Konservoitunut kysteiinirikas eritysproteiini MaCFEM85 on vuorovaikutuksessa MsWAK16:n kanssa aktivoidakseen kasvien puolustusta

Abstrakti: Metarhizium anisopliaeon entomopatogeeninen sieni, joka voi tehostaa kasvien kasvua ja vastustuskykyä toimiessaan isäntäkasveissa endofyyttina. Proteiinien vuorovaikutuksista tai niiden aktivointimekanismeista tiedetään kuitenkin vähän. Yleiset sienten ekstrasellulaariset kalvot (CFEM) proteiinit on tunnistettu kasvien immuunisäätelijöiksi, jotka tukahduttavat tai aktivoivat kasvien resistenssivasteita. Täällä tunnistimme CFEM-domeenia sisältävän proteiinin, MaCFEM85:n, joka sijaitsi pääasiassa plasmamembraanissa. Hiivan kaksihybridi (Y2H), glutationi-S-transferaasi (GST) ja bimolekulaarinen fluoresenssikomplementaatiokokeet osoittivat, että MaCFEM85 oli vuorovaikutuksessa solunulkoisen domeenin kanssa.Medicago sativa(alfalfa) kalvoproteiini, MsWAK16. Geeniekspressioanalyysit osoittivat, että MaCFEM85 ja MsWAK16 olivat merkittävästi ylössäädeltyjäM. anisopliaejaM. sativavastaavasti 12 - 60 tuntia yhteisinokuloinnin jälkeen. Lisähiivan kaksihybridimääritykset ja aminohappokohtaspesifinen mutaatio osoittivat, että CFEM-domeeni ja 52. kysteiini tarvittiin erityisesti MaCFEM85:n ja MsWAK16:n vuorovaikutukseen. Puolustustoimintokokeet osoittivat, että JA oli säädelty ylöspäin, mutta Botrytis cinerea -leesion koko ja Myzus persicae lisääntyminen tukahdutti MaCFEM85:n ja MsWAK16:n ohimenevän ilmentymisen malliisäntäkasvissa Nicotiana benthamianassa. Yhdessä nämä tulokset tarjoavat uusia näkemyksiä M. anisopliaen ja isäntäkasvien välisten vuorovaikutusten taustalla olevista molekyylimekanismeista.

cistanche-lisäaine hyödyttää - lisää vastustuskykyä

Avainsanat: seinään liittyvä kinaasi; CFEM:t; Metahizium anisopliae; kasvien immuniteetti; Medicago sativa

1. Esittely

Vuorovaikutukset kasvien ja mikrobien välillä ovat laajalle levinneitä ja ovat seurausta menneestä ja jatkuvasta yhteisevoluutiosta. Näillä vuorovaikutuksilla voi olla joko hyödyllisiä, neutraaleja tai haitallisia tuloksia kullekin osallistujalle [1–3]. Ritsosfäärin hyödyllinen mikrobiota voi edistää kasvien kasvua ja parantaa yleistä terveyttä suojaamalla maaperän taudeilta tai tehostamalla ravinteiden ottoa [4,5]. Laaja valikoima hyödyllisiä mikrobeja voi parantaa kasvien ominaisuuksia, kuten ravinteiden ottoa, kasvua sekä patogeenien ja hyönteisten puolustusta [6,7]. Metarhizium Sorok¯ın on tärkeä entomopatogeenisten sienien suku, jolla on kyky kolonisoida kasveja [8], mutta on myös näyttöä siitä, että suvun jäsenet voivat parantaa kasvien patogeenien vastustuskykyä. Esimerkiksi laboratoriotutkimuksessa havaittiin 60 %:n esto Fusarium solani (Mart.) Sacc. Metarhizium robertsii:n (aiemmin M. anisopliae) läsnä ollessa verrattuna kontrolleihin, joissa ei ollut M. robertsiia [9]. Jotkin Metarhizium-kannat voivat parantaa kasvien vastustuskykyä tuhohyönteisten ja -sairauksien suhteen muuttamalla kasvinsuojelugeenien ilmentymistä. Endofyyttinen kolonisaatio M. Robertsin kanssa aktivoi sekä jasmonihapon (JA) että salisyylihapon (SA) puolustusreittien ilmentymisen maissinlehdissä; lisäksi tällainen kolonisaatio liittyy kasvien kasvun edistämiseen ja Agrotis epsilonin (Hufnagel) toukkien kehityksen tukahduttamiseen [10]. Metarhizium guizhouense aktivoi -1,3-glukanaasin ja kitinaasin Lansium parasiticumin hedelmäkuoressa, mikä johti Botrytis sp. ja Fusarium sp. Aglaia dookkoo Griffin hedelmästä [11]. Lisäksi, kun M. anisopliaea levitettiin maapähkinän taimiin, useita transkriptiotekijöitä, mukaan lukien WRKY:t, MYC:t, TGA:t ja eteeniresponsiiviset transkriptiotekijät, aktivoituivat, kun taas nitraattikuljettajat ja proteiinit, jotka sitoivat dehydraatioherkkiä elementtejä, ilmentyivät myös eri tavalla [12] . Tämä viittaa siihen, että M. anisopliae säätelee kasvien puolustusgeenejä kolonisoiessaan kasvin. Metarhiziumin aiheuttaman infektion jälkeen kasvien puolustusreaktioiden taustalla olevista mekanismeista tiedetään kuitenkin suhteellisen vähän. Efektorit ovat yleinen tapa, jolla mikro-organismit säätelevät kasvien vastustuskykyä [13]. Kasvien resistenssin aktivoitumiselle on yleensä tunnusomaista oksidatiivinen purkaus ja hormonien, metaboliittien ja muiden signaalien induktio [13]. Kasvihormoneilla SA ja JA on tärkeä rooli kasvien resistenssin indusoinnissa välittäen kahta erillistä puolustussignalointireittiä [14]. SA-signalointireitti toimii ensisijaisesti kasvin allergisessa vasteessa ja systeemisessä hankitussa vastustuskyvyssä taudinaiheuttajia vastaan, mutta se voi myös olla osallisena pistelyhyönteisten ruokinnan aiheuttamissa epäsuorissa kasvin puolustusvasteissa [15]. SA:n kertyminen liittyy lipidisiirtoproteiineja (LTP) ja fenyylialaniiniammoniakkilyaasia (PAL) koodaavien geenien lisääntyneeseen ilmentymiseen [16], jotka välittävät alavirtaan erikoistuneiden metaboliittien, kuten flavonoidien ja ligniinin, synteesiä ja kertymistä [17]. JA-signalointireitti toimii suorina ja epäsuorina reaktioina mekaanisille vaurioille, sienipatogeeneille ja tuhohyönteisille. Tutkimukset ovat osoittaneet, että JA-signaalilla on säätelevä vaikutus erikoistuneiden metaboliittien, kuten terpenoidien, fenyylipropanoidien ja alkaloidien, synteesiin, joilla on laaja valikoima biologisia toimintoja [18]. Joidenkin erikoistuneiden metaboliittien on osoitettu kerääntyvän kasvisoluihin metyyliJA:lla (MeJA) käsittelyn jälkeen, mukaan lukien paklitakseli Taxus-lajeissa [19,20], terpenoidit Centella Asiatica (L.) Urbanissa [21] ja saponiinit ginsengissä [22]. . SA:n ja kitosaanin (CHT) käyttö herättäjänä aiheutti ligniinin kertymistä ja puolustusentsyymireaktioita tomaateissa, mikä vähensi Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi -infektion esiintyvyyttä [23]. Lisäksi JA- ja SA-tasot vehnässä kumuloituivat merkittävästi käyttämällä elicaattoria PeaT, mikä tehosti puolustusvastetta kaurakirvalle Sitobion avenae (Fabricius) [24]. Tämä osoittaa, että nämä efektorit voivat säädellä kasvien immuniteettia kasvihormonien ja metaboliittien kautta.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Sienen solunulkoisen kalvon (CFEM) proteiinit ovat yleisiä useissa sienissä. Ne koodaavat domeeneja, jotka ovat yleensä 60 aminohapon (aa) pituisia ja sisältävät kahdeksan tyypillisesti erillään olevaa kysteiiniä [25]. CFEM-domeenit ovat samanlaisia ​​kuin epidermaalisen kasvutekijän (EGF) kaltaiset domeenit, jotka toimivat solunulkoisina reseptoreina, signaalimuuntimina tai adheesiomolekyyleina isännän ja patogeenin vuorovaikutuksessa [26]. CFEM-domeeneja sisältävät proteiinit voivat manipuloida kasvin resistenssivastetta toimimalla efektoreina. Vehnän lehtiruostesienessä Puccinia triticina Erikas CFEM:n efektoriehdokas PTTG_08198 nopeuttaa solukuoleman etenemistä ja edisti reaktiivisten happilajien (ROS) kertymistä [27]. Antraknoosisieni Colletotrichum graminicola (Ces.) GW Wils sisältää viisi efektoria (CgCFEM6, 7, 8, 9 ja 15), joiden on osoitettu estävän BAX-indusoitua ohjelmoitua solukuolemaa Nicotiana benthamiana Dominissa [28]. Kasvisymbioottisen mykorritsasienen Laccaria bicolor (Maire) PDOrtonin raportoitiin erittävän useita CFEM-proteiineja, kuten Lac310796, Lac296573 ja Lac296572, symbioottisissa kudoksissa [29]. Vaikka näiden proteiinien monimutkaisia ​​toimintoja ei ole tutkittu tarkemmin mykorritsasymbioosissa, aikaisemmat tulokset viittaavat siihen, että CFEM-proteiinit voivat toimia signaloinnissa sienten ja kasvien välillä. M. anisopliae voi toimia joko entomopatogeenisena tai endofyyttisenä sienenä isäntäkasvissa [30]. CFEM-proteiinien rooleja ei kuitenkaan ole vielä raportoitu. Tunnisimme aiemmin CFEM-domeenia sisältävän proteiinin M. anisopliaessa, MaCFEM85:ssä (GenBank ID: MZ682609) [31]. Tässä raportoimme MaCFEM85:n ja Medicago sativa seinään liittyvän kinaasin MsWAK16 välisestä suhteesta. Analysoimme MaCFEM85-sekvenssin ja suoritimme kokeita määrittääksemme, mitkä tähteet ovat kriittisiä vuorovaikutukselle MsWAK16:n kanssa. Lopuksi, käyttämällä N. benthamianaa mallikasvinamme, arvioimme kasvien puolustusvasteet Botrytis cinerealle ja Myzus persicae -kirvalle MaCFEM85:n ja MsWAK16:n ohimenevän ilmentymisen kanssa ja ilman.

Cistanche tubulosan edut- vahvistaa immuunijärjestelmää

Napsauta tästä nähdäksesi Cistanche Enhance Immunity -tuotteet

【Kysy lisää】 Sähköposti:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. Tulokset

2.1. MaCFEM85 liittyi läheisimmin ei-patogeenisiin sieni-CFEM:eihin ja lokalisoitui plasmakalvoon

Fylogeneettinen puu rakennettiin analysoimaan MaCFEM85:n ja muiden patogeenisten ja ei-patogeenisten mallisienten CFEM-proteiinien välisiä suhteita. Näitä olivat Magnaporthe oryzae, Fusarium oxysporum (Schl), Neurospora crassa Shear & BODodge ja Beauveria bassiana (Bals.) (katso osa 4). MaCFEM85 oli läheisimmin sukua CFEM-proteiineille B. bassianassa ja siksi evoluutionaalisesti lähempänä ei-patogeenisiä kuin patogeenisiä sieniä (kuvio 1a).

Kuvio 1a

2.2. MaCFEM85:n säätely lisääntyi vuorovaikutuksen aikana M. sativan kanssa

Seinämäiset reseptorin kaltaiset kinaasit (WAK:t) edustavat alaryhmää reseptorin kaltaisten proteiinikinaasien (RLK) superperheessä, ja ne sisältävät solunulkoisen domeenin, transmembraanisen heliksin ja intrasellulaarisen kinaasidomeenin. Niillä on tärkeä rooli kasvien kasvun, kehityksen, stressivasteen ja patogeenien vastustuskyvyn signalointireittien säätelyssä [32]. RNA uutettiin M. anisopliae hyphaen ja M. sativan juurista yhteisinkuboinnin jälkeen MaCFEM85:n ja MsWAK16:n ilmentymismallien tutkimiseksi. Sekä MaCFEM85 että MsWAK16 ilmentyivät merkittävästi korkeammilla tasoilla rinnakkaisinkuboinnin aikana 12 - 6 0 h (kuvio 1c, d). 0 - 36 tuntia MaCFEM85:n ilmentyminen lisääntyi vähitellen saavuttaen huippunsa 36 tunnissa. Se ilmentyi × 593 kertaa enemmän M. anisopliaen ja M. sativan yhdistelmässä verrattuna yksin kasvatettuun M. anisopliaeen. Vaikka MaCFEM85:n ilmentyminen väheni hieman 48–60 tunnin aikana, se ilmeni silti merkittävästi korkeammalla tasolla kuin yksin kasvatetussa M. anisopliaessa. MsWAK16 oli myös merkittävästi ylössäädelty, ja ekspressio saavutti huippunsa 36 tunnin kohdalla. M. sativassa, joka oli infektoitunut M. anisopliaella, MsWAK16 oli × 89,06 kertaa enemmän ilmentynyt kuin M. sativassa ilman M. anisopliaea. 36:sta 60 tuntiin MsWAK16:n tasot laskivat hieman, mutta sen ilmentyminen oli silti merkittävästi korkeampi kuin siirrostamattomissa kasveissa.

2.3. MaCFEM85 on vuorovaikutuksessa MsWAK16:n kanssa in vitro ja in vivo

MaCFEM85:n mahdollisen toiminnallisen mekanismin tutkimiseksi vasteena M. anisopliae -käsittelylle suoritettiin hiivan kaksihybridi (Y2H) -seulonta, jotta voidaan alustavasti tunnistaa isäntäproteiinit, jotka ovat vuorovaikutuksessa MaCFEM85:n kanssa. MsWAK16:n solunulkoisen domeenin (MsWAK16-ED) ja MaCFEM85:n välistä vuorovaikutusta tutkittiin yksi-yhteen hiiva-kaksihybridimäärityksellä käyttäen MaCFEM85:tä pGBKT7:ssä BD-vektorina ja MsWAK16:ta pGADT7:ssä AD-vektorina. Kaikki muunnettu hiiva kasvoi hyvin SD-T/L-puutteellisella alustalla, ja positiivinen kontrolliryhmä ja koeryhmä kasvoivat onnistuneesti SD-T/L/H/A + X{17}}gal-puutteellisella alustalla. Tämä osoitti, että MaCFEM85 voi olla vuorovaikutuksessa MsWAK16-ED:n kanssa (kuva 2a).

Kuva 2. MaCFEM85:n ja MsWAK16:n välisen vuorovaikutuksen validointi.

In vitro validointia varten glutationi-S-transferaasi (GST) -merkitty MsWAK16-ED (koodaa 60 kDa:n tuotetta) lisättiin pGEX6-P2:een ja polyhistidiinillä (His) merkitty MaCFEM85 ( joka koodaa 17 kDa:n tuotetta) lisättiin pET{10}}b:hen. Immunoblottaus His- ja GST-vasta-aineilla osoitti, että rekombinanttiproteiini MaCFEM{11}}His oli vuorovaikutuksessa GST-MsWAK16-ED-saaliin kanssa, mutta ei pelkästään GST:n kanssa ja että GST-MsWAK{15}} ED oli vuorovaikutuksessa His-proteiinin kanssa. -MaCFEM85 (kuvio 2b). Vahvistaaksemme edelleen MaCFEM85:n ja MsWAK16:n välistä vuorovaikutusta suoritimme bimolekulaarisen fluoresenssin komplementaatiomäärityksen (BiFC) MaCFEM85-YFPN- ja MsWAK16-YFPC-konstrukteilla. MaCFEM85-YFPN:n ja MsWAK16-YFPC:n yhteisilmentyminen tupakanlehdissä synnytti keltaisen fluoresenssisignaalin, mikä osoittaa, että MaCFEM85 oli vuorovaikutuksessa MsWAK16:n kanssa (kuva 2c).

2.4. Tärkeimmät sivustot MaCFEM85- ja MsWAK16-vuorovaikutuksille

Sen MaCFEM85:n alueen määrittämiseksi, joka tarvitaan vuorovaikutukseen MsWAK16-ED:n kanssa, proteiinidomeeneja ennustettiin online-ohjelmistolla SMART (kuva 3a). MaCFEM85 sisälsi CFEM-verkkotunnuksen 19-86 aa-alueella. Myös tertiäärinen rakenne ennustettiin (kuvio 3b). Tämän domeenin kahdeksan kysteiiniä johtivat neljään disulfidisidokseen (CYS26 ja CYS69, CYS30 ja CYS64, CYS43 ja CYS50 ja CYS52 ja CYS85), jotka säilyttivät proteiinin stabiilisuuden (kuvio 3b). MaCFEM85:n oletettujen vuorovaikutuskohtien validoimiseksi proteiinista luotiin seitsemän mutatoitua versiota ja liitettiin pGBKT7:ään syöttiproteiineina. Jokainen rekombinanttivektori kotransfektoitiin AD-MsWAK16-ED:llä Y2H Gold -kannassa. Kanta, jossa CYS52 oli mutatoitu, ei kasvanut valikoivalla alustalla (kuva 3c, ääriviivat punaisella), mikä osoittaa, että CYS52 tarvitaan MaCFEM85:n ja MsWAK{25}}ED:n vuorovaikutukseen.

2.5. MaCFEM85:n vuorovaikutus MsWAK16:n kanssa aktivoi kasvien immuunivasteen

2.5.1. MaCFEM85:n ja MsWAK16:n roolin arviointi B. cinerea -tautiresistenssissä

Tutkiaksemme MaCFEM85:n ja MsWAK16:n mahdollista osallistumista patogeenin puolustusvasteisiin, tutkimme, voisiko MaCFEM85:n, MsWAK16:n tai MaCFEM85:n ja MsWAK16:n yli-ilmentyminen lisätä lisääntynyttä resistenssiä B. cinerealle. Ilmensimme ohimenevästi näitä vektoreita N. benthamianan lehdissä. Western blot -määritys osoitti, että MaCFEM85 ja MsWAK16 ilmentyivät vertailukelpoisilla tasoilla, kun niitä ekspressoitiin yksin tai yhdessä, mikä osoittaa, että MaCFEM85 ja MsWAK16 ilmentyivät onnistuneesti tupakassa (kuvio 4a). Sairausmääritykset suoritettiin myös käyttämällä N. benthamianaa, johon oli infiltroitunut MaCFEM85, MsWAK16, MaCFEM85+MsWAK16 tai GFP-kontrolli. Leesiot olivat merkittävästi pienempiä (noin 30 % 2 vuorokaudessa siirrostuksen jälkeen) lehdissä, joihin oli infiltroitunut MaCFEM85, MsWAK16 tai MaCFEM{19}}MsWAK16 verrattuna kontrollikasveihin (kuva 4b). Nämä tiedot osoittavat, että MaCFEM85:n ohimenevä ilmentyminen N. benthamianassa lisäsi vastustuskykyä B. cinerealle ja että MaCFEM85 ja MsWAK16 säätelevät positiivisesti puolustusvastetta B. cinereaa vastaan.

Kuva 3. MaCFEM5:n ja MsWAK16:n välisen vuorovaikutuskohdan tunnistus.

Kuva 4. Kasvien resistenssin induktio MaCFEM85:n ja MsWAK16:n ohimenevällä ekspressiolla.

2.5.2. MaCFEM85:n ja MsWAK16:n roolin arvioiminen kirvojen puolustuksessa N. benthamianassa

MaCFEM85:n ja MsWAK16:n roolin tutkimiseksi edelleen N. benthamiana -kasveihin, jotka tilapäisesti ilmentävät MaCFEM85:tä ja MsWAK16:ta, saastutettiin M. persicae, ja populaatiot arvioitiin. Tätä koetta varten suuri alue kustakin N. benthamianan lehdestä agroinfiltroitiin rekombinantilla binäärivektorilla pYBA1132, joka sisälsi MaCFEM85:n ja MsWAK16:n. Kontrollina käytettiin GFP:tä. 12 tuntia tunkeutumisen jälkeen 20 M. persicae aikuista pidettiin häkkiin jokaiselle lehdelle altistaen infiltroituneen alueen kirville. Seuraavien kolmen päivän aikana kirjattiin aikuisten kirvojen kuolleisuus ja nymfien lukumäärä; nymfit poistettiin sitten. Kuolleisuusriskissä ei ollut merkittävää eroa M. persicae -populaatioiden välillä, jotka ruokkivat kasveja, jotka ilmentävät MaCFEM85:tä, MsWAK16:ta tai MaCFEM85+MsWAK16:ta (χ2=3.65827, DF=3, p < 0,30081). ) (Kuva 4c). Kuitenkin 24, 48 ja 72 tunnin kohdalla kunkin aikuisen kirvan tuottamien jälkeläisten keskimääräinen lukumäärä oli merkittävästi suurempi GFP-kontrollia ilmentävillä N. benthamianalla verrattuna MaCFEM85:tä, MsWAK16:ta tai MaCFEM{24}}MsWAK16:ta ilmentäviin jälkeläisiin (kuva 4d).

2.5.3. MaCFEM85:n ja MsWAK16:n roolin arviointi hormonien kertymisessä ja hormoneihin liittyvässä geeniekspressiossa

Analysoidaksemme eroja eGFP:tä, MaCFEM85:tä, MsWAK16:ta ja MaCFEM85+MsWAK16:ta ilmentävien N. benthamiana -kasvien puolustusvasteiden välillä mittasimme JA-, SA- ja kokonaisflavonoiditasot sekä vastaavien geenien ilmentymisen. Tulokset osoittivat, että JA- ja SA-tasot erosivat eGFP:tä, MaCFEM85:tä, MsWAK16:ta ja MaCFEM{6}}MsWAK16:ta ilmentävien kasvien välillä (kuva 5a). Verrattuna eGFP:tä ilmentäviin kasveihin JA-tasot olivat merkittävästi alhaisemmat MaCFEM85:tä ilmentävissä kasveissa; SA-tasot nousivat hieman, mutta erot eivät olleet merkittäviä. Sitä vastoin MsWAK16:ta ekspressoivat kasvit eivät osoittaneet merkittäviä eroja JA-tasoissa verrattuna eGFP-kontrolliin, kun taas SA-tasot olivat merkittävästi alhaisemmat kuin kontrollissa (kuvio 5a). JA- ja SA-tasot nousivat merkittävästi ja laskivat vastaavasti MaCFEM85+MsWAK16:ta ilmentävissä kasveissa verrattuna eGFP:hen.

Kuva 5. Hormonitasot ja hormonivastegeenin ilmentyminen

Flavonoidien kokonaispitoisuus oli merkittävästi korkeampi MaCFEM{0}}MsWAK16:ta ilmentävissä kasveissa verrattuna kaikkiin muihin hoitoryhmiin (kuva 5a). Biosynteettisten geenien ilmentymistasot olivat samankaltaisia ​​MsWAK16:ta ja MaCFEM{4}}MsWAK16:ta ilmentävillä kasveilla. Esimerkiksi JA-vasteeseen liittyvät geenit, nimittäin COI1, MYC2 ja PDF1.2, lisääntyivät merkittävästi GFP:tä ilmentäviin kasveihin verrattuna (kuvio 5b). Samoin SA:hen liittyvät geenit NPR1, WRKY70 ja PR1 ilmentyivät merkittävästi eri tavalla kasveissa, jotka ilmensivät MsWAK16:ta ja MaCFEM{16}}MsWAK16:ta; NPR1:tä säädeltiin ylöspäin, kun taas WRKY70:tä ja PR1:tä säädettiin alas kontrolliin verrattuna (kuvio 5b). Tutkimme myös avaingeenien ilmentymistä shikimiinihapon ja fenyylipropanoidin synteesireiteissä, jotka molemmat liittyvät flavonoidisynteesiin. Yleensä MaCFEM85:n ilmentyminen yksinään ei indusoinut näiden geenien merkittävästi suurempaa ilmentymistä tupakassa. Nämä geenit kuitenkin lisääntyivät tupakassa, joka ilmensi MsWAK16:ta tai MsWAK16+MaCFEM85:tä GFP-kontrolliin verrattuna (kuva 5c).

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

3. Keskustelu

3.1. Säilötty CFEM-proteiinimotiivi palvelee useita toimintoja sienilajeissa

CFEM-domeeni on ainutlaatuinen sienille, ja sitä esiintyy yleisesti sienen solunulkoisissa kalvoproteiineissa. Domeeni on peräisin Ascomycotan ja Basidiomycotan viimeisimmästä yhteisestä esi-isästä [33]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että sienipatogeenien CFEM-proteiinit voivat toimia kasvien immuunijärjestelmän säätelijöinä aiheuttaen isäntäkasvin immuunivastetta tai aktivaatiota infektion tyypistä riippuen [28,34,35]. CFEM-domeenia sisältävistä proteiineista M. anisopliaessa on raportoitu vain vähän, vain evoluutiovertailun yhteydessä muihin sieniin [36]. Tässä tutkimuksessa vertailimme M. anisopliaen CFEM-proteiineja muihin tunnettuihin CFEM-proteiineihin sekä patogeenisissa että ei-patogeenisissa sienissä. Vahvistimme, että MaCFEM85:n lähin homologi on Cfem5, joka löytyy Beauveria bassianasta, joka on yksi 12 CFEM-proteiinista kyseisessä lajissa (lisäkuva S1). BbCfem5 on välttämätön raudan hankinnassa [37]. Lisäksi ennustetun tertiaarisen rakenteen perusteella CFEM-domeeni MaCFEM85:ssä on hyvin samanlainen kuin Candida albicans (CPRobin) Berkhoutissa löydetty pinta-antigeeniproteiini 2 (CSA2), jossa 65 tähdettä (96 % sekvenssistä) on mallinnettu 99,8:lla. % luottamus [31]. Candida albicans on eläinpatogeeni; CSA2:lla on tärkeä rooli kasvussa ja patogeenisyydessä, koska se erottaa hemiä hemoglobiinista ja kuljettaa hemiä soluseinästä plasmaan [38–40]. Oletamme, että MaCFEM85 voi olla osallisena hyönteisisäntien M. anisopliae -virulenssissa. Nämä MaCFEM85:n yhdistetyt toiminnot eläinten patogeenisissä infektioissa ja kasvien immuniteetin aktivoinnissa tekevät proteiinista jännittävän tulevaisuuden tutkimuskohteen.

3.2. Disulfidisidokset ovat tärkeitä rakenteita proteiinien toiminnalle

Proteiinirakenteen konformationaalinen eheys liittyy suoraan sen kykyyn toimia. Kysteiiniparien muodostamat disulfidisidokset edistävät proteiinin laskostumista ja konformaatiosta stabiilisuutta, ja niiden katsotaan muodostavan avainkohtia spesifisten reseptorien tai ligandien tunnistamiseen ja sitoutumiseen [41]. Esimerkiksi minkä tahansa kolmesta konservoituneesta disulfidisidoksesta katkaiseminen kasvipatogeenissa Cladosporium fulvum efektoriproteiinissa AVR4 johtaa proteaasiherkkyyteen ja alentuneeseen kitiinin sitoutumiskykyyn [42]. Kolmessa muussa C. fulvum -proteiinissa (ECP1, ECP2 ja ECP5) kysteiinien yksittäiset alaniinien substituutiot vaimentavat tomaatin yliherkkyysvastetta, mikä osoittaa, että kysteiinit ovat kriittisiä stabiilisuuden ja yliherkkyyttä aiheuttavan aktiivisuuden ylläpitämisessä [43]. Lisäksi Magnaporthe oryzaen kypsässä proteiinissa MC69 kahden konservoituneen kysteiinitähteen (Cys36 ja Cys46) mutageneesi voi heikentää MC69:n toimintaa vaikuttamatta eritykseen, mikä viittaa disulfidisidoksen merkitykseen erityisesti MC69:n patogeenisuudessa [44]. CFEM-domeeni näyttää olevan samanlainen kooltaan ja kysteiinitähteiden malliltaan kuin EGF:n kaltaiset domeenit, jotka sisältävät kolme tai neljä paria disulfidisidoksia. EGF-proteiinit voivat toimia solun pinnan reseptoreina, signaalimuuntimina tai adheesiomolekyyleina isäntä-patogeenivuorovaikutuksissa [45]. Tässä tutkimuksessa emme vain havainneet, että MaCFEM85:n CFEM-domeeni sisälsi kahdeksan konservoitunutta kysteiiniä, jotka muodostivat neljä paria disulfidisidoksia (kuva 3b), mutta vahvistimme myös, että CFEM oli kriittinen domeeni MaCFEM85:n ja MsWAK16:n väliselle vuorovaikutukselle. Lisäksi kysteiinitähteiden kohdennetun mutaation kautta alaniiniksi havaitsimme, että kysteiinitähde kohdassa 52 oli vuorovaikutukseen tarvittava ydinkohta (kuvio 3c). Nämä tulokset antavat perustan jatkotutkimuksille CFEM85–WAK16-vuorovaikutuksen fysiologisista toiminnoista.

3.3. MaCFEM85:n vuorovaikutus MsWAK16-aktivoitujen kasvinsuojelujärjestelmien kanssa

Mikrobi-kasvivuorovaikutuksessa kasvien puolustusvasteet aktivoituvat yleensä mikrobien efektoriproteiinien avulla. Indusoidusta puolustuksesta on tulossa tärkeä väline biologisessa tuholaistorjunnassa vastustuskyvyn edistämiseksi. CFEM-proteiinit on tunnistettu kasvien immuuniaktivaation tai -eston säätelyyn osallistuviksi efektoreiksi [28,46]. On kuitenkin vähän julkaistu tutkimusta, joka yhdistää näiden immuunitekijöiden säätelyn niiden erityisiin rooleihin kasvisairauksissa ja hyönteisten vastustuskyvyssä. Tässä tutkimuksessa käytimme entomopatogeenistä ja endofyyttistä sientä M. anisopliae tunnistaaksemme vuorovaikutuksen MaCFEM85:n ja soluseinään liittyvän kinaasin, MsWAK16:n, välillä M. sativassa. Tulokset osoittivat, että tämä vuorovaikutus vähensi vauriosuhdetta B. cinerealla siirrostuksen jälkeen (kuvio 4b) ja vähensi M. persicaen populaation kasvunopeutta (kuvio 4d), mikä osoittaa, että MaCFEM85:n ja MsWAK16:n välinen vuorovaikutus lisäsi M. sativan vastustuskykyä kirvoja vastaan. JA:n, SA:n ja eteenin (ET) tasojen muutoksia voidaan käyttää markkereina arvioitaessa kasvien resistenssin induktiota [47,48]. Tässä osoitimme, että MaCFEM85 oli vuorovaikutuksessa MsWAK16:n kanssa vaikuttaen kasvien vastustuskykyyn hormonaalisen säätelyn kautta ja estäen M. persicaen lisääntymisnopeutta (kuvio 4d). Vastaavia tutkimuksia on raportoitu aiemminkin. Esimerkiksi Brevibacillus laterosporus -efektoriproteiinin PeBL1:n osoitettiin indusoivan JA:n ja SA:n kertymistä tomaateissa ja vähentävän M. persicaen toisen ja kolmannen sukupolven populaatioiden kasvunopeutta, jotka ruokkivat näitä kasveja. Lisäksi efektoreilla ruiskutetuilla tomaattikasveilla on karkottava vaikutus M. persicaeen [49]. Elisitoriproteiinin PeBC1 levittäminen tavalliseen papuun (Phaseolus vulgaris L.) johtaa selkeisiin ja merkittäviin subletaalisiin vaikutuksiin vihreisiin persikkakirviin. PeBC1:llä käsitellyt kasvit osoittavat merkittävää JA- ja SA-geenien lisääntymistä [50]. Beauveria bassiana -eliitsitori PeBb1 vähentää M. persicaen hedelmällisyyttä tupakassa ja indusoi JA- ja ET-geenien ilmentymistä [51]. Tässä tutkimuksessa MaCFEM85:n ja MsWAK16:n ohimenevä ilmentyminen tupakassa lisäsi merkittävästi JA-vasteeseen liittyviä geenejä COI1, MYC2 ja PDF1.2 (kuva 5b) ja lisäsi JA- ja kokonaisflavonoidipitoisuutta (kuva 5a), mikä oli verrattavissa tuloksiin. kirjallisuudessa, kuten edellä on kuvattu. Emme kuitenkaan havainneet korkeita SA-tasoja tupakassa 12 tuntia tunkeutumisen jälkeen, ja ohimenevästi MsWAK16:ta tai MaCFEM{35}}MsWAK16:ta ilmentävät kasvit osoittivat merkittävästi alentuneita SA-tasoja ja SA-vasteeseen osallistuvien geenien säätelyä (kuva 5a,b) . Tämä osoitti, että eri kasvihormonien stimulointi voi johtaa synergististen toimintojen lisäksi myös ylikuulumiseen ja palautteeseen, jolloin kasvit voivat reagoida asianmukaisesti erilaisiin ärsykkeisiin. Kasveissa on aiemmin raportoitu kohonneita JA-tasoja, mutta alhaisia ​​SA-tasoja. Esimerkiksi A. thalianassa, jossa SA-keräytyminen oli puutteellista, JA-tasot olivat 25-kertaa korkeammat kuin villityypin A. thalianassa, ja JA-responsiiviset geenit aktivoituivat [52]. On myös raportoitu, että jotkin bakteerit voivat lisätä JA-tasoja kasveissa estääkseen SA:n kertymistä, välttäen SA:n aiheuttamia haittoja. Esimerkiksi Pseudomonas syringae kohdistuu COI1-reseptoriin toksiinin, koronatiinin, kautta, joka säätelee negatiivisesti JA-reittiä [53]. Tämä edistää MYC2-indusoimaa transkriptiotekijöiden ANAC019, ANAC055 ja ANAC072 [54] lisääntymistä, inhiboi ICS1:n (SA-synteesin avaingeeni) transkriptiota ja vähentää siten SA:n tuotantoa ja signaalinsiirtoa. Tässä tutkimuksessa MaCFEM85:n ja MsWAK16:n välinen vuorovaikutus johti lisääntyneeseen JA:n kertymiseen ja JA-responsiivisten geenien lisääntymiseen, mutta SA:n kertymisen ja SA:hon liittyvien geenien transkription estoon. Tämä osoitti, että MaCFEM85:n ja MsWAK16:n välinen vuorovaikutus indusoi JA:ta, mikä parantaa kasvien vastustuskykyä kirvoja vastaan.

N. benthamianassa, joka ekspressoi ohimenevästi MaCFEM85:tä ja MsWAK16:ta, JA-tasot nousivat ja B. cinerea -vauriokoot pienenivät (kuvio 4b), mikä on yhdenmukainen aikaisempien tutkimusten kanssa. JA osallistuu kasvien vastustuskykyyn hyönteisiä ja nekrotrofisia patogeenejä vastaan ​​[52,55]. B. cinereaa nekrotrofisena patogeenina esti JA:n ja ET:n kertyminen [56]. A. thaliana ET-puutteellisessa mutantissa ein{7}} ja JA-vastemutantticoi:ssa1-1 alavirran puolustusgeenin PDF1.2:n tasot laskivat merkittävästi ja herkkyys B. cinerealle parani [ 57]. Havaitsimme tässä, että JA:n kertyminen ja JA-sukuisten geenien transkriptio lisääntyivät merkittävästi N. benthamianassa, joka ekspressoi ohimenevästi MaCFEM85:tä ja MsWAK16:ta, kun taas SA:n kerääntyminen ja SA:hon liittyvien geenien transkriptio estyivät. MaCFEM85:n ja MsWAK16:n ilmentyminen osoitti myös inhiboivaa vaikutusta B. cinereaan. Tämä osoitti, että MACFEM85 ja MsWAK16 aktivoivat JA:n ja että sillä oli johtava rooli kasvien vastustuskyvyssä B. cinereaa vastaan.

4. Materiaalit ja menetelmät

4.1. Sienikannat, kasvimateriaalit ja viljelymenetelmät

Metarhizium anisopliae -isolaattikantoja Ma 9 viljeltiin peruna-sokeri-agar (PSA) -elatusaineella (200 g vedessä keitettyä kuorittua perunauutetta, 20 g sakkaroosia ja 15 g agaria/l). Tuore sporangiumjauhe kerättiin 10 päivän kuluttua. Nicotiana benthamiana -kasveja kasvatettiin keinotekoisessa ilmastokammiossa 14/10 h valo/pimeyssyklillä (27/25 ◦C). Ohimenevää geeniekspressiota varten Agrobacterium-välitteisen transformaation kautta Agrobacterium tumefaciens -kantaa GV3101 viljeltiin Luria Broth (LB) -elatusaineessa (10 g tryptonia, 5 g hiivauutetta ja 10 g NaCl/l). Hiivakantaa Gold (OE Biotech Co., Ltd., Shanghai, Kiina) viljeltiin hiivauutepeptonidekstroosi (YPDA) -elatusaineella (10 g hiivauutetta, 20 g peptonia, 20 g glukoosia ja 0,03 g adeniinihemisulfaattia/l). Kullekin vektorille ja kannalle käytettiin sopivia antibiootteja, nimittäin rifampiinia, kanamysiiniä tai ampisilliinia (vastaavasti 25, 50 tai 50 ug/ml). Tässä tutkimuksessa käytetyt kannat ja plasmidit on lueteltu lisätaulukossa S1. Medicago sativan siemeniä pintasteriloitiin 75-prosenttisella etanolilla 1 minuutin ajan, minkä jälkeen 50-prosenttisella NaClO:lla (5,5 %) 15 minuutin ajan. Siemenet sekoitettiin perusteellisesti ja pestiin sitten steriilissä vedessä kolme kertaa 5 minuutin ajan. Siemeniä inkuboitiin 4 °C:ssa pimeässä yli 24 tuntia, sitten idätettiin 1 % vesiagarmaljoilla huoneenlämpötilassa yön yli. Kolme päivää itämisen jälkeen kehittyvät taimet siirrettiin suodatinpaperille 9-cm steriileille petrimaljoille, 20 tainta maljaa kohden. Hoidot ja kontrolli jaettiin 15 astiaan, vastaavasti. Sitten taimet kasteltiin 10 ml:lla M. anisopliae itiösuspensiota, joka sisälsi 107/ml, ja kontrollia kasteltiin 10 ml:lla steriiliä vettä. 0, 12, 24, 48 ja 60 tunnin kohdalla otettiin satunnainen valikoima taimia kolmelta petrimaljalta kullekin aikavälille. Näytteet pakastettiin nestetypessä ja säilytettiin -80 ◦C:ssa.

4.2. qRT-PCR ja plasmidirakenne

Kokonais-RNA uutettiin M. anisopliaesta (hyphae) ja M. sativasta (juuret) TRIzol-reagenssilla (Invitrogen, CA, USA) noudattaen valmistajan ohjeita. Tuloksena olevan RNA:n laatu ja runsaus mitattiin NanoPhotometer®:llä (Implen, Münich, Saksa). Ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi (enintään 2 ug RNA:ta) suoritettiin käyttämällä 5x All-In-One RT Master Mixiä (Applied Biological Materials Inc., Vancouver, BC, Kanada) noudattaen valmistajan ohjeita. qRT-PCR suoritettiin käyttämällä US EVER BRIGHT ® INC:n 2×SYBR Green qPCR Master Mixiä ja ABI QuantStudio 5 -järjestelmää valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kullekin geenille käytetyt alukkeet on lueteltu lisätaulukossa S2. Maury [58], Msactin [59] ja Nbactin [60] käytettiin sisäisinä vertailugeeneinä ilmentymistietojen normalisoinnissa. Reaktio suoritettiin seuraavissa olosuhteissa: 5 minuuttia 95 °C:ssa, jota seurasi 40 sykliä 95 °C:ssa 15 sekuntia ja 60 °C:ssa 40 sekuntia. Jokaiselle näytteelle oli kolme teknistä kopiota. Suhteellinen lauseke laskettiin 2−∆∆Ct-menetelmällä [61]. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA) ja Duncanin monialuetestiä SPSS v20.0:ssa (SPSS).

4.3. Proteiinien ohimenevä ilmentyminen N. benthamianassa

MaCFEM85:tä koodaava sekvenssi (CDS) monistettiin ultrafidelity DNA -polymeraasilla käyttämällä cDNA:ta templaattina. Subsellulaarisia lokalisointimäärityksiä varten PCR-tuotteet, jotka sisälsivät CDS:tä MaCFEM85:lle, kloonattiin pYBA1132-eGFP:hen (Digestoitu EcoRI:llä ja Sall:llä) ja pcambia1300-kirsikkaan (EcoRI ja SacI), vastaavasti. Kaikki konstruktit validoitiin sekvensoinnilla (Tsingke Biotechnology Co., Ltd. Beijing, Kiina). Tässä tutkimuksessa käytetyt alukkeet on lueteltu lisätaulukossa S2. MaCFEM85-eGFP:n ja MaCFEM85-mCherryn ohimenevää ekspressiota varten N. benthamianassa A. tumefaciens -kanta GV3101 transformoitiin kullakin plasmidilla ja varmistettiin PCR:llä. Agrobacteriumia viljeltiin yön yli 28 ◦C:ssa ravistellen. Solut kerättiin sentrifugoimalla 5 minuuttia 5000 rpm huoneenlämpötilassa, pestiin kolme kertaa steriilillä kahdesti tislatulla vedellä ja suspendoitiin uudelleen 10 mM MgCl2-puskuriin (sisältää 10 mM MES:ää ja 10 mM asetosyringonia, pH 5,7). Solususpensio säädettiin OD600-arvoon 0,5, minkä jälkeen se suodatettiin 4--5-viikon ikäisten N. benthamianan lehtien alapuolelle 1-ml ruiskulla. Jokainen lehti infiltroitiin 50 ul:lla A. tumefaciensia; kolme lehteä käsiteltiin per kasvi ja kolme kasvia oli kussakin käsittelyryhmässä. Käsitellyt lehdet kerättiin 30 tunnin kuluttua ja visualisoitiin Zeiss LSM980 -konfokaalimikroskoopilla (Carl Zeiss, Saksa) solun alaisen sijainnin määrittämiseksi.

Cistanche-edut miehille - vahvistavat immuunijärjestelmää

4.4 Fylogeneettinen analyysi

Fylogeneettinen puu rakennettiin käyttämällä naapuriliitosmenetelmää MEGA X:ssä. 1000 bootstrap-kopiota käytettiin P-etäisyysmallia. Puun tuottamiseen käytetyt aminohapposekvenssit saatiin BLASTP-hauilla NCBI-tietokantaa vastaan, joka sisältää sukulaisia ​​sieniä (esim. Magnaporthe oryzae, Botrytis cinerea, Fusarium graminearum, Colletotrichum graminicola, Fusarium oxysporum, Neurospora crassa, Aspergillus fumiomaediaum the Gliocriodiplogatus , Trichoderma harzianum, Beauveria bassiana ja Paecilomyces lilacinus) käyttämällä kyselynä MaCFEM85:tä.

4.5. Hiivan kaksihybridimääritykset

Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System -järjestelmää (Clontech Laboratories, Inc.; nyt Takara Bio USA, Inc.) käytettiin varmistamaan MaCFEM85:n ja MsWAK16:n välinen vuorovaikutus. MaCFEM85 ilman signaalipeptidiä vietiin pGBKT7:ään syöttinä ja MsWAK16:n solunulkoinen domeeni (MsWAK16-ED) liitettiin pGADT7:ään saaliiksi. Hiivapätevien solujen valmistus ja transformaatiot suoritettiin käyttämällä Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit™ -sarjaa (ZYMO Research, CA, USA) noudattaen valmistajan ohjeita. Syötti- ja saalisplasmidit muunnettiin yhdessä hiivakantaan Gold. Proteiini-proteiini-vuorovaikutuksia analysoitiin kasvun perusteella SD-kaksoisväliaineella (DDO, SD/-Trp-Leu) ja SD-neljäsväliaineella (QDO, SD/-Trp-Leu-His-Ade).

4.6. BiFC-määritys

BiFC-konstruktien muodostamiseksi pUC-SPYNE- ja pUC-SPYCE-vektorit linearisoitiin digestoimalla BamHI:llä. MaCFEM85:n ja MsWAK16:n täyspitkät CDS:t kloonattiin ja insertoitiin linearisoituihin plasmideihin käyttämällä rekombinanttientsyymiä MaCFEM85-YFPN- ja MsWAK16-YFPC-konstruktien saamiseksi. Plasmidit, jotka sisältävät MaCFEM85:n ja MsWAK16:n, yhteistransformoitiin tyhjillä vektoreilla negatiivisina kontrolleina (MaCFEM85-YFPN + pUC-SPYCE, MsWAK16-YFPC + pUC-SPYNE ja pUC-SPYNE + pUC-SPYCE) . Kaikki vektorit vietiin N. benthamianaan Agrobacterium-välitteisellä transformaatiolla, kuten edellä on kuvattu. Fluoresenssisignaalit havaittiin lehtien epidermaalisissa soluissa käyttämällä Zeiss LSM980 -konfokaalimikroskooppia (Carl Zeiss, Saksa). Vektorikonstruktioon käytetyt alukkeet on lueteltu lisätaulukossa S2.

4.7. GST Pull-Down Assay

GST-pudotusmäärityksiä varten MsWAK16-ED lisättiin pGEX-6P-2-vektoriin ja MaCFEM85 insertoitiin pET-21b:hen. Puhdistettuja fuusioproteiineja (GST-MsWAK16- ED) ja pGEX-6P-2 no-load-proteiinia (GST) käytettiin syöttiproteiinina ja puhdistettua pET-21 b-MaCFEM85-fuusioproteiinia (His-MaCFEM85) käytettiin saaliina. GST-pudotusmääritykset suoritettiin Mag-Beads GST Fusion -proteiininpuhdistusjärjestelmällä (Sangon Biotech, Shanghai, Kiina) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti sanottuna Mag-Beads pestiin viisi kertaa 1 x fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS, pH 7,4) alkoholisuojan vapauttamiseksi, ja sitten lisättiin 10 ml GST:tä tai GST-MsWAK16-ED:tä. Helmiä sekoitettiin kääntämällä huoneenlämmössä 30 minuutin ajan. Supernatantin poistamisen jälkeen Mag-Beads pestiin viisi kertaa 1 x PBS:llä. His-MaCFEM85 lisättiin Mag-Beads-helmiin, jotka oli jo sidottu GST:hen, ja seosta inkuboitiin yön yli 4 °C:ssa pyörittäen. Sitten helmet pestiin viisi kertaa 1 x PBS:llä sitoutumattomien proteiinien poistamiseksi. Sen jälkeen helmiin immobilisoidut proteiinit erotettiin SDS-PAGE:lla, siirrettiin nitroselluloosakalvolle (100 V, 1 h) ja analysoitiin Western blot -menetelmällä. Kalvot pestiin kolme kertaa 10 minuutin ajan PBS + Tween (PBST) -seoksella. Kalvoja blokattiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa 5 % rasvattomalla maidolla, sitten niitä inkuboitiin ProteinFind anti-His hiiren monoklonaalisella vasta-aineella (TransGen Biotech, Peking, Kiina) (laimennettu 1:3000) tai ProteinFind anti-GST hiiren monoklonaalisella vasta-aineella 2 h 4 ◦C. Sitten kalvot upotettiin ProteinFind vuohen anti-kanin IgG(H+L) (HRP) -vasta-aineeseen (TransGen Biotech, Peking, Kiina) (laimennettu 1:5000) 1 tunniksi huoneenlämpötilassa. Kalvot visualisoitiin EasySee® Western Blot Kit -sarjalla (TransGen Biotech, Peking, Kiina) noudattaen valmistajan ohjeita.

4.8 Avainpaikan tunnistaminen MaCFEM85:ssä

MaCFEM85:n ja MsWAK16:n vuorovaikutukseen tarvittavan koon määrittämiseksi suoritettiin PCR-monistus useiden MaCFEM85:n katkaistujen muotojen muodostamiseksi. CFEM-domeeni (MaCFEM85-CFEM; aa-tähteet 19–86) ja C-pääte ilman CFEM-aluetta (MaCFEM85-C, aa-tähteet 87–170) lisättiin vektoriin pGBKT7 syöttiproteiinina (lisätaulukko S1). Toiset viisi varianttia rakennettiin käyttämällä polypeptidisynteesiä kysteiinin mutatoimiseksi alaniiniksi kohdissa 26, 30, 43, 52 ja 26/30/43/50/52/64/69/85 (∆CFEM8526, ∆CFEM8530, ∆CFEM8530, ∆CFEM8, ∆543). CFEM8552 ja ∆CFEM858 kaikki). Näitä muunnelmia käytettiin Y2H-kokeiden suorittamiseen MsWAK16-ED:llä. Transformoituneiden hiivasolujen kasvu määritettiin synteettisillä dropout-SD/-Trp-Leu-levyillä ja SD/-Trp-Leu-His-Ade-maljoilla, jotka sisälsivät X- -galaktosidaasia (X- -Gal).

4.9. Kasvien resistenssimääritykset

Myzus persicae saatiin yhtiöltä Henan Quanying Biological Co., Ltd. Viikkoa ennen biomääritysten aloittamista 150 aikuista kirvoja asetettiin kolmelle N. benthamiana -kasville (50 kirvaa kasvia kohti). 72 tunnin kuluttua kaikki aikuiset poistettiin pehmeällä taiteilijaharjalla, ja nymfien annettiin ruokkia vielä neljä päivää ennen kuin ne siirrettiin N. benthamianaan kirvojen suorituskykymäärityksiä varten.

4.10. Kirvojen suorituskykymääritykset

Nicotiana benthamiana Domin. (Solanales: Solanaceae) käytettiin arvioimaan M. persicaen suorituskykyä, kasvien tautien vastustuskykyä B. cinereaa vastaan ​​ja hormoneihin liittyvien geenien ilmentymistä. Agrobakteereja, jotka kantavat joko pYBA-eGFP:tä, pYBA-MaCFEM85:tä, pYBA-MsWAK16:ta tai pYBA-MaCFEM85+pYBA-MsWAK16:ta, kasvatettiin LB:ssä, jota oli täydennetty sopivilla antibiooteilla 36 tuntia 28 ◦C:ssa. Solut pestiin kolme kertaa, sitten suspensoitiin uudelleen infiltraatiopuskuriin (10 mM MgCl2, 10 mM MES ja 100 uM asetosyringoni, pH 5,6) OD600-arvoon 0,6. Samanaikaista infektiota varten bakteerit, jotka kantavat MaCFEM85:tä ja MsWAK16:ta, säädettiin OD600:ksi 1,2, ja sekoitettiin sitten yhtä suuriin tilavuuksiin. Täysin laajentuneet lehdet suodatettiin bakteereilla käyttämällä 1-ml neulattomia ruiskuja. Jokaiseen kasviin tunkeutui kolme lehteä ja jokainen käsittely suoritettiin kolmeen kasviin yhteensä 12 kasvia kohti koetta kohden.

Kirvojen suorituskykymäärityksiä varten 20 aikuista kirvaa levitettiin kunkin lehden infiltroituneelle alueelle 12 tuntia Agrobacteriumin levittämisen jälkeen. Kirvat suljettiin halkaisijaltaan 5 mm:n pidikehäkeillä. Jokainen hoito toistettiin viisi kertaa. Aikuisten kirvojen kuolleisuus ja vasta munittujen nymfien lukumäärä rekisteröitiin päivittäin kolmen päivän ajan. B. cinereaa viljeltiin viisi päivää PDAY:llä. 12 tuntia Agrobacterium-infiltraation jälkeen vastaviljelty B. cinerea lävistettiin 5-mm sienikakkuksi ja myseelin kasvupinta kiinnitettiin infiltraatioalueelle lehden pinnalla. Taudin kehittymisen helpottamiseksi kasvit pidettiin kosteana peittämällä ne muovikalvolla 22 ◦C:n astioissa taudin etenemisen helpottamiseksi. 48 tunnin kuluttua taudin eteneminen arvioitiin inokuloiduissa lehdissä mittaamalla leesioiden koko. Merkityksellisten geenien suhteellisen ilmentymisen kvantifioimiseksi kolme tunkeutunutta lehteä kerättiin kustakin kasvista 12 tuntia tunkeutumisen jälkeen, jäädytettiin sitten nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 asteessa. RNA:n kokonaisuutto, cDNA-synteesi ja qRT-PCR suoritettiin osiossa 3.2 kuvatulla tavalla. Salisyylihapon (SA), jasmonihapon (JA) ja flavonoiditasot mitattiin 15 sisään suodatetusta N. benthamianan lehdestä käsittelyä kohden. Lehdet kerättiin, pakastettiin nestetypessä ja säilytettiin sitten -80 asteessa. Kasvihormonien määrä määritettiin käyttämällä Plant Salicyclic Acid- ja Plant Jasmonic Acid ELISA Kit -pakkauksia (Beijing WeLab Scientific Co., Ltd.), ja flavonoidit määritettiin käyttämällä Micro Plant Flavonoids Assay Kit -sarjaa (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.) seuraavasti: valmistajan ohjeita.

4.11. Tilastollinen analyysi

Tiedot analysoitiin SPSS v2:ssa0.0. Merkittävät erot MaCFEM85:n ja MsWAK16:n ilmentymistasoissa määritettiin käyttämällä Studentin t-testiä. Merkittävät erot SA-, JA- ja flavonoiditasoissa määritettiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVAa ja Duncanin monialuetestiä kynnysarvolla p < 0,05.

5. Johtopäätökset

Tässä tutkimuksessa tunnistimme ja karakterisoimme uuden erittyvän proteiinin, MaCFEM85:n, M. anisopliaessa. Sen havaittiin olevan konservoitunut efektori, joka voi olla vuorovaikutuksessa MsWAK16:n kanssa ja aktivoida N. benthamianan puolustusvasteen. Osoitimme, että CFEM-domeeni ja kysteiinitähde kohdassa 52 MaCFEM85:ssä olivat kriittisiä vuorovaikutukselle. Tämä vuorovaikutus voi aktivoida JA-peräisiä immuunivasteita sekä taudeille ja hyönteisille vastustuskykyisiä mekanismeja kasveissa.

Viitteet

1. Paulucci, NS; Anta, GG; Gallarato, LA; Vicario, JC; Cesari, AB; Reguera, YB; Kilmurray, C.; Bueno, MA; García, MB; Dardanelli, MS Kasvien ja mikrobien väliset kumppanuudet: Vaikutukset kasvuun ja kasvien terveyteen. In Plant Microbe Symbiosis: Fundamentals and Advances; Springer: Berliini/Heidelberg, Saksa, 2013; s. 105–117. [CrossRef]

2. Schenk, PM; Carvalhais, LC; Kazan, K. Kasvien ja mikrobien välisten vuorovaikutusten purkaminen: Voiko useiden lajien transkriptomiikka auttaa? Trends Biotechnol. 2012, 30, 177–184. [CrossRef]

3. Sasse, J.; Martinoia, E.; Northen, T. Ruoki ystäviäsi: Muokkaavatko kasvieritteet juurimikrobiomia? Trends Plant Sci. 2018, 23, 25–41. [CrossRef]

4. Lugtenberg, B.; Kamilova, F. Kasvien kasvua edistävät risobakteerit. Annu. Rev. Microbiol. 2009, 63, 541–556. [CrossRef]

5. Shoresh, M.; Harman, GE; Mastouri, F. Indusoitu systeeminen vastustuskyky ja kasvien vasteet sienten biotorjunta-aineille. Annu. Rev. Phytopathol. 2010, 48, 21–43. [CrossRef]

6. van de Mortel, JE; de Vos, RC; Dekkers, E.; Pineda, A.; Guillod, L.; Bouwmeester, KJ; van Loon, J.; Dicke, M.; Raaijmakers, JM Rhizobacterium Pseudomonas fluorescens SS101:n aiheuttamat aineenvaihdunta- ja transkriptomiset muutokset Arabidopsiksessa. Plant Physiol. 2012, 160, 2173–2188. [CrossRef]

7. Lareen, A.; Burton, F.; Schafer, P. Kasvien juuren ja mikrobien välinen viestintä juuren mikrobiomien muotoilussa. Plant Mol. Biol. 2016, 90, 575–587. [CrossRef]

8. Sasan, RK; Bidochka, MJ Hyönteispatogeeninen sieni Metarhizium Roberts (Clavicipitaceae) on myös endofyytti, joka stimuloi kasvien juurien kehitystä. Olen. J. Bot. 2012, 99, 101–107. [CrossRef]

9. Sasan, RK; Bidochka, MJ Endofyyttisen hyönteisten patogeenisen sienen Metarhizium robertsii antagonismi papukasvien patogeeniä vastaan ​​Fusarium solanif. sp. phaseoli. Voi. J. Plant Pathol. 2013, 35, 288–293. [CrossRef]

10. Ahmad, I.; Jiménez-Gasco, MdM; Luthe, DS; Shakeel, SN; Barbercheck, ME Endophytic Metarhizium robertsii edistää maissin kasvua, estää hyönteisten kasvua ja muuttaa kasvien puolustusgeenin ilmentymistä. Biol. Control 2020, 144, 104167. [CrossRef]

11. Chairin, T.; Petcharat, V. Puolustusvasteiden induktio Hongkongin hedelmissä (Aglaia dookkoo Griff.) hedelmämätäsieniä vastaan ​​Metarhizium guizhouensen toimesta. Biol. Kontrolli 2017, 111, 40–44. [CrossRef]

12. Hao, K.; Wang, F.; Nong, X.; McNeill, MR; Liu, S.; Wang, G.; Cao, G.; Zhang, Z. Maapähkinä Arachis hypogaea -juurten vaste hyödyllisten ja patogeenisten sienten läsnäoloon transkriptioanalyysillä. Sci. Rep. 2017, 7, 964. [CrossRef] [PubMed]

13. Patel, ZM; Mahapatra, R.; Jampala, SSM Luku 11 – Sienieliisitoreiden rooli kasvien puolustusmekanismissa. julkaisussa Kasvien hyödyllisten mikrobien molekyylinäkökohdat maataloudessa; Sharma, V., Salwan, R., Al-Ani, L., toim.; Academic Press: Cambridge, MA, USA, 2020; s. 143–158. [CrossRef]

14. Dong, X.; Sa, JA Etyleeni ja kasvien taudinkestävyys. Curr. Opin. Plant Biol. 1998, 1, 316-323. [CrossRef] [PubMed]

15. Thomma, BP; Eggermont, K.; Penninckx, IA; Mauch-Mani, B.; Vogelsang, R.; Cammue, BP; Broekaert, WF Arabidopsiksen erilliset jasmonaatista ja salisylaatista riippuvaiset puolustus-vastereitit ovat välttämättömiä vastustuskyvylle eri mikrobipatogeenejä vastaan. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 15107–15111. [CrossRef] [PubMed]

16. Pant, SR; Irigoyen, S.; Liu, J.; Bedre, R.; Christensen, SA; Schmelz, EA; Sedbrook, JC; Scholthof, K.-BG; Mandadi, KK Brachypodium Phenylalanine ammonialyase (PAL) Edistää antiviraalista puolustusta Panicum mosaic virusta ja sen satelliitteja vastaan. mBio 2021, 12, e03518-20. [CrossRef]

17. Liu, R.; Xu, S.; Li, J.; Hu, Y.; Lin, Z. Astragalus membranaceus var. PAL-geenin ilmentymisprofiili. Mongholicus ja sen ratkaiseva rooli flavonoidibiosynteesissä. Plant Cell Rep. 2006, 25, 705–710. [CrossRef]

18. De Geyter, N.; Gholami, A.; Goormachtig, S.; Goossens, A. Transkription koneet jasmonaatin aiheuttamassa kasvien sekundaarisessa aineenvaihdunnassa. Trends Plant Sci. 2012, 17, 349–359. [CrossRef]

19. Mirjalili, N.; Linden, JC Kaasufaasikoostumuksen vaikutukset Taxus cuspidata -lajin suspensioviljelmiin. Biotechnol. Bioeng. 1995, 48, 123–132. [CrossRef]

20. Li, ST; Zhang, P.; Zhang, M.; Fu, CH; Zhao, CF; Dong, YS; Guo, AY; Yu, LJ Taxus chinensis -solujen transkriptioprofiili vasteena metyylijasmonaatille. BMC Genom. 2012, 13, 295. [CrossRef]

21. Tugizimana, F.; Ncube, EN; Steenkamp, ​​PA; Dubery, IA Metabolomicsista johdettu näkemys terpenoidisynteesin manipuloinnista Centella asiatica -soluissa metyylijasmonaatilla. Kasvien biotekniikka. Tasavalta 2015, 9, 125–136. [CrossRef]

22. Lu, M.; Wong, H.; Teng, W. Elicitation vaikutukset saponiinin tuotantoon Panax ginsengin soluviljelmässä. Plant Cell Rep. 2001, 20, 674–677. [CrossRef]

23. Mandal, S.; Kar, I.; Mukherjee, AK; Acharya, P. Elicitorin aiheuttamat puolustusvasteet Solanum lycopersicum -bakteerissa Ralstonia solanacearum -bakteeria vastaan. Sci. World J. 2013, 25, 561056. [CrossRef]

24. Li, L.; Wang, S.; Yang, X.; Francis, F.; Qiu, D. Proteiinieliitsioija PeaT1 lisäsi vastustuskykyä kirvoja (Sitobion avenae) vastaan ​​vehnässä. Pest Manag. Sci. 2020, 76, 236–243. [CrossRef] [PubMed]

25. Bujalowski, W. Heksameerisen DnaB-helikaasin fysiologisen roolin laajentaminen. Trends Biochem. Sci. 2003, 28, 116–118. [CrossRef]

26. Vaknin, Y.; Shadkchan, Y.; Levdansky, E.; Morozov, M.; Romano, J.; Osherov, N. Kolme Aspergillus fumigatusin CFEM-domeeniin GPI-ankkuroitua proteiinia (CfmA-C) vaikuttavat soluseinän stabiilisuuteen, mutta niillä ei ole merkitystä sienivirulenssissa. Sieni. Genet. Biol. 2014, 63, 55–64. [CrossRef]

27. Zhao, S.; Shang, X.; Bi, W.; Yu, X.; Liu, D.; Kang, Z.; Wang, X.; Wang, X. Genome-Wide Effektoriehdokkaiden tunnistaminen konservoituneilla motiiveilla vehnän lehtiruostesienestä Puccinia triticina. Edessä. Microbiol. 2020, 11, 1188. [CrossRef]

28. Gong, A.; Jing, Z.; Zhang, K.; Tan, Q.; Wang, G.; Liu, W. CFEM-proteiinien bioinformaattinen analyysi ja toiminnallinen karakterisointi maissin antraknoosisienessä Colletotrichum graminicola. J. Integr. Agric. 2020, 19, 541–550. [CrossRef]

29. Martin, F.; Aerts, A.; Ahren, D.; Brun, A.; Danchin, EG; Duchaussoy, F.; Gibon, J.; Kohler, A.; Lindquist, E.; Pereda, V.; et ai. Laccaria bicolorin genomi tarjoaa näkemyksiä mykorritsasymbioosista. Nature 2008, 452, 88–92. [CrossRef]

30. Stefan, V.; Lara, RJ Entomopatogeeniset sienet endofyyteinä: Kasvien, endofyyttien ja kasvinsyöjien vuorovaikutus ja käyttömahdollisuudet biologisessa torjunnassa. Curr. Sci. 2015, 109, 46–54.

31. Cai, N.; Liu, R.; Yan, D.; Zhang, N.; Zhu, K.; Zhang, D.; Nong, X.; Tu, X.; Zhang, Z.; Wang, G. Metarhizium anisopliaen CFEM-proteiinien bioinformatiikka-analyysi ja toiminnallinen karakterisointi. J. Fungi. 2022, 8, 661. [CrossRef]

32. Stephens, C.; Hammond-Kosack, KE; ja Kanyuka, K. WAKsing kasvin immuniteetti, heikkenevät sairaudet. J. Exp. Bot 2022, 73, 22–37. [CrossRef]

33. Zhang, ZN; Wu, QY; Zhang, GZ; Zhu, YY; Murphy, RW; Liu, Z.; Zou, CG Systemaattiset analyysit paljastavat CFEM-domeenin ainutlaatuisuuden ja alkuperän sienissä. Sci. Rep. 2015, 5, 13032. [CrossRef] [PubMed]

34. Fang, A.; Gao, H.; Zhang, N.; Zheng, X.; Qiu, S.; Li, Y.; Zhou, S.; Cui, F.; Sun, W. Uusi efektorigeeni SCRE2 edistää Ustilaginoidea virensin täyttä virulenssia riisiin. Edessä. Microbiol. 2019, 10, 845. [CrossRef] [PubMed]

35. Zhu, W.; Wei, W.; Wu, Y.; Zhou, Y.; Peng, F.; Zhang, S.; Chen, P.; Xu, X. BcCFEM1, CFEM-domeenia sisältävä proteiini, jolla on oletettu GPI-ankkuroitu kohta, osallistuu Botrytis cinerean patogeenisyyteen, konidioiden tuotantoon ja stressinsietokykyyn. Edessä. Microbiol. 2017, 8, 1807. [CrossRef]

36. Xu, X.; Li, G.; Li, L.; Su, Z.; Chen, C. Pezizomycotina-sieniin kuuluvien sienien oletettu Pth11--sukuisten G-proteiinikytketyn reseptorin genominlaajuinen vertaileva analyysi. BMC Microbiol. 2017, 17, 166. [CrossRef] [PubMed]

37. Peng, YJ; Hou, J.; Zhang, H.; Lei, JH; Lin, HY; Ding, JL; Feng, MG; Ying, SH CFEM-domeenia sisältävien proteiinien systemaattinen osallistuminen raudan hankintaan on olennaista rihmamaisen patogeenisen sienen Beauveria bassiana lajien väliselle vuorovaikutukselle. Ympäristö. Microbiol. 2022, 24, 3693–3704. [CrossRef] [PubMed]

38. Roy, U.; Kornitzer, D. Hemi-raudan hankinta sienissä. Curr. Opin. Microbiol. 2019, 52, 77–83. [CrossRef] [PubMed]

39. Okamoto-Shibayama, K.; Kikuchi, Y.; Kokubu, E.; Sato, Y.; Ishihara, K. Csa2, Rbt5-proteiiniperheen jäsen, osallistuu ihmisen hemoglobiinin raudan hyödyntämiseen Candida albicansin hyfaalien kasvun aikana. FEMS Yeast Res. 2014, 14, 674–677. [CrossRef]

40. Perez, A.; Pedros, B.; Murgui, A.; Casanova, M.; Lopez-Ribot, JL; Martinez, JP Biofilmin muodostuminen Candida albicans -mutanttien toimesta geeneille, jotka koodaavat sieniproteiineja, joissa on kahdeksan kysteiiniä sisältävä CFEM-domeeni. FEMS Yeast Res. 2006, 6, 1074–1084. [CrossRef]

41. Hogg, PJ Disulfidisidokset proteiinien toiminnan kytkiminä. Trends Biochem. Sci. 2003, 28, 210–214. [CrossRef]

42. van den Burg, HA; Westerink, N.; Francoijs, KJ; Roth, R.; Woestenenk, E.; Boeren, S.; de Wit, PJ; Joosten, MH; Vervoort, J. Tomaattipatogeenin Cladosporium fulvum AVR4:n luonnolliset disulfidisidoksella hajotetut mutantit ovat herkkiä proteolyysille, kiertävät Cf-4--välitteisen resistenssin, mutta säilyttävät kitiinin sitomiskykynsä. J. Biol. Chem. 2003, 278, 27340–27346. [CrossRef] 43. Hu, K.; Cao, J.; Zhang, J.; Xia, F.; Ke, Y.; Zhang, H.; Xie, W.; Liu, H.; Cui, Y.; Cao, Y.; et ai. Useiden agronomisten ominaisuuksien parantaminen tautiresistenssigeenin avulla soluseinän vahvistamisen avulla. Nat. Plants 2017, 3, 17009. [CrossRef] [PubMed]

44. Saitoh, H.; Fujisawa, S.; Mitsuoka, C.; Ito, A.; Hirabuchi, A.; Ikeda, K.; Irieda, H.; Yoshino, K.; Yoshida, K.; Matsumura, H.; et ai. Laajamittainen geenihäiriö Magnaporthe oryzaessa tunnistaa MC69:n, erittyvän proteiinin, jota tarvitaan yksi- ja kaksisirkkaisten sienipatogeenien tartunnassa. PLoS Patog. 2012, 8, e1002711. [CrossRef] [PubMed]

45. Kulkarni, RD; Kelkar, HS; Dean, R. Kahdeksan kysteiiniä sisältävä CFEM-domeeni, joka on ainutlaatuinen sienikalvoproteiinien ryhmälle. Trends Biochem. Sci. 2013, 28, 118–121. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Peng, J.; Wu, L.; Zhang, W.; Zhang, Q.; Xing, Q.; Wang, X.; Li, X.; Yan, J. Systeeminen tunnistaminen ja toiminnallinen karakterisointi yleisiä sienten ekstrasellulaaristen kalvoproteiinien Lasiodiplodia theobromae. Edessä. Plant Sci. 2021, 12, 804696. [CrossRef]

47. Bari, R.; Jones, JD Kasvihormonien rooli kasvien puolustusvasteissa. Plant Mol. Biol. 2009, 69, 473–488. [CrossRef]

48. Verma, V.; Ravindran, P.; Kumar, PP Kasvihormonivälitteinen stressivasteiden säätely. BMC Plant Biol. 2016, 16, 86. [CrossRef]

49. Javed, K.; Qiu, D. Brevibacillus laterosporuksen proteiinieliitsioija PeBL1 lisää vastustuskykyä Myzus persicaea vastaan ​​tomatossa. Patogens 2020, 9, 57. [CrossRef]

50. Basit, A.; Hanan, A.; Nazir, T.; Majeed, MZ; Qiu, D. Botrytis cinereasta uutetun PeBC1:n molekyyli- ja toiminnallinen karakterisointi, joka osallistuu resistenssin induktioon vihreitä persikkakirvoja (Myzus persicae) vastaan ​​tavallisissa papuissa (Phaseolus vulgaris L.). Hyönteiset 2019, 10, 35. [CrossRef]

51. Nazir, T.; Hanan, A.; Basit, A.; Majeed, MZ; Anwar, T.; Nawaz, I.; Qiu, D. Oletettu rooli vielä karakterisoimattomalla proteiinin herättäjällä PeBb1 Johdettu Beauveria bassiana ARSEF 2860 -kannasta Myzus persicae (Homoptera: Aphididae) vastaan ​​Brassica rapa ssp. pekinensis. Patogens 2020, 9, 111. [CrossRef]

52. Spoel, SH; Koornneef, A.; Claessens, SM; Korzelius, JP; Van Pelt, JA; Mueller, MJ; Buchala, AJ; Metraux, JP; Brown, R.; Kazan, K.; et ai. NPR1 moduloi salisylaatti- ja jasmonaattiriippuvaisten puolustusreittien välistä ristipuhelua sytosolissa olevan uuden toiminnon kautta. Plant Cell 2003, 15, 760–770. [CrossRef]

53. Xin, XF; Hän, SY Pseudomonas syringae pv. tomaatti DC3000: Mallipatogeeni taudille alttiuden ja hormonisignaloinnin tutkimiseen kasveissa. Annu. Rev. Phytopathol. 2013, 51, 473–498. [CrossRef] [PubMed]

54. Zhang, X.; Wang, C.; Zhang, Y.; Sun, Y.; Mou, Z. Arabidopsis-välittäjäkompleksin alayksikkö16 säätelee positiivisesti salisylaattivälitteistä systeemistä hankittua vastustuskykyä ja jasmonaatti/eteeni-indusoitua puolustusreittiä. Plant Cell 2012, 24, 4294–4309. [CrossRef] [PubMed]

55. Doares, SH; Narvaez-Vasquez, J.; Conconi, A.; Ryan, CA Salisyylihappo estää proteinaasi-inhibiittoreiden synteesiä tomaatin lehdissä systeemiinin ja jasmonhapon indusoimana. Plant Physiol. 1995, 108, 1741–1746. [CrossRef] [PubMed]

56. Pieterse, CM; Leon-Reyes, A.; Van der Ent, S.; Van Wees, SC Pienmolekyylisten hormonien verkostoituminen kasvien immuniteetissa. Nat. Chem. Biol. 2009, 5, 308–316. [CrossRef]

57. Penninckx, IA; Thomma, BP; Buchala, A.; Métraux, JP; Broekaert, WF Kasvin defensiinigeenin induktio Arabidopsiksessa edellyttää jasmonaatin ja eteenin vastereittien samanaikaista aktivointia. Plant Cell 1998, 10, 2103–2113. [CrossRef]

58. Fang, W.; Bidochka, MJ Itämiseen, konidiogeneesiin ja patogeneesiin osallistuvien geenien ilmentäminen Metarhizium anisopliaessa kvantitatiivisella reaaliaikaisella RT-PCR:llä. Mycol. Res. 2006, 110, 1165–1171. [CrossRef]

59. Guerriero, G.; Legay, S.; Hausman, JF Alfalfa Selluloosasyntaasigeenin ilmentyminen abioottisen stressin alaisena: Liftailijan opas RT-qPCR:n normalisointiin. PLoS ONE 2014, 9, e103808. [CrossRef]

60. Yang, Y.; Zhang, Y.; Li, B.; Yang, X.; Dong, Y.; Qiu, D. Verticillium dahliaen pektaattilyaasi indusoi kasvien immuunivasteita ja edistää virulenssia. Edessä. Plant Sci. 2018, 9, 1271. [CrossRef]

61. Livak, KJ; Schmittgen, TD Suhteellisten geeniekspressiotietojen analyysi käyttäen reaaliaikaista kvantitatiivista PCR:ää ja 2(-Delta Delta C(T)) -menetelmää. Methods 2001, 25, 402–408. [CrossRef]