Kahden diagnostisen määrityksen vertailu sian epidemia-ripuliviruksen seerumin neutraloivan vasta-aineen havaitsemiseksi

Abstrakti:

Laktogeeninen immuniteetti on tärkeä porsaiden suojelemiseksi monilta taudinaiheuttajilta, mukaan lukien sian epidemia-ripulivirus. Emakoiden seerumeissa kiertävät neutraloivat vasta-aineet voivat auttaa määrittämään, voisiko havaittava immuunivaste antaa suojan porsaille. Neutraloivat vasta-aineet voidaan havaita erilaisilla diagnostisilla määrityksillä. Tässä tutkimuksessa arvioitiin kahden neutraloivan vasta-ainemäärityksen diagnostiset ominaisuudet sian epidemian ripuliviruksen neutraloivien vasta-aineiden määrittämiseksi altistettujen nuorten seerumista. Neljä hoitoryhmää, kontrolliryhmä, rokottamattomat, rokotetut ennen altistusta ja rokotetut altistuksen jälkeen, koostuivat 20 nuoresta nuoresta lapsesta. Seeruminäytteet otettiin jokaiselta nuorelta sikalta ennen altistusta sian epidemia-ripulivirukselle ja sen jälkeen. Näytteistä arvioitiin neutraloivien vasta-aineiden läsnäolo fluoresoivan fokuksen neutralointimäärityksellä ja suuren suorituskyvyn neutralointimäärityksellä. Tämän tutkimuksen diagnostinen herkkyys ja spesifisyys fluoresoivan fokuksen neutralointi- ja korkean suorituskyvyn neutralointimäärityksille optimoitiin 80 % ja 80 % fluoresenssivähennyksen laimennuksella, ja ne osoittivat kohtalaista yhdenmukaisuutta kappa-tilaston perusteella. Fokusfluoresenssineutralointi- ja suuren suorituskyvyn neutralointimäärityksiä voidaan käyttää neutraloivien vasta-aineiden tilan seuraamiseen eläimissä tai eläinpopulaatiossa. Korkean suorituskyvyn määrityksellä on etuja fokusfluoresoivaan määritykseen verrattuna, koska sillä on korkeampi spesifisyys ilmoitetulla raja-arvolla ja tulosten luonne mahdollistaa suuremman erottelun yksittäisten tulosten välillä.

cistanche-lisäaine hyödyttää - lisää vastustuskykyä

Avainsanat: PEDV; neutraloiva vasta-aine; diagnostinen määritys

1. Esittely

Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) on alfakoronavirus, josta on tullut endeeminen Amerikassa sen jälkeen, kun se ilmaantui Yhdysvalloissa vuonna 2013 [1–3]. Bioturvallisuustoimenpiteet keskittyvät pitämään taudinaiheuttajat, kuten PEDV, poissa sikakarjoista taudin vaikutusten lieventämiseksi [4]. Serologinen testaus on hyödyllinen työkalu sen määrittämiseksi, ovatko siat aiemmin altistuneet taudinaiheuttajille ja ovatko ne saaneet sen tartunnan. Altistuminen voi tapahtua luonnollisesti (esim. viruksen sisältävän materiaalin nieleminen) tai tarkoituksellisesti (esim. sekoittuminen levittävien siemeneläinten kanssa, oraalinen-nasaalinen rokotus tai mahahuuhtelu). Tätä tutkimusta varten altistus saavutettiin altistamalla tarkoituksellisesti PEDV-positiiviselle kudoshomogenaatille vahvistetusta kliinisestä PEDV-epidemiasta. Song et ai. [5] osoittivat, että seerumin neutraloivien vasta-aineiden tiitterit eivät eronneet emakoiden välillä, joille annettiin oraalista tai lihaksensisäistä Vero-soluilla heikennettyä PEDV DR13 -rokotetta. Tämä tutkimus osoitti myös, että oraalisesti rokotetuilla emakoilla oli pienempi porsaiden kuolleisuus verrattuna lihaksensisäiseen rokotukseen. Lisäksi de Arriba et ai. [6] osoitti korrelaation IgA- ja IgG-vasta-aineita erittävien solujen (ASC) välillä veressä ja suolistoon liittyvän imukudoksen välillä. Emakoiden diffuusi, epiteelinen istukka estää immuunisolujen ja vasta-aineiden siirtymisen porsaisiin kohdussa, mikä tekee sioista syntyessään agammaglobulineemisia [7]. Emon immuniteetti siirtyy emakoista porsaisiin maitorauhasen eritteiden kautta, ja sillä on kriittinen rooli suolistossa leviäviä patogeenejä, kuten PEDV:tä, TGEV:tä ja rotavirusta vastaan. Siksi porsaat turvautuvat ternimaitoon ja maitoon vasta-aineisiin suojatakseen näitä taudinaiheuttajia vastaan. Seerumin immunoglobuliinit ovat suuri osa ternimaitoa, kun taas maidossa olevat immunoglobuliinit tuotetaan maitorauhasessa [8]. Siten neutraloivat vasta-ainemääritykset voivat auttaa määrittämään, voisiko havaittavissa oleva immuunivaste synnytystä edeltävässä emakossa antaa suojan porsaille. Neutraloivien vasta-aineiden mekanismeja ovat aggregaatio, viruksen sisäänpääsyn esto kohdesoluun ja viruksen replikaation esto kohdesolussa [9]. Diagnostisia määrityksiä on kehitetty PEDV:n neutraloivien vasta-aineiden havaitsemiseksi, mukaan lukien virusneutralointi (VN), fluoresoiva fokusneutralointi (FFN) ja korkean suorituskyvyn neutralointitesti (HTNT) [2,10–13]. Kuten Sarmento et ai. [2], FFN-määritys on parannus VN-määritykseen, koska määritys on herkempi, koska määritys perustuu infektoituneiden Vero-solujen pinnalla ilmentyneiden virusantigeenien havaitsemiseen, kun taas VN-määritys perustuu sytopaattiseen vaikutukseen. viruksen toimesta. Lisäksi FFN-tulokset voidaan saada nopeammin kuin VN-tulokset, koska sytopaattisen vaikutuksen havaitseminen kestää kauemmin verrattuna viruksen kiinnittymiseen FFN:ään. HTNT-määritys on lisäparannus FFN-määritykseen verrattuna, koska HTNT-määritys luottaa tulosten saamiseksi digitaaliseen kuvasytometriaan eikä teknikon tulkintaan. Näin ollen koko levy voidaan lukea alle 3 minuutissa, tuottaa kvantitatiivisen mittauksen fluoresoivan intensiteetin osalta ja mahdollisuuden tallentaa kuvia tarkastelua varten. Siten HTNT näytti olevan sopiva käytettäväksi kaupallisissa sikakarjoissa. Tässä tutkimuksessa verrattiin kahden neutraloivan vasta-ainemäärityksen diagnostisia ominaisuuksia (herkkyys ja spesifisyys) sekä positiivisia ja negatiivisia ennustavia arvoja PEDV-, FFN- ja HTNT-määrityksille. Tämä perustuu Sarmenton et al. [2] testaamalla naiiveja, tartunnan saaneita ja rokotettuja eläimiä auttaakseen validoimaan määrityksen käytettäväksi suuren suorituskyvyn diagnostisessa laboratoriossa. Sarmenton et al. [2], nollahypoteesimme on, että näiden kahden analyysin diagnostisissa ominaisuuksissa ei ole eroa neutraloivien PEDV-vasta-aineiden havaitsemiseksi PEDV-altistettujen nuorten seerumista.

cistanche-lisäaine hyödyttää - lisää vastustuskykyä

2. Materiaalit ja metodit

2.1. Lähteet ja sikojen valinta

Kuten aiemmin ovat kuvanneet Brown et ai. [14], tässä tutkimuksessa käytettiin 4 hoitoryhmää, joihin viitattiin nimillä Kontrolli, NV (rokottamaton), Pre (rokotettu ennen altistusta) ja Post (rokotettu altistuksen jälkeen). Kukin ryhmä koostui alun perin 20 kaupallisesta, risteytetystä nuoresta nuoresta nuoresta nuoresta. Yhteensä 60 nuorta poikasta valittiin kätevästi kaupalliselta sikatilalta Iowan keskustassa, jolla ei ollut historiaa PEDV:tä. Kontrolliryhmän 20 nuorta poikasta käytettiin uudelleen NV-ryhmään. NV-ryhmä koostui vain 18 porsaasta, koska kaksi nuorta poikasta poistettiin tutkimuksesta komplikaatioiden vuoksi, jotka eivät liittyneet PEDV-altistukseen.

Lisätodisteena PEDV-negatiivisesta tilasta kerättiin 12 ml verta kaulalaskimopunktiolla käyttämällä 16-mittaria, 1,5- tuuman neulaa ja 12 ml:n ruiskua. Seerumi kerättiin verinäytteistä sentrifugoimalla nopeudella 1 500 x g 8 min (min), jaettiin 1 ml:n eriin ja säilytettiin -80 ◦C:ssa. Seeruminäytteet testattiin wv-ELISA:lla Iowan osavaltion yliopiston eläinlääkärin diagnostisessa laboratoriossa (ISU-VDL, Ames, IA, USA) [15].

2.2. Eläinten jakaminen hoitoryhmiin

Kuusikymmentä nuorta poikasta jaettiin tasaisesti kolmeen ryhmään, joista kukin koostui 20 kaupallisesta, risteytysnaarasta. Neljän hoitoryhmän muodostamiseksi käytettiin peräkkäin 20 poikasta kahdessa hoitoryhmässä, CONTROL ja NV. 20 nuoren ensikoiden uudelleenkäyttö mahdollisti PEDV-positiivisten nuorten ryhmän kehittämisen ja valvonnan, jotka olivat altistuneet PEDV:lle, ja pienensi tutkimuksessa käytettyjen eläinten kokonaismäärää. Loput 40 nuorta tyttöä koostuivat PRE- ja POST-ryhmistä, ja kussakin ryhmässä oli 20 nuorta. Tapahtumien aikajana hoitoryhmittäin on kuvattu julkaisussa Brown et ai. [14]. Lyhyesti sanottuna yksittäisiä verinäytteitä kerättiin kerran viikossa kustakin hoitoryhmästä altistuksen jälkeen. Lisäselvityksiä käsitellään kohdissa 2.4 ja 2.5. Hoitoryhmän "PRE" nuoret nuoret rokotettiin ennen saapumistaan ​​ulkopuoliseen laitokseen. Hoitoryhmän "POST" nuoria nuoria lapsia rokotettiin vasta altistuksen jälkeen.

2.3. Sikojen säilytys ja hoito

Tutkimuslaitokseen saapuessaan nuoret nuoret nuoret majoittivat hoitoryhmän ryhmiin: kaikki hoitoryhmän 20 nuorta oli samassa karsinassa, jossa oli ad libitum -ruokaa ja vettä. Kaikki kynät olivat samassa huoneessa. Yksi kynä jätettiin tyhjäksi NV PRE- ja POST-ryhmien väliin kontaminaation minimoimiseksi. Rehua, vettä, huoneen lämpötilan korkeita ja alimmia arvoja sekä kosteuden ylä- ja alarajoja seurattiin tuotantostandardien noudattamisen varmistamiseksi. Terveyshavaintoja suoritettiin ja kirjattiin kerran päivässä liikkumisen, letargian, ulosteen koostumuksen ja muiden sairauden kliinisten merkkien arvioimiseksi. Korvamerkki (Integra Hog, Allflex, Dallas, TX, USA) asetettiin kunkin nuoren oikean korvaan yksittäisen eläimen tunnistamista varten.

2.4. Suullinen haaste

4-päivän tottumisjakson jälkeen jokainen CONTROLin nuorikko altistettiin suun kautta PEDV:lle käyttämällä kudoshomogenaattia, joka oli kerätty vahvistetusta PEDV-epidemiasta kaupallisella tilalla. Homogenaatin sekvensoi Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory ja sen todettiin olevan US prototyyppikanta, genoryhmä G2b. Kymmenen millilitraa homogenaattia sekoitettiin 590 ml:aan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta ja 30 ml seosta annettiin ironisesti jokaiselle nuorelle lapselle. Inokulaatti vahvistettiin PEDV-positiiviseksi reaaliaikaisella käänteiskopioijapolymeraasiketjureaktiolla CT-arvolla 19,6 ja 14,23 × 107 genomista kopiota millilitraa kohden ja ripulin kehittymistä nuorille altistuksen jälkeen. Yksittäiset verinäytteet kerättiin joka 7. päivä altistuksen jälkeen kaulalaskimopunktiolla, kuten yllä on kuvattu, päivään 42 altistuksen jälkeen. Seerumi kerättiin ja säilytettiin edellä kuvatulla tavalla ja näytteet lähetettiin ISU VDL:lle neutraloivien vasta-aineiden havaitsemiseksi fokusfluoresenssineutralointimäärityksellä ja suuren suorituskyvyn viruksen neutralointitestillä. 60. päivänä CONTROLin ensimmäisen haasteen jälkeen loput 40 nuorta poikasta tuotiin tutkimuskeskukseen ja 18 CONTROL-kotipoikasta tuli NV. Kaksi nuorta poikasta poistettiin CONTROLista tutkimukseen liittymättömien olosuhteiden vuoksi. 3-päivän saapumisen jälkeisen sopeutumisjakson jälkeen 18 nuorta poikasta altistettiin uudelleen (NV) ja 40 nuorta (PRE ja POST) altistettiin, verinäytteet kerättiin, seerumi kerättiin ja näytteet lähetettiin testattavaksi tässä kuvatulla tavalla. .

2.5. Gilttien rokottaminen

Alkuperätilalle oli jäänyt 40 nuorta poikasta, jotka tuotiin tutkimuslaitokseen 8,5 viikkoa CONTROLin saapumisen jälkeen. Kaksikymmentä nuorta poikasta oli rokotettu 5 ja 2 viikkoa ennen altistusta, kuten rokotetta valmistava yritys suositteli, kaupallisesti saatavilla olevalla tapetulla PEDV-rokotteella, genoryhmä G2b, (Porcine Epidemic Diarrhea Vaccine, Zoetis, Inc., Florham Park, NJ , USA), joka käsittää PRE-ryhmän. Loput kaksikymmentä rokotettiin samalla rokotteella 1 ja 3 viikkoa PEDV-altistuksen jälkeen, joka sisälsi POST-ryhmän. Kahdeksantoista alkuperäisestä kahdestakymmenestä CONTROL-nakosta jäi tutkimukseen ja kuului NV-ryhmään eivätkä saaneet rokotetta PEDV:tä vastaan.

cistanche-kasveja lisäävä immuunijärjestelmä

2.6. Neutralisoiva vasta-ainemääritykset

2.6.1. Fluoresoivan tarkennuksen neutralointi (FFN) -menettely

FFN:n suoritti Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory, vakiotoimintamenettely 9.5324 [16]. Lyhyesti sanottuna Vero 76 -solut valmistettiin huuhtelemalla ja inkuboimalla trypsiini-etyleenidiamiinitetraetikkahapon (EDTA) kanssa 5 minuutin ajan 37 °C:ssa. Soluista ja solujen lisääntymisalustasta valmistettiin 1:20 laimennos ja 200 µl lisättiin 96-kuoppalevyn kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 48 tuntia. Levyt kaadettiin ja huuhdeltiin viruksen inokulaatioväliaineella. Seeruminäytteet lämpöinaktivoitiin vesihauteessa 56 ◦C:ssa 30 minuutin ajan ja laimennettiin sitten 2--kertaiseksi sarjalaimennukseksi alkaen 1:10:stä levyllä. Kantavirus laimennettiin 100–200 pesäkkeitä muodostavaan yksikköön 100 µl:aa kohti ja 100 µl lisättiin jokaiseen kuoppaan ja inkuboitiin 60 minuuttia 37 ◦C:ssa 5 % hiilidioksidin (CO2) kanssa. Testilevy kaadettiin, huuhdeltiin ja 150 ui seerumi/virusseosta lisättiin vastaaviin kuoppiin ja inkuboitiin 60 minuuttia 37 °C:ssa. Seerumi/virus-seokset kaadettiin ja kuopat pestiin viruksen ymppäysväliaineella. Jokaiseen kuoppaan lisättiin 150 ui viruksen inokulaatioalustaa ja inkuboitiin 24 tuntia 37 °C:ssa ja 5 % CO2:ssa. Elatusaineet poistettiin levyltä ja solut kiinnitettiin lisäämällä 80 % asetonia, jota on jäähdytetty jäähauteessa 15 minuutin ajan. Asetoni heitettiin pois ja levy ilmakuivattiin. Valmistettiin 1:100 laimennos FITC-konjugoidusta PEDV NP monoklonaalisesta vasta-aineesta, joka oli laimennettu PBS:ään (pH 7,2), ja 50 ui lisättiin kaikkiin kuoppiin ja inkuboitiin 37 °C:ssa 60 minuuttia. Levy pestiin PBS:llä ja luettiin sitten käyttämällä fluoresenssimikroskooppia (Olympus BX51, 10X objektiivi, FITC-suodatin). Positiivisissa kuopissa ei näy fluoresoivia plakkeja ja negatiivisissa vihreitä plakkeja. Neutraloivat vasta-ainetiitterit ilmaistiin korkeimpana seerumilaimennoksena, jossa viruksen replikaation vähentyminen oli 90 % verrattuna viruskontrolliin. Näytteet, joiden tiitteri oli suurempi tai yhtä suuri kuin 20, luokiteltiin positiivisiksi PEDV:tä neutraloivien vasta-aineiden suhteen. Korkeampi tiitteri osoittaa suurempaa neutraloivien vasta-aineiden pitoisuutta näytteessä. Esimerkkejä positiivisista ja negatiivisista seeruminäytteistä on saatavilla lisämateriaaleista.

2.6.2. High Throughput Fluorescent Neutralization Test (HTNT) -menettely

HTNT:n suoritti Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory, vakiotoimintamenettely 9.5324 Version 2 [17]. Seeruminäytteet lämpöinaktivoitiin vesihauteessa 56 ◦C:ssa 30 minuutin ajan. Viruskantasarja laimennettiin 10--kertaisesti viruksen inokulaatioelatusaineeseen (DMEM, jossa oli 2 µg/ml trypsiini-TPCK:ta), siirrettiin Vero 81 -soluihin (ATTC® CCL-81™) ja inkuboitiin 37 ◦C:ssa. 5 % CO2:lla 5 päivän ajan. Viimeistä laimennusta, jossa havaittiin sytopaattinen vaikutus, käytettiin kudosviljelmän tarttuvan annoksen mediaanimäärän (TCID50) määrittämiseen Spearmanin ja Karberin menetelmällä [18]. Sata mikrolitraa soluliuosta (solujen lisääntymisalusta, trypsiini-EDTA ja Vero 81 -solut) laimennettiin 100 µl:lla solujen lisääntymiselatusainetta (DMEM, jossa oli 10 % FBS:ää ja 1 % penisilliini-streptomysiiniä) 1:1-laimennoksen saamiseksi. . Hemosytometriä käytettiin laskemaan ja laskemaan laimennos 5 × 104 solua/kuoppa ja lisättiin jokaiseen kuoppaan kirkaspohjaisella mustalla 96-kuoppalevyllä (Coring 96-kuoppainen CellBind-mikrolevy, Sigma) ja inkuboitiin 48 tuntia 37 ◦C 5 % CO2:lla, jotta solut konfluenttuvat (100 % konfluentti). Jokaisella levyllä oli positiivinen kontrolli, negatiivinen kontrolli ja viruskontrollikuopat. Sitten viisi mikrolitraa lämmöllä inaktivoituja kontrolleja ja näytteitä laitettiin kahteen rinnakkaiskuoppaan 1:40-laimennoksen tekemiseksi ensin 1:20 lisäämällä 95 µl viruksen inokulaatioalustaa, sitten 100 µl 1:10 laimennettua PEDV-virusta (3,16 × 105). TCID50/ml). Seerumi/virusseosta inkuboitiin 1 tunti 37 °C:ssa 5 % C02:lla. Kaikki testilevyn solukuopat pestiin 3 kertaa 150 µl:lla solunpesualustaa (DMEM, jossa oli 1 % penisilliini-streptomysiiniä), ja 150 µl seerumi/virusseosta ja viruskontrollit siirrettiin testilevylle ja inkuboitiin 90 minuuttia. 37 ◦C:ssa. Seerumi/virusseos heitettiin pois ja levyt pestiin kerran solunpesuväliaineella, kuten edellä on kuvattu, ja sen jälkeen kerran viruksen ymppäysväliaineella. Viruksen inokulaatioelatusaine (150 ui) lisättiin jokaiseen kuoppaan ja inkuboitiin 24 tuntia 37 °C:ssa 5 % CO2:n kanssa. Viruksen inokulaatioelatusaine heitettiin pois ja levy pestiin PBS:llä pH 7,4. Solut kiinnitettiin lisäämällä 4 °C, 80 % asetonia jokaiseen kuoppaan ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa 15 minuuttia. Sitten asetoni poistettiin ja levyä ilmakuivattiin 30 minuuttia. Jokainen kuoppa huuhdeltiin PBS:llä pH 7,4. 50 µl FITC-konjugoitua PEDV NP monoklonaalista vasta-ainetta (SD6-29-klooni, Medgene Labs) laimennettuna 1:100 PBS:ään pH 7,4 lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 60 minuuttia 37 °C:ssa. Levy pestiin neljä kertaa PBS:llä pH 7,4, jolloin viimeinen pesu jätettiin levylle 5 minuutiksi, sitten heitettiin pois ja korvattiin 100 ul:lla PBS:ää pH 7,4. Levyt luettiin sitten SpectraMax i3×:lla käyttäen SoftMax Pro 6.5:tä (Molecular Devices, San Jose, CA, USA) käyttämällä 30 ms:n valotusaikaa ja 20 um:n polttovälin säätöjä 541 aallonpituudella. Näytteet, joiden kokonaisfluoresenssin vähennys (%FR) oli suurempi tai yhtä suuri kuin 85 %, luokiteltiin positiivisiksi neutraloivien vasta-aineiden suhteen [2]. Fluoresenssin kokonaisvähennys laskettiin 100 − ([näytteen keskimääräinen kokonaisfluoresenssin intensiteetti/keskimääräinen negatiivinen kontrollin kokonaisfluoresenssin intensiteetti]) × 100). Suurempi kokonaisfluoresenssin väheneminen osoittaa korkeampia neutraloivien vasta-ainepitoisuuksia näytteissä. Esimerkkejä positiivisista ja negatiivisista seeruminäytteistä on saatavilla lisämateriaaleista.

2.7. Diagnostiset ominaisuudet: herkkyys ja spesifisyys sekä positiiviset ja negatiiviset ennustavat arvot

Diagnostinen herkkyys ja spesifisyys laskettiin HTNT:lle käyttämällä %FR-rajaa 70, 75, 80, 85 ja 90 ja FFN:lle käyttämällä näytteen laimennusraja-arvoja 20, 40, 80 ja 160 optimoidun raja-arvon määrittämiseksi. Optimoitu määriteltiin raja-arvoksi, jossa diagnostinen spesifisyys maksimoidaan minimaalisella diagnostisen spesifisyyden menetyksellä. Seitsemänkymmentäkuusi tunnetun PEDV-negatiivisen näytteen alajoukko valittiin kahdesta ensimmäisestä näytteenottopisteestä CONTROL- ja POST-ryhmille. NV-ryhmän kahdesta viimeisestä näytteenottopisteestä valittiin 36 tunnettua PEDV-positiivista näytettä. Positiivisten näytteiden määrittämiseen käytettiin yli 85:n raja-arvoa määrityksen ISU VDL -standardin toimintamenettelyn mukaisesti [17]. Diagnostinen herkkyys arvioitiin jakamalla positiiviseksi osoittautuneiden tunnettujen positiivisten näytteiden määrä tunnettujen positiivisten näytteiden kokonaismäärällä. Diagnostinen spesifisyys arvioitiin jakamalla negatiivisiksi testattujen tunnettujen negatiivisten näytteiden lukumäärä tunnettujen negatiivisten näytteiden lukumäärällä. Raja, joka optimoi diagnostisen spesifisyyden ja herkkyyden, valittiin määrityksen vertailua varten. Tätä tutkimusta varten diagnostinen spesifisyys (DSp) ja herkkyys (DSe) maksimoitiin, missä herkkyys- ja spesifisyysarvojen välisen eron absoluuttinen arvo on pienin. Positiivinen ennustearvo (PPV) arvioitiin jakamalla positiivisten (TP) tunnettujen positiivisten näytteiden lukumäärä testipositiivisten näytteiden kokonaismäärällä (TP plus väärä positiivinen [FP]). Negatiivinen ennustearvo (NPV) arvioitiin jakamalla negatiivisiksi testattujen tunnettujen negatiivisten näytteiden (TN) lukumäärä testinegatiivisten näytteiden kokonaismäärällä (TN plus väärä negatiivinen [FN]).

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Napsauta tästä nähdäksesi Cistanche Enhance Immunity -tuotteet

【Kysy lisää】 Sähköposti:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.8. Tilastollinen analyysi

Tässä tutkimuksessa ei ollut epäselviä tuloksia tai puuttuvia tietoja. Kaikki tiedot analysoitiin käyttämällä SAS-versiota 9.4 (SAS Instit. Cary NC). Käytettiin 609 havaintoa 6{{10}} porsaasta, jotka kuuluivat yhteen neljästä ryhmästä. Kaksi mahdollista raja-arvoa (40 ja 80) FFN-määritykseen otettiin huomioon ja niitä verrattiin HTNT:n raja-arvoon 85. Jokaiselle soveltui lineaarinen sekavaikutusmalli selittämään ryhmän vaikutusta FFN- ja HTNT-määritysten yhteensopivuuteen sikakohtaisella satunnaisvaikutuksella. Kaikki ryhmien parivertailuanalyysit suoritettiin. Lisäksi kahdelle kolmesta FFN-määrityksessä käytetystä raja-arvosta laskettiin Cohenin Kappa-kerroin FFN- ja HTNT-määritysten yleisen yhteensopivuuden määrittämiseksi. Kappa-kertoimet tulkittiin seuraavasti: vähemmän kuin 0.0, "huono" sopimus; välillä 0.0 ja 0.20, "lievä" sopimus; välillä 0.21 ja {{30}}.40, "reilu" sopimus; välillä 0,41 - 0,60, "kohtalainen" sopimus; välillä 0,61–0,80, "olennainen" sopimus; ja välillä 0,81 ja 1,0, "melkein täydellinen" sopimus [19]. Merkitys asetettiin arvoon p Pienempi tai yhtä suuri kuin 0,05. Laatikko- ja viiksikuvat kehitettiin R-ohjelmistolla.

3. Tulokset

Taulukko 1 esittää diagnostisen herkkyyden ja spesifisyyden FFN- ja HTNT-määrityksille valituilla raja-arvoilla. Tämän tutkimuksen kahden määrityksen diagnostinen herkkyys ja spesifisyys optimoitiin 80 %:n ja 80 %:n FR-laimennoksen raja-arvolla.

Taulukko 1. Diagnostinen herkkyys (DSe), diagnostinen spesifisyys (DSp), positiivinen ennustearvo (PPV) ja negatiivinen ennustearvo (NPV) HTNT- ja FFN-määrityksille käyttäen erilaisia ​​taulukon toisella rivillä lueteltuja raja-arvoja. Esimerkiksi HTNT-määrityksen raja-arvolla 70 DSe=0,97 (97 %), DSP=0,91 (91 %), PPV=0,83 ( 83 %) ja NPV=0,95 (95 %). U=määrittelemätön.

Kuvio 1 näyttää laatikko- ja viiksikuvaajat HTNT-tuloksista päivinä altistuksen jälkeen tutkimushoitoryhmittäin. Näytteet CONTROL- ja POST-ryhmistä (n=76) luokiteltiin negatiivisiksi päivinä −4, 0 ja 7, kuten odotettiin sikojen aiemman tilan vuoksi. NV-ryhmä kehitti anamnestisen vasteen haasteen jälkeen. HTNT-tulosten välillä esiintyi vähentynyttä vaihtelua, mikä osoittaa arvoalueen pienenemisen molemmissa rokotetuissa ryhmissä (PRE ja POST) PEDV-altistuksen jälkeen. Tämä vähentynyt vaihtelu voidaan havaita kuvassa 1, kun POST- ja PRE-kuvaajien viikset ja poikkeamat lyhenevät 14 päivää altistuksen jälkeen. Kuvio 2 esittää luonnollisten logaritmittamuunnettujen FFN-tulosten laatikko- ja viiksidiagrammit päivinä altistuksen jälkeen hoitoryhmittäin, joilla on samanlaiset tulokset kuin HTNT-määrityksellä. Sekä HTNT (kuvio 1) että FFN (kuvio 2) tulokset osoittavat vasteen altistukselle ja rokotteelle, kuten havaitaan prosentuaalisen FR:n ja tiittereiden nousuna molemmista määrityksistä. Vaikka kunkin määrityksen tulosten vaihtelu oli suuruudeltaan samanlainen, se väheni homologisen altistuksen (NV) jälkeen. Vähentynyttä vaihtelua esiintyi myös rokotuksen jälkeen (PRE ja POST). Tämä neutraloivien vasta-aineiden arvojen vaihtelu viikoittain altistuksen jälkeen vähenee rokotuksen ja homologisen PEDV-altistuksen jälkeen (kuviot 1 ja 2). Neutraloivan vasta-aineen vaihtelun vähenemisessä oli samanlainen taipumus, joka havaittiin sekä rokotettujen että homologisten altistusryhmien määritystuloksissa. Homologinen PEDV-altistus ja toiset rokotukset tuottivat anamnestisen vasteen, joka synnytti korkeamman tason neutraloivia vasta-aineita pienemmällä vaihtelulla sikojen välillä verrattuna ennen altistusta ja rokotuksen jälkeisiin arvoihin molemmilla määrityksillä mitattuna (kuvio 1). Diagnostisen herkkyyden ja spesifisyyden analyysin perusteella rajat 80 (tiitteri) ja 85 (%FR) valittiin analysoimaan testiyhteensopivuutta vastaavasti FFN- ja HTNT-määrityksille. Kappa-testi osoitti "kohtalaisen" yhtäpitävyyden arvolla 0,5257 95 %:n luottamusvälillä 0,461, 0,5904 määrityksistä raja-arvolle 80 (tiitteri) ja 85 (%FR) FFN- ja HTNT-määritykset.

Kuvio 1. HTNT-vasta-ainevastekäyrien laatikko-ja-viis-kaaviot altistuksen jälkeisten päivien mukaan kussakin hoitoryhmässä. Keskimmäinen palkki edustaa tulosten mediaaniarvoa viikoittain. Saranat (laatikon ylä- ja alaosa) edustavat ensimmäistä (Q1) ja kolmatta (Q3) kvartiilia. Varjostettu alue edustaa interkvartiilialuetta (IQR). Viikset määritetään seuraavasti: Yläviikset=Q3 + 1.5∗IQR; Pohjaviikset=Q1 + 1.5∗IQR. Jos mikään datapiste ei ole lasketussa arvossa, seuraava datapiste, joka on lähimpänä Q1:tä tai Q3:a, on viikun raja. Avoimet ympyrät (◦) osoittavat poikkeavia arvoja. Leikkaus 85 on merkitty katkoviivalla kohdassa 85 y-akselilla.

Kuva 2. Box-and-whisker-kuvaajat FFN-vasta-ainevastekäyristä altistuksen jälkeisten päivien mukaan kussakin hoitoryhmässä. Keskimmäinen palkki edustaa tulosten mediaaniarvoa viikoittain. Saranat (laatikon ylä- ja alaosa) edustavat ensimmäistä (Q1) ja kolmatta (Q3) kvartiilia. Varjostettu alue edustaa interkvartiilialuetta (IQR). Viikset määritetään seuraavasti: Yläviikset=Q3 + 1.5∗IQR; Pohjaviikset=Q1 + 1.5∗IQR. Jos mikään datapiste ei ole lasketussa arvossa, seuraava datapiste, joka on lähimpänä Q1:tä tai Q3:a, on viikun raja. Avoimet ympyrät (◦) osoittavat poikkeavia arvoja. Leikkaus 40 on merkitty katkoviivalla kohdassa ln(40) y-akselilla.

4. Keskustelu

Oletamme, että vähentynyt vaihtelu ja anamnestinen vaste liittyvät homogeeniseen lauman immuniteettiin ja taudeilta suojaamiseen, vaikka kliinisiä oireita havaittiin edelleen PRE-ryhmässä, kuten aiemmin on kuvattu [14]. Näiden eläinten kliinistä vaikutusta ja taudin vakavuutta ei arvioitu tätä tutkimusta varten. Tauti ilmenee eri tavalla aikuisilla ja vastasyntyneillä, ja vastasyntyneiden kliiniset oireet ja kuolema ovat vakavampia kuin aikuisilla eläimillä [1,20]. Vaikka kiertävät neutraloivat vasta-ainetasot eivät yksin anna suojaa [21], niitä voidaan käyttää arvioitaessa vasta-ainevastetta tahallisen altistuksen tai rokotuksen antamisen jälkeen karjoissa. Vaikka viremian puuttuminen on tyypillistä PEDV:lle, viremiaa on raportoitu porsailla jopa 4 viikon ikäisillä [22,23]. Siten kiertävät neutraloivat vasta-aineet voivat vaikuttaa taudin kliiniseen kulumiseen [21]. Laktogeeninen immuniteetti, erityisesti IgA rintarauhasen eritteissä, olisi kuitenkin tarkempi mittaus porsaiden suojasta [21]. Tässä tutkimuksessa kuvattuja määrityksiä voitaisiin käyttää seerumin neutraloivien vasta-aineiden tarkkailemiseen rokotuksen jälkeen emakoiden tai nuorten emakoiden ryhmissä sen lisäksi, että kerätään maitorauhasen eritteitä laktogeenisen/erittävän IgA:n testaamiseksi. Olisi hyödyllistä, jos näistä määrityksistä saadut tiedot voisivat ennustaa rokotuksen jälkeen tuotetun laktogeenisen immuniteetin määrän ja stabiilisuuden. Sitä ei kuitenkaan analysoitu tässä tutkimuksessa. Rokotuksen jälkeisten seerumin IgG-vasta-ainevasteiden on osoitettu ennustavan ternimaista IgG-vastetta, mutta seerumin neutraloivien vasta-aineiden ja maitorauhasen eritteiden vasta-aineiden välillä ei ollut korrelaatiota [15]. Vaikka seerumia neutraloivien vasta-aineiden ja maitorauhasen eritteiden vasta-aineiden välillä ei ollut korrelaatiota, rokotetuilla eläimillä osoitettiin olevan korkeampi neutraloivien vasta-aineiden määrä rintarauhasissa verrattuna kontrollieläimiin [15]. Siksi, kuten Bjustrom-Kraft et ai. [15], jos seerumin neutraloivien vasta-aineiden määrä on korkea, IgG- ja IgA-arvot rintarauhasen eritteissä voivat myös lisääntyä. Siten seeruminäytteiden kerääminen ennen naaraiden siirtämistä porsihuoneeseen minimoisi synnytyksen edeltävän veren ja maitorauhasen eritteiden keräämisen aikana aiheutuvan stressin ja kivun, joka voi vaikuttaa negatiivisesti emakkoon ja pentueeseen [24]. Käyttäjien on tärkeää ymmärtää, kuinka raja-arvo voi vaikuttaa määrityksen diagnostiseen herkkyyteen ja spesifisyyteen. Raja-arvon kasvattaminen vähentää väärien positiivisten tulosten määrää ja lisää väärien negatiivisten tulosten määrää. Päinvastoin, raja-arvon pienentäminen lisää väärien positiivisten tulosten määrää ja vähentää väärien negatiivisten tulosten määrää. Tämän tiedon avulla käyttäjä voi valita, mitä raja-arvoa käyttää omassa tilanteessaan. Tätä tutkimusta varten tämän tutkimuksen ja aiempien Sarmenton et al. julkaisemien tulosten perusteella. [2], valitsimme HTNT:lle 80 % FR:n ja 80 FFN:n laimennuksen. Näillä raja-arvoilla diagnostinen spesifisyys on korkeampi HTNT:lle (97 %) verrattuna FFN:ään (76 %) ja tarjoaa korkeamman positiivisen ennustusarvon HTNT:stä verrattuna FFN:ään. On myös ymmärrettävä, että ennustavat arvot riippuvat taudin esiintyvyydestä [25,26]. Tässä tutkimuksessa esiintyvyys oli luokiteltujen näytteiden perusteella 32,1 % (36 positiivista ja 76 negatiivista näytettä). Kun levinneisyys lisääntyy, myös PPV kasvaisi, koska testattu eläin (näyte) on todennäköisemmin positiivinen; kun esiintyvyys laskee, NPV pienenee. Kuviot 3A ja B havainnollistavat tätä HTNT- ja FFN-määrityksille eri raja-arvoilla, jotka on arvioitu tässä tutkimuksessa Erbin [25] kuvaamien menetelmien mukaisesti. Siksi diagnostisia tuloksia harkittaessa on otettava huomioon määrityksen diagnostinen herkkyys ja spesifisyys ja ymmärrettävä esiintyvyys ryhmässä, jos käytetään ennustavia arvoja.

Kuva 3. (A). Positiiviset Ennustavat arvot HTNT (mustat viivat) ja FFN (harmaat viivat) -määrityksille eri raja-arvoilla. HTNT:lle ei ole edustettuna rajaa 90. (B). Negatiiviset ennustavat arvot tai HTNT (mustat viivat) ja FFN (harmaat viivat) määritykset eri raja-arvoilla. FFN-määrityksessä ei ole esitetty raja-arvoa 20.

HTNT:llä on parempi diagnostinen herkkyys ja spesifisyys verrattuna FFN:ään. Vasta-ainetuloksia analysoitaessa tämä on ihanteellinen minimoimaan väärien positiivisten ja väärien negatiivisten tulosten lukumäärä. Esimerkiksi kun käytimme 80:n raja-arvoa FFN:lle, havaitsimme 97 %:n herkkyyden ja 76 %:n spesifisyyden. Tämä tarkoittaa, että vääriä negatiivisia tuloksia olisi vähän, mutta vääriä positiivisia olisi suuri määrä. Jos tulokset luokitellaan virheellisesti positiivisiksi, tämä voi johtaa virheelliseen tulkintaan, jonka mukaan laumassa on vasta-aineita PEDV:tä vastaan, vaikka niitä ei itse asiassa ole. Koska HTNT:llä on korkeampi diagnostiikka ja spesifisyydet eri raja-arvoissa, se on edullinen määritys PEDV-vasta-aineiden havaitsemiseksi. Tulokset Sarmentolta et ai. [2] osoitti paljon korkeampia diagnostisia spesifisyyksiä FFN:lle ja vertailukelpoisia herkkyydet ja spesifisyydet HTNT:lle. Nämä diagnostiset määritykset osoittivat kohtalaista yhdenmukaisuutta kappa-tilaston (K) mukaan. Yksi κ:n heikkous on, että yhtä testiä on pidettävä kultastandardina. Kun verrataan kahta epätäydellistä määritystä, tämä voi vääristää κ:n tulkintaa. Tätä tutkimusta varten arvioimme määritysten diagnostisen suorituskyvyn yhdessä κ:n kanssa määrittääksemme, että testi on yhtäpitävä, mutta sillä voi olla erilainen hyöty. HTNT:n lisäetu FFN-määritykseen verrattuna on se, että HTNT-tulokset lasketaan jatkuvista tiedoista verrattuna FFN:n kategorisiin arvoihin (titrauksiin). HTNT-tietojen jatkuva luonne mahdollistaa näytetulosten paremman erottelun emakoiden neutraloivan vasta-aineen tilan kuvaamiseksi. Kuten Sarmento et ai. [2], HTNT:llä on lyhyempi 96-kuoppaisen levyn lukuaika alle 4 minuuttiin, mikä mahdollistaa nopeamman tulosten käsittelyn. Verenkierrossa olevat systeemiset vasta-aineet voivat edistää porsaiden suojaa PEDV-infektioita vastaan ​​[21]. Ei kuitenkaan ole olemassa kirjallisuutta siitä, mikä määrä emakossa kiertävää neutraloivaa vasta-ainetta antaisi PEDV-suojan porsaille. Verenkierrossa olevien vasta-aineiden korkeat tasot johtavat korkeampiin pitoisuuksiin ternimaidossa ja antavat paremman suojan. Lisäarviointi on perusteltua sen määrittämiseksi, milloin tiineyden aikana kerätään näytteitä, ja ternimaista vasta-ainesuojasta PEDV-infektiota vastaan. Laktogeeninen ja limakalvoimmuniteetti on elintärkeää PEDV:lle altistuneiden sikojen selviytymiselle. Vasta-aineet kerääntyvät maitoon suolen-MG-sIGA-akselin kautta ja siirtyvät porsaisiin suojaamaan. Langel et ai. [27] havaitsivat, että ensimmäisen ja kolmannen raskauskolmanneksen aikana altistuneilla nuorilla nuorilla oli merkittävästi korkeammat verenkierrossa olevien IgA-, IgG- ja neutraloivien vasta-aineiden tasot. Lisäksi Langel et ai. [27] havaitsivat, että toisella raskauskolmanneksella PEDV:lle altistuneiden nuorten porsaiden eloonjäämisaste oli 100 % verrattuna alle 87,2 %:iin muilla raskauskolmanneksilla, mikä viittaa siihen, että korkea seerumin IgA, IgG ja neutraloivat vasta-aineet liittyvät porsaiden eloonjäämiseen. PEDV. Vaikka seerumin vasta-aineet eivät anna suojaa PEDV:lle, tutkimuksemme tulokset viittaavat siihen, että seerumin neutraloivat vasta-ainetasot liittyvät suojaukseen PEDV-infektiota vastaan. Kuten Brown et ai. ovat aiemmin raportoineet. [14] PEDV erittyy ulosteeseen homologisen altistuksen ja nuorten poikasten rokotuksen jälkeen. Tässä tutkimuksessa käytettiin näytteitä samoista eläimistä kuin Brown et ai. [14]. osoittaa lisäksi, että lisääntynyt seerumin neutraloiva vasta-aine altistusaltistuksen tai rokotuksen jälkeen ei vaikuta viruksen leviämismalliin, koska vasta-ainetasot nousivat altistuksen ja rokotuksen jälkeen. Lisätutkimukset ovat perusteltuja sen varmistamiseksi, liittyykö ulosteeseen erittyneen viruksen määrä seerumissa olevan neutraloivan vasta-aineen määrään [21].

cistanche-edut miehille - vahvistavat immuunijärjestelmää

5. Johtopäätökset

Tämän tutkimuksen nollahypoteesi oli, että kahden PEDV:tä neutraloivan vasta-ainemäärityksen, FFN:n ja HTNT:n, diagnostisissa ominaisuuksissa ei ollut eroa. Tulokset osoittavat, että nämä määritykset ovat kohtalaisen yhtäpitäviä kappa-tilaston perusteella, kun taas niiden diagnostisissa ominaisuuksissa ja ennustearvoissa on vaihtelua määrityksen raja-arvon perusteella. Näitä määrityksiä voitaisiin käyttää karjan rokotusvasteen mittaamiseen. Nollahypoteesin hylkäämättä jättäminen osoittaa, että HTNT on ensisijainen testi PEDV:tä neutraloivien vasta-aineiden havaitsemiseksi seerumista. Sekä PRE- että POST-ryhmien rokotuksen jälkeen tämä tutkimus havaitsi suurimman osan tuloksista positiivisina. PRE-ryhmässä myös tulosten vaihtelun väheneminen seurasi haastetta. Nämä tulokset viittaavat siihen, että sikojen lääkärit voisivat mitata seerumia neutraloivia vasta-aineita määrittääkseen, annetaanko PEDV-rokotteita asianmukaisesti laumassa.

Viitteet

1. Saif, L.; Wang, Q.; Vlasova, A.; Jung, K.; Xiao, S. Coronaviruses. In Diseases of Swine, 11. painos; Zimmerman, JJ, toim.; Wiley Blackwell: Hoboken, NJ, USA, 2019.

2. Sarmento, LV; Poonsuk, K.; Tian, ​​L.; Mora-Diaz, JC; Main, RG; Baum, DH; Zimmerman, JJ; Gimenez-Lirola, LG Sikojen epidemian ripulivirusta neutraloivan vasta-aineen havaitseminen korkean suorituskyvyn kuvantamissytometriaa käyttämällä. J. Vet. Diagn. Tutki. 2020, 32, 324–328. [CrossRef]

3. Stevenson, GW; Hoang, H.; Schwartz, KJ; Burrough, ER; Sun, D.; Madson, D.; Cooper, VL; Pillatzki, A.; Gauger, P.; Schmitt, BJ; et ai. Sikojen epidemian ripuliviruksen ilmaantuminen Yhdysvalloissa: Kliiniset merkit, leesiot ja virusgenomisekvenssit. J. Vet. Diagn. Tutki. 2013, 25, 649–654. [CrossRef]

4. Kim, Y.; Yang, M.; Goyal, SM; Cheeran, MC; Torremorell, M. Bioturvallisuustoimenpiteiden arviointi sian epidemian ripuliviruksen epäsuoran leviämisen estämiseksi. BMC Vet. Res. 2017, 13, 89. [CrossRef]

5. Song, DS; Voi JS; Kang, BK; Yang, JS; Moon, HJ; Joo, HS; Jang, YS; Park, BK Vero-solujen heikennetyn sian epidemian ripuliviruksen DR13-kannan oraalinen tehokkuus. Res. Vet. Sci. 2007, 82, 134–140. [CrossRef] [PubMed]

6. de Arriba, ML; Carvajal, A.; Pozo, J.; Rubio, P. Limakalvo- ja systeemiset isotyyppispesifiset vasta-ainevasteet ja suoja tavanomaisissa sioissa, jotka ovat altistuneet virulentille tai heikennetylle sian epidemia-ripulivirukselle. Vet. Immunol. Immunopatoli. 2002, 85, 85–97. [CrossRef] [PubMed]

7. Furukawa, S.; Kuroda, Y.; Sugiyama, A. Istukan histologisen rakenteen vertailu koe-eläimillä. J. Toxicol. Pathol. 2014, 27, 11–18. [CrossRef] [PubMed]

8. Bourne, FJ; Curtis, J. Immunoglobiinien IgG, IgA ja IgM siirto seerumista ternimaitoon ja emakon maitoon. Immunology 1973, 24, 157-162. [PubMed]

9. Parren, PW; Burton, DR Vasta-aineiden antiviraalinen aktiivisuus in vitro ja in vivo. Adv. Immunol. 2001, 77, 195–262. [CrossRef]

10. Bjustrom-Kraft, J.; Woodard, K.; Gimenez-Lirola, L.; Rotolo, M.; Wang, C.; Sun, Y.; Lasley, P.; Zhang, J.; Baum, D.; Gauger, P.; et ai. Sikojen epidemia ripuliviruksen (PEDV) havaitseminen ja vasta-ainevaste kaupallisissa kasvavissa sioissa. BMC Vet. Res. 2016, 12, 99. [CrossRef]

11. Voi, JS; Song, DS; Yang, JS; Song, JY; Moon, HJ; Kim, TY; Park, BK Entsyymi-immunosorbenttimäärityksen ja seerumin neutralisaatiotestin vertailu sian epidemian ripulivirusinfektion serodiagnoosiksi. J. Vet. Sci. 2005, 6, 349–352. [CrossRef]

12. Okda, F.; Liu, X.; Singrey, A.; Clement, T.; Nelson, J.; Christopher-Hennings, J.; Nelson, EA; Lawson, S. Epäsuoran ELISA:n, esto-ELISA:n, fluoresoivan mikropallon immunomäärityksen ja fluoresoivan fokuksen neutralointimäärityksen kehittäminen sian epidemian ripuliviruksen pohjoisamerikkalaisille kannoille altistumisen serologiseen arviointiin. BMC Vet. Res. 2015, 11, 180. [CrossRef] [PubMed]

13. Chen, Q.; Li, G.; Stasko, J.; Thomas, JT; Stensland, WR; Pillatzki, AE; Mittari, PC; Schwartz, KJ; Madson, D.; Yoon, KJ; et ai. Vuoden 2013 taudinpurkaukseen liittyvien sikojen epidemian ripulivirusten eristäminen ja karakterisointi Yhdysvalloissa. J. Clin. Microbiol. 2014, 52, 234–243. [CrossRef]

14. Brown, J.; Rademacher, C.; Baker, S. Kaupallisen sian epidemia-ripulivirusrokotteen tehokkuus viruksen leviämisen keston lyhentämisessä ensikoilla. JSHAP 2019, 27, 256–264.

15. Bjustrom-Kraft, J.; Woodard, K.; Giménez-Lirola, L. Seerumin ja maitorauhasen erityksen vasta-ainevasteet sian epidemia-ripuli-immuunivasteilla sian epidemia-ripulirokotuksen jälkeen. JSHAP 2018, 26, 34–40.

16. Iowan osavaltion yliopisto. Menettely sian epidemian ripuliviruksen (PEDV) fluoresoivan fokuksen neutralointitestin (FFN) testaamiseksi. Serology 2017, 1–7.

17. Iowan osavaltion yliopisto. Menettely sian epidemian ripuliviruksen (PEDV) High Throughput Virus Neutralization Test (HTNT) -testille. Serology 2017, 1–16.

18. Hierholzer, JC; Killington, RA; Kangro, HO; Mahy, BWJ Virology Methods Manual; Academic Press: Lontoo, Iso-Britannia, 1996; s. 21.

19. Thrusfield, M. Veterinary Epidemiology, 2. painos; Blackwell Science LTD: Hoboken, NJ, USA, 1995; s. 479.

20. Lee, C. Porcine epidemic ripulivirus: nouseva ja uudelleen ilmaantuva epitsoottinen sian virus. Virol. J. 2015, 12, 193. [CrossRef]

21. Poonsuk, K.; Gimenez-Lirola, LG; Zhang, J.; Arruda, P.; Chen, Q.; Correa da Silva Carrion, L.; Magtoto, R.; Pineyro, P.; Sarmento, L.; Wang, C.; et ai. Onko kiertävällä vasta-aineella roolia porsaiden suojelemisessa sian epidemia-ripulivirukselta? PLoS ONE 2016, 11, e0153041. [CrossRef]

22. Niederwerder, MC; Nietfeld, JC; Bai, J.; Peddireddi, L.; Breazeale, B.; Anderson, J.; Kerrigan, MA; An, B.; Oberst, RD; Crawford, K.; et ai. Sikojen epidemian ripuliviruksen kudosten lokalisointi, irtoaminen, viruksen kulkeutuminen, vasta-ainevaste ja aerosolivälitys 4-viikon ikäisten ruokintaporsaiden rokotuksen jälkeen. J. Vet. Diagn. Sijoittaa. 2016, 28, 671–678. [CrossRef]

23. Madson, DM; Arruda, PH; Magstadt, DR; Burrough, ER; Hoang, H.; Sun, D.; Bower, LP; Bhandari, M.; Mittari, PC; Stevenson, GW; et ai. Sikojen epidemia-ripuliviruksen karakterisointi eristää US/Iowa/18984/2013 tartunnan 1-päivän ikäisissä keisarileikkausperäisissä ternimaitoa vailla olevissa porsaissa. Vet. Pathol. 2016, 53, 44–52. [CrossRef]

24. Mainau, E.; Manteca, X. Posituksen aiheuttama kipu ja epämukavuus lehmillä ja emakoilla. Appl. Anim. Behav. Sci. 2011, 135, 241–251. [CrossRef]

25. Erb, HN Ennakkotodennäköisyys (ennakkotestin paras arvaus) vaikuttaa diagnostisten testien ennustaviin arvoihin. Vet. Clin. Pathol. 2011, 40, 154–158. [CrossRef] [PubMed]

26. Tenny, S.; Hoffman, MR:n esiintyvyys. StatPearlsissä; StatPearls Publishing: Treasure Island, FL, USA, 2022. 27. Langel, SN; Paim, FC; Alhamo, MA; Buckley, A.; Van Geelen, A.; Lager, KM; Vlasova, AN; Saif, LJ Stage of gestation at Porcine Epidemic Ripuli Virusinfektio raskaana olevilla sioilla vaikuttaa emon immuniteettiin ja vastasyntyneiden imettävien porsaiden laktogeeniseen immuunijärjestelmään. Edessä. Immunol. 2019, 10, 727. [CrossRef] [PubMed]