Proteiineja löydettiin vähintään 2 jokaisessa tutkitussa tilassa

Ota yhteyttäoscar.xiao@wecistanche.comLisätietoja

Lisäksi, kuten kuvioiden 5B ja 6B pylväskaavioista ilmenee, erottuva proteiinijakauma erittävien solujen hypoksisen esikäsittelyn mukaan on huomattava. Tässä tapauksessa täydellisen tiedon saamiseksi raportoitiin myös proteiineja, jotka eivät ylitä DAve- ja DCI-sarjan kynnystä. Sikiön eritystulokset on rikastettu 60 kDa lämpöshokkiproteiinilla (HSPD1, kuva 5B, vasen paneeli) sen hypoksisessa formulaatiossa, kun taas perinataalivastineella on voimakkaasti ilmentynyt sileän lihaksen supistumisen myosiinia säätelevä [52] kevyt polypeptidi 9 (MYL9, kuva). 5B, oikea paneeli). Merkittävä osa gestaatiovaiheiden välisistä eroista näyttää riippuvan enemmän hAFS:n hypoksisesta esihoidosta. Sähköautot; F-have-EV:t, jotka saatiin hypoksisesta solujen esikäsittelystä, havaittiin rikastuneena sellaisilla tekijöillä kuin Perlecan (HSPG2), Agrin (AGRN), Laminin Subunit -5 ja -1(LAMA5 ja LAMB1), trombospondiini{{17 }} (THBS1, kuva 6B, vasen paneeli). Hypoksiset p-hAFS-EV:t sisälsivät ferritiiniä raskaan ketjun (FTH1), rakennustelineproteiineja, kuten Flotillin-1(FLOT1), Fascin (FSCN1), anneksiini A6 (ANXA6), Rab GDP:n dissosiaatio-inhibiittori beeta (GDI2) sekä Thy. -1 kalvoglykoproteiini (THY1), Neuropilin-1(NRP1) ja Matrix Metalloprotein 14 (MMP14, kuva 6B, oikea paneeli).

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja

Proteiineja löydettiin frekvenssillä vähintään 2 kussakin tutkitussa tilassa f-hAFS:ssä. Sähköautoja ja p-hAFS-EV:itä verrattiin edelleen Vesciclepedia-tietokantaan [53]. Kuten odotettiin, suurin osa tunnistetuista proteiineista (96 prosenttia) on kuvattu aiemmin EV:issä ja eksosomeissa vertailutietokannassa (kuva S3A).cistanchen edutTässä suhteessa Gene Ontology (GO) -rikastusanalyysi suoritettiin FunRichin avulla [54]. GO-termien runsautta aineistossa verrattiin niiden luonnolliseen määrään viitetietokannassa tilastollisesti yliedustettujen proteiiniryhmien löytämiseksi niiden biologisiin prosesseihin, molekyylitoimintoihin ja solukomponentteihin osallistumisen mukaan (tästä viimeisestä näkökulmasta tiedot eivät ole näytetään, mutta saatavilla pyynnöstä). Mitä tulee tunnistettuihin proteiineihin liittyvien molekyylitoimintojen analyysiin, hAFS-CM-fraktiot osoittivat rikastumista solunulkoisen matriksin ja solun tukirangan rakenteellisessa ainesosassa, solun tukirankaproteiinien sitoutumisessa ja rakenteellisen molekyylin aktiivisuuden (kuva S2), kun taas hAFS-EV:t rikastuivat rakenteellisella aineella. sytoskeleton ja ribosomin ainesosa, DNA:ta ja RNA:ta sitovat sekä GTPaasia ja chaperonia sitovat tekijät (kuva S3C).

Biologisten prosessien rikastusanalyysi sekä hAFS-CM:lle että have-EV:lle osoitti, että suurin osa sikiön ja perinataalisen hAFS:n eritysfraktioissa moduloiduista proteiineista kuuluu solujen kasvuun/ylläpitoon ja proteiinien aineenvaihduntaan (kuvat 5C ja 6C). hAFS-EV:issä havaitsimme, että termi "sellulaarisen matriisin rakenteelliset ainesosat" liitettiin yksinomaan hypoksisiin f-hAF-EV:ihin; termit "kalsiumionien sitoutuminen" ja "rakenteellinen molekyyliaktiivisuus" rikastuivat pääasiassa hypoksisissa f-hAFS- ja p-hAFS-näytteissä (kuvio S3B).

Figure 6. Comparative proteomics analysis of fetal- and perinatal hAFS-EVs. (A)Venn diagram illustrating the distribution of proteins identified with a frequency of at least 2 within f-hAFS-EVSnormo (dark yellow),f-hAFS-EVSHypo (red), p-hAFS-EVSnormo (light green), and p-hAFS-EVShypo (dark green). (B)Differentially expressed proteins were identified in fetal hAFS-EVs (left panel) and perinatal hAFS-EVs (right panel) by label-free quantification with MAProMa software. Left panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between normoxic control (dark yellow bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (red bars and positive DAve values) of f-hAFS-EVs over p-hAFS-EVs. Right panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between control normoxic (light green bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (dark green bars and positive DAve values) of p-hAFS-EVs over f-hAFS-EVs. Proteins with DAve (ratio of protein expression)>10.4I ja DCI (differentiaalisen lausekkeen luottamus) suurempi tai yhtä suuri kuin I5I läpäisivät suodattimet, ja niitä pidettiin differentiaalisesti ilmaistuina; katso taulukosta S3 raportoitujen proteiinien täydellinen luettelo ja yksityiskohtaiset parametrit. (C) Biologisten prosessien rikastusanalyysi proteiineista, jotka tunnistetaan vähintään 2:lla f-hAFS-EV:issä (vasen paneeli) ja p-hAFS-EV:issä (oikea paneeli) hypoksisen esikäsittelyn jälkeen. FunRich-työkalun perusteella geeniontologian termit näytetään pylväskaavioissa, jotka ilmoittavat kunkin kategorian rikastettujen geenien prosenttiosuuden (tummankeltaiset palkit f-hAFS-EVsnormolle, punaiset palkit f-hAFS-EVShypolle, vaaleanvihreät palkit p-hAFS:lle -EVsnormo ja tummanvihreät palkit p-hAFS-EVShypolle). Vain geeniontologiatermit Bonferronilla korjattu*p<0.05 are="">

Cistanche voi estää ikääntymistä

2.6. Sikiön vs. perinataalisen has-CM ja have-EV:n sytokiini- ja kemokiiniprofilointi paljasti erilaisia ​​jakautumismalleja

Olemme aiemmin validoineet f-hAFS-CMhypon regeneratiivisen kapasiteetin loukkaantuneissa sydän- ja verisuonisoluissa parakriinisten vaikutusten kautta [34, 35, 49]. Tässä vertailimme f-hAFS-CMHypon sytokiini- ja kemokiinipitoisuutta vastaavaan p-hAFS-vastineeseen (kuva 7A, kuva S4A ja taulukko S4) ja löysimme joitain erottavia tekijöitä.

ANGIOGENIN, ekstrasellulaarisen matriisin metalloproteinaasin indusoija (EMMPRIN), interleukiini 8 (IL-8) ja monosyyttikemoattraktanttiproteiini-1 (MCP-1) löydettiin yksinomaan rikastettuna inf-hAFS-CMNypo:na, eikä niitä ollut. havaittu p-hAFS-CMhypo:ssa. Insuliinin kaltainen kasvutekijää sitova proteiini 2 (IGFBP2) ja osteopontiini (OPN) lisääntyivät merkittävästi f-hAFS-CMhypossa p-hAFS-CMHypoon verrattuna 35-ja 38--kertaisesti (" s<0.05 and=""><0.01 respectively,="" figure="" 5a).="" plasminogen="" activator="" inhibitor-1(pai-1)="" was="" strongly="" expressed="" in="" both="" f-hafs-cmhypo="" and="" p-hafs-cmnypo="" (figure7a).="" other="" cytokines="" were="" detectable="" at="" low="" levels,="" namely="" cystatin="" c(cst3),="" fibroblast="" growth="" factor="" 19="" (fgf-19)interleukin-17a="" (il-17a),="" macrophage="" migration="" inhibitor="" factor="" (mif),="" pentraxin="" 3="">

Vaikka sikiön ja perinataalisen have-CM osoitti erilaista ilmentymistä sytokiini- ja kemokiiniprofiilissaan, vastaavat sikiön vs. perinataaliset EV-vastineet olivat jakautuneet tasaisemmin, vaikka niillä oli alhaisemmat ilmentymisprofiilit (kuva 7B, kuva S4B ja taulukko S5). Joitakin eroja voidaan kuitenkin arvostaa: DiPeptidyyli-Peptidaasi IV (DPPIV), kasvu-/erilaistumistekijä 15 (GDF-15) ja IL-8 ilmentyivät vain f-hAFS-EVSHypolla, vaikkakin alhaisella tasolla. tasot; ANGIOPOIETIN2, CD40 LIGAND ja D-vitamiinia sitova proteiini (VDBP) löydettiin vain p-hAFS-EVShyposta, vaikka niitä havaittiin jälleen pieninä määrinä. Muut sytokiinit, kuten Brain-derived Neurotrophic Factor (BDNF)ENDOGLIN, FGF-19, insuliinin kaltainen kasvutekijää sitova proteiini 3 (IGFBP3), IL-17a, MIF OPN, PTX3, stromaalista johdettu tekijä{ {23}} alfa (SDF-1a) löydettiin sekä f-hAFS-EVShyposta että p-hAFS-EVSHvposta, ja PAI-1 ja EMMPRIN olivat voimakkaammin ilmentyneitä (kuva 7B)

BDNF, ENDOGLIN, IGFBP3 ja SDF-lo olivat yksinomaan rikastettuja kaikissa hypoksisissa have-EV:issä verrattuna vastaavaan hAFS-CM:ään raskauden vaiheesta riippumatta. Lisäksi vaikka EMMPRIN:iä ei havaittu p-hAFS-CMhypossa, sen havaittiin olevan rikastunut EV:tä vastaavassa fraktiossa; päinvastoin, OPN oli runsaampi f-have-CMhypossa kuin f-have-EVShypossa, kun taas se oli vertailukelpoinen vastaavien p-hAFS-eritysfraktioiden kesken. FGF-19, MIF ja PTX3 ilmentyivät samalla tavalla sekä sikiön että perinataalisen has-CM:ssä ja vastaavissa hAFS-EV:issä. PAI-1 oli erittäin rikastettu hypoksisilla eritysfraktioilla.

Kuva 7. Sytokiinien ja kemokiinien profilointi sikiön ja perinataalisen hAFS:n eritysformulaatioissa. (A) Sytokiinien ja kemokiinien ilmentyminen, joka on havaittu hypoksisessa sikiön vs. perinataalisessa have-CM:ssä (f-hAFS-CMHypo vs. p-hAFS-CMHypo) on raportoitu pikselitiheydellä mielivaltaisena yksikkönä [AU]. Arvot on ilmaistu riippumattomien kokeiden keskiarvona ± sem ja raportoitu taulukossa S4;*p=0.0485;**p=0.006.(B)Sytokiini- ja kemokiinipitoisuus havaittu hypoksisessa sikiössä. vs. perinataaliset hAFS-EV:t (f-hAFS-EVSHypo vs. p-hAFS-EVSHypo) ja ilmaistaan ​​pikselitiheydellä mielivaltaisissa yksiköissä [AU].cistanche-kolesteroliArvot ilmaistaan ​​n=3 riippumattoman kokeen keskiarvona±sem ja raportoidaan taulukossa S5. CST3: kystatiini C; EMMPRIN: solunulkoisen matriisin metalloproteinaasin indusoija; FCFF-19: fibroblastien kasvutekijä-19; IGFBP2: insuliinin kaltainen kasvutekijä (IGF) sitova proteiini 2; IL-8: interleukiini -8;IL-17a:Interleukiini-17a; MCP-1: Monocyte Chemoattractant Protein-1;MIF:Macrophage migration Inhibitory Factor; PTX3: Pentraxin 3; PAI-1: plasminogeeniaktivaattorin estäjä-1; BDNF: Brain-Dived Neurotrofic Factor; DPPIV: dipeptidyylipeptidaasi IV; GDF-15:Growth Differentiation Factor-15;IGFBP3:Insuliinin kaltainen kasvutekijä (IGF)Binding Protein 3;SDF-1a: Stromaalista johdettu tekijä-1 alfa; VDBP: D-vitamiinia sitova proteiini.

2.7. Sikiö- ja perinataaliset sähköautot on rikastettu RNA-tiedoilla niiden lastissa

Koska pieniä ei-koodaavia RNA:ita on pidetty EV:n parakriinisen vaikutuksen pääsäätelijöinä kohdesoluihin [4,55], keskityimme pääasiassa RNA-sekvensointianalyysiin f-hAFS-EV:n ja p-hAFS-EV:n mikroRNA:n (miRNA) pitoisuuteen. Pieni RNA-profilointi osoitti miRNA:n rikastumista sekä sikiö- että perinataalisissa hAFS-EV:issä (noin 35-36 prosenttia) verrattuna pieneen RNA:n kokonaismäärään (kuvio 8A). MiRNA-komponentti oli todellakin kahden eniten edustettuna olevan RNA-lajin joukossa molemmissa EV-formulaatioissa yhdessä rRNA:n (***p) p < 0,0001)="" kanssa.="" seuraavat="" mirna:t="" olivat="" eniten="" rikastettuja="" analysoiduissa="" ev-näytteissä:="" mir-31-5p;="" mir-196a-5p;="" mir-93-5p;="" mir-100-5p;="" mir-125a-5p;="" mir-27b-3p,let-7a-5p,let-7b-5p,let-7f{="" {27}}p,let-7i-5p,mir-16-5p,mir-21-5p,mir-29a-3p,="" mir30a-5p,="" mir-125b-5p,="" mir-155-5p,="" mir-191-5p="" ja="" mir-221-3p.="" huomionarvoista="" on,="" että="" sikiö-="" ja="" perinataaliset="" ev:t="" jakavat="" suurimman="" osan="" tällaisista="" mirna:ista="" (eli="" let-7a-5p,let-7b-5p,let{{47="" }}f-5p,="" let-7i-5p,="" mir-16-5p,="" mir-21-5p,="" mir-29a{{54="" }}p,mir30a-5p,="" mir-125b-5p,="" mir-155-5p,="" mir-191-5p="" ja="" mir-221-3p,="" kuva="" 7b).="" toisaalta="" noin="" 100="" mirna:ta="" löydettiin="" jäljellä="" olevista="" 30="" prosentista="" vesikulaarisen="" mirna-sisällöstä="" (kuvio="">

MiRNA-sisällön karakterisoimiseksi edelleen hAFS-EV:issä tutkimme, voisiko hAFS-raskausvaihe tai in vitro hypoksisten solujen esikäsittely vaikuttaa spesifisten miRNA:iden rikastumiseen. Voimakkain modulaatio havaittiin gestaatiovaiheiden välillä, jolloin lähes kaikki moduloidut miRNA:t rikastuivat f-hAFS-EV:illä perinataalisen vastineen yli (kuva 9A ja taulukko 1). Hypoksisella esikäsittelyllä oli lievempi vaikutus miRNA-lastiin, kun taas tässä vertailussa modulaatio tapahtui kumpaankin suuntaan, ja osa miRNA:sta oli rikastunut hypoksisissa ja toisissa normoksisissa kontrolliolosuhteissa (kuva 9A).

Täydentävänä analyysinä keskityimme tutkittujen miRNA:iden tunnistamiseen, joilla on pienin vaihtelu eri luovuttajien välillä, ja viljelmän esikäsittelyyn molemmista tutkituista raskausvaiheista peräisin oleville EV:ille. Tästä analyysistä saadut miRNA:t ulottuivat korkeista alhaisiin ilmentymistasoihin (kuvio 9B). hAFS-EV:n lastin vakaimmasta miRNA-ytimestä tunnistettiin yhteistä miRNA:ta f-hAFS-EV:n ja p-hAFS-EV:n välillä (miR-21-5p, miR-29a-3 p, miR-16-5p korkealla tasolla; miR-221-3p,miR-221-5p ja miR-22-3p himmeällä tasolla, taulukko 2).

Kuva 9. Analyysi sikiön ja perinataalisen hAFS-EV:iden miRNA:iden erilaisesta rikastumisesta. (A) Tulivuorikaaviot hAFS-EV-miRNA-lastin differentiaalista rikastamista varten gestaatiovaiheen (vasen paneeli) ja erittävien solujen hypoksisen esikäsittelyn mukaan (oikea paneeli). Katso miRNA-tiedot taulukosta 1. (B) Sikiön hAFS-EV:iden (vasen paneeli) ja perinataalisen hAFS-EV:n (oikea paneeli) stabiilien miRNA:iden vaihtelevuuden (X-akseli) ja rikastumistason (Y-akseli) välisen korrelaation sirontakaavio korkean (keltaiset pisteet) mukaan, himmeä (vihreät pisteet) ja alhainen (tumman violetti pisteet) rikastus. Katso miRNA:n yksityiskohdat taulukosta 2. RPM: lukemia miljoonaa kohti.

3. Keskustelu

Jäljelle jääneet poistetut näytteet ihmisen lapsivedestä on tunnistettu arvokkaaksi stroomasolujen lähteeksi, jolla on lupaavia mahdollisuuksia regeneratiivisessa lääketieteessä ja kudostekniikassa. Heidän eristämiseen liittyvät eettiset huolenaiheet ovat minimaaliset, koska ne voidaan saada joko rutiininomaisesta synnytystä edeltävästä lapsivesitutkimuksesta jääneistä näytteistä, raskauden toisen kolmanneksen aikana (sikiön hAFS) tai lapsivedestä, joka on hylätty kliiniseksi jätteeksi kolmannen kolmanneksen suunnitellussa C-osassa. Viime vuosina hAFS:ää on ehdotettu mahdolliseksi terapeuttiseksi lääkkeeksi ihmisen kudosten korjaamiseen ja regeneraatioon, kun otetaan huomioon kokeellisista sairausmalleista saadut rohkaisevat todisteet. Mielenkiintoista on, että niitä on ehdotettu myös sikiön ja vastasyntyneen neurologisten sairauksien in utero-hoitoon; Itse asiassa prekliiniset tutkimukset ehdottivat, että hAFS, joka annettiin synnytystä sikiönsisäisen synnytyksen kautta, suojasi selkäydintä raskauden aikana parakriinisen aktiivisuuden kautta myelomeningosele-rottamallissa [56-58] ja vähensi paljastuneen suolen vaurioita kokeellisessa jyrsijän gastroskiisissä[59]. ]. Translaationäkökulmasta katsottuna hAFS:n kohdunsisäinen transplantaatio voitaisiin korvata niiden eritysaineen sopivimman valmisteen (hAFS-CM tai hAFS-EV:t) antamisella.cistanche deserticolan sivuvaikutuksetTämä strategia mahdollistaisi nopean ja oikea-aikaisen intervention tiineyden aikana ylittämällä kanonisen soluterapian rajoitukset (eli aikaa vievän solujen in vitro -laajenemisen) ja tarjoamalla samalla valmiita ja käyttövalmiita farmaseuttisia formulaatioita.

Vähemmän invasiivisten prenataalisten diagnostisten tekniikoiden viimeaikainen kehitys saattaa johtaa lapsivesitutkimuksen vähenemiseen lähitulevaisuudessa, mikä suosii perinataalista hAFS:aa helpommin saavutettavissa olevana vaihtoehtona. Siitä huolimatta, koska sikiön hAFS:t ovat kehittymättömämpiä, niillä voi olla tehokkaampi parakriininen potentiaali. Tässä skenaariossa vertailimme tässä sikiön ja perinataalisen c-KITt hAFS:ää ja keskityimme niiden eritysfraktioiden profilointiin. Korostimme asiaankuuluvia eroja, jotka on otettava huomioon niiden parakriinisen kapasiteetin mahdollisessa kliinisessä translaatiossa.

Yhdessä aikaisempien riippumattomien tutkimusten kanssa osoitamme, että gestaatiovaihe ei vaikuttanut heterogeeniseen hAFS-morfologiaan ja niiden mesenkymaaliseen antigeeniprofiiliin [25,26]. Arvioimme sitten parametreja, jotka todennäköisemmin vaikuttavat solujen erittymiseen ja parakriiniseen aktiivisuuteen kanonisen stroomaalisen immunofenotyypin lisäksi. Erityisesti CD146-positiivisen, CD107a-pitoisuudeltaan korkean alapopulaation läsnäolon luuytimen mesenkymaalisissa progenitoreissa on äskettäin osoitettu korreloivan huomattavan moduloivan ja terapeuttisen parakriinisen aktiivisuuden kanssa [47]. Täällä paljastimme, että sekä sikiön että perinataalisen hAFS:lle on vahvasti tunnusomaista tämä molekyylinen allekirjoitus, joka tukee niiden eritystehoa merkityksellisillä translaatiovaikutuksilla. Lisäksi sikiön hAFS:ille oli ominaista tehoton aerobinen aineenvaihdunta, kun taas kypsemmät perinataaliset osoittivat korkeampaa hapenkulutusta ja ATP-synteesiä. Tämä saattaa viitata toisen raskauskolmanneksen hAFS:n kehittymättömämpään metaboliseen profiiliin, joka muistuttaa keskosten napanuoran stroomasoluja, jotka ovat osoittaneet samaa suuntausta [60].

Parakriinipotentiaalin laukaisemiseksi hAFS:t altistettiin 24 tunnin seerumittomalle hypoksiselle esikäsittelylle, strategialle, jonka olemme aiemmin menestyksekkäästi kehittäneet [34, 35, 37] sikiön soluille ja jota tutkimme täällä ensimmäistä kertaa niiden perinataalista vastinetta varten. Sikiön ja perinataalisen hAFS:n esikäsittely hypoksian alla johti positiiviseen trendiin niiden erityspitoisuuden ja vapautuvien EV:n määrän kasvussa, kun taas raskausvaihe ei vaikuttanut solun erityssatoon eikä EV:n morfologiaan ja kokojakaumaan.

Erityisesti hAFS-parakriinin lastin karakterisointi paljasti joitain erityisiä eroja arvioimiemme eri olosuhteiden mukaan. Sikiön hAFS-erityksen proteominen profilointi paljasti havaittavissa olevia tekijäjakaumia, jotka perustuvat gestaatiovaiheeseen ja solun hypoksiseen esikäsittelyyn. Tämä osoittaa, että hAFS:n parakriininen potentiaali voi saada selkeän identiteetin kypsymisen aikana Ⅱ - Ⅲ raskauskolmanneksen aikana, jota puolestaan ​​voidaan moduloida stimuloimalla erittäviä soluja in vitro. hAFS-CM:n ja hAFS-EV:n biologisten prosessien rikastusanalyysi viittasi siihen, että useimmat moduloidut proteiinit voivat olla yhtä mieltä solujen kasvun/ylläpidon ja proteiinien aineenvaihdunnan kanssa, mikä tukee soluille toistaiseksi raportoituja hyödyllisiä parakriinisiä vaikutuksia. Erityisesti hypoksisen sikiön hAFS-kokonaiserityksen havaittiin rikastuneen lämpösokkiproteiinilla HSPD1 (HSP60), jonka osoitettiin tukevan haavan paranemista diabeettisen hiiren ihovauriomallissa ja edistävän makrofagien pro-resolventumista vääristyvän M2-fenotyyppiin [61]. . Samoin hypoksiset sikiön hAFS-EV:t rikastuivat neurogeneesiä edistävillä tekijöillä (HSPG2[62], solujen itsensä uusiutumista sekä aivojen ja sydän- ja verisuonijärjestelmän kehitystä (LAMA5[63] ja LAMB1[64] ja migraatiota (THBS1 [2]).) Proteoglykaani AGRN löydettiin myös sähköautoista sikiön hAFS:n hypoksisen esikäsittelyn jälkeen.cistanche annostus redditHavaintomme ovat linjassa aiempien todisteiden kanssa siitä, että AGRN on lisääntynyt mesenkymaalisten stroomasolujen proteomissa tulehduksellisten ja hypoksisten ohjaavien ärsykkeiden vaikutuksesta[65]. AGRN:n on myös osoitettu osallistuvan immuunisynapsin signalointiin [66] ja vastaavan vastasyntyneen hiiren sydämen regeneraatioon [67], mikä tukee kehittyvästi nuoren sikiön hAFS:n voimakasta taipumusta regeneratiivisiin parakriinisiin vaikutuksiin. Lisäksi sikiön hAFS:n vahvistettiin reagoivan paremmin hypoksiseen esikäsittelyyn, mikä osoitti verisuonten regeneratiivisen tehokkuuden ennustajien, kuten ANGIOGENIN, EMMPRIM, IL-8 ja MCP-1 sytokiinin[68] rikastuminen. heidän ehdolliseen väliaineeseensa. Tämä tukee aikaisempia todisteita sikiön hAFS-CM:n parakriinisesta tehosta endogeenisen neoarteriogeneesin tehostamisessa sydäninfarktin, takaraajan iskemian ja iskeemisen fasciokutaanisen läpän prekliinisissä jyrsijämalleissa [34,69-71]Lisäksi sikiön hAFS Kokonaiserityksen havaittiin olevan huomattavasti rikastettua IGFBP2:lla ja OPN:llä perinataaliseen verrattuna, mikä viittaa selvempään ratkaisevaa ja ikääntymistä estävään moduloivaan profiiliin[72-75]. Vaikka perinataalinen have-CM oli vähemmän parakriiniset tekijät lisääntynyt, sitä täydennettiin samalla tavalla neurotrofisilla ja immunomodulatorisilla tekijöillä, kuten CST3[76,77] ja MIF[78].

Verrattuna kokonais-hAFS-CM:ään, vastaavat hypoksiset sikiön ja perinataalisen EV-vastaavat osoittivat alhaisempaa sytokiinien ja kemokiinien ilmentymistä lukuun ottamatta verisuonten uudelleenmuotoilun välittäjää EMMPRIN [79], joka oli enimmäkseen rikastunut vesikkeliosastossa. Aiemmin raportoitu sikiön hAFS-EV:iden kardioaktiivinen ja pro-regeneratiivinen profiili[34,37] on vahvistettu tässä todisteilla niiden yksinomaisesta sydäntä suojaavan IL-8 [80] ja GDF-15 ilmentymisestä. keskeinen parakriininen tekijä, joka laukaisee endogeenisen aikuisen hippokampuksen neurogeneesin[81,82] sekä ehkäisee antrasykliinin aiheuttamaa kardiotoksisuutta [78]. Sekä sikiö- että perinataaliset hAFS-EV:t osoittivat samankaltaista ekspressiota progenitori-/kantasolukaupan säätelijälle SDF-1 [83-85]. Proteominen analyysi raportoi angiogeneesiin liittyvien proteiinien, kuten NRP1 [86] ja MP14[87] lisääntyneen ilmentymisen hypoksisissa perinataalisissa hAFS-EV:issä; tällainen stimuloiva profiili voi selittää aiemmat tulokset Ⅲ raskauskolmanneksen hAFS:n endoteelin regeneratiivisista ominaisuuksista luurankolihasten iskeemisen vaurion prekliinisessä hiirimallissa [25] huolimatta siitä, että niiden hAFS-CM on vähemmän pro-angiogeeninen kuin vastaava sikiö. Erityisesti hermoston kasvutekijä BDNF löytyi sekä sikiön että perinataalisen EV-lastista, vaikkakin pieniä määriä, mikä viittaa oletettuun neurotrofiseen aktiivisuuteen hAFS-EV:ille hermosolujen selviytymisessä ja hermoston kehitysprosesseissa, kuten havaittiin myös ihmisen luun erittämissä solunulkoisissa rakkuloissa. luuydin- ja napanuoraveri-MSC[8889]. Molemmat eritysformulaatiot sikiön ja perinataalisen hAFS:n hypoksisesta stimulaatiosta osoittivat olevan rikastettu PAI:lla-1, endoteelin aktivoitumisen edistäjällä [90], joka on myös osallistunut M2-makrofagien polarisaatioon sydämessä ja jolla on sydäntä suojaava vaikutus. ja anti-fibroottinen potentiaali [91].

MikroRNA:ita (miRNA:ita) on käsitelty laajasti kantasolujen ja mesenkymaalisten stroomasolujen EV-parakriinisen aktiivisuuden säätelijöinä [92,93]. Täällä havaitsimme, että 15 eniten rikastettua miRNA-lajia hAFS-EV:issä kattavat yli 60 prosenttia kunkin näytteen miRNA-kokonaispitoisuudesta. Näiden miRNA:iden on raportoitu luonnehtivan mesenkymaalisten stroomasolujen EV:iden molekyylilastia (olkoon -7b-5p, anna-7f-5p, miR-21-5p ja miR-155-5p [96,97]), mainostaa haavan paraneminen säätelemällä keratinosyyttien toimintaa (miR-16-5p [98]) ja ehkäisemällä hermosolujen kuolemaa etuaivojen iskemian jälkeen (miR-29a-3p [99,100]). Toisaalta noin 1000 miRNA:ta löydettiin jäljellä olevista 30 prosentista vesikulaarisen miRNA:n sisällöstä. Tällainen epätasapainoinen jakautuminen on yhdenmukainen aiempien tutkimusten kanssa [4] ja korostaa enimmäkseen rikastettujen miRNA:iden oletettuja olevan vastuussa hAFS-EV:iden pääasiallisesta biologisesta aktiivisuudesta. Mielenkiintoista on, että sikiö- ja perinataaliset hAFS-EV:t jakoivat suurimman osan 15 miRNA:sta. Huomioimme myös, että sekä sikiön hAFS-EV:t että perinataaliset sisälsivät joukon erittäin vakaita miRNA:ita eri rikastustasoilla. Tällaiset todisteet voivat ehdottaa laajaa valikoimaa "kodinhoitoehdokkaita" käytettäväksi sisäisenä vertailukontrollina qPCR-kokeissa hAFS-EV:illä. Lisäksi tällaisten stabiilien miRNA:iden johdonmukainen osajoukko (miR-16-5p,miR-21-5p,miR-22-3p,miR-29a-3p,miR{ {40}}y miR-221-5p) on jaettu kahden raskausvaiheen välillä ja se on päällekkäinen 15 enimmäkseen rikastetun vaiheen kanssa, mikä viittaa vieläkin tasaisempaan käyttäytymiseen ja luotettavaan esiselvittävään molekyylitunnisteeseen ([96,{{45 }}]). On huomionarvoista, että pari ehdokasta tällaisessa erottuvassa ytimessä on äskettäin raportoitu referenssimiRNA:iksi neuroprotektiivisissa EV:issä, jotka on saatu toisen raskauskolmanneksen lapsivesiperäisistä mesenkymaalisista stroomasoluista (miR-29a-3p ja miR{{ 49}}s. [95]). Siitä huolimatta huomasimme myös, että raskausikä voi moduloida miRNA-lastia enemmän kuin hypoksinen esihoito. Kolmannen kolmanneksen sikiön hAFS:sta saadut nuoremmat EV:t rikastettiin miRNA:illa, joiden on aiemmin osoitettu tukevan alkion kantasolujen elinkykyä (miR{51}}p [101]), solujen lisääntymistä ja luuytimen stroomasolujen osteogeenista erilaistumista (miR). -217 [102]), mutta sisältää myös kasvainsuppressoripotentiaalin (miR-302-3p[103,104]);miR-383-5p[105,106]).

Tulostemme perusteella vahvistamme tässä, että sikiön ja perinataalisen hAFS voi edustaa houkuttelevia parakriinisiä lähteitä, joita voidaan hyödyntää regeneratiivisessa lääketieteessä. Vaikka niiden fenotyyppi ja eritysaktiivisuus olivat samankaltaisia, olemme korostaneet joitain erityisiä näkökohtia niiden eritysformulaatioissa hyödyllisinä oivalluksina niiden tulevaa terapeuttista translaatiota varten.

4. Materiaalit ja menetelmät

4.1.Ihmisen amniotic nesteen kantasolujen eristäminen ja in vitro -viljely

Ihmisen lapsivesien kantasolut (hAFS) eristettiin jäljellä olevista lapsivesinäytteistä (AF), jotka kerättiin rutiininomaisella prenataalisella seulonnalla Ⅱ raskauskolmanneksen lapsivesitutkimuksella (sikiön hAFS, f-hAFS) tai kliiniseksi jätteeksi suunnitellun keisarinleikkauksen aikana Ⅲ kolmanneksen aikana. (perinataalinen hAFS,p-hAFS) Prenatal Diagnosis and Perinatal Medicine Unit, IRCCS San Martino Hospital, IRCCS Istituto Gaslini Hospital (Genova, Italia) sikiön ja perinataalin lääketieteellisen ja kirurgian yksikössä ja ihmisgenetiikan laboratoriossa. Kaikilta luovuttajilta hankittiin tietoinen kirjallinen suostumus paikallisen eettisen toimikunnan valtuutuksen (protokolla PR428REG2015) ja Helsingin julistuksen ohjeiden mukaisesti. Toisen raskauskolmanneksen sikiön AF-näytteet otettiin naisluovuttajilta, joiden keski-ikä oli noin 37,42±0,32 vuotta (n=15 vaihtelee 36-jopa 41-vuotiaisiin);Ⅲ kolmanneksen perinataaliset AF-näytteet saatiin naisluovuttajat, joiden keski-ikä on 34,25±1,31 vuotta (n=10 vaihtelee välillä 26- - 42 vuotta). Sikiön ja perinataaliset hAFS:t saatiin näytteistä, jotka oli validoitu normaalille karyotyypille ja eristettiin immunomagneettisella lajittelulla c-KIT-ilmentymistä varten (CD117 MicroBead Kit, Miltenyi Biotechnology, Bologna, Italia) kiinnittyneistä AF:n mesenkymaalisista stroomasoluista[16].cistanche-uutteen edutc-KIT* hAFS:a viljeltiin Minimal Essential Medium (MEM)-alphassa, jossa oli 15 prosenttia FBS:ää (Fetal Bovine Serum, Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italia), 18 prosenttia Chang B:tä ja 2 prosenttia Chang C Mediumia (Irvine Scientific). , Santa Ana, Kalifornia, USA) 1 prosentilla L-glutamiinia ja 1 prosentilla penisilliiniä/streptomysiiniä (Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italia), inkubaattorissa 37 asteessa 5 prosentin CO2:n ja 20 prosentin Oz-ilmakehässä ja viljellään. 5 siirrostukseen in vitro ennen kuin niitä käytettiin niiden erittämiseen.

4.2.hAFS-aineenvaihdunnan biokemiallinen arviointi

Cell aerobic metabolism was evaluated in terms of oxygen consumption and ATP synthesis through the FI-Fo ATP synthase. Oxygen consumption rate (OCR) was measured at 37 ℃ in a closed chamber magnetically stirred using an amperometric electrode (Unisense-Microrespiration, Unisense A/S, Denmark). One hundred thousand (10>) -soluja käytettiin jokaisessa kokeessa. Perushengityksen arvioimiseksi hAFS:t permeabilisoitiin 0,03 mg/ml digitoniinilla 10 minuutin ajan ja suspendoitiin fosfaattipuskurisuolaliuokseen (PBS). -tapoja, jotka koostuvat komplekseista I, II ja IV tai komplekseista Ⅱ ja IV, vastaavasti [60].

Glutamiinin, pitkäketjuisten rasvahappojen hapettumisen ja glukoosin suhteellisen vaikutuksen arvioimiseksi digitoniinin läpäisyn jälkeen solut suspendoitiin kasvatusalustaan ​​ja 4 uM BPTES:iin, 4 uM etomoksiriin ja 4 uM UK5:een{{22} }99 lisättiin estämään glutaminaasia, karnitiinipalmitoyylitransferaasia 1A (CPT1A) tai mitokondriaalista pyruvaattikantajaa (MPC). Fi-F.ATP-syntaasi (ATP-syntaasi) aktiivisuus havaittiin mittaamalla ATP:n tuotanto erittäin herkällä lusiferiini/lusiferaasimenetelmällä. Määritykset suoritettiin 37 asteessa 2 minuutin ajan, ja tiedot kerättiin 3 0 sekunnin välein. Ensimmäisessä koesarjassa 10 asteen soluja inkuboitiin 10 minuutin ajan alustassa, joka sisälsi 50 mM KCl, 1 mMEGTA, 2 m MEDTA, 5 mMKH2PO4, 2 mMMgC12, 0,6 mMouabain, 1 mM P1P5-Di. (adenosiini-5')pentafosfaatti, 0,040 mg/ml ampisilliinia ja 10 mM Tris-HCl pH 7,4. Myöhemmin ATP-synteesi indusoitiin lisäämällä hengityssubstraatteja (10 mM pyruvaattia plus 5 mM malaattia tai 20 mM sukkinaattia) ja 0,1 mM ADP:tä. Reaktio mitattiin käyttämällä lusiferiini/lusiferaasi ATP-bioluminesenssimäärityssarjaa CLSII (Roche, Basel, Sveitsi) luminometrissä (GloMax 20/20 Luminometer, Promega, Milano, Italia) ATP-standardiliuoksissa (Roche, Basel, Sveitsi) välillä {{ Kalibrointiin käytettiin 42}}/M. Toisessa koesarjassa ATP-synteesi arvioitiin 4 uM BPTES:n, 4 uM etomoxirin tai 4 uM UK5099:n läsnä ollessa. Tässä tapauksessa 10 solua inkuboitiin 10 minuuttia kasvualustassa ilman tai läsnä ollessa. aineenvaihdunnan estäjä, ja ATP-synteesi indusoitiin 0,1 mM ADP:llä. OxPhos (oksidatiivisen fosforylaation) tehokkuus (P/O-suhde) laskettiin suhteeksi tuotetun ATP:n pitoisuuden ja kulutetun hapen määrän välillä hengityssubstraatin ja ADP:n läsnä ollessa. Kun hapenkulutus on kokonaan omistettu energiantuotantoon, P/O-suhteen tulisi olla noin 2,5 ja 1,5 pyruvaatin ja malaatin tai sukkinaatin lisäyksen jälkeen. [48]Anaerobisen glykolyysin vaikutuksen hAFS-aineenvaihduntaan arvioimiseksi arvioitiin glukoosi- ja laktaattipitoisuudet. kasvualustassa. Glukoosin kulutus arvioitiin heksokinaasin (HK) ja glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasin (G6PD) kytkentäjärjestelmällä NADP:n pelkistyksen jälkeen 340 nm:ssä. Määrityselatusaine sisälsi 100 mM Tris-HCl:a, pH 7,4, 2 mM ATP:tä, 10 mMNADP:tä, 2 mMMgC12:ta, 2 IU heksokinaasia ja 2 IU glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasia. Laktaatin vapautuminen määritettiin NAD plus:n vähentämisen jälkeen 340 nm:ssä. Määrityselatusaine sisälsi 100 mM Tris-HCl:a (pH8), 5 mM NAD plus:a ja 1 IU/ml laktaattidehydrogenaasia. Näytteet analysoitiin ennen 4 ug:n puhdistettua laktaattidehydrogenaasia lisäämistä ja sen jälkeen. Molemmissa tapauksissa tiedot normalisoitiin solujen lukumäärään ja ilmaistiin vastaavasti mM glukoosia / 10 asteen soluja tai mM laktaattia / 10 asteen soluja, vastaavasti [107].

4.3. Virtaussytometria hAFS:n karakterisointi

Satatuhatta (105) sikiö- ja p-hAFS-solua irrotettiin ja inkuboitiin hiiren anti-ihmis-CD107a-Alexa Fluor 647-- ja anti-ihmis-CD146-FITC- konjugoidut vasta-aineet (eBioscience, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italia). Solujen apoptoosi arvioitiin käyttämällä FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit -sarjaa (BD Pharmingen, Becton Dickinson, Mi-lan, Italia) noudattaen valmistajan ohjeita. Tapahtumat hankittiin BD Bioscience FACS Aria II -lajittelijalla ja -analysaattorilla, joka oli varustettu FACS Diva -ohjelmistolla (BD Bioscience, Bec-ton Dickinson, Milano, Italia). Tiedot analysoitiin FlowJo V9.0 -ohjelmistolla (BD Bioscience, Becton Dickinson, Milano). , Italia). 4.4. Vanhenemisvärjäys

5. vaiheeseen asti viljellyn hAFS:n vanhenemisfenotyyppiä arvioitiin tavanomaisissa in vitro -olosuhteissa Senescence-Galactosidase Staining Kit -sarjalla (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA): f-hand p-hAFS kiinnitettiin 1x Fixative-liuoksella 70 prosentissa. konfluenssi ja värjätty SA- -gal 37 asteessa yön yli valmistajan ohjeiden mukaisesti. Vanhenevat tapahtumat mitattiin Leica DMil -mikroskoopilla (varustettu Leica Acquire -ohjelmistolla V3.4.4, Leica Microsystems, Milano, Italia) ja arvioitiin SA- -gal-positiivisten solujen prosenttiosuutena solujen kokonaismäärästä kenttää kohti.

4.5. HAFS-eritysfraktioiden erottaminen ja väkevöinti

f-hAFS:ää ja p-hAFS:ää viljeltiin 24 tuntia seerumivapaassa alustassa (SF) 1 prosentin 02-hypoksiassa versus 20 prosentin 02-normoksia (kontrolli), joista jälkimmäistä käytettiin perustason referenssinä. Tätä esikäsittelystrategiaa käytettiin lisäämään bioaktiivisten parakriinisten tekijöiden vapautumista, kuten olemme aiemmin raportoineet [34, 35, 37, 49]. hAFS:ia viljeltiin 24 tuntia seerumittomassa (SF) alustassa (korkean glukoosin sisältävä Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM, jossa oli 1 % L-glutamiinia ja 1 % penisilliiniä/streptomysiiniä, kaikki yhtiöltä Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italia), normoksissa. (20 prosenttia O2 ja 5 prosenttia CO2 37 asteessa) tai hypoksiset (1 prosentti O2 ja 5 prosenttia CO2 37 asteessa CellXpert C170i- ja Galaxy 48R CO2 -hautomoissa, Eppendorf, Milano, Italia) olosuhteissa.

f-hAFS-CM ja p-hAFS-CM kerättiin ja sentrifugoitiin 4 asteessa nopeudella 300 x g 10 minuuttia ja 2000 x g 20 minuuttia solujätteen poistamiseksi; hAFS-CM konsentroitiin käyttämällä ultrasuodatuskalvoja 3 kDa:n selektiivisellä raja-arvolla (Amicon Ultra-15, Merck Millipore Darmstadt, Saksa) 4 asteessa 3000 × g:ssa 90 minuutin ajan ja sitten väkevöitiin edelleen 4 °C:ssa. astetta 3000× g 30 minuutin ajan. hAFS-EV:t erotettiin ja konsentroitiin sarja-ultrasentrifugoinnilla hAFS-CM:stä. Lyhyesti sanottuna hAFS-CM kerättiin ja sentrifugoitiin 4 asteessa 300 x g:ssä 10 minuuttia ja 2000 x g:ssä 20 minuutin ajan solujätteen poistamiseksi. Supernatanttia käsiteltiin sitten 10 000 x g:ssä 40 minuutin ajan. Pelletti heitettiin pois ja supernatanttia käsiteltiin edelleen ultrasentrifugoimalla Optima L-90K:ssa (Beckmann Coulter, Milano, Italia) nopeudella 10 000 × g 120 minuuttia käyttämällä Beckman Coulterin kääntökauhaisia ​​SW55Ti-sentrifugiroottoreita. Heterogeenisiä hAFS-EV:itä sisältävä pelletti pestiin PBS:ssä ja lopuksi sentrifugoitiin 100 000 x g:ssä 120 minuutin ajan ja sitten suspendoitiin uudelleen PBS:ään, joka oli suodatettu 0,22 um:n huokossuodatinkalvolla. Proteiinipitoisuudet hAFS-CM:ssä ja hAFS-EV:iden pinnalla mitattiin käyttämällä BiCinchoninic Acid (BCA) -määritystä (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italia). Näytteet hankittiin Gen5-mikrolevylukijalla 570 nm:ssä hAFS-CM:n ja hAFS-EV:n saannon arvioimiseksi ug:na liuosta/10 astetta tuottavia soluja.

4.6. hAFS-EV:ien karakterisointi transmissioelektronimikroskoopilla ja nanohiukkasten seurantaanalyysillä

Transmissioelektronimikroskoopin (TEM) analyysi suoritettiin Hitachi TEM -mikroskoopilla (HT7800-sarja, Hitachi High Technologies, Monza, Italia). Digitaaliset kuvat otettiin Mega view 3 -kameralla ja Radius-ohjelmistolla (EMSIS, Muenster, Saksa). f-hAFS ja p-hAFS kiinnitettiin 3,7-prosenttiseen paraformaldehydi (PA)-liuokseen, joka oli laimennettu 1:1 hAFS-täydellisellä alustalla, pestiin 0,1 M kakodylaattipuskurilla ja inkuboitiin sitten välittömästi 1 tunnin ajan huoneenlämmössä 0,1 M kakodylaattipuskuri, joka sisältää 2,5 prosenttia glutaraldehydiä (Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA). Solupellettejä jälkikiinnitettiin osmiumtetroksidissa 1 tunnin ajan ja 1-prosenttisessa uranyyliasetaattiliuoksessa 1 tunnin ajan. Näytteitä kuivattiin 24 tuntia 42 asteessa ja 48 tuntia 60 asteessa asteitetun etanolisarjan läpi ja upotettiin epoksihartsiin (Poly-Bed; Polysciences Europe GmbH, Minneapolis, Saksa). Ultraohuet leikkeet (50 nm) leikattiin Leica Ultracut -mikrotomilla (Leica Microsystems, Milano, Italia) ja vastavärjättiin 5-prosenttisella uranyyliasetaatilla 50-prosenttisessa etanoliliuoksessa. f-hAFS-EV:t ja p-hAFS-EV:t suspendoitiin uudelleen 20 ul:aan PBS-liuosta ja kiinnitettiin lisäämällä yhtä suuri tilavuus 2 % paraformaldehydiä 0,1 M fosfaattipuskuriliuoksessa (pH 7,4). EV:t adsorboitiin sitten 10 minuutiksi formvar-hiilellä päällystettyihin kupariritiloihin kelluttamalla ristikot 5 μl:n pisaroilla parafilmillä. Tämän jälkeen ristikot, joissa oli kiinnittyneitä EV:itä, huuhdeltiin PBS:ssä ja värjättiin negatiivisesti 2-prosenttisella uranyyliasetaattiliuoksella 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Värjättyt ristikot upotettiin 2,5-prosenttiseen metyyliselluloosaan säilyvyyden parantamiseksi ja ilmakuivattiin ennen tutkimusta. hAFS-EV:iden morfometria-analyysi mitattiin 10 satunnaisesti otetulla mikrokuvalla 40000× g suurennuksella. Koko laskettiin käyttämällä mielivaltaista viivafunktiota, joka oli upotettu Radius-ohjelmiston (EMSIS, Muenster Saksa) mittausvalintaikkunaan. HAFS-EV:n kokojakauman visualisoimiseksi tulokset piirrettiin sirontapistekaaviona ja taajuusjakaumana, jossa jokainen koko on esitetty pisteenä sekä mediaaniarvon ja alueen viivojen kanssa.

f-hAFS-EV:t ja p-hAFS-EV:t analysoitiin myös nanopartikkelien seurantaanalyysillä (NTA) 10 asteen solujen vapauttamien hiukkasten arvioimiseksi. hAFS-EV:t laimennettiin 1:100 PBS-liuoksella ja hankittiin NanoSight LM10:llä (Malvern Instruments, Malvern, UK), joka tallensi vähintään 3 erilaista 60 s:n kuvaa. Jokaisesta näytteestä analysoitiin kolme erilaista hankintaa käyttämällä ohjelmiston Batch Process -vaihtoehtoa. 4.7. LC-MS/MS-analyysi hAFS-CM:stä ja hAFS-EV:stä 4.7.1. In-Solution Digestion

Proteominen analyysi suoritettiin kolmelle hAFS-CM:n ja hAFS:n biologiselle kopiolle. EV:t f-hAFS:stä ja p-hAFS:stä normoksisen tai hypoksisen esikäsittelyn jälkeen (n=24 eri olosuhteita).hAFS-CM- ja hAFS-EVs-näytteet suspendoitiin 0.1 M NHCO3:een pH 7,9 ja käsiteltiin RapigestIM:llä SF-reagenssi (Waters Co, Milford, MA, USA) lopullisella konsentraatiolla 0,25 prosenttia (w/v). Tuloksena saatuja suspensioita inkuboitiin samalla sekoittaen 100 asteessa 2{{40}} minuuttia. Digestointi suoritettiin jokaiselle näytteelle lisäämällä sekvensointiluokan modifioitua trypsiiniä (Promega Inc, Madison, WI, USA) entsyymi/substraatti-suhteessa 1:50 (w/w) yön yli 37 asteessa 0,1 M NH4HC03:ssa pH 7,9 Puskuri, jossa oli 10 % CHSCN:ää. Lisäerä trypsiiniä (1:100 w/w) lisättiin aamulla, ja pilkkomista jatkettiin 4 tuntia. Lisäksi 0,5 prosentin trifluorietikkahapon (TFA) lisääminen Gigma-Aldrich Inc., St Louis, MO, USA) pysäytti entsymaattisen reaktion, ja myöhempi inkubaatio 37 asteessa 45 minuutin ajan saattoi päätökseen RapiGest-happohydrolyysin[108]. Veteen sekoittumattomat hajoamistuotteet poistettiin sentrifugoimalla 13.000 rpm 10 minuutin ajan. Lopuksi tryptisestä digestioseoksista poistettiin suola käyttämällä PierceTM C-18-spinkolonneja (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italia) valmistajan ohjeiden mukaisesti ja suspendoitiin uudelleen 0,1-prosenttiseen muurahaishappoon (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA) vedessä (LC-MS Ultra CHROMASOLVTM, Honeywell Riedel-de HaenTM, Muskegon, MI, USA) pitoisuutena 0,1 ug/μl.

4.7.2. Nestekromatografia

Trypsiinillä hajotetut seokset analysoitiin alustalla, joka koostui nanonestekromatografiajärjestelmästä, Eksigent nanoLC-Ultra[2]2D Systemistä (Eksigent, osa AB SCIEX Dublin, Dublin, CA, USA), joka oli konfiguroitu trap-eluute-moodiin, yhdistettynä korkearesoluutioiseen massaspektrometriin. Lyhyesti sanottuna näytteet (injektoitu 0,8 ug) ladattiin ensin peptidiloukkuun (200 um × 500 um ChromXP C18- CL, 3 um, 120 A) ja pestiin isokraattisessa tilassa 0,1-prosenttisella muurahaishapolla vedessä 10 minuutin ajan virtauksella 3 µl/min. Kymmenenportin venttiilin automaattinen vaihto eluoi sitten jääneen seoksen nano-käänteisfaasikolonniin (75 um × 15 cm ChromXP C18-CL, 3 um, 120 A) eluentti B:n 150 minuutin gradientin kautta. (eluentti A, 0,1 % muurahaishappoa vedessä; eluentti B, 0,1 % muurahaishappoa asetonitriilissä) virtausnopeudella 300 nl/min. Tarkemmin, gradientti oli: alkaen 5-10 prosenttia Bin 3 min, 10-40 prosenttia Bin 130 min, 40-95 prosenttia Bin 10 min ja pito 95 prosentissa B 7 min. 4.7.3. Massaspektrometria

MS/MS-analyysit suoritettiin LTQ-OrbitrapXL-massaspektrometrillä (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italia), joka oli varustettu nanosumutusionilähteellä. Suihkutuskapillaarijännite asetettiin 1,7 kV:iin ja ioninsiirtokapillaarin lämpötila pidettiin 220 asteessa. Täydelliset MS-spektrit tallennettiin 400-1600 m/z-alueella positiivisen ionin tilassa, erotuskyvyllä 60 000 (täysleveys puolimaksimissa) ja pyyhkäisynopeudella 2 spektriä/s. Tätä vaihetta seurasi viisi matalaresoluutioista MS/MS-tapahtumaa, jotka generoitiin peräkkäin tiedoista riippuvaisella tavalla viidelle suurimmalle ionille, jotka valittiin täydestä MS-spektristä (35 prosentin törmäysenergialla), käyttämällä 0,5 minuutin dynaamista poissulkemista MS/MS-analyysi. Massaspektrometrin pyyhkäisytoimintoja ja korkean suorituskyvyn nestekromatografian liuotingradientteja ohjattiin Xcalibur-tietojärjestelmän versiolla 1.4 (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italia).

4.7.4.Proteominen tietojenkäsittely ja tiedonlouhinta

Kaikki tuotetut tiedot etsittiin Thermo Scientific Proteome Discoverer -ohjelmiston version 2.1 sisältämän Sequest HT -hakukoneen avulla. Kokeelliset MS/MS-spektrit korreloitiin tryptisten peptidisekvenssien kanssa vertaamalla teoreettisia massaspektrejä, jotka saatiin Uniprot Homo Sapiens -proteomitietokannan in silico -digestiolla (74600 merkintää), ladattiin 2. tammikuuta. 020 (www.uniprot.org, käytetty 10 2. maaliskuuta021. Peptidisekvenssien ja siihen liittyvien proteiinien tunnistamiseen käytettiin seuraavia kriteerejä: trypsiini entsyyminä, kolme puuttuvaa pilkkomista peptidiä kohti, massatoleranssit ±50 ppm prekursori-ioneille ja ±0,8 Da fragmentti-ioneille. Perkolaattorisolmua käytettiin kohde-syöttistrategian kanssa antamaan lopulliseksi väärän havaitsemisnopeudeksi (FDR) peptidispektrin vastaavuuden (PSM) tasolla 0,01 (tiukka) q-arvojen perusteella ottaen huomioon maksimi deltaCN 0,05 [109]. Vain peptidit, joiden peptidin vähimmäispituus on kuusi aminohappoa ja rank1, otettiin huomioon. Proteiinien ryhmittelyä ja tiukkoja parsimoniaperiaatteita sovellettiin. MS-tiedot on talletettu ProteomeXchange Consortium -konsortioon PRIDE [10]-kumppanin arkiston kautta (ftp://massive.ucsd.edu/MSV000087013/, kirjattu 10. maaliskuuta 2021). SEQUEST-algoritmista saadut 48 proteiinia kohdistettiin, normalisoitiin , ja tarraton verrattuna. Tähän tarkoitukseen käytettiin talon sisäistä algoritmia, nimittäin MAProMaa (multidimensional Algorithm Protein Map), jossa käytettiin keskimääräisiä peptidispektrin yhteensopivuutta (aPSM) [111,112], jotka vastaavat kaikkien proteiinille tunnistettujen spektrien keskiarvoa ja näin ollen. , sen suhteelliselle runsaudelle kussakin analysoidussa tilassa. Erilaisesti ilmentyneiden proteiinien valitsemiseksi alaryhmiä (sekä sikiön vs perinataali-hAFS-CM:lle että hAFS-EV:lle, ottaen huomioon myös hypoksinen solujen esikäsittelystimulaatio) verrattiin pareittain soveltamalla kynnysarvoja 0,4 ja 5 kahdelle MAProMalle. indeksit DAve (Differential Average) ja DCI (Differential Confidence Index). DAve, joka arvioi muutoksia proteiinin ilmentymisessä, määriteltiin muodossa (XY)/(X＋Y)/0,5, kun taas DCI, joka arvioi differentiaalisen ilmentymisen luotettavuuden, määriteltiin muodossa (X plus Y) × (XY)/2 X ja Y termit edustavat tietyn proteiinin PSM:ää kahdessa verratussa näytteessä. Lisäksi kustakin tutkitusta tilasta saaduille keskimääräisille proteiiniluetteloille suoritettiin lineaarinen erotteluanalyysi (LDA) ja proteiineille, joilla oli suurin F-suhde (suurempi tai yhtä suuri kuin 4,5) ja pienin p-arvo (pienempi tai yhtä suuri kuin 0,001) säilytettiin ja käsiteltiin hierarkkisella klusteroinnilla Wardin menetelmää ja Euklidisen etäisyysmetriikkaa käyttäen JMP 15.2 -ohjelmistolla. Tarkemmin sanottuna F-suhde edusti mallin keskineliötä jaettuna virheen keskineliöllä, kun taas p-arvo osoitti todennäköisyyttä saada F-arvo, joka on suurempi kuin laskettu, jos todellisuudessa väestöryhmän keskiarvojen välillä ei olisi eroa. 4.8 HAFS-CM:n ja have-EV:n sytokiini- ja kemokiiniprofilointi

f-hAFS:lla ja p-hAFS:lla hypoksisen esikäsittelyn jälkeen saatujen hAFS-CM:n ja have-EV:ien sytokiini- ja kemokiiniprofilointi arvioitiin Proteome ProfilerTM Human XL Cytokine Array -sarjan (R&D System, Minneapolis, MN, USA) avulla. valmistajan ohjeita. Käytettiin 20 ug hAFS-CM- ja hAFS-EVs-näytteitä. Kalvokuvat hankittiin Chemidoc Mini HD9 Autolla (Uvitec Cambridge, UK). Spesifinen sytokiini-/kemokiinipitoisuus arvioitiin kvantifioimalla kunkin havaittavan sytokiinin positiivinen pikseliintensiteetti (mielivaltaisen yksikön avulla) ImageJ-ohjelmistolla (saatavilla osoitteessa https: //imagej.nih.gov/ij/,käytetty 10. maaliskuuta 2021 [13]). 4.9.RNA:n erottaminen hAFS-EV:istä ja Next

Sukupolvien sekvensointi

RNA eristettiin f-hAFS-EV:istä ja p-have-EV:istä miRNeasy Micro Kitillä (Qiagen, Milano, Italia) valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA:n eheys ja kokojakauma arvioitiin käyttämällä Agilent Small RNA -kittiä, jossa oli pieni ei-koodaava RNA-siru, jotta voidaan arvioida pienten RNA:iden pitoisuus, jotka vaihtelivat välillä 6 - 150 nukleotidia (nt). Qubit microRNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italia) käytettiin mikro-RNA:iden (miRNA:iden) pitoisuuden määrittämiseen valmistajan ohjeiden mukaisesti. miRNA-sekvensointikirjastot valmistettiin ja monistettiin käyttämällä QIAseq miRNA Library -kittiä (Qiagen, Milano, Italia) käyttämällä 18,5 ng eristettyjä miRNA:ita syötteenä ja noudattaen valmistajan ohjeita. Kirjastot yhdistettiin TapeStationin (Agilent Technologies, Foster City, CA, USA) suorittaman laaduntarkastuksen ja kvantifioinnin jälkeen käyttäen Agilent High Sensitivity D1000 ScreenTapea. Yhdistettyjen kirjastojen laadunvalvonta arvioitiin reaaliaikaisella qPCR:llä "Sequencing Library qPCR Quantification" -oppaan (Illumina Inc, San Diego, CA, USA) mukaisesti ja sekvensoitiin Illumina NextSeq -alustalla käyttämällä High Output Hit v2.5:tä (75 sykliä) ( Illumina Inc, San Diego, CA, USA). Peruskutsu suoritettiin Illumina NextSeq500 -oletustyönkululla.

4.10. MiRNA-sekvensoinnin bioinformaattisten tietojen analyysi

Fastq-tiedostot käsiteltiin ensin leikkaamalla pois 3'-adapteri ja huonolaatuiset alustat Cutadaptilla [114]. Leikkaamisen jälkeen inserttisekvenssit ja UMI-sekvenssit tunnistettiin. Lukemat, joissa ei ollut sovitinsekvenssiä, lukemat, joissa oli alle 16 bp:n inserttisekvenssit, ja lukemat, joissa oli alle 10 bp:n UMI-sekvenssejä, hylättiin. Inserttisekvenssien merkitsemiseksi lukemat kohdistettiin GRCh38-ihmisen genomikokoonpanoon käyttämällä Bowtietä [15] Jokaiselle näytteelle laskettiin kaikki tietylle miRNA:lle osoitetut lukemat, ja niihin liittyvät UMI:t aggregoitiin yksilöllisten molekyylien laskemiseksi. Toissijainen analyysi suoritettiin mukautetuilla R-skripteillä, jotka olivat saatavilla kohtuullisesta pyynnöstä. Differentiaalinen rikastusanalyysi suoritettiin käyttämällä Limma [116] ja EdgeR Bioconductor -paketteja [117].

4.11. Tilastolliset analyysit

Tulokset esitetään vähintään kolmen (n{{0}}) riippumattoman kokeen keskiarvona ± sem. Vertailut tehtiin yksisuuntaisella ANOVA:lla, jota seurasi posthoc Tukeyn monivertailutesti tai Studentin t-testi. Analyysit suoritettiin käyttämällä Graph-Pad Prism versiota 8.0.2 (GraphPad Software, https://www.graphpad.com, käytetty 10. maaliskuuta 2021) tilastollisen merkitsevyyden asetuksella* p<0.05. for="" proteomics="" analysis,="" the="" distribution="" of="" proteins="" in="" the="" examined="" conditions,="" functional="" enrichment="" analysis,="" and="" comparison="" of="" data="" versus="" the="" vesiclepedia="" database="" (http:/microvesicles.org,="" accessed="" on="" 10="" march="" 2021)="" were="" achieved="" using="" funrich="" (version="" 3.1.3,http://www.funrich.org,accessed="" on="" 10="" march="" 2021[54]),="" that="" uses="" hypergeometric="" test="" and="" bonferroni="" for="" statistics="" and="" allows="" the="" graphical="" visualization="" of="" data="" with="" venn="" and="" bar="" charts="" [118].="" 5.="">

Yhteenvetona voidaan todeta, että sikiön ja perinataalisen hAFS:n todettiin fenotyyppisesti vastaavan vertailukelpoista eritystehoa ja EV-rikastumista koon ja jakautumisen suhteen; kuitenkin joitakin eroja niiden eritysprofiilissa voitaisiin arvostaa. Erityisesti sikiön hAFS:n kehityksen kannalta epäkypsä profiili voidaan koota yhteen niiden eritysformulaatioilla, joilla on selvempi pro-vaskulogeeninen, pro-regeneratiivinen ja nuorentava eritys. Perinataalinen hAFS säilyttää kuitenkin edelleen merkityksellisen parakriinisen profiilin endoteelisolujen migraatioon liittyvien tekijöiden ilmentymisen kautta, immuunimoduloivan, anti-inflammatorisen ja neurotrofisen potentiaalin kautta, joka on samanlainen kuin sikiön hAFS. Nämä havainnot voivat tarjota hyödyllisiä näkemyksiä, jotka tukevat vammoihin liittyvien ja tulehduksellisten/iskeemisten sairauksien tulevaa parakriinistä hoitoa. Siksi joko sikiön tai perinataalisen hAFS:n valinta ihanteellinen solulähteeksi tulisi arvioida ottaen huomioon erityinen kliininen skenaario.

Tämä artikkeli on poimittu Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms