RNA M6 A Reader YTHDF2 ohjaa NK-solujen kasvainten ja virusten vastaista immuniteettia, osa 3

YTHDF2 tarvitaan IL-15-välitteiseen NK-solujen selviytymiseen, lisääntymiseen ja efektoritoimintoihin

IL-15 on yksi, ellei tärkein sytokiini NK-solujen pleiotrooppisille toiminnoille. Me ja muut olemme aiemmin havainneet, että IL-15 on avainasemassa NK-solujen homeostaasin, eloonjäämisen ja efektoritoimintojen säätelyssä (Becknell ja Caligiuri, 2005; Carsonet al., 1997; Carson et ai., 1994; Wang et al., 2019b; Yu et ai., 2013).

Solujen pleiotropia viittaa niiden kykyyn suorittaa erilaisia ​​toimintoja eri ympäristöissä. Solupleiotropia liittyy läheisesti immuniteettiin, koska monilla immuunijärjestelmän soluilla voi olla useita erilaisia ​​rooleja.

Immuunijärjestelmässä T-solut ovat erittäin kriittinen solutyyppi. Ne tunnistavat ja hyökkäävät taudinaiheuttajia vastaan ​​samalla kun säätelevät muiden immuunisolujen toimintaa. T-solujen pleiotropia on erittäin tärkeä, koska kun immuunijärjestelmä kohtaa uuden patogeenin, T-solujen on näytettävä erilaisia ​​rooleja lyhyessä ajassa vastatakseen tehokkaasti. Esimerkiksi kun immuunijärjestelmä kohtaa bakteeri-infektion, T-solujen täytyy toimia bakteerien tappajana, ja kun immuunijärjestelmä kohtaa virusinfektion, T-solujen on säädeltävä muita immuunisoluja.

Lisäksi immuunijärjestelmässä makrofageiksi kutsuttujen solujen luokassa on myös pleiotrooppisia vaikutuksia. Ne voivat fagosytoosia ja hajottaa vieraita taudinaiheuttajia ja voivat myös aktivoida muita immuunisoluja hyökkäämään taudinaiheuttajia vastaan. Makrofagien pleiotropia on tärkeä, koska niillä on oltava erilaisia ​​rooleja eri ympäristöissä. Esimerkiksi virusinfektioissa makrofagien on eritettävä joitain aineita torjuakseen virusta, kun taas bakteeri-infektioissa makrofagien on imeydyttävä ja sulatettava bakteerit poistaakseen patogeenin.

Yhteenvetona voidaan todeta, että solun pleiotropian ja immuniteetin välillä on läheinen yhteys. Pleiotrooppisilla soluilla voi olla erilaisia ​​rooleja eri patogeenien saastuttamissa ympäristöissä, mikä parantaa immuunijärjestelmän kykyä reagoida ja parantaa kehon vastustuskykyä eri taudinaiheuttajia vastaan. Siksi meidän tulee kiinnittää huomiota solujen pleiotropiaan ja myös vahvistaa immuniteetin viljelyä ihmisten terveyden ylläpitämiseksi. Voidaan nähdä, että meidän on parannettava muistia, ja Cistanche deserticola voi merkittävästi parantaa muistia, koska Cistanche deserticola voi myös säädellä välittäjäaineiden tasapainoa, kuten nostaa asetyylikoliinin ja kasvutekijöiden tasoa. Nämä aineet ovat erittäin tärkeitä muistille ja oppimiselle. Lisäksi Cistanche deserticola voi myös parantaa verenkiertoa ja edistää hapen toimitusta, mikä voi varmistaa, että aivot saavat riittävästi ravinteita ja energiaa, mikä parantaa aivojen elinvoimaa ja kestävyyttä.

Napsauta Tiedä tapoja parantaa muistiasi

Tässä tutkimuksessa osoitamme, että IL-15 nosti YTHDF2:n mRNA- ja proteiinitasoja NK-soluissa (kuva 6 A; ja kuva 1, D–F). Siksi arvelimme, että YTHDF2 tarvitaan IL-15-välitteiseen eloonjäämiseen ja NK-solujen efektoritoimintoihin.

Yritimme ensin tunnistaa mahdolliset transkriptiotekijät IL-15-signaloinnin jälkeen, jotka säätelevät suoraan YTHDF2:n ilmentymistä. Analysoimme Encyclopedia of DNA Elements -tietosanakirjaa käyttämällä Kalifornian yliopiston Santa Cruzissa Genome BrowserDatabasea (https://genome.ucsc.edu), joka tarjoaa ennusteita sitoutumiskohdista koko genomissa yhdessä JASPAR:n kanssa (http://jaspar.genereg). .netto).

Havaitsimme, että STAT5:llä, joka on avaintekijä IL-15:n alavirran puolella NK-soluissa, on neljä sitoutumiskohtaa 2 kb:n sisällä Ythdf2:n transkription aloituskohdasta (TSS) ylävirtaan, mikä osoittaa, että IL-15 voi positiivisesti säätele Ythdf2-transkriptiota hiiren NK-soluissa STAT5:n kautta.

Käyttämällä STAT5-estäjää STAT5-IN-1 (Müller et al., 2008) osoitimme, että STAT5:n estäminen johti Ythdf2:n laskuun sekä mRNA- että proteiinitasoilla hiiren NK-soluissa (kuva S4, A). ja B). Vahvistaaksemme edelleen, että YTHDF2 on STAT5:n säätelemä alavirran tekijä, käytimme Stat5fl/fl Ncr1-iCre-hiiriä (jäljempänä Stat5ΔNK-hiiriä), joissa STAT5 on erityisesti deletoitu hiiren NK-soluista (Wiedemann et). al., 2020).

Käsittelimme Stat5WT- ja Stat5ANK-hiirten perna-NK-soluja IL-15:lla. Huomasimme, että YTHDF2 väheni merkittävästi Stat5ANK-hiirten NK-soluissa verrattuna Stat5WT-hiirten NK-soluihin sekä RNA- että proteiinitasoilla (kuvio 6, B ja C; ja kuva S4, C ja D).

Lusiferaasireportterimääritys osoitti, että sekä STAT5a että STAT5b aktivoivat Ythdf2-geenin transkription suoraan (kuvio 6, D ja E). Kromatiini-immunosaostus (ChIP)-qPCR-tulokset osoittivat, että STAT5:llä on merkittävää rikastumista neljässä paikassa normaaliin IgG-kontrolliin verrattuna, mikä osoittaa suoran sitoutumisen hiiren NK-soluissa (kuva 6 F). Yhdessä tulokset osoittavat, että YTHDF2-ilmentymistä säätelee STAT5 alavirtaan IL-15-signaloinnin jälkeen NK-soluissa.

Sitten mietimme, olivatko Ythdf2--puutteelliset NK-solut puutteellisia vasteessa IL-15-vastaisuuteen. Eristimme pernan NK-soluja Ythdf2ANK-hiiristä ja Ythdf2WT-hiiristä ja viljelimme themin vitro IL-15:n läsnä ollessa. Havaitsimme, että NK-solujen kasvu väheni merkittävästi Ythdf2ANK-hiirissä verrattuna Ythdf2WT-hiiriin (kuvio 6 G). CellTrace Violet (CTV) -leimausmääritykset osoittivat, että Ythdf2-puutos haittasi NK-solujen lisääntymistä (kuvio 6 H).

 Solusyklin jakautumisanalyysi paljasti merkittävästi lisääntyneen NK-solujen fraktion Ythdf2ANK-hiiristä G0/G1-vaiheessa, mutta merkittävästi pienentyneen NK-solujen fraktion Ythdf2ANK-hiiristä S-vaiheessa (kuva 6 I), mikä viittaa siihen, että Ythdf2-puutostuloksia G0/G1-vaiheen pysähtymisessä NK-soluissa.

Lisäksi apoptoottisten (anneksiini V+Sytox-Blue+/-) NK-solujen määrä Ythdf2ANK-hiiristä kasvoi kahdesta kolminkertaiseksi verrattuna Ythdf2WT-hiirten soluihin (kuva 6 J), mikä osoittaa NK-solujen puutteellisen eloonjäämisen hiirten häviämisen jälkeen. Ythdf2. Nämä tulokset viittaavat siihen, että YTHDF2 säätelee NK-solujen vastetta IL-15:lle in vitro. Koska IL-15 transloituu huonosti ja erittyy in vivo vakaassa tilassa (Corbel et ai., 1996; Fehniger et ai., 2001), on tutkittava, ovatko Ythdf2--puutteet NK-solut puutteellisia vasteessa IL-15 in vivo, hoidimme hiiriä IL-15:lla.

Huomasimme, että Ythdf2--puutteiset verrattuna WT-NK-soluihin osoittivat merkittävästi vähentynyttä solujen lisääntymistä ja lisääntynyttä solujen apoptoosia, kun hiiriä käsiteltiin IL-15:lla (kuva 6 K; ja kuva S4, E–J). Nämä tiedot viittaavat siihen, että YTHDF2 säätelee NK-solujen vastetta IL-15:lle, erityisesti joissakin olosuhteissa, joissa IL-15 on korkea. Havaitsimme myös, että IFN-:n, grantsyymi B:n ja perforiinin mRNA- ja proteiinitasot laskivat merkittävästi Ythdf2ΔNK NK-soluissa verrattuna Ythdf2WT NK-soluihin vasteena IL-15:lle (kuvio 6, L–N), mikä osoittaa, että YTHDF2 edistää myös IL-15-välitteisiä NK-solujen efektoritoimintoja in vitro.

Yhdessä tietomme osoittavat, että YTHDF2:ta tarvitaan IL-15-välitteiseen NK-solujen eloonjäämiseen, lisääntymiseen ja efektoritoimintoihin. Seuraavaksi tutkimme alavirran mekanismeja, joilla YTHDF2 säätelee IL-15-välitteistä NK-solujen selviytymistä, lisääntymistä ja efektoritoimintoa. Havaitsimme, että Ythdf2ANKhiirten ja Ythdf2WT-hiirten NK-soluilla oli samanlaiset tasot IL-15-reseptoreissa CD122 (IL-15R) ja CD132 (IL-15R c; kuva S4 K). IL-15-signalointia välittää vähintään kolme alavirran signalointireittiä NK-soluissa: Ras–Raf–MEK–ERK, PI3K–AKT–mTOR ja JAK1/3–STAT3/5 (Mishra et al., 2014).

Tutkiaksemme, mitä signalointireittiä säätelee YTHDF2 NK-soluissa, tutkimme ERK-, AKT-, S6-, STAT3- ja STAT5-inNK-solujen fosforylaatiotasoja Ythdf2ΔNK-hiiristä tai Ythdf2WT-hiiristä IL-15-stimulaation jälkeen.

Tulokset osoittivat, että Ythdf2-puutos ei vaikuttanut ERK:n, AKT:n, S6:n ja STAT3:n fosforylaatioon IL-15-stimulaatiossa (kuvat S4, L ja M), mutta esti merkittävästi STAT5:n aktivaatiota, mistä on osoituksena STAT5:n alentuneet fosforylaatiotasot Ythdf{{:ssa. 7}}puutteellisia NK-soluja kuin Ythdf2WT-hiirten NK-soluissa (kuvio 60), mikä osoittaa, että YTHDF2 tarvitaan optimaaliseen IL-15/STAT5-signalointiin aktivoiduissa NK-soluissa.

Koska osoitimme, että fosforyloitu STAT5 alavirtaan IL-15:sta sitoutuu Ythdf2:n promoottoriin (kuva 6, D–F), ja tässä osoitimme, että YTHDF2:ta tarvitaan optimaaliseen STAT5-fosforylaatioon, tietomme viittaavat siihen, että alavirtaan on STAT5–YTHDF2 positiivinen palautesilmukka. IL-15, joka voi kontrolloida NK-solujen selviytymistä, lisääntymistä ja efektoritoimintoja.

Transkription laajuinen analyysi tunnistaa Tardbp:n YTHDF2-kohteena NK-soluissa

Käsitelläksemme molekyylimekanismia, jolla YTHDF2 säätelee NK-soluja, suoritimme ensin RNA-sekvensoinnin (seq) IL-2-laajennetuissa Ythdf2WT- ja Ythdf2ANK NK-soluissa. Ythdf2:n poisto NK-soluissa johti 617 eri tavalla ilmentyneeseen geeniin, mukaan lukien 252 säädeltyä geeniä ja 365 alasäädeltyä geeniä (kuva S5 A).

Geeniontologia (GO) -analyysi osoitti, että erilaisesti ilmentyneet geenit rikastuivat merkittävästi solusyklissä, solunjakautumisessa ja solun jakautumiseen liittyvissä prosesseissa, mukaan lukien mitoosisytokineesi, kromosomien segregaatio, kara, nukleosomi, keskivartalo ja kromosomi (kuva 7). A).

Geenisarjan rikastusanalyysi (GSEA) osoitti E2F-kohteiden, G2/Mcheckpointin ja mitoottisen karan tunnusmerkkigeenien merkittävää rikastumista Ythdf2ANKNK-soluissa (kuva S5 B). Solukiertoon ja solun jakautumiseen liittyvät geenit, mukaan lukien Aurka, Aurkb, Cdc20, Cdc25b, Cdc25c, Cdk1, E2f2 ja Plk1 (Bertoli et al., 2013), vähenivät merkittävästi Ythdf2ANK7 B -hiirten NK-soluissa (kuva 1). ).

Karan ja kromosomien segregaatiogeenit, kuten Anln, Aspm, Birc5, Bublb, Cenpe, Esco2, Ska1, Ska3 ja Tpx2 (Gorbsky, 2015), olivat myös merkittävästi alasäädeltyjä Ythdf2ANK-hiirten NK-soluissa verrattuna NK-soluihin Ythdf2ANK-hiiristä (Ythdf2ANK-hiirten NK-soluihin).

Lisäksi solujen selviytymisgeenit, mukaan lukien Birc5 (Niu et ai., 2010), Septin4 (Larisch et ai., 2000) ja Rffl (Yanget al., 2007), vähenivät merkittävästi Ythdf2ANK-hiirten NK-soluissa (kuva 1). 7 D). NK-solujen efektorifunktiogeenit, mukaan lukien Klrk1, Ncr1, CD226 ja Gzma (Bezman et ai., 2012), olivat myös merkittävästi alentuneet Ythdf2ANK-hiirten NK-soluissa (kuvio 7 D).

Nämä tiedot tukevat YTHDF2:n karakterisoituja roolejamme NK-solujen lisääntymisen, eloonjäämisen ja efektoritoimintojen säätelyssä. Tämän jälkeen suoritimme m6A-seq:n IL-2-laajennetuissa NK-soluissa Ythdf2WT- ja Ythdf2ANK-hiiristä. Pääkomponenttianalyysit osoittivat, että kunkin genotyypin kolme biologista kopiota ryhmittyi yhteen (tietoja ei näytetä), mikä viittaa m6A-seq-näytteiden hyvään toistettavuuteen.

Motiivien rikastamisen hypergeometrinen optimointi (HOMER) -analyysi tunnisti m6A-konsensusmotiivin (GGAC), mikä osoittaa m6A-modifioitujen transkriptien onnistuneen rikastamisen (kuva 7 E). m6A-muunnokset sijaitsivat pääasiassa proteiinia koodaavissa transkripteissä, ja piikit rikastuivat 59 transloimattomalla alueella (UTR) ja 39UTR:ssa, erityisesti aloitus- ja lopetuskodonien ympärillä (kuva 7 F ja kuva S5 C).

GOenrichment analyysi geenien kanssa m6A huiput paljasti, että useimmat m6A-merkitty transkriptit NK-soluissa oli rikastunut polkuja, jotka osallistuvat solusykliin ja solujen lisääntymiseen (kuva S5 D).

For more information:1950477648nn@gmail.com