteiinipohjaisella mikrosirulla. Useiden sytokiinien seerumipitoisuudet havaittiin ensimmäisen sairauskuukauden aikana, mukaan lukien IL-1a (proinflammatorinen), IL-6 (proin-inflammatorinen) ja IL-10 (anti-inflammatorinen). ), jotka on yhdistetty sytokiinien vapautumisoireyhtymään vakavissa COVID{11}}-tapauksissa, 39,40 sekä IFN-g (TH1-tyyppi) ja IL-4 (TH2-tyyppi) (Kuva 2, A, ja kuva E8 online-varastossa osoitteessa www.jacionline.org). Tarkemmin sanottuna seerumin IL-6, IL-10 ja IFN-g nousivat 15 päivän kuluessa potilaiden oireiden alkamisesta ja laskivat myöhemmissä vaiheissa, kun taas IL-1 a:n ja IL{25}}:n osoitettiin lisääntyneen huomattavasti 16–30 päivän aikana taudin alkamisesta ja putosivat nopeasti normaaliksi sen jälkeen (kuva 2, A). Korrelaatioanalyysi osoitti heikon tai ei lainkaan lineaarista yhteyttä antigeenispesifisten vasta-ainevasteiden ja sytokiinituotannon välillä SARS-CoV-2-infektion jälkeen, vaikka tilastollinen merkitsevyys havaittiin IL-10- ja SARS-CoV{{-tasojen välillä. 34}} N-proteiinia sitova vasta-aine (r 5 0.321 ja P < .05), IL-1b-tuotannon ja S-proteiinia sitovan vasta-aineen välillä (r 5 20.335 ja P<.05), and between TNF-a and S protein binding antibody levels (r 5 20.335 and P <.05; see Fig E9 in the Online Repository). To allow direct visualization and comparison among patient samples across multiple cytokine responses over time, we constructed a heat map showing fold changes in cytokine release relative to the healthy donor control group (Fig 2, B). Consistent with our findings presented above, elevated serum cytokine levels after SARS-CoV-2 infection were predominantly observed during the acute phase and an early period of convalescence (within 30 days after disease onset) (Fig 2, A and B). Among cytokines tested, proinflammatory IL-6 exhibited the most robust response, with a 4.9-fold increase and a 2.9-fold increase on average for samples collected during 1 to 15 days and 16 to 30 after onset of symptoms, respectively (Fig 2, B). Of note, 1 serum sample (sample Pt-S22, collected on day 18 after disease onset) obtained from a COVID–19–infected individual with moderate disease, exhibited a marked increase in the production of multiple proinflammatory cytokines, including IL-1a, IL-1b, IL-6, and TNF-a (Fig 2, B). Additionally, hyperproduction of cytokines including IL- 1a, IL-4, IL-6, IL-10, IL-13, and IFN-g was also detected in 1 sample (sample Pt-S11, collected at day 15 after disease onset) collected from a severe case of COVID-19; presumably, these are associated with disease severity and outcome (Fig 2, B). These results indicate broad inflammatory activation and changes over time involving the concomitant release of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines as well as TH1-type and TH2-type cytokines in COVID-19 patients.

Proteominlaajuinen epitooppikartoitus tunnistaa hallitsevat epitoopit, jotka välittävät pysyviä humoraalisia immuunivasteita COVID-19-potilailla

Jotta voitaisiin paremmin karakterisoida humoraalisen immuniteetin tunnuspiirteitä SARS-CoV-2:lle ajan myötä, sovelsimme proteomin laajuista epitooppikartoitusta käyttämällä peptidipohjaisia ​​mikrosiruja. SARS-CoV-2-proteomin peittävä peptidikirjasto luotiin ja immobilisoitiin objektilaseille, joissa kukin peptidi oli 15 aminohapon pituinen ja 11 aa:n päällekkäisyys. Yhteensä 51 pitkittäissuuntaista seeruminäytettä 19 potilaalta, joilla oli joko oireeton (n 5 1) tai lievä (n 5 2) tai kohtalainen (n 5 15) tai vaikea (n 5 1) ) SARS-CoV-2-infektiot testattiin (taulukko I). Suhteellisen tasapainoisen näytteenottomäärän, -välien ja ajankohtien saavuttamiseksi näytteet kerättiin peräkkäin 2 tai 3 ajankohdassa jokaiselta COVID-19-osallistujalta 16–219 päivää oireiden alkamisen jälkeen. Suurin osa potilaista (18/19) tuotti neutraloivia vasta-aineita virusinfektion jälkeen, paitsi yksittäisellä yksilöllä, jolla oli oireeton infektio (taulukko I). Eri näytteenottoajankohtien mukaan näytteet jaettiin kolmeen ryhmään: päivät 10-60 (n 5 18), päivät 100-150 (n 5 18) ja päivät {{28 }} (n 5 15). COVID-19-potilaiden virusepitooppiprofiilien pitkittäisarviointi suoritettiin sekä seerumin IgG- että IgM-vasta-aineille. Negatiivisena kontrollina käytettiin 20 terveen luovuttajan yhdistettyjä seerumeita. Käyttämällä SARS-CoV-2-proteomimikrosirua määritettiin peptidejä sitovien vasta-ainevasteiden kinetiikka ja analysoitiin (1) sitoutumissignaalin intensiteetti ja (2) positiivisesti reaktiivisten näytteiden prosenttiosuus (positiivinen määrä) jokaiselle peptidille. . Positiivisen peptidin sitoutumisvasteen raja-arvon perusteella, joka asetettiin kaksi kertaa negatiivisen kontrollin signaalin intensiteetiksi, tunnistimme yhteensä 460 positiivista peptidiä IgG:lle ja 479 positiivista peptidiä IgM:lle, jotka olivat reaktiivisia vähintään yhden potilaan kanssa. seeruminäyte. Positiiviset peptidimäärät ja vasteiden jakautuminen SARS-CoV-2:n eri avoimien lukukehysten (ORF) välillä olivat suhteellisen vakaita eri näyteryhmissä, ja positiivisten peptidien määrä laski hieman ajan myötä (kuva 3, A). Suurin reaktiivisuus tunnistettiin replikaasipolyproteiinissa ORF1ab, joka on suurin ORF, joka kattaa yli kaksi kolmasosaa koko genomista (kuvio 3, A). Mielenkiintoista on, että havaitsimme keskivaikean tai vahvan korrelaation positiivisten peptidisitoutumisvasteiden ja seerumin sytokiinitasojen välillä varhain SARS-CoV-2-infektion jälkeen (päiviä 10-60 taudin puhkeamisen jälkeen; katso kuva E10 online-varastossa osoitteessa www. jacionline.org). IgM:lle positiivisten sitoutuvien peptidien lukumäärän osoitettiin liittyvän seerumin IL-6 ja IL-10 tasoihin; samoin reaktiivisten kokonaispeptidien ja IgM:n ORF1ab:tä sitovien peptidien keskimääräinen signaalin intensiteetti esitti positiivisia assosiaatioita IL-6- ja IFN-g-tuotannon kanssa seeruminäytteissä. Nämä tiedot viittaavat siihen, että muutokset sytokiinitasoissa SARS-CoV{60}}-infektion jälkeen voivat vaikuttaa antigeenispesifisten humoraalisten vasteiden tunnistamien epitooppien suuruuteen ja leveyteen. Positiivisten epitooppien tunnistamisen perusteella valitsimme edelleen yleisimmät epitoopit, jotka pysyivät jatkuvasti reaktiivisina yli 80 %:ssa COVID{63}}-näytteistä kustakin kolmesta näyteryhmästä (joita kutsutaan hallitseviksi ja pysyviksi epitoopeiksi). Tulokset paljastivat, että nämä erittäin hallitsevat epitoopit, jotka pystyivät välittämään pitkäaikaisia ​​humoraalisia immuunivasteita, sijaitsivat SARS-CoV-2 ORF1ab-polyproteiinissa ja S-proteiinissa, ja IgM-vasta-aineet tunnistivat enemmän epitooppeja (n 5 33) kuin IgG-vasta-aineet (n 5 10) (kuva 3, B ja taulukko II; katso kuva E11 ja kuva E12 online-varastossa osoitteessa www.jacionline.org). ORF1ab-polyproteiinilla oli suurin määrä hallitsevia epitooppeja, jotka välittävät pitkäaikaisia ​​vasteita, ja epitoopit olivat laajalti jakautuneet ei-rakenteellisten proteiinien (nbsp) 2-5, nbsp 8-10, nbsp 12-14 alueille, ja nbsp 16 (taulukko II). Huomasimme, että tunnistimme yhden immunodominantin epitoopin, 2073:n (ORF1ab, aa 5801-5815), jonka IgG- ja IgM-vasta-aineet saattoivat tunnistaa 100 %:lta COVID-19-potilaista seeruminäytteenottohetkistä riippumatta (kuva 1). 3, B ja taulukko II; katso kuva E13 ja kuva E14 online-varastossa). Tämä erittäin reaktiivinen peptidi sijaitsee ORF1ab-polyproteiinin helikaasialueella (nsp 13), joka on välttämätön kaksijuosteisten RNA-templaattien purkamiselle SARS-CoV-2-replikaation aikana.41 Valituista ORF1ab:n peptideistä 2 immunodominanttia peptidiä joilla on korkeimmat IgG-vasta-aineiden tunnistamat keskimääräiset signaalin intensiteetit, numero 1985 (ORF1ab, aa 5449-5463) ja numero 2073 (ORF1ab, aa 5801-5815), molemmat sijaitsevat nsp 13:ssa. IgM-vasteille peptidi 685 (ORF1ab, aa 249-263) nsp 2:lla ja peptidi 1985 (ORF1ab, aa 5449-5463) nsp 13:lla esitti voimakkaimmat sitoutumisintensiteetit (kuva 3, B). Ottaen huomioon vaihtelut lähtöviivasignaaleissa (yhdistetyt seerumit terveiltä luovuttajilta) eri peptideille (kuvio 3, B), laskemme edelleen signaalin intensiteettien kertaiset muutokset kunkin avainpeptidin osalta suhteessa terveeseen kontrolliryhmään. Tulokset osoittivat, että nsp 13 -alueella sijaitsevat peptidi 2073 (IgG-sitoutuminen) ja peptidi 1985 (IgM-sitoutuminen) säilyttivät suurimmat peptidin sitoutumisintensiteetit (kerroinmuutos) kerättyjen potilaiden seerumien joukossa 180-220 päivään asti (kuvio E13 ja kuvio E14).

KUVA 2. Sytokiinituotannon kinetiikka COVID-19-potilailla. A, Sytokiinien tuotantotasot 55 seeruminäytteessä, jotka kerättiin 16 COVID-19-potilaalta akuutin vaiheen ja toipumisen varhaisen vaiheen aikana, havaittiin proteiini-microarray-pohjaisella ELISA:lla (päivät 1-15, n 5 11; päivää 16-30, n 5 26; päivää 31-61, n 5 18; terveet luovuttajat, n 5 20). Jokainen piste edustaa yksittäistä seeruminäytettä; katkoviivat osoittavat havaitsemisrajaa. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin 1-ANOVA-menetelmällä Tukeyn moninkertaisilla vertailuilla. *P < .05, **P < .01 ja ****P < .0001. B, (A):ssa näkyvä COVID-19-potilaiden sytokiinin tuotantotason kertainen muutos verrattuna 20 terveiden luovuttajien näytteen keskiarvoihin. Jokainen sarake osoittaa erillisen seeruminäytteen, joka on kerätty osoitetuista ajankohdista oireiden alkamisen jälkeen; jokainen rivi edustaa yhtä yksittäistä testattua sytokiinia.

TAULUKKO I. COVID{0}}-potilaiden ja näytekohortien ominaisuudet epitooppikartoituksessa

Kuvio 3. Sellaisten hallitsevien epitooppien IgM- ja IgG-tunnistus, jotka myötävaikuttavat pitkäaikaisiin vasta-ainevasteisiin SARS-CoV-2-tartunnan saaneilla yksilöillä. Pitkittäinen analyysi epitooppien seerumin tunnistamisesta 19 yksilöllä, joilla on COVID-19, käyttäen SARS-CoV-2-proteomin peittävää peptidimikrosirua. Potilasnäytteissä olevan peptidin sitoutumisen positiivisen vasteen raja-arvoksi (n 5 51) ​​asetettiin kaksinkertainen signaalin intensiteetti 20 terveen luovuttajan yhdistetyissä seerumeissa. A, peptidien määrät ja positiivisten sitoutuvien peptidien jakautuminen, jotka olivat havaittavissa yhdestä tai useammasta näytteestä, jotka kerättiin 10-60 päivän (n 5 18), 100-150 päivän (n 5 18) kohdalla, ja 180- 220 päivää (n 5 15) taudin puhkeamisen jälkeen. Numerot osoittavat kunkin ORF:n tunnistetut IgG- ja IgM-epitoopit. B, Dominanttien ja pysyvien IgG- ja IgM-epitooppien signaaliintensiteetit (x-akseli), jotka olivat kestävästi reaktiivisia yli 80 %:ssa näytteistä kaikissa kolmessa näytteenottoajankohdassa. Jokainen piste osoittaa terveiltä luovuttajilta kerätyn seerumin (ylhäällä) tai erillisen potilaan seeruminäytteen, joka on kerätty osoitetuista ajankohdista oireiden alkamisen jälkeen. E, kirjekuoriproteiini.

TABLE II. Epitopes with >80 % positiivinen määrä kaikissa kolmessa näytteenottoajankohdassa

SARS-CoV-2 S-proteiinin hallitsevat ja pysyvät epitoopit sijaitsevat NTD- ja S2-alayksiköissä

SARSCoV-2 S-proteiinista tunnistettiin yhteensä 4 hallitsevaa ja pysyvää epitooppia: peptidi 318 (S, aa 45-59) ja peptidi 356 (S, aa 197-211), jotka sijaitsevat NTD-alueen sisällä; peptidi 510 (S, aa 813-827), joka peittää S2'-katkaisukohdan ja osia S2-alayksikön FP:stä, ja peptidi 530 (S, aa 893-907), joka sijaitsee yhdistävällä alueella FP:n ja S2-alayksikön ensimmäisen heptad-toistoalueen välillä (kuvio 3, B ja taulukko II). Näistä S-proteiinin avainpeptideistä, jotka valitsimme, peptidillä 318, joka sijaitsee S-proteiinin NTD:ssä, oli voimakkain sitoutumisintensiteetti (kerroinmuutos verrattuna kontrolliin; kuvio E13 ja kuva E14). Rakenneanalyysit paljastivat, että nämä epitoopit ovat täysin paljastuneet monomeerisen S-proteiinin pinnalla; Jotkut peptidien 318, 356 ja 530 epitooppijäännökset ovat kuitenkin piilossa trimeerisen S-proteiinin pinnan alla (kuvio 4, A ja B), mikä viittaa siihen, että isännän immuunijärjestelmä tunnistaa tehokkaasti sekä S-monomeeri- että trimeerirakenteet tietyissä olosuhteissa. olosuhteissa. Tarkemmin sanottuna 2 peptidin 318 silmukkasegmenttiä (aa 45-46 ja aa 56-59) paljastetaan trimeerisellä S-proteiinilla, jonka sisälle on haudattu keskeinen b-juoste; ja useimmat peptidin 356 tähteet ovat saatavilla pinnalla, mukaan lukien ydin b-juoste (aa 203-209) ja silmukkasegmentti (aa 210-211). Peptidi 510 sisältää S2'-katkaisukohdan ja FP:n keskusheliksin, jotka molemmat ovat täysin S-proteiinin pinnalla; peptidin 530 tähteet ovat enimmäkseen kryptisiä, ja vain pieni osa silmukasta (aa 893-895) on paljastettu trimeerisellä S-proteiinilla (kuvio 4, C). Seitsemän yleisen ihmisen koronaviruksen sekvenssihomologia-analyysi paljasti, että kahdella S2-alayksikössä sijaitsevalla epitoopilta (peptidit 510 ja 530) on korkea sekvenssi-identtisyys muiden koronavirusten kanssa, mikä viittaa serologiseen ristireaktiivisuuteen, joka kohdistuu näihin epitooppeihin ihmisen koronavirusten joukossa (kuvio 4, D). Peptidin 318 sekvenssi osoitti suurta samankaltaisuutta SARSCoV:n kanssa, kun taas koronavirusten joukossa osoitettiin alhainen sekvenssihomologia peptidin 356 kanssa, mikä viittaa SARS-CoV-2-spesifisiin vasta-ainevasteisiin, jotka kohdistuivat tälle alueelle (kuva 4, D). Ottaen huomioon uusia nousevia ja kiertäviä SARS-CoV-2-variantteja maailmanlaajuisesti, suoritimme edelleen sekvenssien rinnastamisen S-proteiinin tärkeimpien epitooppien suhteen varhaisen SARS-CoV{50}}-kannan (Wuhan-Hu{52}) välillä. }) ja viisi huolta aiheuttavaa muunnelmaa (Alpha, Beta, Gamma, Delta ja Omicron) sekä 2 kiinnostavaa muunnelmaa (Lambda ja Mu) Maailman terveysjärjestön virusmuunnelmaluokitusten mukaan (päivitetty 30.11.2021). ). Tulokset osoittivat, että näiden hallitsevien ja pysyvien epitooppien sekvenssit ovat lähes identtisiä analysoitujen varianttien joukossa, lukuun ottamatta yhtä N211I-mutaatiota, joka on tunnistettu uudessa Omicron-variantissa (kuvio 4, E). Nämä tiedot osoittavat, että varhaisten SARS-CoV{60}} -kantojen tuottamat vasta-aineet voivat jatkuvasti tunnistaa nykyisiä kiertäviä variantteja ja että nämä hallitsevat epitoopit voivat kyetä välittämään pitkäaikaisia ​​pitkäaikaisia ​​vasta-ainevasteita SARS-CoV-tartunnan yhteydessä-2 muunnelmia. S-proteiinin tunnistettujen epitooppien immunologisten ominaisuuksien edelleen määrittämiseksi ja näiden S-proteiiniepitooppien mahdollisen arvon edelleen tutkimiseksi peptidirokoteehdokkaina suoritimme hiiren immunisaatiotutkimuksen käyttämällä valittuja peptidejä. BALB/c-hiiret ympättiin 3 kertaa kullakin peptidillä alunan ja CpG-adjuvanttien läsnä ollessa (kuvio 4, F). Neljästä valitusta peptidistä rokottaminen peptidillä 356 sai aikaan antigeenispesifisiä vasta-aineita toisen ja kolmannen annoksen jälkeen (kuvio 4, G). Seerumin neutralointimäärityksen tulokset paljastivat, että immunisointi lineaarisilla peptideillä ei tuottanut merkittäviä neutraloivien vasta-aineiden tasoja SARS-CoV-2:a vastaan ​​(kuvio 4, H), mikä viittaa siihen, että nämä lineaariset peptidit toimivat huonosti indusoitaessa voimakkaita neutraloivia vasta-ainevasteita.

SARS-CoV-2:n N-proteiinista puuttuu useimmat reaktiiviset epitoopit, jotka välittävät kestäviä vasta-ainevasteita virusinfektion jälkeen

Useat tutkimukset ovat selvittäneet SARS-CoV-2 N-proteiinin tehokkaan antigeenisyyden.4,11,12 Emme kuitenkaan onnistuneet tunnistamaan N-proteiinissa sijaitsevia hallitsevia ja pysyviä epitooppeja nykyisten valintakriteerien perusteella. (yli 80 % positiivinen määrä kaikilla kolmella näytteenottohetkellä). N-proteiinin epitooppiprofiilien pitkittäisarviointia varten yksilöillä, joilla on COVID{7}}, suoritimme epitooppiseulonnan toisen kierroksen, joka perustui peptidimikroseulonnasta saatuihin tietoihin subdominanttien epitooppien valitsemiseksi, jotka pysyivät jatkuvasti positiivisina reaktiivisina. yli 60 %:ssa COVID-19-näytteistä jokaisessa kolmessa näytteenottoajankohdassa (joita kutsutaan subdominantteiksi ja pysyviksi epitoopeiksi). SARS-CoV-2 N-proteiinista tunnistettiin yhteensä 4 subdominanttia ja pysyvää epitooppia, joista peptidi 2455 (N, aa 213-227) oli reaktiivinen sekä IgG- että IgM-vasta-aineille COVID:ssa{{16 }} potilasta, joilla on suhteellisen korkeampi signaalin intensiteetti (kuva 5, A ja B ja katso taulukko E4 online-varastossa osoitteessa www.jacionline.org). Kaksi päällekkäistä peptidiä, peptidi 2455 (N, aa 213-227) ja peptidi 2456 (N, aa 217-231), sijaitsevat Ser/Arg-rikkaalla linkkerialueella N-terminaalisen RNA:ta sitovan domeenin välissä. ja N-proteiinin C-terminaalinen dimerisaatiodomeeni. Peptidi 2482 (N, aa 321-335) ja peptidi 2491 (N, aa 357-371) sijaitsevat kokonaan tai osittain N-proteiinin dimerisaatiodomeenin sisällä (taulukko E4). Koska 3-D-rakenteita ei koskien N-proteiinin ehjää konformaatiota, suoritimme rakenteellisia analyyseja vain 2 tunnistetulle epitoopille C-terminaalisen dimerisaatiodomeenin dimeerirakenteesta. Peptidi 2482:n tähteet muodostavat 2 b-juostetta, jotka on järjestetty antirinnakkaisella tavalla dimerisaatiorajapintoihin, kun taas peptidin 2491 aa 357-364 muodostaa heliksipohjaisia ​​rakenteita, jotka sijaitsevat dimeerin vastakkaisissa päissä (kuva 5, C) . Sekvenssikohdistus varhaisen SARS-CoV-2 (kanta Wuhan-Hu-1) ja 7 nousevan muunnelman välillä paljasti lisäksi, että näiden N-proteiinissa olevien subdominanttien ja pysyvien epitooppien sekvenssit ovat lähes identtisiä nykyisissä kiertävissä muunnelmissa. peptidin 2455 yksittäinen G215C-substituutio, joka esiintyy Delta-variantissa ja yksi peptidin 2455 G214C-mutaatio, joka on tunnistettu Lambda-variantissa, mikä viittaa siihen, että näihin peptideihin kohdistuvat vasta-aineet mahdollisesti tunnistavat nousevien SARS-CoV{51}}-varianttien antigeenin (kuvio 5, D ).

Kuvio 4. SARS-CoV-2-piikkiproteiinin hallitsevat epitoopit kestävien humoraalisten immuunivasteiden välittämisen kannalta. A ja B, Dominanttien ja pysyvien epitooppien sijainnit monomeerisen (A) ja trimeerisen (B) S-proteiinin 3-D-rakenteissa (PDB ID: 6VXX). Epitoopit on korostettu vihreällä (peptidi 356, aa 197-211), punaisella (peptidi 318, aa 45-59), sinisellä (peptidi 510, aa 813-827) ja violetilla (peptidi 530, aa) 893-907), vastaavasti. Kolme suljetussa konformaatiossa olevaa S-monomeeriä on kuvattu harmaalla, vaaleanpunaisella ja syaanilla, vastaavasti. C, SARS-CoV-2 S-proteiinin hallitsevien epitooppien yksityiskohtainen rakenneanalyysi S-trimeerin suljetussa tilassa (PDB ID: 6VXX). D, identifioitujen epitooppien sekvenssikohdistus tavallisten ihmisen koronavirusten joukossa. Epitooppijäännökset, jotka ovat säilyneet SARS-CoV{17}}:n ja muiden ihmisen koronavirusten välillä, on varjostettu harmaalla. E, Varhaisen SARS-CoV-2 (kanta Wuhan-Hu-1) ja 7 nousevan muunnelman epitooppien säilymisanalyysi. Mustat pisteet edustavat identtisiä tähteitä Wuhan-Hu-1-kannan ja ilmoitetun välillä.

Kuvio 5. SARS-CoV-2-nukleokapsidiproteiinissa sijaitsevat alaepitoopit kykenevät välittämään pysyviä vasta-ainevasteita. Subdominanttien peptidien A-, IgG- ja IgM-tunnistustaajuudet (pysyvästi reaktiivisia yli 60 % näytteistä) potilaiden seeruminäytteiden joukossa, jotka on kerätty useaan ajankohtaan taudin alkamisen jälkeen. B, tunnistettujen subdominanttien epitooppien signaalin intensiteettikinetiikka ajan kuluessa. Jokainen piste edustaa erillistä potilaan seeruminäytettä, joka on otettu COVID-19-potilailta ilmoitettuina ajankohtina oireiden alkamisen jälkeen. Vaakasuorat katkoviivat osoittavat kunkin peptidin positiivisen vasteen raja-arvoja. C, N-proteiinin C-terminaalisen dimerisaatiodomeenin epitooppien yksityiskohtainen rakenneanalyysi (PDB ID: 6YUN). Epitoopit on merkitty sinisellä (peptidi 2482, aa 321-335) ​​ja ruskealla (peptidi 2491, aa 357-364). Kaksi monomeerirakennetta on kuvattu harmaalla ja syaanilla, vastaavasti. D, tunnistettujen N-proteiiniepitooppien sekvenssikohdistusanalyysi varhaisen SARS-CoV-2 (kanta Wuhan-Hu-1) ja 7 nousevan muunnelman välillä. Mustat pisteet osoittavat identtisiä sekvenssejä Wuhan-Hu-1-kannan ja mainitun muunnelman välillä. Muutokset aminohapposekvenssissä on korostettu punaisella.

KUVA 6. SARS-CoV-2-tartunnan saaneiden yksilöiden tunnistamat liner-epitoopit, joilla on korkea sitoutumisintensiteetti ja pienenevät reaktiiviset taajuudet ajan myötä. A ja B, Pitkittäinen analyysi ja identifioitujen peptidien jakautuminen, joilla on korkea sitoutumissignaalin intensiteetti (yli keskiarvon 1 SD signaalin intensiteetistä kaikista testatuista näytteistä), mutta positiivinen nopeus pienenee ajan myötä. Epitooppien tunnistustaajuus (A) ja signaalin intensiteetti (B) piirrettiin 3 näytteenottoajankohdan kanssa oireiden alkamisen jälkeen. Jokainen piste kohdassa (B) tarkoittaa yksittäistä potilaan seeruminäytettä, joka on kerätty ilmoitettuina ajankohtina oireiden alkamisen jälkeen; katkoviivat vaakasuorat viivat osoittavat kunkin peptidin positiivisuuden raja-arvot. Tilastollinen merkitsevyysanalyysi suoritettiin Limma of R v3.6.3 -ohjelmiston perusteella. *P < ,05 ja **P < ,01. C, 2 vierekkäisen epitoopin, peptidin 510 (dominoiva ja pysyvä) ja peptidin 511 (suuri signaalin intensiteetti ja laskeva positiivisuus ajan myötä), sijainti- ja sekvenssivertailu SARS-CoV-2 S -proteiinin rakenteessa (PDB ID: 6ZGI) . Päällekkäiset alueet kahden epitoopin välillä on korostettu vihreällä; ainutlaatuiset sekvenssit on merkitty punaisella ja sinisellä.

Pitkittäinen serologinen analyysi tunnistaa epitoopit, joilla on korkea signaalin intensiteetti, mutta joiden reaktiivisuus vähenee ajan myötä

Valittujen erittäin reaktiivisten epitooppien lisäksi, jotka ovat vastuussa yllä mainituista pysyvistä humoraalisista immuunivasteista, tunnistimme ja karakterisoimme edelleen 9 positiivisen peptidin paneelin, joilla oli vahva sitoutumisintensiteetti (yli kaikkien testattujen näytteiden signaalin intensiteettien keskiarvo 1 SD) COVID-19-potilailta otettujen seeruminäytteiden reaktiivisuuden vähenemissuuntaus (positiiviset muutokset yli 20 %) ajan myötä humoraalisten immuunivasteiden yleisen heikkenemissuuntauksen mukaisesti. Nämä epitoopit sijaitsevat kolmen hallitsevan antigeenin sisällä: ORF1ab-, S- ja N-proteiinit (kuvio 6, A; ja katso taulukko E5 online-varastossa osoitteessa www.jacionline.org). Lisäksi havaittiin ORF1ab-proteiinien (peptidit 784-IgG, 1617-IgM ja 1986-IgM) ja N (peptidi 2457-IgG) signaalin intensiteettien merkittävää vähenemistä. näytteenoton aikaisen ajanjakson näytteiden välillä (päiviä 10-60 taudin alkamisen jälkeen) ja myöhemmän näytteenottovaiheen ajankohtien välillä (päiviä 100-150 tai päivää 180-220 oireiden alkamisen jälkeen) (kuva 6 , B). Huolimatta suurelta osin päällekkäisyydestä S-proteiinin peptidin 510 (dominoiva ja pysyvä; kuva 3, B) ja peptidin 511 (suuri signaalin intensiteetti ja laskeva positiivinen nopeus ajan myötä; kuva 6, A) peptidillä oli erilaisia ​​​​kuvioita. potilaan seeruminäytteiden reaktiivisuus ajan myötä. Sekvenssi- ja sijaintianalyysi osoitti, että peptidi 510 sisältää S2'-katkaisukohdan ja muita 813-SKRS-816-aminohappoja, kun taas peptidi 511 on täysin FP:n sisällä jatketulla 828-LADA{{29 }} jäännökset, jotka ovat täysin paljastuneet trimeerisen S-proteiinin pinnalla (kuvio 6, C). Nämä tulokset paljastivat epitooppien uusia ominaisuuksia, jotka voivat viime kädessä edistää pidempään kestävää ja vahvempaa humoraalista immuniteettia SARS-CoV-virusta vastaan-2.

KESKUSTELU

SARS-CoV-2-infektion pitkäaikaisten immuunivasteiden systemaattinen karakterisointi on ratkaisevan tärkeää paremman diagnostiikan, tehokkaiden hoitotoimenpiteiden ja rokotteiden kehittämisen kannalta. Tässä tutkimuksessa suoritimme kattavan pitkittäisanalyysin COVID-19-potilaista 180–220 päivän seurantajakson aikana, mikä osoitti pysyviä humoraalisia immuunivasteita ja aktivoituneen sytokiinituotannon virusinfektion jälkeen.

Merkittävää on, että hyödyntämällä SARS-CoV-2-proteomin kattavaa peptidipohjaista mikrosirua paljastimme edelleen epitooppitunnistuksen kinetiikkaa ja tunnistimme joukon hallitsevia epitooppeja, jotka pystyvät välittämään pitkäaikaista humoraalista immuniteettia. Tässä raportoimamme havainnot humoraalisten immuunivasteiden kestosta SARS-CoV{5}}-infektion jälkeen vahvistavat joitain aiemmin julkaistuja tietoja5, 10, 12, 13, 42, mutta laajentavat niitä suorittamalla syvän serologisen profiloinnin ja epitooppiseulonnan pitkittäisten seeruminäytteiden avulla. COVID-potilailta{11}} proteominlaajuisen microarray-lähestymistavan avulla. Tässä tutkimuksessa tunnistimme SARS-CoV-2 S-proteiinista neljä hallitsevaa epitooppia (peptidit 318, 356, 510 ja 530), jotka kykenivät reagoimaan jatkuvasti yli 80 %:n COVID-19-potilaan kanssa. näytteet testataan 180–220 päivää oireiden alkamisen jälkeen. Peptidi 510 (S, aa 813-827), joka sisältää S2-katkaisukohdan ja S2-alayksikön FP:n, on yleisesti tunnistettu aiemmissa tutkimuksissa muita ryhmiä.26,28,32-34 Funktionaaliset analyysit osoittivat vasta-aineita kohdistaminen tälle alueelle voi osoittaa rajoitettua neutralointitehoa SARS-CoV-226,33:a vastaan ​​huolimatta siitä, että se altistuu voimakkaasti S-proteiinin pinnalla (kuvio 4, AC). Peptidin 530 (S, aa 893-907) tapauksessa, joka sijaitsee FP:n ja S2-alayksikön ensimmäisen heptad-toistoalueen välissä, tähteet ovat yleensä hautautuneita S-proteiinin trimeeriseen rakenteeseen, mikä tekee siitä vaikea päästä käsiksi voimakkaiden neutraloivien vasta-aineiden ansiosta SARS-CoV-2 (Kuva 4, AC). Lisäksi valittiin 2 S1-NTD-ohjattua peptidiä, jotka voisivat välittää pitkäaikaisia ​​SARS-CoV-2-vasta-ainevasteita. Peptidisekvenssiä ja sijaintia koskevat analyysit osoittivat, että näiden kahden peptidin tähteet – peptidi 318 (S, aa 45-59) ja peptidi 356 (S, aa 197-211) – ovat lähellä raportoituja tunnistettuja epitooppeja. infektiota tehostavilla vasta-aineilla23,25, mutta lukuun ottamatta S1-alayksikön NTD:hen kohdistuvien erittäin tehokkaiden neutraloivien vasta-aineiden avainkohtia16,19,43, mikä viittaa mahdollisuuteen epitooppitunnistuksen avulla ei-neutralisoivien vasta-aineiden avulla näitä kahta tunnistettua peptidiä vastaan. Edellä mainittujen yksityiskohtien lisäksi hiiren immunisaatio valituilla peptideillä osoitti edelleen näiden ei-reseptoria sitovien lineaaristen peptidien tehokkuuden voimakkaiden neutraloivien vasta-ainevasteiden indusoinnissa (kuvio 4, G). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että hallitsevat lineaariset epitoopit, jotka välittävät pitkäaikaisia ​​humoraalisia immuunivasteita SARS-CoV{65}}-infektioon, todennäköisesti indusoivat vasta-aineita, joilla ei ole tai on rajoitettu neutralointiteho. SARS-CoV{67}}-vasta-aineiden, erityisesti S-proteiiniin suuntautuneiden epitooppien, epitooppimaiseman ymmärtäminen antaa uutta tietoa vasta-aineiden toiminnallisesta dissektiosta, mikä helpottaa entisestään innovatiivista ja järkevää rokotesuunnittelua. Neutraloivat vasta-aineet antavat suojaa virusinfektioiden eliminoimiseksi, kun taas neutraloimattomilla vasta-aineilla voi olla hyödyllinen, neutraali tai jopa haitallinen rooli viruksen puhdistuman aikana. Ei-neutralisoivat vasta-aineet tarjoavat lisäsuojaa in vivo Fc-välitteisten efektoritoimintojen kautta vasta-aineriippuvaisen fagosytoosin ja vasta-aineriippuvaisen sytotoksisuuden yhteydessä. Sitä vastoin jotkut tutkimukset ovat ehdottaneet ei-neutralisoivien vasta-aineiden patogeenisen roolin mahdollisuutta koronavirusinfektiossa. Aiemmissa tutkimuksissa, joissa käytettiin useita SARS-CoV- ja MERS-CoV-rokoteehdokkaita, havaittiin tehostunut immunopatologia rokotetuissa pienissä eläimissä ja kädellisissä virusaltistuksen jälkeen.24,44-50 Äskettäin kahden ryhmän tutkimukset raportoivat, että ei-neutralisoivat. SARS-CoV-2 S-proteiinin NTD:hen kohdistuvat vasta-aineet kykenivät tehostamaan virusinfektiota in vitro Fcg-reseptorista riippumattomien mekanismien kautta,23,25, vaikka passiivisesti annosteltujen infektiota lisäävien vasta-aineiden on osoitettu eläinmalleissa suojaavan SARS:ia vastaan -CoV-2-infektio in vivo. Ottaen huomioon vasta-aineiden kiistanalaiset roolit koronavirusinfektion aikana, tarvitaan lisätutkimuksia vasta-aineiden mahdollisen roolin vahvistamiseksi näiden hallitsevien ja pysyvien epitooppien tunnistamisessa virusinfektion torjunnassa in vivo. SARS-CoV-2-rokotteen rationaalisen suunnittelun seuraava vaihe voitaisiin toteuttaa tuomalla esiin erittäin tehokkaita neutraloivia vasta-aineita ja suojaavia ei-neutralisoivia vasta-aineita sekä vähentämällä infektioita tehostavien epitooppien tai immunodominanttien epitooppien esiintymistä, joilla ei ole hyödyllisiä vaikutuksia. Vaikka useat aiemmat tutkimukset ovat keskittyneet vain SARS-CoV-2 S-proteiiniin pyrkien rajaamaan vasta-aineiden neutralointiin liittyviä toimintoja, suoritimme kattavan proteominlaajuisen epitooppikartoituksen ja tunnistimme ORF1ab-polyproteiinin sisältämiä epitooppeja, jotka tunnistettiin jatkuvasti suuresta osasta potilaiden seeruminäytteitä ajan mittaan. Vaikka nämä ORF1ab-ohjatut peptidit, jotka jakautuvat useille ei-rakenteellisille proteiineille, eivät välttämättä herätä SARS-CoV{97}}-virioniin kohdistuvia toiminnallisia vasta-aineita, niitä voidaan soveltaa diagnostisena työkaluna auttamaan erottamaan luonnollinen infektio rokotuksesta. Rokotteen saajien määrän kasvaessa maailmanlaajuisesti, nykyiset S- ja N-proteiiniin perustuvat serologiset testit kohtaavat haasteita, koska ne ovat tehokas tapa auttaa molekyylitesteissä SARS-CoV{99}}-infektion havaitsemiseksi ja myös immuunitilanteen määrittäminen virusinfektion jälkeen. Hyödyntämällä ORF1ab:n yleisimpiä ja pysyvimmin reaktiivisia peptidejä COVID{101}}-tartunnan saaneiden henkilöiden keskuudessa, luonnollisen infektion serologinen diagnoosi suoritetaan ottamatta huomioon rokotustilaa, joka koskee reseptoriin sitoutuvaa domeenipohjaista S-proteiinia. ja inaktivoituihin viruspohjaisiin rokotteisiin. Tulevia tutkimuksia tarvitaan, jotta voidaan arvioida tunnistettujen ORF1ab-peptidien reaktiivisuutta, herkkyyttä ja spesifisyyttä suuremmissa kohortteissa, joihin kuuluu sekä SARSCoV-2-tartunnan saaneita henkilöitä että rokotteen saajia. Lisäksi tarvitaan lisäarviointia havaitsemistehokkuudesta useiden peptidien yhdistelmästrategioiden avulla, jotta voidaan voittaa peptidien pienempi herkkyys täyspitkään proteiiniin verrattuna ja mahdollinen ristireaktiivisuus tavallisten ihmisen koronavirusten välillä. Tutkimuksemme tärkeimmät rajoitukset ovat suhteellisen harvat näytteet, jotka saatiin pienestä potilaskohorttikoosta, ja suurin osa osallistujista koki ei-vakavia COVID{106}}-sairauksia. Nämä voivat rajoittaa joitain päätelmiämme immuunivasteiden positiivisen vasteen esiintymistiheydestä ja suuruudesta, jotka voivat vaihdella taudin vaikeusasteen mukaan. Tästä huolimatta tässä tutkimuksessa esitetyt tiedot tarjoavat arvokasta tietoa immuunivasteiden kinetiikasta ajan mittaan SARS-CoV-tartunnan jälkeen ja hallitsevien epitooppien ominaisuuksista, jotka pystyvät välittämään jatkuvaa humoraalista immuniteettia COVID-potilailla{109}}. Yhdessä nämä havainnot tarjoavat syvemmän ymmärryksen virusinfektion aiheuttaman luonnollisen immuniteetin kestosta ja niillä on laaja vaikutus innovatiivisiin rokotusstrategioihin ja parempiin diagnostisiin lähestymistapoihin.

VIITTEET

1. Lu R, Zhao X, Li J, Niu P, Yang B, Wu H, et ai. Vuoden 2019 uuden koronaviruksen genominen karakterisointi ja epidemiologia: vaikutukset viruksen alkuperään ja reseptorisitoutumiseen. Lancet 2020;395:565-74.

2. Maailman terveysjärjestö (WHO). WHO:n koronavirus (COVID-19) -hallintapaneeli, 2021. Saatavilla osoitteessa: https://COVID19.who.int/. Käytetty 30. marraskuuta 2021.

3. Wu Z, McGoogan JM. Koronavirustauti 2019 (COVID-19) -epidemian ominaisuudet ja tärkeät opetukset Kiinassa: yhteenveto Kiinan tautien valvonta- ja ehkäisykeskuksen 72 314 tapauksen raportista. JAMA 2020;323:1239-42.

4. Rydyznski Moderbacher C, Ramirez SI, Dan JM, Grifoni A, Hastie KM, Weiskopf D, et ai. Antigeenispesifinen adaptiivinen immuniteetti SARS-CoV-virukselle-2 akuutissa COVID-viruksessa-19 ja yhteys ikään ja taudin vaikeusasteeseen. Cell 2020;183:996-1012.e19.

5. Wu J, Liang B, Chen C, Wang H, Fang Y, Shen S, et ai. SARS-CoV-2-infektio indusoi jatkuvaa humoraalista immuunivastetta toipilaisilla potilailla oireisen COVID-19 jälkeen. Nat Commun 2021;12:1813.

6. Long QX, Liu BZ, Deng HJ, Wu GC, Deng K, Chen YK, et ai. SARS-CoV-2-vasta-ainevasteet COVID-potilailla-19. Nat Med 2020;26:845-8.

7. Sterlin D, Mathian A, Miyara M, Mohr A, Anna F, Claer L, et ai. IgA hallitsee varhaista neutraloivaa vasta-ainevastetta SARS-CoV:lle-2. Sci Transl Med 2021;13: eabd2223.

8. Zhang J, Wu Q, Liu Z, Wang Q, Wu J, Hu Y, et ai. Piikkispesifiset kiertävät T-follikulaariset auttajasolut ja ristiin neutraloivat vasta-ainevasteet COVID-19- toipilaisilla yksilöillä. Nat Microbiol 2021;6:51-8.

9. Wang P, Liu L, Nair MS, Yin MT, Luo Y, Wang Q, et ai. SARS-CoV-2-neutralointivasta-ainevasteet ovat voimakkaampia potilailla, joilla on vaikea sairaus. Emerg Microbes Infect 2020;9:2091-3.

10. Vanshylla K, Di Cristanziano V, Kleipass F, Dewald F, Schommers P, Gieselmann L, et ai. SARSCoV-2-infektion neutraloivan vasta-ainevasteen kinetiikka ja korrelaatiot ihmisillä. Cell Host Microbe 2021;29:917-29.e4.

11. Xiang T, Liang B, Fang Y, Lu S, Li S, Wang H, et ai. SARS-CoV-2 -tartunnan neutraloivien vasta-aineiden väheneminen toipilaisilla COVID-19-potilailla vuoden kuluttua oireiden alkamisesta. Front Immunol 2021;12:708523.

12. Wang Z, Muecksch F, Schaefer-Babajew D, Finkin S, Viant C, Gaebler C, et ai. Luonnollisesti tehostettu neutralointialue SARS-CoV-2-virusta vastaan ​​vuoden kuluttua tartunnasta. Luonto 2021; 595:426-31.

13. Dan JM, Mateus J, Kato Y, Hastie KM, Yu ED, Faliti CE, et ai. Immunologinen muisti SARS-CoV-2:lle arvioitu enintään 8 kuukauden ajan tartunnan jälkeen. Science 2021;371:eabf4063.

14. Sokal A, Chappert P, Barba-Spaeth G, Roeser A, Fourati S, Azzaoui I, et ai. Anti-SARS-CoV-2-muistin B-soluvasteen kypsyminen ja säilyminen. Cell 2021; 184:1201-13.e14. 15. Ju B, Zhang Q, Ge J, Wang R, Sun J, Ge X, et ai. SARS-CoV{11}}-infektion aiheuttamat ihmisen neutraloivat vasta-aineet. Luonto 2020; 584:115-9.

16. Liu L, Wang P, Nair MS, Yu J, Rapp M, Wang Q, et ai. Tehokkaat neutraloivat vasta-aineet useita SARS-CoV-2-piikin epitooppeja vastaan. Luonto 2020; 584:450-6.

17. Zost SJ, Gilchuk P, Case JB, Binshtein E, Chen RE, Nkolola JP, et ai. Potentiaalisesti neutraloivat ja suojaavat ihmisen vasta-aineet SARS-CoV-virusta vastaan-2. Luonto 2020; 584:443-9.

18. Xu C, Wang Y, Liu C, Zhang C, Han W, Hong X, et ai. SARS-CoV-2 trimeerisen piikkiglykoproteiinin konformaatiodynamiikka kompleksissa ACE2-reseptorin kanssa, paljasti kryo-EM. Sci Adv 2021;7:eabe5575.

19. McCallum M, De Marco A, Lempp FA, Tortorici MA, Pinto D, Walls AC, et ai. N-terminaalisen verkkotunnuksen antigeenikartoitus paljastaa SARSCoV-haavoittuvuuden-2. Cell 2021;184:2332-47.e16.

20. Sauer MM, Tortorici MA, Park YJ, Walls AC, Homad L, Acton OJ, et ai. Rakenteellinen perusta laajalle koronaviruksen neutraloinnille. Nat Struct Mol Biol 2021;28:478-86.

21. Tortorici MA, Beltramello M, Lempp FA, Pinto D, Dang HV, Rosen LE, et ai. Huipputehokkaat ihmisen vasta-aineet suojaavat SARS-CoV-2-altistukselta useiden mekanismien kautta. Tiede 2020; 370:950-7.

22. Pinto D, Park YJ, Beltramello M, Walls AC, Tortorici MA, Bianchi S, et ai. SARS-CoV-2 ristineutralointi ihmisen monoklonaalisella SARS-CoV-vasta-aineella. Luonto 2020; 583:290-5.

23. Liu Y, Soh WT, Kishikawa JI, Hirose M, Nakayama EE, Li S, et ai. Tartuntakykyä lisäävä kohta SARS-CoV-2-piikkiproteiinissa, johon vasta-aineet kohdistuvat. Cell 2021; 184:3452-66.e18.

24. Liu L, Wei Q, Lin Q, Fang J, Wang H, Kwok H, et ai. Anti-spike IgG aiheuttaa vakavan akuutin keuhkovaurion vääristämällä makrofagivasteita akuutin SARS-CoV-infektion aikana. JCI Insight 2019;4:e123158.

25. Li D, Edwards RJ, Manne K, Martinez DR, Sch€afer A, Alam SM, et ai. SARS-CoV-2-infektiota tehostavat ja neutraloivat vasta-aineet in vitro ja in vivo. Cell 2021;184:4203-19.e32. 26. Poh CM, Carissimo G, Wang B, Amrun SN, Lee CY, Chee RS, et ai. Kaksi lineaarista epitooppia SARS-CoV-2-piikkiproteiinissa saa aikaan neutraloivia vasta-aineita COVID{10}}-potilailla. Nat Commun 2020;11:2806.

27. Zhang BZ, Hu YF, Chen LL, Yau T, Tong YG, Hu JC, et ai. SARS-CoV-2-piikkiproteiinin epitooppien louhinta COVID-19-potilailta. Cell Res 2020;30:702-4.

28. Stoddard CI, Galloway J, Chu HY, Shipley MM, Sung K, Itell HL, et ai. Epitooppiprofilointi paljastaa SARS-CoV-2-immuunivasteen sitoutumisen luonnollisessa infektiossa ja ristireaktiivisuuden endeemisen ihmisen CoV-viruksen kanssa. Cell Rep 2021;35: 109164.

29. Shrock E, Fujimura E, Kula T, Timms RT, Lee IH, Leng Y et ai. COVID{1}}-potilaiden virusepitooppiprofilointi paljastaa ristireaktiivisuuden ja korrelaatioiden vakavuuden. Tiede 2020;370:eabd4250.

30. Zamecnik CR, Rajan JV, Yamauchi KA, Mann SA, Loudermilk RP, Sowa GM, et ai. ReScan, moninkertainen diagnostinen putkisto, tutkii ihmisen seerumeita SARS-CoV-2- 2-antigeenien varalta. Cell Rep Med 2020;1:100123.

31. Haynes WA, Kamath K, Bozekowski J, Baum-Jones E, Campbell M, Casanovas Massana A, et ai. SARS-CoV-2-vasta-aineiden korkearesoluutioinen epitooppikartoitus ja karakterisointi suurissa COVID-19-potilasryhmissä. Commun Biol 2021;4:1317.

32. Li Y, Lai DY, Lei Q, Xu ZW, Wang F, Hou H, et ai. Systemaattinen IgG-vasteiden arviointi SARS-CoV-2-piikkiproteiinista johdetuille peptideille COVID-19-potilaiden seurantaa varten. Cell Mol Immunol 2021;18:621-31.

33. Li Y, Ma ML, Lei Q, Wang F, Hong W, Lai DY, et ai. SARS-CoV-2-piikkiproteiinin lineaarinen epitooppimaisema, joka on rakennettu 1 051 COVID-19-potilaasta. Cell Rep 2021;34:108915.

34. Wang H, Wu X, Zhang X, Hou X, Liang T, Wang D, et ai. SARS-CoV-2 Proteome Microarray COVID-19-vasta-ainevuorovaikutusten kartoittamiseen aminohapporesoluutiolla. ACS Cent Sci 2020;6:2238-49.

35. Yi Z, Ling Y, Zhang X, Chen J, Hu K, Wang Y, et ai. SARS-CoV-2:n lineaaristen B-soluepitooppien toiminnallinen kartoitus COVID-19 toipilasväestössä. Emerg Microbes Infect 2020;9:1988-96.

36. National Health Commission & National Administration of Traditional Chinese Medicine. Uuden koronaviruksen keuhkokuumeen diagnoosi- ja hoitoprotokolla (kokeiluversio 7). Chin Med J (Englanti) 2020;133:1087-95; https://doi.org/10.1097/ CM9.0000000000000819.

37. Li Y, Li CQ, Guo SJ, Guo W, Jiang HW, Li HC, et ai. Pituussuuntainen seerumin autovasta-ainevalikoiman profilointi tunnistaa leikkaukseen liittyvät biomarkkerit keuhkojen adenokarsinoomassa. EBioMedicine 2020;53:102674.

38. Zhao J, Yuan Q, Wang H, Liu W, Liao X, Su Y, et ai. Vasta-ainevasteet SARSCoV:lle-2 potilailla, joilla on uusi koronavirustauti 2019. Clin Infect Dis 2020;71: 2027-34.

39. Lucas C, Wong P, Klein J, Castro TBR, Silva J, Sundaram M, et ai. Pitkittäiset analyysit paljastavat immunologisen sytytysvirheen vakavassa COVID-taudissa-19. Luonto 2020; 584: 463-9.

40. Moore JB, June CH. Sytokiinien vapautumisoireyhtymä vakavassa COVID-taudissa-19. Tiede 2020; 368:473-4.

41. Chen J, Malone B, Llewellyn E, Grasso M, Shelton PMM, Olinares PDB, et ai. Rakenneperusta helikaasi-polymeraasikytkemiselle SARS-CoV-2 -replikaatio-transkriptiokompleksissa. Cell 2020;182:1560-73.e13.

42. Wajnberg A, Amanat F, Firpo A, Altman DR, Bailey MJ, Mansour M, et ai. Vahvat neutraloivat vasta-aineet SARS-CoV-2-infektiota vastaan ​​säilyvät kuukausia. Tiede 2020; 370:1227-30.

43. Chi X, Yan R, Zhang J, Zhang G, Zhang Y, Hao M, et ai. Neutraloiva ihmisen vasta-aine sitoutuu SARS-CoV-2-piikkiproteiinin N-terminaaliseen domeeniin. Tiede 2020; 369:650-5.

44. Tseng CT, Sbrana E, Iwata-Yoshikawa N, Newman PC, Garron T, Atmar RL, et ai. Rokotus SARS-koronavirusrokotteilla johtaa keuhkojen immunopatologiaan SARS-viruksella altistuksessa. PLoS One 2012;7:e35421.

45. Bolles M, Deming D, Long K, Agnihothram S, Whitmore A, Ferris M, et ai. Kaksoisinaktivoitu vakavan akuutin hengitystieoireyhtymän koronavirusrokote tarjoaa epätäydellisen suojan hiirissä ja indusoi lisääntynyttä eosinofiilistä proinflammatorista keuhkovastetta altistuksen yhteydessä. J Virol 2011;85:12201-15.

46. ​​Weingartl H, Czub M, Czub S, Neufeld J, Marszal P, Gren J, et ai. Immunisointi modifioidulla vacciniaviruksella Ankara-pohjaisella yhdistelmärokotteella vaikeaa akuuttia hengitystieoireyhtymää vastaan ​​liittyy lisääntyneeseen hepatiittiin freteillä. J Virol 2004;78:12672-6.

47. Yasui F, Kai C, Kitabatake M, Inoue S, Yoneda M, Yokochi S, et ai. Aiempi immunisointi vakavaan akuuttiin hengitystieoireyhtymään (SARS) liittyvällä koronaviruksen (SARS-CoV) nukleokapsidiproteiinilla aiheuttaa vakavan keuhkokuumeen SARS-CoV-tartunnan saaneilla hiirillä. J Immunol 2008;181:6337-48.

48. Deming D, Sheahan T, Heise M, Yount B, Davis N, Sims A, et ai. Rokotteen teho ikääntyville hiirille, jotka on altistettu rekombinantti SARS-CoV -tartunnan saaneille epidemia- ja zoonoosipiikkivarianteille. PLoS Med 2006;3:e525.

49. Wang Q, Zhang L, Kuwahara K, Li L, Liu Z, Li T, et ai. Immunodominantit SARS-koronaviruksen epitoopit ihmisillä saivat aikaan sekä parantavia että neutraloivia vaikutuksia ei-ihmiskädellisten infektioon. ACS Infect Dis 2016;2: 361-76.

50. Agrawal AS, Tao X, Algaissi A, Garron T, Narayanan K, Peng BH, et ai. Immunisaatio inaktivoidulla Lähi-idän hengitystieoireyhtymän koronavirusrokotteella johtaa keuhkojen immunopatologiaan, kun se altistetaan elävälle virukselle. Hum Vaccin Immunother 2016;12:2351-6.