Tyrosiinikinaasi C-Abl tehostaa interferonivälitteistä antiviraalista immuniteettia STAT1-fosforylaatiolla

YHTEENVETO

Interferonin (IFN) indusoima signaalimuuntimen ja transkriptioperheen aktivaattorin (STAT) aktivaatio on tärkeä tapahtuma antiviraalisessa immuniteetissa. Tässä osoitamme, että ei-reseptorikinaasit c-Abl ja Arg ovat suoraan vuorovaikutuksessa STAT1:n kanssa ja tehostavat STAT1:n fosforylaatiota Y701:ssä. c-Abl/Arg voisi välittää STAT1-fosforylaatiota Janus-kinaaseista riippumatta IFNg:n puuttuessa ja voimistaa IFNg-välitteistä STAT1-fosforylaatiota. Lisäksi STAT1:n dimerisaatiota, tuman translokaatiota ja alavirran geenitranskriptiota säätelee c-Abl/Arg. c-Abl/Arg (abl1/abl2) -puutos vaimentaa merkittävästi antiviraalisia vasteita vesicular stomatitis -viruksen infektoimissa soluissa. Vehikkeliin verrattuna c-Abl/Arg-selektiivisen inhibiittorin AMN107 antaminen johti merkittävästi lisääntyneeseen kuolleisuuteen hiirillä, jotka olivat infektoituneet ihmisen influenssaviruksella. Tutkimuksemme osoittaa, että c-Abl:lla on olennainen rooli STAT1-aktivaatiosignalointireitissä ja se tarjoaa tärkeän lähestymistavan antiviraalisen immuniteetin säätelyyn.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

JOHDANTO

Interferonit (IFN:t) näyttelevät avainroolia synnynnäisessä immuniteetissa virusinfektioita vastaan ​​ja immuunivalvonnassa säätelemällä Janus-kinaasien (JAK) ja signaalinmuuntimen ja transkription aktivaattorin (STAT) aktivaatiota ja ohjelmoimalla uudelleen solujen geeniekspressiota (Stark ja Darnell, 2012). IFN:ien sitoutuminen vastaaviin reseptoreihinsa johtaa kolmen assosioituneen JAK:n (JAK1, JAK2 ja TYK2) ristiinfosforylaatioon ja STAT:iden kerääntymiseen, jolloin JAKit voivat fosforyloida yksittäiset tyrosiinitähteet lähellä näiden STAT:ien C-terminaalisia päitä. (Platanias, 2005). Aktivoidut STAT:t dimerisoituvat sitten, siirtyvät tumaan ja sitoutuvat IFN-responsiivisten geenien promoottoriin indusoidakseen niiden transkription. STAT:ien tyrosiinifosforylaatio on olennainen vaihe IFN-signaloinnin JAK-STAT-reitillä ja osallistuu STAT:n dimerisaatioon, tuman translokaatioon ja DNA:n sitoutumiseen (Stark ja Darnell, 2012). Siten tyrosiinin fosforylaatio toimii STAT-aktivointikytkimenä. Hiirillä JAK-geenien kohdistetulla hajoamisella saadut todisteet viittaavat siihen, että JAK:t ovat tärkeimmät STAT-tyrosiinikinaasit (Villarino et al., 2017). STAT1:n, STAT3:n ja STAT5:n tyrosiinitähteiden on kuitenkin myös osoitettu fosforyloituvan JAK-puutteellisissa soluissa epidermaalisen kasvutekijän ja verihiutaleperäisten kasvutekijäreseptoreiden toimesta, joilla on luontainen tyrosiinikinaasiaktiivisuus (Leaman et al., 1996; Vignais et al. ., 1996). Lisäksi STAT:ien konstitutiivista aktivaatiota on havaittu transformoiduissa soluissa, jotka ilmentävät onkogeenisiä tyrosiinikinaaseja, kuten v-Src, v-Abl ja BCR-Abl, mutta onko STAT:t näiden kinaasien suoria substraatteja, on vielä määritettävä (Danial ja Rothman 2000; Reddy et ai., 2000). Nisäkkään Abelson-kinaasi c-Abl, jota koodaa c-abl (abl1) -geeni, ja Abl-sukuinen geeniproteiini Arg, jota koodaa arg (abl2) -geeni, ovat jäseniä solunsisäisten ei-reseptorityrosiinikinaasien perheeseen, joita tarvitaan useisiin soluprosesseihin, mukaan lukien proliferaatio, apoptoosi, adheesio, solumigraatio ja stressivasteet (Bradley ja Koleske, 2009; Colicelli, 2010; Greuber et al., 2013; Pendergast, 2002). c-Abl:n kinaasiaktiivisuutta säädellään tiukasti normaaleissa fysiologisissa olosuhteissa. Retroviraalinen transduktio ja kromosomaaliset translokaatiotapahtumat aiheuttavat v-Abl:n tai BCR-Abl:n, Abl:n onkogeenisen muodon, ilmentymisen, vastaavasti (Advani ja Pendergast, 2002). Lisäksi c-abl-geenin kohdennettu deleetio hiirissä johtaa pleiotrooppisiin fenotyyppeihin, jotka liittyvät immuunihäiriöön, mukaan lukien korkea perinataalinen kuolleisuus, pernan ja kateenkorvan surkastuminen, lymfopenia ja lisääntynyt infektioherkkyys (Schwartzberg et ai., 1991). Lisäksi BCR-Abl-positiivisen kroonisen myelooisen leukemian (CML) hoito Abl-estäjillä STI571 (imatinibi) ja AMN107 (nilotinibi) liittyy immunosuppressioon osassa potilaita (Dietz et al., 2004; Hochhaus et al., 2016; Mattiuzzi et ai., 2003). Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että cAbl:lla on rooli TCR- (T-solureseptori)- ja BCR- (B-solureseptori) -välitteisen signaalinsiirron, kehityksen, proliferaation ja sytokiinituotannon säätelyssä (Gu et al., 2009; Pendergast, 2002). Silberman et ai., 2008). Abl-puutteellisilla hiirillä on myös vähentynyt määrä T/B-soluja (Gu et ai., 2009; Liberatore ja Goff, 2009; Schwartzberg et ai., 1991). Kuitenkin heikentyneen immuniteetin taustalla olevat mekanismit, jotka syntyvät c-Abl:n puuttuessa tai inhiboinnissa, ovat edelleen vaikeasti havaittavissa. On laajalti raportoitu, että JAK-STAT-signalointireitti on välttämätön BCR-Abl-indusoidulle transformaatiolle (Carlesso et ai., 1996; Danial et ai., 1998; de Groot et ai., 1999). Siksi on syytä tutkia, voiko JAK-STAT myötävaikuttaa myös c-Abl:iin liittyvään synnynnäiseen immuniteettiin. Tässä raportoimme, että STAT1 on vuorovaikutuksessa c-Abl:n kanssa ja fosforyloi sen JAK-riippumattomalla tavalla, jolla säädellään STAT1:n dimerisaatiota, tuman lokalisaatiota ja alavirran geenitranskriptiota. Nämä havainnot paljastivat, että JAK-kinaasin lisäksi c-Abl on välttämätön STAT1:n täydelliselle aktivaatiolle ja sitä seuraaville IFN-välitteisille antiviraalisille vasteille.

Cistanche tubulosan edut- vahvistaa immuunijärjestelmää

Napsauta tästä nähdäksesi Cistanche Enhance Immunity -tuotteet

【Kysy lisää】 Sähköposti:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

TULOKSET

Interferonin gamma-aktivoidun sekvenssin alavirran geenien transkriptiota säätelee Abl-kinaasi

Our previous study suggested that c-Abl widely participates in the regulation of gene transcription (Dong et al., 2017). To illustrate the role of c-Abl in gene expression, the transcription of approximately 22,000 genes in wild-type (WT) and c-abl / arg / MEFs (mouse embryonic fibroblasts) was detected using Affymetrix GeneChips (Mouse Genome 430 2.0) (GEO accession: GSE154568). A total of 1,744 differentially expressed genes (DEGs) with fold changes >4 tunnistettiin c-abl/arg double-knockout (DKO) ja WT MEF:issä, joista 960 oli säädelty ylöspäin ja 784 alasäädelty (kuva 1A, vasemmalla). Näiden DEG:ien mahdollisten solutoimintojen ja niihin liittyvien reittien tutkimiseksi edelleen suoritimme geeniontologian (GO) analyysin (biologisen prosessin, molekyylifunktion ja solukomponentin termeille) (kuva S1A). C-Abl:n ja Argin säätelemät geenit liittyivät pääasiassa viruspuolustusvasteisiin (GO: 0009615, GO: 0051607 ja GO: 0045071) ja immuunivasteisiin (GO: 0002376, GO: 0045087). Lisäanalyysi osoitti, että IFN-spesifiset geenit (Liu et al., 2012) rikastuivat alassäänneltyjen geenien joukossa (kuvat 1A, oikealla ja S1B). Erilaisten ilmentymisprofiilien validoimiseksi antiviraalisten geenien, mukaan lukien cxcl10, psmb9, tap1 ja isg15, transkriptitasot määritettiin kvantitatiivisilla reaaliaikaisilla käänteistranskriptiopolymeraasiketjureaktiomäärityksillä (RT-PCR) ja normalisoitiin psma5:n tasoille. , jota c-Abl ei sääntele voimakkaasti. Verrattuna WT MEF:iin, c-abl/arg/MEF:t osoittivat merkittävästi alhaisempia transkriptitasoja näissä geeneissä, mutta DKO-indusoidut vähennykset kumosi täysin c-Abl-pelastuksen avulla annoksesta riippuvaisella tavalla (kuviot 1B ja S1C). Nämä tiedot viittasivat siihen, että c-Abl ja Arg säätelevät paneelia IFN-indusoituja geenejä. Abl-kinaasien säätelemien tärkeimpien transkription elementtien tutkimiseksi vasteena IFN:lle rakennettiin lusiferaasireportterijärjestelmä perustuen tap1/psmb9:n jaettuun kaksisuuntaiseen promoottoriin, jota säätelee IFNg (kuvio 1C). Kuten odotettiin, c-Abl/Arg-selektiivinen inhibiittori AMN107 inhiboi merkittävästi tap1-promoottorin (punainen) transkriptioaktiivisuutta (kuvio 1D). Erityisesti, toisin kuin NFkB-toimivien (sininen) tai IFN-konsensussekvenssin (keltainen) elementtien deleetio, AMN107-hoidolla oli vain vähän, jos ollenkaan vaikutusta tap1-promoottorin aktiivisuuteen, kun gamma-aktivoitu sekvenssi (GAS) -elementti (vihreä) poistettiin (kuva 1D). ). Nämä havainnot osoittavat, että STAT1-kohdennettu GAS-cis-elementti on osallisena c-Abl-säädellyssä tap1-transkriptiossa, mikä viittaa vahvasti siihen, että STAT1 on vastuussa c-Abl-välitteisestä IFN-responsiivisen geeniekspression säätelystä.

c-Abl on suoraan vuorovaikutuksessa STAT1:n kanssa

IFN-indusoitua TAP1:n ilmentymistä säätelee c-Abl, mahdollisesti STAT1:n kautta, mikä viittaa siihen, että STAT1 saattaa liittyä c-Abl:n kanssa. Tämän hypoteesin vahvistamiseksi MCF-7-solujen lysaateille tehtiin anti-c-Abl-immunosaostus, jota seurasi immunoblottaus anti-STAT1-vasta-aineella. STAT1 oli läsnä anti-c-Abl, mutta ei IgG-immunosaostumissa (kuvio 2A). Seuraavaksi 293T-solut kotransfektoitiin Myc-cAbl:lla ja Flag-STAT1:llä tai Flag-Vectorilla kontrollina. Myc-c-Abl:n läsnäolo anti-Flag-immunosaostumissa, jotka oli valmistettu soluista, jotka ekspressoivat samanaikaisesti Flag-STAT1:tä, mutta ei Flag-Vektoria, osoitti yhteyden ektooppisesti ekspressoituneen Myc-c-Abl:n ja Flag-STAT1:n välillä (kuvio 2B, vasemmalla). Samanlainen tulos saatiin myös vastavuoroisessa kokeessa (kuva 2B, oikealla). Lisäksi toinen Abl-perheen jäsen, Arg (Abl2), joka on erittäin homologinen c-Abl:n kanssa N-terminaalisessa domeenissaan (NTD), oli myös vuorovaikutuksessa STAT1:n kanssa (kuva S2A).

Kuva 1. c-Abl säätelee IFN-responsiivisten geenien promoottoreita GAS-elementtien kautta

Seuraavaksi lysaatteja, jotka oli valmistettu Flag-c-Abl:ta ilmentävistä 293T-soluista, inkuboitiin agaroosikonjugoidun GST-STAT1:n tai pelkän GST:n kanssa, ja Flag-c-Abl havaittiin GST-STAT1:ssä, mutta ei GST-adsorbaateissa (kuvio 2C). Muiden solulysaattien komponenttien välittämän epäsuoran sitoutumisen poissulkemiseksi Flag-c-Abl:ta ilmentävistä 293T-soluista valmistetut anti-Flag-immunosaostumat altistettiin SDS-PAGE:lle (natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi), ja proteiinit siirrettiin PVDF (polyvinylideenifluoridi) -kalvo ja blotattiin sitten liukoisella GST-STAT1:llä tai GST:llä (kontrollina). Tulokset osoittivat, että GST-STAT1, mutta ei GST, sitoi c-Abl:ta suoraan in vitro (kuvio 2D). c-Abl-sitovan domeenin määrittämiseksi agaroosikonjugoitua ja GST-fuusioitua täyspitkää tai katkaistua STAT1:tä (kuvio 2E, ylempi paneeli) inkuboitiin Flag-c-Abl:a ilmentävien 293T-solujen lysaattien kanssa. Adsorbaattien analyysi immunoblottauksella anti-Flag-vasta-aineella osoitti, että STAT1:n aminohapot 577–750, jotka muodostavat alueen, joka sisältää SH2-domeenin ja transaktivaatiodomeenin, olivat vastuussa c-Abl-vuorovaikutuksesta (kuva 2E, alapaneeli). . Samalla tavalla anti-Flag-vasta-aineen immunosaostettu Flag-STAT1 fraktioitiin SDS-PAGE:lla ja siirrettiin PVDF-kalvolle. Sitten kalvo blotattiin liukoisella GST-c-Abl SH3:lla tai GST-c-Abl SH2:lla ja vain GST:llä. Tulos osoitti, että c-Abl SH3 -domeeni oli päädomeeni, joka oli vastuussa STAT1-assosiaatiosta (kuvio 2F). Lisäksi endogeenisen c-Abl:n in situ -vuorovaikutus STAT1:n kanssa arvioitiin Duolink-proximity ligaation assaylla (PLA). STAT1:c-Abl-komplekseja havaittiin pääasiassa sytoplasmassa, ja IFNg-stimulaatio tehosti näiden kompleksien muodostumista oleellisesti (kuvio 2G). Yhdessä nämä havainnot osoittavat suoran yhteyden c-Abl:n ja STAT1:n välillä sekä in vitro että in vivo.

Kuva 2. c-Abl on vuorovaikutuksessa STAT1:n kanssa

c-Abl välittää JAK-riippumatonta STAT1-fosforylaatiota

Sen tutkimiseksi, onko STAT1 c-Abl:n substraatti, puhdistettua His-merkittyä STAT1:tä inkuboitiin rekombinantin c-Abl:n kanssa (joka sisälsi katalyyttisen domeenin aminohapoissa 237–643) ATP:n läsnä ollessa in vitro kinaasimääritystä varten. Reaktiotuotteen immunoblottaus anti-fosfotyrosiinilla ja anti-fosfo-STAT1 Y701:llä osoitti, että c-Abl fosforyloi suoraan STAT1:n tyrosiinitähteissä, mukaan lukien Y701, in vitro (kuvio 3A). Seuraavaksi havaitsimme, että 293T-soluissa ekspressoitu Flag-STAT1 oli tyrosiinifosforyloitu, erityisesti tähteessä Y701, Myc-c-Abl:lla, mutta ei kinaasiinaktiivisella mutantilla Myc-c-Abl (K290R). Lisäksi käsiteltäessä c-Abl/Arg-selektiivisellä inhibiittorilla AMN107, c-Abl-välitteinen STAT1-fosforylaatio lähes eliminoitui, mikä osoittaa, että STAT1:n tyrosiinifosforylaatio on riippuvainen c-Abl-kinaasiaktiivisuudesta (kuvio 3B). c-Abl-välitteinen STAT1-fosforylaatio heikkeni olennaisesti, kun STAT1 Y701 korvattiin fenyylialaniinilla, mikä osoittaa, että Y701 on Abl:n pääfosfosiitti (kuvio 3C). Lisäksi Arg fosforyloi myös STAT1:n (kuva S2B). c-Abl:n fosforyloimien spesifisten STAT1-tähteiden rajaamiseksi tarkemmin Myc-c-Abl:n kanssa samanaikaisesti ilmennetylle Flag-STAT1:lle suoritettiin nestekromatografia yhdistettynä tandem-massaspektrometria-analyysiin. Hyvin määritellyn ja toiminnallisesti tärkeän STAT1-fosfosiitin Y701 (Schindler et ai., 1992; Shuai et ai., 1993) lisäksi tunnistettiin myös kaksi muuta fosfosiittia, Y106 ja Y665 (kuva S4A). Verrattuna WT STAT1:een, sekä Y106F- että Y701F-mutantit osoittivat heikentynyttä tyrosiinin fosforylaatiota (kuvio 3C). Y106:n ja Y665:n fosforylaatio ei kuitenkaan vaikuttanut merkittävästi STAT1 Y701:n fosforylaatioon, mikä osoittaa, että Y106:lla ja Y665:llä voi olla erillinen rooli (kuva S4B). Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että Abl-perheen kinaasit voivat fosforyloida STAT1:n tyrosiinitähteet, mukaan lukien aiemmin raportoitu tähde Y701.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

JAK:t ovat ensisijaisesti vastuussa IFN:n aiheuttamasta STAT1 Y701:n fosforylaatiosta (Villarino et al., 2017). Kuten odotettiin, IFNg indusoi STAT1 Y701:n fosforylaation, ja ruksolitinibi, JAK1:n ja JAK2:n bispesifinen estäjä, esti sitä merkittävästi (kuvio 3D). Erityisesti vaarantunut Y701-fosforylaatio havaittiin myös Abl:n estämisen yhteydessä (kuvio 3D, kaista 4), mikä osoittaa, että c-Abl osallistuu osittain IFNg:n indusoimaan STAT1-aktivaatioon. Lisäksi DPH, solua läpäisevä c-Abl-aktivaattori, indusoi myös STAT1 Y701:n fosforylaatiota vähemmässä määrin kuin IFNg, jonka AMN107 saattoi kääntää kokonaan päinvastaiseksi (kuvio 3E). DPH:n aiheuttaman Abl-aktivaation vahvistamiseksi havaittiin myös c-Abl Y412:n fosforylaatio, joka on Abl-aktivaation indikaattori (kuvio 3E). On osoitettu, että JAK2-aktivaatio tapahtuu ensin ja sitä tarvitaan myöhempään JAK1:n aktivaatioon (Briscoe et ai., 1996). Suljemme pois JAK2:n vaikutuksen STAT1-aktivaatioon perustimme jak2-KO MCF-7 -solulinjan CRISPR:n kautta. Vähentynyttä, mutta havaittavissa olevaa STAT1 Y701 -fosforylaatiota havaittiin jak2-KO MCF-7 -soluissa verrattuna vanhempien MCF-7-soluihin, mikä voi samalla tavoin voimistua Myc-c-Abl:n läsnä ollessa. mutta ei Myc-c-Abl (K290R) (kuvio 3F), ja se väheni edelleen AMN107-hoidon jälkeen. c-abl/arg/soluissa IFNg:n aiheuttama STAT1:n fosforylaatio Y701:ssä vaarantui suuresti ajasta ja annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 3G). Kaikki nämä havainnot osoittavat, että c-Abl-kinaasi voisi suoraan fosforyloida ja aktivoida STAT1:n IFNg-JAK-signalointireitistä riippumatta ja että mikä tärkeintä, näillä kahdella kinaasilla voi olla synergistisiä vaikutuksia STAT1:n fosforylaatioon Y701:ssä.

Kuva 3. c-Abl fosforyloi STAT1:n

Kuva 4. c-Abl edistää STAT1-dimeerin muodostumista ja tuman tuontia

c-Abl-välitteinen fosforylaatio säätelee STAT1-transaktivaatioaktiivisuutta

STAT:ien tyrosiinifosforylaatio on olennainen vaihe IFN-signaloinnin JAK-STAT-reitillä ja osallistuu STAT:n dimerisaatioon, tuman translokaatioon ja DNA:n sitoutumiseen. Sen tutkimiseksi, sääteleekö c-Abl-välitteinen fosforylaatio STAT-dimerisaatiota, GFP-STAT1 ja Flag-STAT1 ekspressoitiin rinnakkain 293T-soluissa Myc-c-Abl:n läsnä ollessa tai poissa ollessa. GFP-STAT1:n tasot anti-Flag-immunosaostumissa tutkittiin STAT1:n dimerisoitumisen osoittamiseksi. Kuten kuvassa 4A esitetään, c-Abl:n rinnakkaisilmentyminen tehosti STAT1-STAT1-homodimeerien muodostumista. MCF-7-solujen immunofluoresenssimikroskopia osoitti lisäksi, että c-abl/arg:n ablaatio tai hoito AMN107:llä heikensi merkittävästi IFNg:n indusoimaa STAT1:n tuman translokaatiota (kuvat 4B ja 4C).

Lisäksi käytettiin sähköliikkuvuuden muutosmäärityksiä analysoimaan STAT1:n promoottorin sitoutumisaktiivisuutta. Havaitsemiskoettimena käytettiin biotiinilla merkittyä IRF1-promoottorialuetta, joka sisälsi STAT1:n sitoutumiskonsensussekvenssin (Aaronson ja Horvath, 2002). Tätä koetinta inkuboitiin tumauutteiden kanssa 293T-soluista, jotka ekspressoivat eksogeenisesti STAT1:tä c-Abl:n kanssa tai ilman sitä, joka tasapainotettiin kuvion S5A perusteella. Kuten kuviossa 4D esitetään, lukuisia IRF1-koettimeen sitoutuneita komplekseja, jotka sisälsivät STAT1:tä, havaittiin tumauutteissa (kuvio 4D, kaista 1). Kompleksin muodostuminen lisääntyi hieman IFNg-käsittelyn myötä (kuvio 4D, kaista 2) ja lisääntyi merkittävästi soluissa, jotka ekspressoivat ektooppisesti c-Abl:ta (kuvio 4D, kaista 3). Kuitenkin verrattuna WT STAT1:een, c-Abl osoitti vain vähän jos ollenkaan vaikutusta Y701F:n sisältävän STAT1:n promoottorisitoutumiseen (kuvio 4D, kaistat 7 ja 8), kun taas Y106F- ja Y665F-mutaatiot eivät osoittaneet lähes mitään eroa WT STAT1:n kanssa. STAT1:n ja havaitsemiskoettimen sisältävien kompleksien spesifisyys varmistettiin lisäämällä merkitsemätön kilpailijakoetin (kuvio 4D, kaista 9). Lisäksi anti-STAT1-vasta-aineen lisääminen johti supersiirtyneen vyöhykkeen muodostumiseen (kuvio 4D, kaista 11). Kun merkittyjä koettimia inkuboitiin 293T-solujen tumauutteiden kanssa kontrollina, komplekseja ei havaittu (kuvio 4D, kaista 10). Nämä tulokset osoittavat, että c-Abl-välitteinen STAT1 Y701 -fosforylaatio voimistaa STAT1:n sitoutumista kohdepromoottoreineen.

Kuvio 5. c-Abl säätelee IFN:ään liittyvää geeniekspressiota

Tämän jälkeen IFNg:n aiheuttama tärkeimpien STAT1-säädeltyjen geenien, mukaan lukien ccl5, cxcl10, cxcl11, gbp2, ido1, ifi35, irf1, isg15, oasl, psmb9 ja tap1, transaktivaatio arvioitiin WT:ssä tai c-abl/:ssa. arg DKO MCF-7 -soluja RT-PCR:n kautta. Kuten odotettiin, c-abl/arg-depletio heikensi merkittävästi geenin transkriptiota (kuvio 5A). Lisäksi IFNg:n ja IFNa:n tyypillisesti indusoimia geenejä ei voitu stimuloida IFN:illä AMN107:n läsnä ollessa (kuviot 5B ja 5C). Nämä havainnot osoittavat, että c-Abl säätelee positiivisesti STAT1:n transaktivaatioaktiivisuutta.

c-Abl edistää IFN-riippuvaisia ​​antiviraalisia vaikutuksia

TAP1 ja PSMB9 osallistuvat peptidien tuotantoon ja esittelyyn MHC-luokan I antigeenin prosessointireitillä (Ghannam et ai., 2014; Vitale et ai., 1998). Aiempien havaintojen mukaisesti AMN107 suppressoi merkittävästi ovalbumiinin antigeenin esittelyä JAWS II -solujen B3Z-soluille vähentyneen IL2-tuotannon vuoksi (kuvio 6A). C-Abl:n aiheuttaman STAT1-säätelyn antiviraalisten biologisten seurausten arvioimiseksi edelleen WT- ja c-abl/arg/MEF-solut, jotka oli esikäsitelty sarjalaimennetun IFNg:n kanssa tai ilman niitä, infektoitiin vesicular stomatitis -viruksella (VSV). VSV-infektio aiheutti vakavamman solukuoleman AMN107:llä käsitellyissä c-abl/arg/MEF- ja WT-soluissa kuin vehikkeleillä käsitellyissä WT-MEF-soluissa (kuvio 6B). IFNg-hoito vähensi huomattavasti virusinfektion aiheuttamaa solukuolemaa, mutta sillä oli paljon vähemmän selvä vaikutus AMN107:n läsnä ollessa. Tämän havainnon mukaisesti c-abl/arg-ablaatio MEF:issä johti epäherkkyyteen IFN-stimulaatiolle, mutta tämä vaikutus kumosi huomattavasti c-Abl-pelastuksen avulla (kuvio 6B). Seuraavaksi A549-solut, joita oli käsitelty AMN107:llä tai ilman sitä, infektoitiin Newcastlen taudin viruksella (NDV), joka ekspressoi GFP:tä, ja tulokset paljastivat, että AMN107-käsittely tehosti myös viruksen replikaatiota, mutta c-Abl-ilmentyminen tukahdutti (kuvio 6C). Sen havainnon mukaisesti, että DNA-transfektio johtaa endogeenisen IFN-vasteen aktivoitumiseen (Park et ai., 2003), transfektio pcDNA-vektorilla esti viruksen lisääntymistä. Erityisesti transfektio Flag-c-Abl:lla johti selvempään virusproliferaatiota estävään vaikutukseen kuin transfektio tyhjällä vektorilla (kuvio 6C). Lisäksi IFNg-hoidolla oli vähän, jos ollenkaan, vaikutusta virusinfektioon c-Abl-selektiivisen inhibiittorin AMN107 läsnä ollessa (kuvio 6D). Nämä tiedot viittaavat siihen, että c-Abl:lla on tärkeä rooli STAT1-välitteisissä antiviraalisissa vaikutuksissa. Seuraavaksi tutkimme c-Abl:n rooleja virusinfektiossa call/fl, Lck-Cre (c-abl-conditional knockout, c-abl-cKO) hiirissä, joissa c-abl oli spesifisesti poistunut tymosyyteistä (kuva S7A ), koska c-abl-geenin ituradan poisto johtaa juoksemiseen ja kuolemaan kahden ensimmäisen viikon aikana syntymän jälkeen (Koleske et ai., 1998; Schwartzberg et ai., 1991). Sitten WT- ja c-abl-cKO-hiiret infektoitiin nenänsisäisesti influenssa A -viruksella (IAV). Tilastollisesti ei-merkittävä suurempi kuolleisuus havaittiin c-abl-cKO-hiirillä kuin WT-hiirillä. WT-hiiret, joille annettiin jatkuvasti AMN107:ää, joka suppressoi järjestelmällisesti c-Abl/Arg-kinaaseja kaikissa kudoksissa, osoitti merkittävästi lisääntynyttä herkkyyttä IAV:lle (kuvio 6E). Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että c-Abl:a tarvitaan antiviraaliseen immuniteettiin eläimillä.

Kuvio 6. c-Abl edistää IFN-riippuvaisia ​​antiviraalisia vaikutuksia

KESKUSTELU

IFNg on yksi tärkeimmistä immuunijärjestelmää moduloivista sytokiineistä ja sillä on elintärkeä rooli synnynnäisessä immuniteetissa virusinfektioita vastaan. Kanonisessa IFNg-signaloinnissa IFNg-stimulaatiolla JAK1 ja JAK2 värvätään aggregoituneiden IFNg-reseptorien (IFNGR:iden) sytoplasmisiin pyrstöihin ja aktivoituvat peräkkäisten autofosforylaatio- ja transfosforylaatiotapahtumien kautta (Stark, 2007; Villarino et al.7). Sitten STAT1 kiinnittyy IFNGR:ään liittämällä SH2-domeeninsa IFNGR:n tunnistussekvenssiin (Y440DKPH444), jossa JAK:t fosforyloivat Y440:n (Greenlund et ai., 1995). Sen jälkeen, kun JAK:t ovat fosforyloineet Y701:ssä, STAT1 dimeroituu ja siirtyy ytimeen, jossa se edistää joukon IFNg-responsiivisten geenien transkriptiota (Aaronson ja Horvath, 2002; Stark ja Darnell, 2012). Stat1-ablaatio hiirillä johtaa transkriptionaalisten vasteiden puuttumiseen IFN:lle ja IFN:n indusoimien antimikrobisten ja antiviraalisten aktiivisuuksien puuttumiseen soluissa (Meraz et ai., 1996). Stat1 / hiiret osoittavat myös lisääntynyttä herkkyyttä spontaanien ja kemiallisten (3-metyylikolantreenin) aiheuttamien kasvainten kehittymiselle (Kaplan et al., 1998) ja yliherkkyyttä tietyille tulehduspatologioille (Bettelli et al., 2004; Villarino et al. ., 2010). Lisäksi STAT1-signalointi suojaa T-soluja luonnolliselta tappajasoluvälitteiseltä sytotoksisuudesta (Kang et al., 2019).Nämä havainnot viittaavat siihen, että STAT1 välittää synnynnäistä immuuniaktivaatiota ja kasvainimmuniteettia.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Schlatterer et ai. raportoi, että c-Abl, mutta ei Arg, voisi aiheuttaa hermosolujen menetyksen saamalla STAT1-aktivoitumisen ja interferonin tuotannon. Tarkkaa mekanismia, joka on vastuussa c-Abl-riippuvaisesta STAT1-aktivaatiosta, ei kuitenkaan ole selvitetty (Schlatterer et al., 2012). Tässä osoitamme, että c-Abl sitoo ja fosforyloi STAT1:n ja on vuorovaikutuksessa suoraan STAT2:n kanssa in vitro (kuvat 2 ja 3, S8A, S9A ja S10A). JAK-kinaasit fosforyloivat yksinomaan STAT1 Y701:tä, mikä säätelee STAT1-dimeerin muodostumista (Schindler et ai., 1992; Shuai et ai., 1993) ja nukleosytoplasmista sukkulaa IFNg-signaloinnin aikana (Mao et al., 2005; Mertens et al., Mertens et al., 2005; Zhong et ai., 2005). Tutkimuksemme havaitsi odottamatta, että c-Abl, toinen kinaasi, joka ei ole JAK:t, osallistuu myös STAT1 Y701:n fosforylaatioon itsenäisesti (kuva 3). Vaikka c-Abl-välitteinen Y701-fosforylaatio ei ole yhtä voimakas kuin JAK:ien, näyttää olevan välttämätöntä, että Y701 saavuttaa maksimaalisen fosforylaation, koska c-abl/arg/soluissa havaittiin vakavasti heikentynyt Y701-fosforylaatio IFNg-ärsykkeellä ja IFNg- AMN107 esti indusoitua STAT1 Y701:n fosforylaatiota 1,25 mM:sta 5 mM:iin annoksesta riippuvalla tavalla (kuviot 3G ja S11A). Y701:n fosforylaatioon ei kuitenkaan juurikaan vaikuta Y106:n ja Y665:n, c-Abl:n kahden muun fosfosiitin, fosforylaatiotila, mikä osoittaa, että tehostettu STAT1:n Y701-fosforylaatio ei johdu c-Abl-välitteisestä monipaikkaisesta fosforylaatiosta. lisääntyneen JAK-toiminnan seurauksena. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että JAK1:n konstitutiivista aktivaatiota ja JAK2:n muuttuvaa aktivaatiota on havaittu BCR-Abl:ta ilmentävissä soluissa (Chai et ai., 1997; Henderson et ai., 1997; Shuai et ai., 1996). Lisäksi BCR-Abl:n on osoitettu aktivoivan vaatimattomasti STAT1:tä ja STAT2:ta JAK1:n, JAK2:n ja JAK3:n tyrosiinifosforylaation kautta (Henderson et ai., 1997). Nykyiset todisteet tukevat sitä, että Abl:lla ja JAK:illa voi olla voimakkaita synergistisiä vaikutuksia STAT1:n fosforylaatioon Y701:ssä (kuva 3E).

Y701:n lisäksi Y106:n ja Y665:n fosforylaatio tunnistettiin samanaikaisesti (kuviot 3C ja S4A). Nämä fosfosiitit eivät olleet mukana STAT1 Y701:n fosforylaatiossa tai STAT1:n homodimerisaatiossa (kuvat S4B ja S4C). Murphy ja kollegat havaitsivat kuitenkin, että monomeerien NTD:iden (N-terminaalinen proteiinivuorovaikutusdomeeni, aminohapot 1–136) välinen vuorovaikutus on välttämätöntä fosforyloimattomien täyspitkien STAT-molekyylien dimerisoitumiselle (Ota et al., 2004). STAT1-mutantit (F77A ja/tai L78A) eivät pysty muodostamaan fosforyloimattomia dimeerejä, ja nämä mutantit osoittavat fenotyypin mukaan pysyvää fosforylaatiota IFN-käsitellyissä soluissa ja vastustuskykyä TC45-välitteiselle defosforylaatiolle in vitro (Mertens et al., 206). Y106 NTD:ssä, joka on lähellä F77:ää ja L78:aa, voi olla vastuussa STAT1:n pitämisestä fosforyloidussa dimeeritilassa ja STAT1:n ylläpitämisestä ytimessä ionisoivan säteilyn alaisena (kuvat S6A ja S6B). Lisäksi SH2-domeeni on vuorovaikutuksessa fosforyloidun tyrosiinia sisältävän domeenin kanssa, kun IFN indusoi fosforyloidun homodimeerin muodostumista (Shuai et ai., 1994). Y665, joka sijaitsee SH2-domeenissa, voi vaikuttaa dimerisaatioon. c-Abl-välitteisten fosforylaatiokohtien (Y106 ja Y665) toiminnot vaativat lisätutkimuksia.

JAK:ien tapaan c-Abl-välitteinen fosforylaatio säätelee STAT1-dimeerin muodostumista (mukaan lukien STAT1- STAT1-homodimeerin ja STAT1-STAT2-heterodimeerin muodostuminen (kuvat 4A, S12A ja S12B)), tuman translokaatiota, DNA:n sitoutumista ja IFN-stimuloitujen geenien transkriptio. Abl:n hajoaminen vaikutti voimistuneeseen viruksen lisääntymiseen ja lisääntyneeseen viruksen aiheuttamaan solukuolemaan (kuviot 6B, 6C ja 6D). Lisäksi havaitsimme, että ionisoiva säteily (IR) aiheutti STAT1:n tuman translokaation c-Abl-estäjän puuttuessa (kuvat S6A ja S6B). IR aktivoi suoraan c-Abl:n (Pendergast, 2002) ja sen jälkeen STAT1-riippuvaisen IFNg-signaloinnin, mikä voi tarjota taustalla olevan mekanismin, jolla sädehoito käynnistää IFN-sarjan luontaisen ja adaptiivisen immuunihyökkäyksen kasvaimeen (Burnette et al. ., 2011) ja tarjoaa vahvemman luontaisen immuunitilan vasteena IR-ärsykkeille. Verrattuna WT-pentueen kavereihin, hiirillä, joissa c-abl oli ehdollisesti poistunut tymosyyteistä, oli korkeampi, mutta ei tilastollisesti merkitsevä kuolleisuus. Erityisesti hiirillä, joille annettiin systemaattisesti c-Abl/Arg-inhibiittoria AMN107, oli korkeampi kuolleisuus (kuvio 6E), mikä osoittaa, että c-Abl:n ilmentyminen erilaisissa kudoksissa vaikutti antiviraaliseen immuniteettiin eläimillä. Näiden tietojen perusteella ehdotamme, että endogeeninen Abl tarjoaa piilevän perusresistenssin virusinfektiolle ja että ionisoivan säteilyn stimuloima aktivoitunut Abl suojaa soluja. Abl-kinaasit aktivoituvat konstitutiivisesti useimmilla KML-potilailla. Abl-kinaasiestäjät STI571 ja AMN107 edustavat KML-hoidon etulinjan hoitoa. Yleisesti havaitaan kuitenkin ylempien hengitysteiden infektioita ja immunosuppressiota, jotka voivat johtua STAT-välitteisen immuunisäätelyreitin tukahduttamisesta (Hochhaus et al., 2016; Mattiuzzi et al., 2003). Havaintomme lisäsivät teoreettista perustaa hoidon optimointiin.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Yhteenvetona voidaan todeta, että tyrosiinikinaasi c-Abl:n havaittiin liittyvän STAT1:een in vivo ja in vitro, edistävän STAT1:n fosforylaatiota Y701:ssä JAK:ista riippumatta, voimistavan transaktivaatiota ja välittävän synnynnäisiä immuunivasteita infektiota vastaan, erityisesti c:n yhteydessä. -Abliaan liittyvä stressi. Löytömme tarjoaa täydentävän lähestymistavan STAT1-aktivointiin, mikä myötävaikuttaa kasvavaan tietomäärään IFN:n alavirran signalointireitin säätelystä.

VIITTEET

Aaronson, DS ja Horvath, CM (2002). Tiekartta niille, jotka eivät tunne JAK-STATia. Science 296, 1653–1655.

Advani, AS ja Pendergast, AM (2002). BcrAbl-variantit: biologiset ja kliiniset näkökohdat. Leuk. Res. 26, 713–720.

Bettelli, E., Sullivan, B., Szabo, SJ, Sobel, RA, Glimcher, LH ja Kuchroo, VK (2004). T-vedon menetys, mutta ei STAT1, estää kokeellisen autoimmuunisen enkefalomyeliitin kehittymisen. J. Exp. Med. 200, 79–87.

Bradley, WD ja Koleske, AJ (2009). Solujen migraation ja morfogeneesin säätely Abl-perheen kinaasien toimesta: nousevat mekanismit ja fysiologiset kontekstit. J. Cell Sei. 122, 3441–3454.

Briscoe, J., Rogers, NC, Witthuhn, BA, Watling, D., Harpur, AG, Wilks, AF, Stark, GR, Ihle, JN ja Kerr, IM (1996). JAK1:n kinaasinegatiiviset mutantit voivat ylläpitää gamma-interferonilla indusoituvaa geeniekspressiota, mutta eivät antiviraalista tilaa. EMBO J. 15, 799-809.

Carlesso, N., Frank, DA ja Griffin, JD (1996). Signaalimuuntimien ja transkriptioproteiinien (STAT) aktivaattorien tyrosyylifosforylaatio ja DNA-sitoutumisaktiivisuus Bcr/Abl:lla transformoiduissa hematopoieettisissa solulinjoissa. J. Exp. Med. 183, 811–820.

Chai, SK, Nichols, GL ja Rothman, P. (1997). JAK:ien ja STAT:ien konstitutiivinen aktivaatio BCR Abl:tä ilmentävissä solulinjoissa ja perifeerisissä verisoluissa, jotka ovat peräisin leukemiapotilaista. J. Immunol. 159, 4720–4728.

Colicelli, J. (2010). ABL-tyrosiinikinaasit: toiminnan, säätelyn ja spesifisyyden kehitys. Sci. Signaali. 3, re6.

Danial, NN, Losman, JA, Lu, T., Yip, N., Krishnan, K., Krolewski, J., Goff, SP, Wang, JY ja Rothman, PB (1998). Jak1:n ja v-Abl:n suora vuorovaikutus vaaditaan v-Abl:n aiheuttamaa STAT:ien aktivaatiota ja proliferaatiota varten. Mol. Cell Biol. 18, 6795–6804.

Danial, NN ja Rothman, P. (2000). JAK-STAT-signalointi aktivoi Abl oncogenes. Oncogene 19, 2523–2531.

de Groot, RP, Raaijmakers, JA, Lammers, JW, Jove, R. ja Koenderman, L. (1999). BCR-Abl:n STAT5-aktivaatio edistää K562-leukemiasolujen transformaatiota. Blood 94, 1108–1112.

Dietz, AB, Souan, L., Knutson, GJ, Bulur, PA, Litzow, MR ja Vuk-Pavlovic, S. (2004). Imatinibimesylaatti estää T-solujen lisääntymistä in vitro ja viivästynyttä yliherkkyyttä in vivo. Blood 104, 1094–1099.

Dong, Q., Li, C., Qu, X., Cao, C. ja Liu, X. (2017). C-abl/arg onkogeenisten kinaasien differentiaalisen geeniekspression globaali säätely. Med. Sci. Monit. 23, 2625–2635.

Ghannam, K., Martinez-Gamboa, L., Spengler, L., Krause, S., Smiljanovic, B., Bonin, M., Bhattarai, S., Grutzkau, A., Burmester, GR, Haupl, T. et ai. (2014). Immunoproteasomien alayksiköiden lisääntyminen myosiitissa osoittaa aktiivista tulehdusta, johon osallistuvat antigeeniä esittelevät solut, CD8 T-solut ja IFNGamma. PLoS One 9, e104048.

Greenlund, AC, Morales, MO, Viviano, BL, Yan, H., Krolewski, J. ja Schreiber, RD (1995). Tyrosiinifosforyloitujen sytokiinireseptorien suorittama tilastojen rekrytointi: järjestetty palautuva affiniteettiohjattu prosessi. Immunity 2, 677–687.

Greuber, EK, Smith-Pearson, P., Wang, J. ja Pendergast, AM (2013). ABL-perheen kinaasien rooli syövässä: leukemiasta kiinteisiin kasvaimiin. Nat. Rev. Cancer 13, 559–571.

Gu, JJ, Ryu, JR ja Pendergast, AM (2009). Abl-tyrosiinikinaasit T-solujen signaloinnissa. Immunol. Ilm. 228, 170–183.

Henderson, YC, Guo, XY, Greenberger, J. ja Deisseroth, AB (1997). Bcr-abl:n mahdollinen rooli JAK1-kinaasin aktivoinnissa. Clin. Cancer Res. 3, 145–149.

Hochhaus, A., Saglio, G., Hughes, TP, Larson, RA, Kim, DW, Issaragrisil, S., le Coutre, PD, Etienne, G., Dorlhiac-Llacer, PE, Clark, RE, et ai. (2016). Etulinjan nilotinibin ja imatinibin pitkäaikaiset hyödyt ja riskit kroonisessa vaiheessa olevan myelooisen leukemian hoidossa: 5-vuoden päivitys satunnaistetusta ENESTnd-tutkimuksesta. Leukemia 30, 1044–1054.

Kang, YH, Biswas, A., Field, M. ja Snapper, SB (2019). STAT1-signalointi suojaa T-soluja NK-soluvälitteiseltä sytotoksisuudesta. Nat. Commun. 10, 912.

Kaplan, DH, Shankaran, V., Dighe, AS, Stockert, E., Aguet, M., Old, LJ ja Schreiber, RD (1998). Interferonin gamma-riippuvaisen kasvaimen valvontajärjestelmän osoittaminen immunokompetenteilla hiirillä. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 7556–7561.

Koleske, AJ, Gifford, AM, Scott, ML, Nee, M., Bronson, RT, Miczek, KA ja Baltimore, D. (1998). Abl- ja Arg-tyrosiinikinaasien keskeiset roolit hermohoidossa. Neuron 21, 1259–1272.

Leaman, DW, Pisharody, S., Flickinger, TW, Commane, MA, Schlessinger, J., Kerr, IM, Levy, DE ja Stark, GR (1996). JAK:ien roolit STAT:ien aktivoinnissa ja c-fos-geenin ilmentymisen stimuloinnissa epidermaalisen kasvutekijän vaikutuksesta. Mol. Cell Biol. 16, 369–375.