CRISPRi-välitteinen viritettävä geenin ilmentymistaso Escherichia Colissa muokatun yksisuuntaisen RNA:n avulla

ABSTRAKTI

Precise control of gene expression is essential for flux redistribution in metabolic pathways. Although the CRISPR interference (CRISPRi) system can effectively repress gene expression at the transcriptional level, it has still been difficult to precisely control the level without loss of specificity or an increase in cell toxicity. In this study, we developed a tunable CRISPRi system that performs transcriptional regulation at various levels. We constructed a single-guide RNA (sgRNA) library targeting repeat, tetraloop, and anti-repeat regions to modulate the binding affinity against dCas9. Each screened sgRNA could regulate the gene expression at a certain level between fully repressing and nonrepressing states (>45-fold). Nämä sgRNA:t mahdollistivat myös modulaarisen säätelyn erilaisilla kohde-DNA-sekvensseillä. Käytimme tätä järjestelmää aineenvaihduntavirran uudelleenjakamiseen tuottaaksemme violaseiinijohdannaisia ​​ennustettavassa suhteessa ja optimoidaksemme lykopeenin tuotantoa. Tämä järjestelmä auttaisi nopeuttamaan virtauksen optimointiprosesseja aineenvaihduntatekniikassa ja synteettisessä biologiassa.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Napsauta tästä nähdäksesi Cistanche Enhance Immunity -tuotteet

【Kysy lisää】 Sähköposti:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

JOHDANTO

Tyypin II Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-assosioitunut (Cas) -järjestelmä on RNA-ohjattu DNA:n katkaisujärjestelmä, joka koostuu CRISPR RNA:sta (crRNA), transaktivoivasta CRISPR RNA:sta (tracrRNA) ja Cas9-proteiinista (1). ,2). Streptococcus pyogenesin Cas9:ää on käytetty laajasti genomitekniikassa sen hyvin karakterisoitujen ominaisuuksien vuoksi (3, 4). SpCas9-proteiinin, tracrRNA:n ja crRNA:n kompleksi sitoo ja katkaisee kohde-DNA:n protospacerin, joka on komplementaarinen crRNA:n 20 nukleotidin (nt) välikesekvenssin kanssa 5'-NGG-3' protospacer-viereisen motiivin (PAM) läsnä ollessa. ) sekvenssi (5,6). Järjestelmän yksinkertaistamiseksi voidaan käyttää kimeeristä single guide RNA:ta (sgRNA), jossa crRNA ja tracrRNA on yhdistetty keinotekoisella linkkerillä nimeltä tetraloop (5). Se mahdollistaa kahden erillisen RNA:n korvaamisen yhdellä RNA-molekyylillä, mikä tekee järjestelmästä hallittavamman. Yksi CRISPR-pohjaisista järjestelmistä, CRISPR-häiriö (CRISPRi), hyödyntää katalyyttisesti inaktiivista Cas9:ää (dCas9) korvaamalla tietyt aminohapot kustakin endonukleaasidomeenista (7). Tämä modifikaatio tekee ribonukleoproteiini (RNP) -kompleksin, joka voi ohjata kohde-DNA:ta ja sitoutua siihen ja häiritsee RNA-polymeraasia (RNAP) estääkseen transkription alkamisen tai pidentymisen (7). Toisin kuin CRISPR/Cas9-järjestelmän aiheuttama knockout, CRISPR mahdollistaa geenien palautuvan kaatumisen ekspressoimalla dCas9:ää tai sgRNA:ta indusoituvan promoottorin alla, mikä mahdollistaa suuremman joustavuuden geenisäätelyssä (7). CRISPRi-järjestelmä on tehokkaasti hiljentänyt kohdegeenit satakertaisesti (7, 8). Kohde-spesifinen geenirepressio mahdollistaa korkean suorituskyvyn fenotyypityksen käyttämällä genominlaajuista sgRNA-poolia (9) tai ohjaa muokatuissa bakteereissa hiilivirtaa kohdekemikaaliin (10-12). Lisäksi multiplex CRISPRi on osoitettu useissa isännissä käyttämällä erilaisia ​​menetelmiä stabiilisti ilmaista useita sgRNA:ita, mukaan lukien pitkät crRNA-ryhmät, varvaskytkimien integraatio ja ei-toistuva extralong sgRNA-taulukot (13-16). Näitä tekniikoita, joilla estetään useita geenejä samanaikaisesti, on käytetty monimutkaisempien tehtävien suorittamiseen, kuten toksisten välituotteiden vähentämiseen tai kilpailevien polkujen estämiseen bakteerifermentaatiossa (13, 16–19). Täydellinen tukahduttaminen ei kuitenkaan aina ole toivottavaa aineenvaihduntatekniikan kannalta. Geenien ilmentymistasoja tulee kontrolloida tarkasti, jotta saavutetaan optimaalinen entsyymiaktiivisuus kasvu- ja tuotantopolkujen välillä, tasapainotetaan solunsisäisten esiastepitoisuuksien kanssa ja vältetään myrkyllisten välituotteiden kertymistä (20–22). Erilaisia ​​tekniikoita on kehitetty CRISPRi-repressiotehokkuuden kehittämiseksi. Useita tekijöitä manipuloitiin, kuten sgRNA:n ja dCas9-proteiinin määrää tai sgRNA:n valintaa. dCas9:n ilmentymisen tai sekä dCas9:n että sgRNA:n ilmentymisen säätely indusoituvaa promoottoria käyttämällä sääteli kohdegeenin ilmentymistä yli 30--kertaisesti tai 300--kertaisesti, vastaavasti (23,24). On kuitenkin havaittu, että dCas9-konsentraation moduloiminen voi johtaa epäjohdonmukaisiin repressiotehokkuuksiin eri protospacerissä (23). Saatavilla olevien indusoituvien promoottorien rajallinen määrä asettaa myös suunnittelun haasteita monista ponnisteluista huolimatta (25). Toinen strategia on ligandispesifisen RNA-aptameerin liittäminen sgRNA:han, jossa pieni sukulaismolekyyli voi paljastaa välikkeen, mikä mahdollistaa CRISPRi:n annosriippuvaisen hallinnan (26). Ligandispesifinen sgRNA on hyödyllinen, jos sopiva ligandi- ja aptameeripari on saatavilla. Myös etäisyys transkription aloituskohdasta ja dCas9:n sitoutumisen suunta vaikuttavat CRISPRi:n tehokkuuteen (7). Säätämällä etäisyyttä sgRNA:n sitoutumiskohdan ja transkription aloituskohdan välillä voidaan optimoida aineenvaihduntatekniikan reitti (17, 27, 28). Hybridisaation tehokkuus spacer- ja protospacer-sekvenssien välillä muuttaa myös RNP-kompleksin sitoutumistehokkuutta (29-31). Siksi epäsuhta, joka oli suunniteltu siemenalueen ulkopuolelle muuttamaan vapaata energiaa, otettiin käyttöön CRISPRi-tehokkuuden monipuolistamiseksi (31, 32). Kuitenkin sgRNA:n suunnittelu vaaditaan jokaista uutta kohdesekvenssiä varten, ja merkittävän eron saavuttaminen vapaassa energiassa vain yhteensopimattomuuden kautta voi olla haastavaa. Lisäksi on mahdollista, että kohteen ulkopuolinen sitoutuminen lisääntyy (33). Siitä huolimatta se rajoittuu edelleen useiden geeniekspressioiden täsmälliseen repressointiin modulaarisella tavalla kohdesekvenssistä riippumatta. Tässä tutkimuksessa kehitimme viritettävän CRISPRi-järjestelmän, joka säätelee geenien ilmentymistä erittäin tarkasti ja ennustettavasti. Tetrasilmukkaan ja sen viereiseen alueeseen kohdistuvan sgRNA-kirjaston iteratiivisen fluoresenssipohjaisen solulajittelun avulla saavutimme transkription repressiotehokkuuden jopa 45--kertaisesti, vaikka kohde-DNA vaihdettaisiin. Tämä järjestelmä mahdollistaa aineenvaihduntavirran ennustettavan uudelleenjakauman ilman isäntägenomia tai synteettisiä reittejä manipuloimatta, mikä tarjoaa lupaavan työkalun aineenvaihduntareittien optimointiin.

MATERIAALIT JA MENETELMÄT

Bakteerikannat, plasmidit ja reagenssit

Tässä tutkimuksessa käytetyt Escherichia coli -kannat ja -plasmidit on lueteltu lisätaulukossa S1. Tässä tutkimuksessa käytetyt alukkeet on lueteltu lisätaulukossa S2. Kloonausmenettelyt on kuvattu lisämenetelmissä. Kohdegeenit ja niiden kohde-DNA-sekvenssit CRISPR-järjestelmälle on esitetty lisätaulukossa S3. Mach1-T1R:ää käytettiin yleiseen kloonaukseen. Kirjasto rakennettiin käyttämällä NEB 5-alpha Electrocompetent E. colia (NEB). Rutiiniviljelmät plasmidien ja kantojen rakentamiseksi suoritettiin 37 °C:ssa Luria-Bertani (LB) -liemessä tai LB-agarmaljalla, joka sisälsi sopivia antibiootteja (34 g/ml kloramfenikolia, 50 g/ml spektinomysiiniä). PCR suoritettiin käyttämällä Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (NEB). Plasmidit ja PCR-tuotteet puhdistettiin käyttämällä GeneAll® Exprep™ Plasmid SV Kit- ja Gel SV Kit -sarjaa (GeneAll Biotechnology). SgRNA-mutanttien repressiotehokkuus Yön viljelyalusta päivitettiin arvoon 0,05 OD600 ja sitä inkuboitiin, kunnes se saavutti arvon välillä 0,6 - 0,8. Elatusaine laimennettiin sitten OD600:aan 0,05 20 ng/ml aTc:llä ja inkuboitiin 4 tuntia. Yhden pesäkkeen fluoresenssi mitattiin aallonpituudella 575 nm/616 nm käyttämällä Hidex Sense -mikrolevylukijaa (Hidex), ja OD600-arvo määritettiin käyttämällä Jenway 7300 -spektrofotometriä (Jenway). Suhteellinen fluoresenssi laskettiin fluoresenssiyksikköinä OD600-arvoa kohti, ja PC:n arvoksi asetettiin 100 %.

Cistanche tubulosan vaikutukset - hoitaa ummetusta

sgRNA-kirjaston seulonta

Käytettiin samaa kulttuurimenetelmää kuin edellä kuvattu. Elatusaine laimennettiin [soluun]<10−7 cells/ml in PBS buffer (pH 7.4). The fluorescence distribution was obtained from 100,000 cells from each sample using S3e Cell Sorter (Bio-Rad), and 5000 cells for each fluorescence range were sorted in each iteration. Cells were overnight cultured in fresh media for the next iteration. Samples were obtained after the final iteration and spread to the LB agar plate. Each colony was inoculated into 100 l of LB media and overnight cultured in 96-well microplate shaking at 900 rpm by Hidex Sense microplate reader (Hidex). Overnight culture media was refreshed by diluting 3 l culture media in 97 l fresh media and incubated for 2 h. Culture media was re-diluted by mixing 6 l culture media with 94 l fresh media, and aTc was added. The fluorescence of every single colony was obtained at 575 nm/616 nm by Hidex Sense microplate reader (Hidex) after 6 h of incubation. The OD600 value from the microplate reader was converted to the OD600 value from the spectrophotometer.

RNA:n uuttaminen

Kokonais-RNA uutettiin käyttämällä RNeasy Mini Kitiä (Qiagen) vain miRNeasy Mini Kitillä (Qiagen) sgRNA:n kvantifiointiin RNAprotect Bacteria Reagent -käsittelyn (Qiagen) ja varastoinnin -80 °C:ssa jälkeen. Uuttamisprosessin aikana suoritettiin DNA-digestio kolonnissa käyttämällä RNase-Free DNase Set -sarjaa (Qiagen). DNA-kontaminaatio varmistettiin PCR:llä ilman käänteistranskriptiota. Kunkin näytteen pitoisuus ja puhtaus määritettiin käyttämällä NanoDrop One -laitetta (Thermo Scientific), ja laatu arvioitiin käyttämällä DNA 5K/RNA/CZE 24 LabChipiä (PerkinElmer) LabChip GX Touch 24:ssä (PerkinElmer).

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

RT-qPCR-analyysi

RT-qPCR:n alukkeet joko hankittiin laboratoriovarastosta tai ne on suunniteltu Primer3Plus-työkalulla (34) ja lueteltu lisätaulukossa S4. CysG-geeniä käytettiin vertailugeeninä (35) kaikissa RT-qPCR-kokeissa. Vakiokäyrä luotiin 10-laimentamalla mallipohja 107 kopiosta/l arvoon 10-1 kopiota/l. Kvantifioinnin raja määritettiin sovittamalla kopioluku ja positiivinen vahvistusnopeus sigmoidifunktioon ja laskemalla 95 % positiivisen kopioluvun arvo. Lineaarinen dynaaminen alue määriteltiin pienimmäksi kopioluvuksi, jolla taaksepäin laskettu Cq-variaatio on alle 35 %. Cq-arvot yli 30 tai ne, joita ei vahvistettu ei-templaatissa kontrollissa, validoitiin. Vakiokäyrätiedot ovat saatavilla lisätaulukossa S5 ja lisäkuvassa S1. Yhteensä 2,5 ng kokonais-RNA:ta käytettiin 10 l:n RT-qPCR-reaktiossa Luna® Universal One-Step RT-qPCR Kitin (NEB) kanssa. RT-PCR suoritettiin kolmena rinnakkaisena StepOnePlus™ RealTime PCR System -järjestelmällä (Applied Biosystems) seuraavilla vaiheilla: (i) käänteistranskriptio 55 °C:ssa 10 minuutin ajan, mitä seurasi denaturointi 95 °C:ssa 1 minuutin ajan; (ii) 40 lämpösykliä 95 °C:ssa 10 sekunnin ajan ja 60 °C:ssa 1 minuutin ajan; (iii) sulamiskäyrän analyysi 95 ◦C:ssa 15 s ja 60 ◦C:ssa 1 minuutin ajan, jota seuraa ramppi 60 ◦C:sta 95 ◦C:seen nopeudella 0,3 ◦C/min. RNA:n suhteellinen kvantifiointi määritettiin käyttämällä delta-deltaCt-menetelmää (36) ja analysoitiin StepOnePlus™ Softwarella (Applied Biosystems).

RNA-sekvensointi (RNA-seq) ja data-analyysi

1.5 in biological duplicate. Total RNA was extracted by the abovementioned method, and ribosomal RNA (rRNA) was depleted using Ribo-Zero plus rRNA Depletion Kit (Illumina). cDNA libraries were constructed using KAPA Stranded RNA-Seq Kits (Kapa Biosystems), with an additional size-selection step using AMPure XP (Beckman Coulter). Adapters and primers used in this study are listed in Supplementary Table S2. The concentration was measured using a Qubit 3.0 Fluorometer (Thermo Scientific), and the size distribution of the cDNA was measured using X-Mark LabChip (PerkinElmer) on the LabChip GX Touch 24 instrument. The average cDNA length ranged from 390 to 450 bps. RNA-Seq was performed as >19M reads of 41 bp paired-end using NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 Cycles) (Illumina) on NextSeq 550 (Illumina). Data analysis was performed using the reference genome of E. coli BL21(DE3) complete genome (Genbank CP001509.3) with FastQC (v0.11.9) (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) (37), Bowtie (v1.2.3) (38) with trim3 option value of 3, samtools (v1.10) (39), and cufflinks (v2.2.1) (40,41). All samples between replicates had R2 >{0}}.92, joka perustuu FPKM:ään (Fragments Per Kilobase of Transscripts per Miljoona kartoitettua lukukertaa). Erilaisesti ilmentyvät geenit saatiin kynnysarvosta 1,5 (log2-perustuva) ja 0,01 (q-arvo).

Proviolaseiinin ja prodeoksiviolaseiinin tuotanto ja näytteenotto

Violaseiinin ja prodeoksiviolaseiinin tuotantoon käytettiin seuraavaa väliainekoostumusta: 10,7 g/l K2HPO4, 5,2 g/l KH2PO4,1g/l NaCl, 1 g/l NH4Cl, 1 g/l MgSO4, { {17}},2 g/l hiivauutetta ja 1{{20}} g/l glukoosia. Yön yli elatusaine päivitettiin OD600-arvoon 0,1 ja viljeltiin, kunnes OD600 saavutti arvon 0,6-0,8. Viljelyelatusaine laimennettiin sitten OD600:aan 0,1 ja sitä täydennettiin 500 ng/ml aTc:llä, 0,05 mM IPTG:llä ja 0,1 g/l L-tryptofaanilla 5 ml:n lopulliseen tilavuuteen. 300 l:sta viljelyalustaa otettiin näyte ja sentrifugoitiin nopeudella 14 000 rpm 5 minuuttia solupelletin saamiseksi HPLC-analyysiä varten, ja 300 l:sta viljelyalustaa otettiin näyte RNA:n uuttamista varten.

HPLC-analyysi

Violaseiinin biosynteesireitin analyysiä varten solupelletti suspendoitiin uudelleen {{0}}tilavuuteen metanoliin, sonikoitiin 5 minuuttia, sentrifugoitiin ja suodatettiin 0.22-m nylonsuodattimen läpi. HPLC-analyysi seurasi menetelmää (42) Poroshell 120 EC-C18:lla, 4,6 × 150 mm, 4 m kolonni (Agilent). Kahta liikkuvaa faasia, A, jossa oli 0,1 % muurahaishappoa DDW:ssä ja B, jossa oli 0,1 % muurahaishappoa asetonitriilissä, käytettiin virtausnopeudella 0,6 ml/min seuraavalla gradienttiprofiililla: 95 % A 1,5 minuutin ajan, nousu A 95:stä % - 2 % 4 minuutin ajan, 2 % A:n ylläpitäminen 2 minuutin ajan, A:n nousu 2 %:sta 95 %:iin 30 sekunnin ajan ja 95 % A:n ylläpitäminen 10 minuutin ajan. Näytteet havaittiin käyttämällä PDA-detektoria, ja HPLC-alue määritettiin 600 nm:ssä violaseiinille ja 610 nm:ssä prodeoksiviolaseiinille.

Lykopeenin tuotanto ja näytteenotto

Lykopeenin tuotantoon käytettiin seuraavaa väliainekoostumusta: 13,56 g/l Na2HPO4,6g/l KH2PO4,2g NH4Cl, 1 g NaCl, 2 ml 1 M MgSO4, 0.1 ml 1 M CaCl2 ja 4 g g/l glukoosia (22). Käytettiin kloramfenikolia 27 g/ml ja spektinomysiiniä 50 g/ml. Yön yli elatusaine päivitettiin OD600-arvoon 0,1 lopulliseen tilavuuteen 5 ml. Kun OD600 saavutti arvon 0,5 - 0,6, aTc lisättiin lopulliseen pitoisuuteen 500 ng/ml, ja kun OD600 saavutti 0,9 - 1, IPTG lisättiin lopulliseen pitoisuuteen 0,02 mM. Lykopeeni uutettiin käyttämällä asetonia, kuten on kuvattu viitteessä (22). Lykopeenin pitoisuus saatiin absorbanssista 475 nm:ssä käyttämällä Jenway 7300 -spektrofotometriä käyttäen standardikäyrää. 300 l:sta viljelyalustaa otettiin näyte RNA-uuttoa varten.

cistanche-edut miehille - vahvistavat immuunijärjestelmää

TULOKSET JA KESKUSTELU

SgRNA:n mutaatioiden vaikutukset CRISPR-järjestelmän repressiotehokkuuteen

CRISPRi-järjestelmä voi tukahduttaa geenin ilmentymisen, kun dCas9-sgRNA-DNA-kolmiokompleksi sitoutuu voimakkaasti yhteen. Oletimme, että CRISPRi-järjestelmän repressiotehokkuutta voitaisiin muuttaa tietylle tasolle moduloimalla RNP-kompleksin muodostumista. CRISPR-järjestelmän repressiotehokkuuden kvantifioimiseksi suunnittelimme fluoresenssiraportointijärjestelmän, joka perustuu geneettiseen piiriin, jossa S. pyogenesin dCas9 indusoituu anhydrotetrasykliinillä (aTc) ja sekä reportterigeeni (mCherry) että sgRNA-variantit ilmentyvät konstitutiivisesti (kuva) 1A). Kun aTc on lisätty elatusaineeseen, dCas9-sgRNA-DNA-kolmiokompleksi estää reportterigeenin transkription, ja fluoresenssitaso osoittaa käänteisesti CRISPR-järjestelmän repressiotehokkuuden. SgRNA sisältää yhteensä 96 nukleotidia (nts). Välikealue (ensimmäiset 20 nt:tä) sitoutuu kohde-DNA-sekvenssiin, ja muut 76 nt:tä edistävät kompleksin muodostumista ja stabiilisuutta. Koska erot spacer-alueella voivat menettää spesifisyytensä ja lisätä kohteen ulkopuolisia vaikutuksia CRISPR-pohjaisessa järjestelmässä (33,43), sgRNA:n maksimipituus, joka voidaan muokata, on 76 nts. Tässä tapauksessa pitäisi saada kirjaston koko 476 (noin 1045), mutta se on liian suuri rakennettavaksi. Siten on tarpeen kaventaa kirjaston kokoa määrittämällä spesifiset paikat sgRNA:ssa. Tutkimme ensin, kuinka sgRNA:n mutaatiot kullakin alueella vaikuttavat repressioon CRISPR-järjestelmässä. Aikaisempi tutkimus raportoi, että mutaatiot kantasilmukassa 1 (sg mut01 ja sg mut02) johtivat Cas9:n nukleaasiaktiivisuuden merkittävään laskuun, kun taas mutaatiot kantasilmukassa 2 (sg mut03) tai varsi-silmukassa 3 (sg) mut04) ei vaikuttanut sen toimintaan (44). Rekonstruoitu sgRNA (sg mut05), joka sisälsi mutaatioita varsi-silmukka 1 -alueella ja toisto-, tetrasilmukka-, anti-repeat- ja varsi-silmukka 2 -alueilla, vähensi myös nukleaasiaktiivisuutta (44). CRISPRi-järjestelmässä kaikilla viidellä sgRNA-variantilla oli kuitenkin vain vähän vaikutusta repressiotehokkuuteen verrattuna villityypin sgRNA:han (sg WT), ja jokaisella variantilla oli 2–4 % fluoresenssitaso verrattuna positiiviseen kontrolliin, jossa ei ollut välikealuetta ( sg PC) (kuva 1B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että dCas9-sgRNA-kompleksin muodostuminen on vähemmän herkkä sekvenssin muutoksille kanta-silmukka 1 -alueella CRISPRi-järjestelmässä, toisin kuin CRISPR/Cas9-järjestelmässä. Oletimme, että kompleksin stabiilisuuteen liittyvien alueiden poistaminen voi olla lähtökohta ekspression säätelylle useilla tasoilla edelleen. Tätä tarkoitusta varten rakensimme typistetyn sgRNA:n (sg trcSL1), josta puuttui linkkeri, kanta-silmukka 2 ja kanta-silmukka 3. Tässä katkaistussa sgRNA:ssa on minimaalinen määrä komponentteja ja sen on osoitettu vähentävän merkittävästi nukleaasiaktiivisuutta CRISPR/:ssä. Cas9-järjestelmä (5,44). CRISPRi-järjestelmässä testattaessa tämä viallinen mutantti osoitti 8 %:n fluoresenssitasoa verrattuna sg PC:hen, mikä viittaa siihen, että se voisi silti sitoutua dCas9:ään ja tukahduttaa kiinnostuksen kohteena olevan geenin tietyllä tasolla jopa heikentyneen ternäärisen kompleksin stabiiliuden kanssa (kuva 1B). RNP-kompleksin rakenneanalyysi viittaa siihen, että sgRNA:n linkkeri-, kanta-silmukka 2- ja varsi-silmukka 3 -alueet ovat vastuussa kompleksin stabiloinnista vuorovaikutuksensa kautta dCas9:n nukleaasidomeenin kanssa, mikä johtaa merkittävään indel-arvon laskuun. tehokkuus CRISPR/Cas9-järjestelmässä (44). Sitä vastoin toisto: sgRNA:n toiston vastainen alue ja varsi-silmukka 1 ovat pääasiassa vuorovaikutuksessa dCas9:n tunnistusdomeenin ja PAM-vuorovaikutteisen domeenin kanssa eivätkä vaikuta merkittävästi indel-tehokkuuteen CRISPR/Cas9-järjestelmässä (44). Tämä tulos tukee havaintoa, että sg trcSL1 vähensi merkittävästi nukleaasiaktiivisuutta CRISPR/Cas9-järjestelmässä, mutta vaikutti vain hieman sitoutumisaffiniteettiin CRISPRi-järjestelmässä.

Kuva 1. Järjestelmän rakenne ja vaikutus sgRNA-mutaation repressiotehokkuuteen. (A) Kahden plasmidin järjestelmä repressiotehokkuuden kvantifiointiin. Yksi plasmidi, jolla on p15A-alkuperä, sisältää dCas9-geenin aTc-indusoituvan promoottorin alla ja mCherry-geenin konstitutiivisen promoottorin alla. Toinen plasmidi, jolla on CloDF13-alkuperä, sisältää villityypin tai mutantin sgRNA:n konstitutiivisen promoottorin alla. (B) Kunkin sgRNA-mutantin (sg mut01 ~ sg mut05 ja sg trcSL1) ja sg WT:n suhteellinen fluoresenssi verrattuna sg PC:hen. +1 - + 20 ovat välisekvenssi, joka sitoutuu mCherry-geeniin. sg PC: sgRNA ilman välikappaletta positiivisena kontrollina, sg WT: villityypin sgRNA. Virhepalkit osoittavat keskihajonnan (n=3). P-arvot määritettiin parittomalla t-testillä. ns: ei merkitsevä, **P< 0.01

Monitasoisen ilmentymisen säätelyn kompleksinmuodostuksen tehokkuuden muuttaminen

Tetraloop on keinotekoinen linkkeri, joka yhdistää crRNA:n ja tracrRNA:n CRISPR-Cas9-järjestelmässä (5). Kolmikomponentin kiderakenne, joka koostuu dCas9:stä, crRNA:sta ja tracrRNA:sta, on osoittanut, että tetrasilmukalla ja sen 5 ja 3 viereisellä alueella on vähän kosketusta dCas9:n kanssa (44). Samanaikaisesti toisto: anti-toisto ja varsi-silmukka 1 -alueet ovat kriittisiä toiminnallisen kompleksin kannalta (44). Koska se ei ole suoraan vuorovaikutuksessa dCas9:n kanssa, tetrasilmukkaa ja sen viereisiä alueita on tutkittu mahdollisina kohtina sgRNA:n muokkaukselle lisäkomponenteilla, kuten aptameerisekvenssien sisällyttämisellä lisäproteiinien värväämiseksi sgRNA:han (45, 46). On todennäköistä, että mutaatiot tällä alueella voisivat monipuolistaa sitoutumisaffiniteettia sgRNA:n ja dCas9:n välillä häiritsemättä kompleksia kokonaan. 12--mer-satunnainen kirjasto (4 nt tetraloop-aluetta ja 4 nt 5 ja 3 viereistä aluetta, vastaavasti) rakennettiin käyttämällä sg trcSL1:tä templaattina alentamaan entisestään kompleksinmuodostuksen tehokkuutta sgRNA:n ja dCas9:n välillä (kuva 2A). ). Käytimme kaksivaiheista lajittelustrategiaa saadaksemme erilaisia ​​sgRNA-mutantteja, jotka kattavat repressiotehokkuuden sg WT:n (täysin repressoiva tila) ja sg PC:n (ei-repressoiva tila) välillä. Jaoimme alkuperäisen kirjaston pienempiin kirjastoihin, joilla oli erilaiset fluoresenssin intensiteettialueet, ja sitten yksilöimme kunkin sgRNA-variantin fluoresenssin pienemmästä kirjastosta. Virtaussytometrialla saadun alkuperäisen kirjaston fluoresenssijakauma oli lähes identtinen sg PC:n kanssa (kuvio 2B). Kuitenkin kolmen peräkkäisen lajitteluvaiheen jälkeen kullakin kirjastolla (korkea, keskitaso ja matala) oli 63 %, 24 % ja 14 % mediaanifluoresenssitasot verrattuna sg PC:hen, vastaavasti (kuvio 2B). Näistä pienemmistä kirjastoista eristettiin 82 pesäkettä, joiden fluoresenssitasot vaihtelivat välillä 8 % - 104 % (kuvio 2C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että mutatoituva tetrasilmukka ja sen viereinen alue sgRNA:ssa voi moduloida sitoutumisaffiniteettia dCas9:n ja sgRNA:n välillä erilaisten repressiotehokkuuksien saavuttamiseksi. Käänteistranskription kvantitatiivinen PCR (RT-qPCR) -analyysi 10 sgRNA-mutantista (sg trcSL1c1–sg trcSL1c10, täydentävä taulukko S6) erilaisilla fluoresenssisignaaleilla sg WT:n ja sg PC:n välillä 82 sgRNA-pesäkkeen joukossa lisääntyneiden transkriptipesäkkeiden joukossa osoitti, että mCherryn linjatasot kasvoivat. , mikä osoittaa, että CRISPRi-järjestelmämme ohjaa geeniekspressiota transkription tasolla (lisäkuva S2). Viritettävä CRISPRi-järjestelmämme käyttää muokattuja sgRNA:ita, jotka voivat saavuttaa jopa 45--kertaisen repressionhallinnan, mikä mahdollistaa repressiotehokkuuden hienosäädön muuttamatta dCas9:n tai sgRNA:n määriä. Järjestelmämme merkittävä etu on, että se voi hienosäätää repressiotehokkuutta spesifisten sgRNA-varianttien avulla ilman mahdollisia ei-toivottuja seurauksia, vaikka lisäkloonausta tarvitaan. Lisäksi kasvukäyrä viittaa siihen, että järjestelmämme ei aiheuta merkittävää solutaakkaa (lisäkuva S3). Lisäksi RNA-Seq kolmessa sg trcSL1 -variantissa, joilla on vaihteleva repressiotehokkuus, osoitti, että 51 - 83 geenin ilmentyminen muuttui, toisin kuin 262 geeniä, jotka muuttuivat sg WT:ssä (täydentävä kuva S4). Nämä tulokset viittaavat siihen, että sg trcSL1 -varianteilla oli jopa pienemmät kohteen ulkopuoliset vaikutukset kuin tavanomaisella CRISPRi-järjestelmällä. Se on erityisen merkityksellinen aineenvaihduntatekniikan sovelluksissa, joissa aineenvaihduntareittien optimointiin liittyy usein useiden geenien manipulointia. Kyky hienosäätää geenien ilmentymistä aiheuttamatta negatiivisia sivuvaikutuksia voi merkittävästi nopeuttaa optimointiprosessia ja parantaa järjestelmän yleistä tehokkuutta ja tuottavuutta.

Kuva 2. SgRNA-kirjaston rakenne ja kirjaston seulonta. (A) tässä tutkimuksessa käytetty sgRNA-teline. 12-mer, joka sisältää tetrasilmukan ja sen viereinen sekvenssi, mutatoidaan satunnaisesti sg trcSL1:stä sgRNA-kirjaston saamiseksi. (B) Fluoresenssijakauma saatu virtaussytometristä ennen (vasemmalla) ja jälkeen (oikealla) lajittelua. Jokainen jakelu sisältää 100,000 solua. (C) Kohdasta (B) saatujen yksittäisten pesäkkeiden fluoresenssi. Virhepalkit osoittavat keskihajonnan (n=2).

dCas9:n ja sgRNA:n määrän vaikutukset repressiotehokkuuteen

Koska joko dCas9:n tai sgRNA:n määrän modulointi voi muuttaa CRISPRi-järjestelmän repressiotehokkuutta (23, 24), on olennaista tutkia dCas9:n ja sgRNA:n määrän vaikutusta repression tehokkuuteen. Testasimme järjestelmämme suorituskykyä eri olosuhteissa muuttamalla dCas9- ja sgRNA-määriä käyttämällä kymmentä sgRNA-mutanttia (sg trcSL1c1–sg trcSL1c10). Kolmea eri pitoisuutta (20, 100 ja 500 ng/ml) indusoijaa käytettiin dCas9-ilmentymiseen. Verrattuna dCas9-mRNA-tasoon, kun käytettiin 20 ng/ml indusoijaa, se kasvoi edelleen 15--kertaiseksi (100 ng/ml) ja 22--kertaiseksi (500 ng/ml) (lisäkuva S5A ). dCas9:n yli-ilmentyminen aiheuttaa huolta, koska korkea dCas9-taso voi olla myrkyllistä soluille (47, 48) tai joskus ei (49). Kasvunopeus kuitenkin väheni alle 10 %, kun käytettiin jopa 500 ng/ml aTc:tä kasvukäyrien mukaan eri induktoripitoisuuksilla (lisäkuva S6). Tämä viittaa siihen, että dCas9:n määrällä ei ollut toksista vaikutusta E. coliin testatuissa olosuhteissa. Repressiotehokkuus muuttui hieman, kun dCas9:n eri määrä ilmaistiin (kuva 3A). Se oli yhdenmukaista aiemman tutkimuksen kanssa, että CRISPRi-järjestelmä saavutti maksimaalisen repressiotehokkuuden [aTc]:lla< 5 ng/ml when the same replication origin and promoter were used for the expression of CRISPRi components (24). We set the inducer concentration to 500 ng/ml to sufficiently supply dCas9 for further applications such as multiple gene regulation. The property that our system is less sensitive to the amount of dCas9 has advantages over the strategy of adjusting inducer concentration, as the dose-dependent induction of dCas9 might be varied due to the promoters, plasmid copy numbers, or host strains (50–53). Additionally, using CRISPR-based systems allows for the simultaneous targeting of multiple genes for editing or repression, making it an effective tool for multiplexing gene regulation (54). Our tunable CRISPRi system allows for the precise modulation of repression efficiency through sgRNA variants. With this approach, it would be possible to target multiple genes with varying levels of repression simultaneously. The previous study reported that stronger promoters for sgRNA expression lead to higher repression efficiency (24). To investigate the effect of the amount of sgRNA on repression efficiency in our system, two different promoters having different strengths were used (BBa J23100; J23100 and BBa K2753055; UPJ23119). Promoter UPJ23119 contains a UP element that interacts with E. coli RNA polymerase and expresses 16-fold more transcript than J23100 (55). However, the exact fold change may vary depending on the plasmids, genes, and host strains used. Our results showed that UPJ23119 doubled sgRNA expression in our system and had higher repression efficiency (Figure 3B and Supplementary Figure S5B). These results suggest that adjusting the amount of sgRNA can further expand the dynamic range of multi-level expression and provide precise modulation of repression efficiency.

Kuva 3. Viritettävän CRISPRi-järjestelmän karakterisointi ja modulaarisuus. (A) Suhteellinen fluoresenssi erilaisissa aTc-pitoisuuksissa (20, 100 ja 500 ng/ml). (B) Suhteellinen fluoresenssi eri promoottoreiden alla (J23100 ja UPJ23119). (C) Suhteellinen fluoresenssi eri protospacereissä. X-akseli osoittaa mCherryn suhteellista fluoresenssia ja y-akseli osoittaa lacI33-mCherryn (punainen) ja araC33-mCherryn (sininen) suhteellista fluoresenssia. 33 bp lisäsekvenssejä lacl:stä ja araC:stä lisättiin mCherryn 5-päähän (56). (D) 12-meerin vapaa energia ja suhteellinen fluoresenssi. Katkoviivat osoittavat 95 %:n ennusteväliä ja kiinteät viivat regressioviivaa. sg trcSL1c2:n dG-arvoa ei voitu saada mFoldilla, joten se jätettiin pois analyysistä. (A–D) Kaikki virhepalkit osoittavat keskihajonnan (n=3).

Viritettävän CRISPRi-järjestelmän modulaarisuus

Lähestymistapallamme, jossa käytetään spesifisiä sgRNA-variantteja tietyn ekspressiotason ylläpitämiseksi kohde-DNA:lle, on potentiaalia käyttää modulaarisena järjestelmänä. Havainnollistaaksemme viritettävän CRISPRi-järjestelmän toteutettavuuden eri protospacereiden kohdistamiseen rakensimme kaksi fuusiogeeniä (lacI{{0}}mCherry ja araC33-mCherry) lisäämällä 33 bps sekvenssejä lacI:stä ja araC:stä. mCherryn 5 -päähän (56). E. coli BL21(DE3)-genomi (GenBank: CP001509.3) sisältää kaksi kopiota protospacer-sekvenssistä lacI33- mCherrylle ja yhden kopion araC33-mCherrylle. Näillä kromosomisekvensseillä ei kuitenkaan ole PAM-sekvenssejä, joten dCas9-sgRNA-kompleksi ei voi kohdistua niihin (43). Kun siRNA:t suunniteltiin kohdistamaan jokaiseen protospaceriin, repressiotehokkuus ylläpidettiin johdonmukaisesti kaikissa protospacerissä lacI33:sta, araC33:sta ja mCherrystä (kuvio 3C). Nämä havainnot viittaavat siihen, että viritettävä CRISPRi-järjestelmämme voi tehokkaasti säädellä geenin ilmentymistä tietyllä tasolla riippumatta protospacer-sekvenssistä. Yksi mahdollinen selitys havaitulle suhteelle RNP-kompleksin muodostumisen ja repressiotehokkuuden välillä on muutos vapaassa energiassa kompleksin muodostuessa. Keinotekoinen tetrasilmukkalinkkeri ja sen viereinen alue sisältävät kaksi A: U ja G: C Watson-Crick-emäsparia ja A: G ei-Watson-Crick-emäsparia (44). Koska crRNA:n ja tracrRNA:n sitoutuminen on ratkaisevan tärkeää kompleksin muodostukselle, tetrasilmukkaan kohdistuvat mutaatiot vaikuttaisivat dCas9:n ja sgRNA:n väliseen sitoutumisaffiniteettiin. Tämä affiniteetti voidaan laskea vapaan energian erosta rajoitetun ja rajoittamattoman tilan välillä. Rajoitettujen tilojen vapaan energian laskeminen on kuitenkin haastavaa (57). Oletimme, että rajatun tilan yleinen rakenne ja stabiilisuus eivät muutu, koska kirjastosta lajitellut sgRNA:t eivät täysin häirinneet sen toimintaa. Lisäksi tetrasilmukalla ja sen viereisellä alueella on vähän kosketusta dCas9:n kanssa (44). Siksi dCas9:n ja sgRNA:n väliseen sitoutumisaffiniteettiin vaikuttaisi pääasiassa tetrasilmukan sekundaarirakenteen ja sen viereisen sekvenssin stabiilius. Tämän idean perusteella laskemme muotilla (58) tetrasilmukan ja sen vierekkäisten sekvenssien vapaan energian. Mutaatioista johtuva laskostumisen vapaan energian ero määritellään mutatoituneiden ja villityypin sekvenssien vapaan energian väliseksi eroksi. Se voidaan laskea suoraan mutanttien laskostumisen vapaasta energiasta, koska villityypin sekvenssin laskostumisenergia on vakio –4,3 kcal/mol. Kun taittumisen vapaa energia kasvoi, fluoresenssisignaali kasvoi (kuva 3D). Repressiotehokkuus oli korkein, kun tetrasilmukan sisältävän alueen laskostumisenergia oli lähellä tai alle 0 kcal/mol ja laski lineaarisesti laskostumisenergian ylittäessä 0 kcal/mol. Tämä havainto viittaa siihen, että dCas9:n ja sgRNA:n välisen kompleksin muodostumisen tehokkuus määräytyy tetrasilmukka-alueen sekundaarisen rakenteen perusteella, mikä auttaa selittämään järjestelmämme modulaarisuuden. Ylimääräisen 85 sgRNA:n, joissa oli erilaisia ​​12-meerisekvenssejä kirjastosta, repressiotehokkuus mitattiin tämän suhteen vahvistamiseksi edelleen. Se osoitti myös sg trcSL1-varianteista havaitun korrelaation (kuva 3D ja täydentävä taulukko S7), mikä viittaa siihen, että tetrasilmukkalinkkerillä on ratkaiseva rooli RNP-kompleksin muodostamisessa ja että mutaatiot tällä alueella voivat vaikuttaa CRISPR-järjestelmän tehokkuuteen. Lisäksi tämä suhde osoittaa mahdollisuuden tietokonepohjaiseen suunnitteluun sgRNA-variantteja halutulla repressiotehokkuudella.

Viritettävän CRISPRi-järjestelmän soveltaminen virtauksen uudelleenjakaumiseen violaseiinin biosynteesireitillä E. colissa

Redistributing the metabolic flux is an important process in metabolic engineering to maximize the yield of target products (59,60). Because our system could precisely control gene expression by targeting any protospacer, we chose the violacein biosynthetic pathway as a model system for pathway redistribution. Violacein is an indole derivative compound that exhibits a deep purple color, originally produced by Chromobacterium violaceum (Figure 4A) (61). This compound is synthesized from L-tryptophan by five enzymes encoded by vioA, vioB, vioE, vioD, and vioC (62). Along with violacein (V), other indole derivatives such as proviolacein (PV), deoxyviolacein (DV), and prodeoxyviolacein (PDV) with different colors can also be produced (Figure 4A) (62). The production of violacein and deoxy violacein is an enzymatic process mediated by vioC, while the production of PV and PDV is a non-enzymatic process. We expressed the violacein biosynthetic pathway under the IPTG inducible promoter (63), and different trcSL1 variants were designed to target vioD to redirect the flux. It could effectively modulate the expression of vioD at the transcriptional level (Figure 4B). vioC was repressed by sg WT and showed high variation (Supplementary Figure S7), but the absolute copy number was kept at low levels (>100-kertainen) verrattuna muihin geeneihin standardikäyristä laskettuna. Sitä vastoin muiden säätelemättömien entsyymien ilmentyminen violaseiinireitillä (vioA, vioB ja vioE) pysyi muuttumattomana. Nämä tulokset viittaavat siihen, että järjestelmämme voi spesifisesti kohdistaa ja moduloida yksittäisten geenien ilmentymistä vaikuttamatta muihin reitin geeneihin. PV:n ja PDV:n suora kvantifiointi ei ollut mahdollista, koska kaupallisesti saatavilla olevia HPLC-analyysistandardeja ei ollut. Näin ollen mittasimme tiitterit mielivaltaisina yksiköinä käyttämällä HPLC-piikin pinta-alaa. Tuotteen tiitteri saavutti maksiminsa 8 tunnin kuluttua induktion jälkeen ja laski sitten vähitellen (lisäkuva S8), mahdollisesti johtuen tuotteen muuttumisesta muiksi sivutuotteiksi, kuten kromoviridaaneiksi, tuntemattomalla mekanismilla (42, 64). HPLC-spektrissä havaitut pienet piikit osoittivat muiden vähäisten sivutuotteiden läsnäolon. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että jokaisen tuotteen tiitterin logaritmi mielivaltaisissa yksiköissä voidaan ennustaa kunkin violaseiinin biosynteesireittiin osallistuvan geenin promoottorin voimakkuuden lineaarisilla yhdistelmillä (42). Tämä log-lineaarinen regressiomalli oli voimassa myös järjestelmässämme, ja lisääntyneet vioD-transkriptit liittyivät lisääntyneeseen PV-tuotantoon (kuva 4B). Tiedetään, että kunkin violaseiinin biosynteesireittiin osallistuvan geenin promoottorin tai 5 -UTR:n muokkaaminen mahdollisti virtauksen uudelleenjakautumisen ja polun optimoinnin (65, 66). Järjestelmämme voisi toimia vaihtoehtoisena menetelmänä, joka havainnollistaa transkription säätelyä ilman, että polkuun osallistuvia promoottoreita manipuloidaan käyttämällä synteettisiä sgRNA:ita, jotka ovat lyhyitä ja jotka voidaan koota yksivaiheisilla menetelmillä. Seulonta viritettävän CRISPRi-järjestelmän kautta mahdollistaa reitin uudelleenohjauksen ennustettavalla virtauksella ennen kuin suoraan manipuloidaan isäntäkantoja tai geenikasetteja, mikä mahdollisesti nopeuttaa prosessia.

Viritettävän CRISPRi-järjestelmän käyttäminen hiilivirran tasapainottamiseen lykopeenia tuottavassa E. colissa

Arvokkaiden yhdisteiden tehokas tuotanto aineenvaihduntatekniikassa edellyttää hiilivirran tasapainottamista. Metyylierytritoli-4-fosfaatti (MEP) -reitti on aineenvaihduntareitti, joka käyttää yksinkertaisia ​​esiasteita, kuten pyruvaattia ja glyseraldehydi-3-fosfaattia (GAP), tuottaakseen isoprenoidirakennuspalikoita, dimetyyliallyylipyrofosfaattia ja isopentenyylipyrofosfaattia (67,68) . Nämä molekyylit syntetisoivat geranyylipyrofosfaattia, joka muuttuu farnesyylipyrofosfaatiksi (FPP) (67,68). Lykopeeni, erittäin arvostettu karotenoidi, jolla on voimakkaita antioksidanttisia ominaisuuksia ja erilaisia ​​sovelluksia eri teollisuudenaloilla (69), syntetisoidaan FPP:stä sarjan entsymaattisten reaktioiden kautta crtE:stä, crtB:stä ja crtI:stä (kuva 4C) (22,70). GAP-prekursori on välttämätön paitsi MEP-reitin myös glykolyysireitin kannalta (22). Glykolyysireitillä glykolyysireitillä olevaa glykopeenin glykopeenin tuotantoa koodaavan gapA-geenin vähentyneen ilmentymisen on osoitettu lisäävän GAP-poolia (22). Siksi kohdistamme gapA:han viidellä muunnelmalla, mukaan lukien kolme sg trcSL1-varianttia (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5 ja sg trcSL1c6), jotka osoittivat erilaista repressiotehokkuutta, sg PC ja sg WT. GapA on kuitenkin olennainen geeni, jota ei voida täysin kaataa (71,72). Yritykset tukahduttaa gapA tavanomaisella CRISPRi:llä käyttämällä sg WT:tä epäonnistuivat edes dcas9:n alhaisella vuotokyvyllä tet-promoottorin alla (73). Toisaalta gapA-geenin ilmentymisen monitasoinen tukahduttaminen viritettävällä CRISPRi-järjestelmällä saavutettiin ilman kasvuvirheitä ja johti 27-nkertaiseen kasvuun sg trcSL1c6:lla lykopeenin tuotannossa verrattuna kantaan, joka ekspressoi täysin gapA-geeniä. 15 tunnin viljelyn jälkeen (kuva 4D ja lisäkuva S9). On raportoitu, että vain 10 % gapA-geenin luonnollisesta ilmentymisestä johtaa lisääntyneeseen GAP-varaan ilman merkittävää muutosta glykolyysireitin alavirran metaboliiteissa, kuten 2-fosfoglyseraatti ja 3-fosfoglyseraatti ( 22). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että viritettävä CRISPRi voi tarkasti tukahduttaa geenin ilmentymisen useilla tasoilla ilman kromosomitekniikkaa.

Kuva 4. Viritettävän CRISPRi-järjestelmän soveltaminen violaseiinin biosynteesireitille. (A) Violaseiinin biosynteesireitti ja plasmidirakenne. Viisi geeniä (vioA, vioB, vioC, vioD ja vioE), jotka vastaavat violaseiinin tuottamisesta, kloonattiin dCas{1}}-ilmentävään plasmidiin. Valmistetaan neljää päätuotetta (violaseiini, proviolaseiini, deoksiviolaseiini ja prodeoksiviolaseiini). sg WT vioC:lle ja viisi sg trcSL1-varianttia (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6, sg trcSL1c8 ja sg trcSL1c9) vioD:lle, jotka osoittavat erilaisia ​​repressiotehokkuuksia, kloonattiin muihin plasmioihin. Trp: L-tryptofaani, V: violaseiini, PV: proviolaseiini, PDV: prodeoksiviolaseiini, DV: deoksiviolaseiini, PDVA: protodeoksiviolaseiinihappo, PVA: protoviolaseiinihappo. (B) Suhde vioD-transkriptien, mCherry-fluoresenssin sekä PDV- ja PV-tiitterin välillä. X-akseli osoittaa RT-qPCR:stä saatua suhteellista vioD RNA:ta, vasemmalla oleva y-akseli osoittaa suhteellista mCherryn fluoresenssia kuvasta 3 ja y-akseli oikealla osoittaa HPLC-alueen suhteen. Näytteet, joilla oli korkein vioD RNA -arvo, asetettiin 100 %:iin normalisointia varten. (C) Lykopeenin biosynteesireitti ja plasmidin rakentaminen. Kolme lykopeenin tuottamisesta vastaavaa geeniä (crtE, crtB, crtI) kloonattiin dCas9--ilmentävään plasmidiin. gapA kohdistettiin sg trcSL1-varianteille (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6) ja sg PC kloonattiin toiseen plasmidiin. Glc: glukoosi, GAP: glyseraldehydi-3-fosfaatti, 1,3-BPG: 1,3-bisfosfoglyseraatti, DMAPP: dimetyyliallyylipyrofosfaatti, IPP: isopentenyylipyrofosfaatti, FPP: farnesyylihappo. (D) GapA-transkriptien, mCherry-fluoresenssin ja lykopeenituotannon välinen suhde. X-akseli osoittaa RT-qPCR:stä saatua suhteellista aukko-RNA:ta, vasemmalla oleva y-akseli osoittaa suhteellista mCherry-fluoresenssia kuviosta 3 ja y-akseli oikealla osoittaa lykopeenin tiitterin. (B, D) Kaikki virhepalkit osoittavat keskihajonnan (n=3).

PÄÄTELMÄ

Suunnittelimme viritettävän CRISPRi-järjestelmän, joka pystyi kontrolloimaan tarkasti geenin ilmentymistä halutulla tasolla. Mutatoimalla tetrasilmukkaa ja sen viereistä aluetta synteettiset sgRNA:t, jotka kohdistuvat erilaisiin protospacer-sekvensseihin, voivat säädellä geeniä tietyllä tasolla. Käytimme onnistuneesti tätä järjestelmää kiinnostavan aineenvaihduntavirran ohjaamiseen violaseiinin biosynteesireitillä tuottamaan indolijohdannaisia ​​ennustettavassa suhteessa. Lisäksi olemme osoittaneet, että viritettävän CRISPRi:n käyttö johti 27--kertaiseen lykopeenituotannon kasvuun, mikä korostaa järjestelmämme monipuolisuutta parantaa muiden arvokkaiden yhdisteiden tuotantoa. Tämä järjestelmä nopeuttaisi virtauksen optimointiprosesseja ennen isäntägeneettisen tiedon pysyvää manipulointia, kuten promoottorin tai 5-UTR-sekvenssien korvaamista.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

VIITTEET

1. Sapranauskas, R., Gasiunas, G., Fremaux, C., Barrangou, R., Horvath, P. ja Siksnys, V. (2011) Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas -järjestelmä tarjoaa immuniteetin Escherichia colissa. Nucleic Acids Res., 39, 9275-9282.

2. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P. ja Siksnys, V. (2012) Cas9-crRNA-ribonukleoproteiinikompleksi välittää spesifistä DNA:n katkaisua adaptiivisen immuniteetin aikaansaamiseksi bakteereissa. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109, E2579–E2586.

3. Cong, L., Ran, FA, Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, PD, Wu, X., Jiang, W., Marraffini, LA et ai. . (2013) Multiplex genomitekniikka käyttäen CRISPR/Cas-järjestelmiä. Science, 339, 819–823.

4. Ran, FA, Hsu, PD, Wright, J., Agarwala, V., Scott, DA ja Zhang, F. (2013) Genomitekniikka CRISPR-Cas9-järjestelmällä. Nat. Protoc., 8, 2281–2308.

5. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, JA ja Charpentier, E. (2012) Ohjelmoitava kaksois-RNA-ohjattu DNA-endonukleaasi adaptiivisessa bakteeri-immuniteetissa. Science, 337, 816–821.

6. Anders, C., Niewoehner, O., Duerst, A. ja Jinek, M. (2014) Cas9-endonukleaasin PAM-riippuvaisen kohde-DNA:n tunnistamisen rakenteellinen perusta. Nature, 513, 569–573.

7. Qi, LS, Larson, MH, Gilbert, LA, Doudna, JA, Weissman, JS, Arkin, AP ja Lim, WA (2013) CRISPR:n uudelleenkäyttö RNA-ohjatuksi alustaksi geeniekspression sekvenssispesifiseen ohjaukseen. Cell, 152, 1173-1183.

8. Larson, MH, Gilbert, LA, Wang, X., Lim, WA, Weissman, JS ja Qi, LS (2013) CRISPR-häiriö (CRISPRi) geeniekspression sekvenssispesifiseen säätelyyn. Nat. Protoc., 8, 2180–2196.

9. McGlincy, NJ, Meacham, ZA, Reynaud, KK, Muller, R., Baum, R. ja Ingolia, NT (2021) Genomilaajuinen CRISPR-häiriöopaskirjasto mahdollistaa kattavan fenotyyppisen profiloinnin hiivassa. BMC Genomics, 22, 205.

10. Yoon, J. ja Woo, HM (2018) CRISPR-häiriövälitteinen Corynebacterium glutamicumin metabolinen muokkaus homobutyraatin tuotantoa varten. Biotechnol. Bioeng., 115, 2067–2074.

11. Cleto, S., Jensen, JV, Wendisch, VF ja Lu, TK (2016) Corynebacterium glutamicum metabolic engineering with CRISPR interferenssi (CRISPRi). ACS Synth. Biol., 5, 375-385.

12. Zhang,GQ, Ren,XN, Liang,XH, Wang,YQ, Feng,DX, Zhang,YJ, Xian,M. ja Zou, HB (2021) Aminohappojen mikrobituotannon parantaminen: perinteisistä lähestymistavoista viimeaikaisiin trendeihin. Biotechnol. Bioproc. E, 26, 708–727.

13. Kim, SK, Seong, W., Han, GH, Lee, DH ja Lee, SG (2017) CRISPR:n häiriöohjattu multipleksinen endogeenisten kilpailevien reittigeenien repressio aineenvaihduntavirran ohjaamiseksi Escherichia colissa. Microb. Cell Fact., 16, 188.

14. Ellis, NA, Kim, B., Tung, J. ja Machner,MP (2021) Multiplex CRISPR-häiriötyökalu virulenssigeenien kyselyyn Legionella pneumophilassa. Commun. Biol., 4, 157.

15. Siu, KH ja Chen, W. (2019) Riboregulated toehold-gated gRNA ohjelmoitavaa CRISPR-Cas9-toimintoa varten. Nat. Chem. Biol., 15, 217-220.

16. Reis, AC, Halper, SM, Vezeau, GE, Cetnar, DP, Hossain, A., Clauer, PR ja Salis, HM (2019) Useiden bakteerigeenien samanaikainen repressio käyttämällä ei-toistuvia, erittäin pitkiä sgRNA-ryhmiä. Nat. Biotechnol., 37, 1294-1301.

17. Tian, ​​T., Kang, JW, Kang, A. ja Lee, TS (2019) Aineenvaihduntavirran ohjaaminen kombinatorisen multipleksisen CRISPRi-välitteisen repression kautta isopentenolin tuotantoon Escherichia colissa. ACS Synth. Biol., 8, 391-402.

18. Gauttam, R., Seibold, GM, Mueller, P., Weil, T., Weiss, T., Handrick, R. ja Eikmanns, BJ (2019) Yksinkertainen kaksois-indusoituva CRISPR-häiriöjärjestelmä useiden geenien kohdentamiseen Corynebacterium glutamicum -bakteerissa. Plasmid, 103, 25-35.

19. Yao, L., Cengic, I., Anfelt, J. ja Hudson, EP (2016) Monien geenien repressio syanobakteereissa käyttäen CRISPRi:tä. Acs Synth. Biol., 5, 207-212.

20. Lim, HG, Noh, MH, Jeong, JH, Park, S. ja Jung, GY (2016) Optimaalinen tasapainottaminen 3-hydroksipropionihapon tuotantoreitillä glyserolista Escherichia colissa. ACS Synth. Biol., 5, 1247-1255.

21. Yang,Y., Lin,Y., Li,L., Linhardt,RJ ja Yan,Y. (2015) Malonyyli-CoA-aineenvaihdunnan säätely synteettisten antisense-RNA:iden avulla luonnontuotteiden biosynteesin tehostamiseksi. Metab. Eng., 29, 217–226.

22. Jung, J., Lim, JH, Kim, SY, Im, DK, Seok, JY, Lee, SV, Oh, MK ja Jung, GY (2016) Tarkka esiasteen tasapainotus isoprenoidituotannossa gapA-ilmentymän hienosäädöllä Escherichia coli. Metab. Eng., 38, 401–408.

23. Li,XT, Jun,Y., Erickstad,MJ, Brown,SD, Parks,A., Court,DL ja Jun,S. (2016) tCRISPRi: viritettävä ja palautuva, yksivaiheinen geeniekspression hallinta. Sci. Rep., 6, 39076.

24. Fontana, J., Dong, C., Ham, JY, Zalatan, JG ja Carothers, JM (2018) SgRNA:iden säännelty ilmentyminen virittää CRISPRi:n E. colissa. Biotechnol. J., 13, e1800069.

25. Kim, NM, Sinnott, RW ja Sandoval, NR (2020) Transkriptiotekijäpohjaiset biosensorit ja indusoituvat järjestelmät ei-mallibakteereissa: nykyinen edistys ja tulevaisuuden suunnat. Curr. Opin. Biotechnol., 64, 39-46.

26. Kundert, K., Lucas, JE, Watters, KE, Fellmann, C., Ng, AH, Heineike, BM, Fitzsimmons, CM, Oakes, BL, Qu, J., Prasad, N. et ai. (2019) CRISPR-Cas9:n kontrollointi ligandiaktivoiduilla ja ligandideaktivoiduilla sgRNA:illa. Nat. Commun., 10, 2127.

27. Ferreira, R., Skrekas, C., Hedin, A., Sanchez, BJ, Siewers, V., Nielsen, J. ja David, F. (2019) Hiivan keskushiilen aineenvaihdunnan malliavusteinen hienosäätö dCas{4}}-pohjaisen säätelyn avulla. ACS Synth. Biol., 8, 2457-2463.

28. Su, T., Guo, Q., Zheng, Y., Liang, Q., Wang, Q. ja Qi, Q. (2019) hemB:n hienosäätö CRISPRi:llä 5-aminolevuliinihapon tuotannon lisäämiseksi Escherichia colissa. Edessä. Microbiol., 10, 1731.

29. Zheng,T., Hou,Y., Zhang,P., Zhang,Z., Xu,Y., Zhang,L., Niu,L., Yang,Y., Liang,D., Yi,F . et ai. (2017) Yksisuuntaisen RNA:n spesifisyyden profilointi paljastaa yhteensopimattomuusherkän ydinsekvenssin. Sci. Rep., 7, 40638.

30. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F. ja Marraffini, LA (2013) RNA-ohjattu bakteerigenomien editointi CRISPR-Cas-järjestelmillä. Nat. Biotekniikka.,

31, 233–239. 31. van Gestel, J., Hawkins, JS, Todor, H. ja Gross, CA (2021) Laskennallinen putkisto ohje-RNA:iden suunnitteluun mismatch-CRISPRi:lle. STAR Protoc, 2, 100521.

32. Hawkins, JS, Silvis, MR, Koo, BM, Peters, JM, Osadnik, H., Jost, M., Hearne, CC, Weissman, JS, Todor, H. ja Gross, CA (2020) Mismatch-CRISPRi paljastaa Escherichia colin ja Bacillus subtilis -bakteerin olennaisten geenien samanaikaiset ilmentymis-kunnon suhteet. Cell Syst., 11, 523-535.

33. Fortin, J.-P., Tan, J., Gascoigne, KE, Haverty, PM, Forrest, WF, Costa, MR ja Martin, SE (2019) Usean geenin kohdistus ja yhteensopimattomuustoleranssi voivat hämmentää genomianalyysiä. leveät yhdistetyt CRISPR-näytöt. Genome Biol., 20, 21.

34. Rozen, S. ja Skaletsky, H. (2000) Primer3 WWW:ssä tavallisille käyttäjille ja biologeille ohjelmoijille. Menetelmät Mol. Biol., 132, 365-386.

35. Zhou, K., Zhou, L., Lim, Q., Zou, R., Stephanopoulos, G. ja Too,HP (2011) Uudet vertailugeenit Escherichia colin transkriptionaalisten vasteiden kvantifiointiin proteiinin yli-ilmentymiseen kvantitatiivisella PCR:llä. BMC Mol. Biol., 12, 18.

36. Livak, KJ ja Schmittgen, TD (2001) Suhteellisen geeniekspressiotietojen analyysi käyttäen reaaliaikaista kvantitatiivista PCR:ää ja 2(-Delta Delta C(T)) -menetelmää. Methods, 25, 402–408.

37. Andrews, S. (2010) FastQC: Laadunvalvontatyökalu korkean suorituskyvyn sekvenssitiedoille. v0.11.9 ed.

38. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. ja Salzberg, SL (2009) Ultranopea ja muistitehokas lyhyiden DNA-sekvenssien kohdistus ihmisen genomiin. Genome Biol., 10, R25.

39. Danecek, P., Bonfield, JK, Liddle, J., Marshall, J., Ohan, V., Pollard, MO, Whitwham, A., Keane, T., McCarthy, SA, Davies, RM et ai. (2021) Kaksitoista vuotta SAMtoolsia ja BCFtoolsia. Gigascience, 10, giab008.

40. Trapnell, C., Williams, BA, Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., van Baren, MJ, Salzberg, SL, Wold, BJ ja Pachter, L. (2010) Transkriptien kokoaminen ja kvantifiointi RNA-Seq:n avulla paljastaa huomautuksia sisältämättömät transkriptit ja isoformien vaihtamisen solujen erilaistumisen aikana. Nat. Biotechnol., 28, 511-515.

41. Trapnell, C., Hendrickson, DG, Sauvageau, M., Goff, L., Rinn, JL ja Pachter, L. (2013) Geenisäätelyn differentiaalinen analyysi transkriptin resoluutiolla RNA-seq. Nat. Biotechnol., 31, 46-53.

42. Lee, ME, Aswani, A., Han, AS, Tomlin, CJ ja Dueber, JE (2013) Ekspressiotason optimointi monientsyymireitille ilman korkean suorituskyvyn määritystä. Nucleic Acids Res., 41, 10668-10678.

43. Hsu, PD, Scott, DA, Weinstein, JA, Ran, FA, Konermann, S., Agarwala, V., Li, Y., Fine, EJ, Wu, X., Shalem, O. et ai. (2013) RNA-ohjattujen Cas9-nukleaasien DNA-kohdistusspesifisyys. Nat. Biotechnol., 31, 827-832.

44. Nishimasu, H., Ran, F., Hsu, P., Konermann, S., Shehata, S., Dohmae, N., Ishitani, R., Zhang, F. ja Nureki, O. (2014) Cas9:n kristallirakenne kompleksissa opas-RNA:n ja kohde-DNA:n kanssa. Cell, 156, 935-949.

45. Fu,Y., Rocha,PP, Luo,VM, Raviram,R., Deng,Y., Mazzoni,EO ja Skok,JA (2016) CRISPR-dCas9- ja sgRNA-telineet mahdollistavat satelliittisekvenssien kaksivärisen live-kuvauksen ja toistuvasti rikastettuja yksittäisiä lokuksia. Nat. Commun., 7, 11707.

46. ​​Khosravi, S., Schindele, P., Gladilin, E., Dunemann, F., Rutten, T., Puchta, H. ja Houben, A. (2020) Aptameerien sovellus parantaa kasvien telomeerien CRISPR-pohjaista elävää kuvantamista. Edessä. Plant Sei., 11, 1254.

47. Nielsen,AA ja Voigt,CA (2014) Monituloiset CRISPR/Cas-geenipiirit, jotka yhdistävät isäntäsäätelyverkkoja. Mol. Syst. Biol., 10, 763.

48. Lee, YJ, Hoynes-O'Connor, A., Leong, MC ja Moon, TS (2016) Ohjelmoitava bakteerien geeniekspression hallinta 44, 2462–2473:lla.

49. Vigouroux, A., Oldewurtel, E., Cui, L., Bikard, D. ja van Teeffelen,S. (2018) Tuning dCas9:n kyky estää transkriptio mahdollistaa voimakkaan, äänettömän bakteerigeenien tuhoamisen. Mol. Syst. Biol., 14, e7899.

50. Zhang,Y., Shang,X., Lai,S., Zhang,G., Liang,Y. ja meni. (2012) Kehittäminen ja soveltaminen arabinoosi-indusoituva ilmentämisjärjestelmä helpottamalla indusoijan sisäänottoa Corynebacterium glutamicum. Appl. Ympäristö. Microbiol., 78, 5831-5838.

51. Thompson, MG, Sedaghatian, N., Barajas, JF, Wehrs, M., Bailey, CB, Kaplan, N., Hillson, NJ, Mukhopadhyay, A. ja Keasling, JD (2018) Uusien mutaatioiden eristäminen ja karakterisointi pSC101-alkuperässä, jotka lisäävät kopiomäärää. Sci Rep-UK, 8, 1590. 52. Fricke, PM, Link, T., Gatgens, J., Sonntag, C., Otto, M., Bott, M. ja Polen, T. (2020) Viritettävä L-arabinoosilla indusoituva ekspressioplasmidi etikkahappobakteerille Gluconobacter oxydans. Appl. Microbiol. Biotechnol., 104, 9267-9282.

53. Nguyen, TT, Nguyen, NH, Kim, Y., Kim, JR ja Park, S. (2021) 3-hydroksipropionidehydrogenaasin indusoituvan promoottorijärjestelmän in vivo karakterisointi Pseudomonas denitrificansissa. Biotechnol Bioproc E, 26, 612–620.

54. McCarty, NS, Graham, AE, Studena, L. ja Ledesma-Amaro,R. (2020) Multipleksoidut CRISPR-tekniikat geenien muokkaamiseen ja transkription säätelyyn. Nat. Commun., 11, 1281.

55. Yan, Q. ja Fong,SS (2017) Tutkimus in vitro transkription sitoutumisvaikutuksista ja kohinasta käyttämällä konstitutiivisia promoottoreita yhdistettynä UP-elementtisekvensseihin Escherichia colissa. J. Biol. Eng., 11, 33.

56. Seo, SW, Yang, JS, Kim, I., Yang, J., Min, BE, Kim, S. ja Jung, GY (2013) mRNA:n translaation aloitusalueen ennakoiva suunnittelu prokaryoottisen translaation tehokkuuden hallitsemiseksi. Metab. Eng., 15, 67–74. 57. Kappel, K., Jarmoskaite, I., Vaidyanathan, PP, Greenleaf, WJ, Herschlag, D. ja Das,R. (2019) RNA-proteiinin sitoutumisaffiniteetin ennustamisen sokkotestit. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 116, 8336–8341.

58. Zuker, M. (2003) Mfold-verkkopalvelin nukleiinihappojen laskostumisen ja hybridisaation ennustamiseen. Nucleic Acids Res., 31, 3406-3415.

59. Xiong,B., Zhu,Y., Tian,D., Jiang,S., Fan,X., Ma,Q., Wu,H. ja Xie,X. (2021) Keski-hiilen aineenvaihdunnan virtaus uudelleenjakauma tehokkaaseen l-tryptofaanin tuotantoon Escherichia colissa. Biotechnol. Bioeng., 118, 1393–1404.

60. Yao, R., Li, J., Feng, L., Zhang, X. ja Hu, H. (2019) (13) C-aineenvaihduntavirta-analyysiin ohjattu Escherichia colin aineenvaihduntatekniikka parantaa asetolin tuotantoa glyserolista. Biotechnol. Biopolttoaineet, 12, 29.

61. Duran, N. ja Menck, CF (2001) Chromobacterium violaceum: katsaus farmakologisiin ja teollisiin näkökulmiin. Crit. Rev. Microbiol., 27, 201-222.

62. Balibar, CJ ja Walsh, CT (2006) Violaseiinin biosynteesi in vitro L-tryptofaanista Chromobacterium violaceumin VioA-E-entsyymeillä. Biochemistry, 45, 15444-15457.

63. Gwon, DA, Seok, JY, Jung, GY ja Lee, JW (2021) Biosensor-avusteinen adaptiivinen laboratorioevoluutio violaseiinin tuotantoon. Int. J. Mol. Sei., 22, 6594.

64. Sanchez, C., Brana, AF, Mendez, C. ja Salas, JA (2006) Violaseiinin biosynteesireitin uudelleenarviointi ja sen suhde indolokarbatsolin biosynteesiin. Chem. Bio. Chem., 7, 1231-1240.

65. Jones, JA, Vernacchio, VR, Lachance, DM, Lebovich, M., Fu, L., Shirke, AN, Schultz, VL, Cress, B., Linhardt, RJ ja Koffas, MA (2015) ePathOptimize: a kombinatorinen lähestymistapa aineenvaihduntareittien transkription tasapainottamiseen. Sci. Rep., 5, 11301.

66. Zhang, Y., Chen, H., Zhang, Y., Yin, H., Zhou, C. ja Wang,Y. (2021) Biosynteettisen geeniklusterin suora RBS-tekniikka violaseiinien tehokkaaseen tuottamiseen E. colissa. Microb. Cell Fact., 20, 38.

67. Hunter, WN (2007) ei-mevalonaattipolku isoprenoidiprekursorin biosynteesiä. J. Biol. Chem., 282, 21573-21577.

68. Rohmer, M. (1999) Mevalonaatista riippumattoman reitin löytäminen isoprenoidien biosynteesiin bakteereissa, levissä ja korkeammissa kasveissa. Nat. Tuot. Rep., 16, 565–574.

69. Muller, L., Caris-Veyrat, C., Lowe, G. ja Bohm, V. (2016) Lykopeeni ja sen antioksidanttirooli sydän- ja verisuonisairauksien ehkäisyssä – kriittinen katsaus. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 56, 1868–1879.

70. Miura, Y., Kondo, K., Saito, T., Shimada, H., Fraser, PD ja Misawa, N. (1998) Karotenoidien lykopeenin, beetakaroteenin ja astaksantiinin tuotanto Candida utilis -ruokahiivassa. Appl. Ympäristö. Microbiol., 64, 1226-1229.

71. Goodall, ECA, Robinson, A., Johnston, IG, Jabbari, S., Turner, KA, Cunningham, AF, Lund, PA, Cole, JA ja Henderson, IR (2018) Escherichia coli K{:n olennainen genomi {2}}. Mbio, 9, e02096-17.

72. Baba, T., Ara, T., Hasegawa, M., Takai, Y., Okumura, Y., Baba, M., Datsenko, KA, Tomita, M., Wanner, BL ja Mori, H. (2006) Escherichia coli K-12 -kehyksen sisäisten, yhden geenin knockout-mutanttien rakentaminen: Keio-kokoelma. Mol. Syst. Biol., 2, 2006.0008.

73. Bertram,R. ja Hillen, W. (2008) Tet-repressorin soveltaminen prokaryoottisten geenien säätelyssä ja ilmentymisessä. Microb. Biotechnol., 1, 2-16.