Nykyään solujen vanhenemista pidetään lähes kaikentyyppisten lisääntyvien solujen yleisenä reaktiona

Ota yhteyttäoscar.xiao@wecistanche.comLisätietoja

AbstraktiKohdennettu vanhenevien solujen eliminointi, analyysi, on yksi ikääntymistä estävän hoidon ydintrendeistä. Sydänglykosidit osoittautuivat äskettäin laajakirjoisiksi senolyyttisiksi aineiksi. Täällä testasimme sydämen glykosidien senolyyttisiä ominaisuuksia ihmisen mesenkymaalisia kantasoluja (hMSC) vastaan. Sydänglykosideilla ei ollut senolyyttistä kykyä eri alkuperää olevia vanhenevia hMSC:itä kohtaan. Käyttämällä biologisia ja bioinformaattisia lähestymistapoja vertaamme vanhenemisen kehitystä "sydänglykosideille herkissä" A549:ssä ja "epäherkissä" hMSC: issä. Analyysin puuttumisen havaittiin välittävän tehokkaan kaliumin tuonnin ja lisääntyneen apoptoosin vastustuskyvyn vanhenevissa hMSC:issä. "Antiapoptoottisen puolustuksen" heikkeneminen altistaa hMSC:t analyysille. Paljastimme, että apoptoosiresistenssi, joka on aiemmin tunnistettu vanhenemisen yhteiseksi ominaispiirteeksi, ei itse asiassa ole vanhenevien solujen yleinen ominaisuus. Lisäksi vain apoptoosin proliinin vanhenevat solut ovat herkkiä sydämen glykosidi-indusoidulle analyysille. Siten voimme olettaa, että analyysin tehokkuus saattaa riippua siitä, tulevatko vanhenevat solut todella apoptoosin vastustuskykyisiksi verrattuna niiden lisääntyviin vastineisiin.

AvainsanatKantasolut. Senolyysi · Vanheneminen · Apoptoosi · Stressinkestävyys

KSL27

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja

Johdanto

Nykyään solujen vanhenemista pidetään lähes kaikentyyppisten lisääntyvien solujen, mukaan lukien syöpä- ja kantasolut, sekä joidenkin postmitoottisten solujen yleinen reaktio erilaisiin stressaaviin ärsykkeisiin [1-3]. Seuraavat solujen vanhenemistyypit voidaan erottaa indusoivan tekijän alkuperän mukaan: replikatiivinen (johtuen DNA-vauriosta lyhennetyissä telomeeripäissä), onkogeenin aiheuttama (vasteena onkogeenisen signaloinnin poikkeavaan aktivoitumiseen), stressin aiheuttama ( Oksidatiivisen stressin, lämpösokin, UV- ja y-säteilyn jne. aiheuttaman DNA-vaurion välittämä ja kemoterapian aiheuttama (aktivoituu syöpäsoluissa vasteena kemoterapeuttisille lääkkeille)[4-7]. Vanhenevien solujen ilmentämissä markkereissa on heterogeenisyyttä riippuen sekä solutyypistä että vanhenemisen indusoimiseen käytetystä loukkauksesta. Useimmille ikääntyville solutyypeille tyypillisiä yhteisiä piirteitä on kuitenkin useita. Olennainen ikääntymisen ominaisuus kaikenlaisille jakautuville soluille on peruuttamaton proliferaation menetys [8].cistanche tubulosa -uuteSolusyklin pysähtymisen peruuttamattomuutta säätelevät sykliiniriippuvaiset kinaasin (CDK) estäjät pl6 ja p21, ja sitä säätelee usein kasvainsuppressoriproteiini p53 [8,9]. Muita tärkeitä vanhenevien solujen ominaisuuksia ovat jatkuvan DNA-vauriovasteen aktivointi; solujen hypertrofia, joka usein syntyy heikentyneen ribosomaalisen biogeneesin ja proteiinisynteesin seurauksena; lysosomaalisen hajoamisen häiriöt ja muiden hajoamisjärjestelmien toimintahäiriöt; spesifisen lysosomaalisen entsyymin vanhenemiseen liittyvän - -galaktosidaasin aktiivisuuden lisääntyminen; erilaiset mitokondrioiden muutokset; ikääntymiseen liittyvän sekretorisen fenotyypin (SASP) hankkiminen, joka koostuu tulehdusta edistävistä tekijöistä, matriisia hajottavista entsyymeistä, reaktiivisista happilajeista jne.; epigeneettiset ja kromatiinimaiseman muutokset, mukaan lukien vanhenemiseen liittyvien heterokromaattisten pesäkkeiden muodostuminen ja ikääntymiseen liittyvä satelliittien venyminen [8-10]. Toisin sanoen vanhenevat solut säilyttävät aineenvaihdunnan aktiivisuuden ja elinvoimaisuuden, mutta niiden toiminta muuttuu merkittävästi verrattuna alkuperäsolut.

KSL28

Cistanche voi estää ikääntymistä

Nyt on selvää, että vanhenevat solut voivat muokata ympäröivää mikroympäristöä vaikuttaen sekä naapurisoluihin että solurakoihin, mikä voi johtaa kudosten toimintahäiriöihin ja siten liittyä ikääntymisen ja ikääntymiseen liittyvien sairauksien etenemiseen [11,12]. Tämä mielessä pitäen nykyään enemmän huomiota kiinnitetään vanhenevien solujen kohdennettuun "tappamiseen"[13-15]. Tätä tarkoitusta varten kehitetään aktiivisesti uusi lääkeluokka, jota kutsutaan senolyyttiseksi aineeksi. Senolyytit kohdistavat signalointireittejä, jotka edistävät vanhenevien solujen vastustuskykyä apoptoosia kohtaan, mikä indusoi apoptoosia ensisijaisesti vanhenevissa soluissa[16]. Senolyyttisten aineiden luettelo täydentyy jatkuvasti uusilla aineilla. Tunnetuimpia yhdisteitä, joilla on ilmoitettu senolyyttinen aktiivisuus, ovat navitoklaksi (Bcl-2-perheen estäjä), dasatinibin (useiden tyrosiinikinaasien estäjä) ja kversetiinin (luonnollinen flavonoli), Hsp90-estäjät, MDM2-estäjät, FOXO{ {8}}p53:a häiritsevä peptidi, BET-perheen proteiinia hajottava aine, uPAR-spesifinen CAR-T, galaktoon konjugoitu navitoklaksi ja erilaiset senolyyttiset luonnolliset yhdisteet[16-24]. Äskettäin kaksi riippumatonta tutkimusryhmää identifioivat sydämen glykosidit, erityisesti ouabaiinin, digoksiinin ja bufaliinin, laajakirjoisiksi senolyyttisiksi aineiksi käyttämällä korkeatehoista lääkeseulontaa [25,26].cistanche tubulosa arvostelutOn syytä mainita, että lähes kaikilla ilmoitetuilla senolyyteillä on rajoituksia, kuten ei-toivottuja sivuvaikutuksia tai tehottomuutta tiettyjä solutyyppejä kohtaan. Mesenkymaalisille kantasoluille (MSC:t), joita löytyy käytännöllisesti katsoen kaikista postnataalisista elimistä/kudoksista, on ominaista kyky uusiutua itsestään (symmetrinen jakautuminen) ja erilaistua, mikä myötävaikuttaa kudoksen ylläpitoon ja uusiutumiseen [27]. Näiden ainutlaatuisten ominaisuuksien sekä tehokkaiden anti-inflammatoristen ja immunosuppressiivisten toimintojen ansiosta MSC:itä käytetään laajasti solukorvaushoidossa eri sairauksien, mukaan lukien diabetes mellitus, multippeliskleroosi, sydäninfarkti ja niin edelleen, hoidossa [28]. Kuitenkin, aivan kuten niiden erilaistuneita jälkeläisiä ja muita unipotentteja soluja, MSC:t pystyvät vanhentumaan joko replikatiivisesti tai ennenaikaisesti vastauksena onkogeenien aktivaatioon ja stressaaviin ärsykkeisiin [29, 30]. MSC:iden vanhenemisella on paljon ei-toivottuja jälkiseurauksia, joihin kuuluu uupumus. kantasolujen joukosta, vähentynyt kudosten ylläpito ja regeneraatio, heikentynyt erilaistumiskyky, SASP-välitteinen vanhenemisen leviäminen, vähentyneet angiogeeniset ominaisuudet, kantasolujen markkinaraon modifikaatio [29,31-33]. Kun otetaan huomioon MSC:iden asianmukaisen toiminnan biologinen merkitys, vanhenevia MSC:itä voidaan pitää keskeisenä analyysikohteena. Tämän ehdotuksen mukaisesti viime vuoden aikana on julkaistu useita katsauksia, joissa korostetaan vanhenevien MSC:iden poistamisen mahdollisia edullisia tuloksia [29, 31, 34, 35]. Tästä ongelmasta on kuitenkin olemassa vain muutamia kokeellisia tietoja [36-40].

Tässä tutkimuksessa osoitamme ensimmäistä kertaa, että sydämen glykosidit, nimittäin ouabaiini ja bufaliini, eivät pysty osoittamaan hemolyyttistä aktiivisuutta ihmisen MSC:itä (hMSC:itä) kohtaan, jotka ovat peräisin kohdun limakalvosta (END-MSC), rasvakudoksesta (AD-MSC), hammasmassa (DP-MSC) ja Warton-hyytelö (WJ-MSC). Lisäksi vahvistamme, että molemmat sydänglykosidit kykenevät indusoimaan apoptoosia ensisijaisesti vanhentuneessa A549:ssä ja SK-HEP:ssä-1, kuten aiemmin kuvattiin pilottitutkimuksissa [25,26]. Arvioimalla muutoksia ionisessa homeostaasissa, jotka johtuvat Nat/K plus -ATPaasi-salpauksesta ja vastaavien geenien ilmentymistasoista, paljastamme, että ouabaiinin aiheuttaman analyysin puuttuminen saattaa johtua kompensoivan K plus -tuonnin tehostamisesta vanhenevassa END- MSC:t verrattuna vanhenevaan A549:ään. Lisäksi käyttämällä edistynyttä bioinformatiikkaa osoitamme, että ouabaiinin aiheuttamalle analyysille vastustuskykyisten END-MSC:iden vanhenemiseen liittyy apoptoosille resistentin fenotyypin hankkiminen, kun taas ouabaiinille herkän A549: n vanheneminen ei ole. Tärkeää on, että antiapoptoottisen proteiinin MCL-1 toiminnan estäminen ennen sydämen glykosidihoitoa johti apoptoosille resistenttien vanhenevien END-MSC:iden analyysiin. Siksi tarjoamme selkeitä todisteita siitä, että apoptoosin vastustuskyky ei ole vanhenevien solujen yleinen ominaisuus. Saatujen tietojen perusteella päättelemme, että analyyttisten lähestymistapojen tehokkuus saattaa riippua siitä, tuliko soluista todellakin apoptoosin vastustuskykyisiä vanhenemisen aikana.

Materiaalit ja menetelmät

Solut

END-MSC:t, WJ-MSC:t, DP-MSC:t, AD-MSC:t, A549 ja SK-Help saatiin Venäjän solukulttuurien kokoelmasta (Institute of Cytology, Saint-Petersburg, Venäjä). A549- ja SK-Help-linjat varmennettiin karyologialla, tuumorigeenisyydellä, isoentsyymitesteillä (LDH ja G6PD) ja STR-analyysillä. Soluja viljeltiin täydellisessä alustassa DMEM F12 (Gibco BRL), jota oli täydennetty 10 prosentilla FBS:llä (HyClone), 1 prosentilla penisilliini-streptomysiiniä (Gibco BRL) ja 1 prosentilla glutamiinia (Gibco BRL). Kaikki solut testattiin rutiininomaisesti mykoplasmakontaminaation varalta.

Vanhenemista ja stressiä aiheuttavat olosuhteet

Oksidatiivisen stressin aiheuttamaa vanhenemista varten END-MSC:itä/WJ-MSC:itä käsiteltiin 200 uM/100 uM HO:lla (Sigma) 1 tunnin ajan. Doksorubisiinin aiheuttamaa vanhenemista varten DP-MSC/A549:ää käsiteltiin 1 µM doksorubisiinilla (Veropharm) 3 päivän ajan. Kussakin tapauksessa solujen katsottiin vanhentuneiksi aikaisintaan 14 päivää käsittelyn jälkeen. Replikatiiviselle vanhenemiselle AD-MSC:t, jotka olivat ennen 4. siirtoa, tunnistettiin kontrollisoluiksi ja 10. jälkeen myöhemmin vanheneviksi soluiksi. Etoposidin aiheuttamaa vanhenemista varten A549/END-MSC:t/SK-Help käsiteltiin 2 uM/5 uM/3 uM etoposidilla (Veropharm) 3 päivän ajan ja analysoitiin aikaisintaan 7 päivää vanhenemisen induktion jälkeen. Tässä tapauksessa hoitosuunnitelma vastasi täysin RNA-seq-data peräisin olevassa tutkimuksessa kuvattuja (Wang et al., 2017). Kaksi sydämen glykosidia, joita käytimme senolyyttisinä yhdisteinä - Ouabain (Sigma) ja Bufalin (Calbiochem).

Kontrollin ja vanhenevien END-MSC:n tai A549:n stressiresistanssin vertaamiseksi soluja käsiteltiin joko 400/800 uM H02:lla (Sigma) 1 tunnin ajan tai 0,3/1 uM staurosporiinilla (Sigma). Solujen elinkelpoisuus analysoitiin 48 tuntia stressin induktion jälkeen.

MCL{0}}-toiminnan estämiseksi END-MSC:itä esikäsiteltiin 10 uM:lla A-1210477(Sigma) 3 päivän ajan.

KSL29

Virtaussytometrinen analyysi

Solujen elinkelpoisuuden, proliferaation, solukoon, autofluoresenssin, apoptoosinopeuksien, kaspaasin 3/7-katkaisun, mitokondrioiden membraanipotentiaalin ja kalvon depolarisaation mittaukset suoritettiin virtaussytometrialla. Virtaussytometria suoritettiin käyttämällä CytoFLEXiä (Beckman Coulter) ja saadut tiedot analysoitiin CytExpert-ohjelmistoversiolla 2.0. Kiinnittyneet solut huuhdeltiin kahdesti PBS:llä ja kerättiin trypsinisoimalla. Irrotetut solut yhdistettiin ja suspendoitiin uudelleen tuoreeseen väliaineeseen ja sitten laskettiin ja analysoitiin autofluoresenssin suhteen. Solujen elinkelpoisuuden saavuttamiseksi kuhunkin näytteeseen lisättiin 50 ug/ml propidiumjodidia (Life Technologies) juuri ennen analyysiä. Solukoko arvioitiin PI-negatiivisten solujen sytometrisellä valonsironnalla eteenpäin. Apoptoosin induktio varmistettiin käyttämällä Annexin-V-APC (Invitrogen) ja DAPI (Sigma) rinnakkaisvärjäystä valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaspaasiaktiivisuus arvioitiin käyttämällä CellEventTM Caspase{11}}/7 Green Flow Cytometry Assay Kitiä (Invitrogen) valmistajan protokollan mukaisesti. Mitokondrioiden kalvopotentiaalin menetys arvioitiin käyttämällä ratiometristä väriainetta JC-1 (Invitrogen). Värjäysmenettely suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kalvon depolarisaatioon käytimme DiBAC4(3)-fluoresoivaa koetinta (Invitrogen).

Vanhenemiseen liittyvä -galaktosidaasivärjäys

Vanhenemiseen liittyvä -galaktosidaasi (SA- -Gal) -värjäys suoritettiin käyttämällä vanhenemisgalaktosidaasivärjäyssarjaa (Cell Signaling Technology) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kuvien kvantitatiivinen analyysi tuotettiin MatLab-paketilla aiemmin kuvatun algoritmin mukaisesti[41]. Jokaista koepistettä kohden analysoitiin vähintään 50 satunnaisesti valittua solua.

Western blottaus

Western blot -analyysi suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla [41]. SDS-PAGE-elektroforeesi, siirto nitroselluloosakalvolle ja immunoblottaus ECL-detektiolla (Thermo Scientific) suoritettiin valmistajan standardikäytäntöjen mukaisesti (Bio-Rad Laboratories). Käytettiin vasta-aineita seuraavia proteiineja vastaan: glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH)(klooni 14C10), fosfo-p53(Ser15), p21(klooni 12D1), fosfo-Rb (Ser807/811) , HMGB1 (klooni D3E5), sekä piparjuuriperoksidaasilla konjugoitu vuohen antikanin IgG. Laimennussuhteet olivat 1:1000 kaikille primäärisille vasta-aineille ja 1:7000 sekundaarisille vasta-aineille. Kaikki vasta-aineet ostettiin Cell Signalingilta. Scion Image 4.0:aa (Scion Corporation) käytettiin vyöhykkeiden taustasta vähennetyn tiheyden valitsemiseen ja määrittämiseen kaikissa geeleissä ja bloteissa.

Transkriptominen analyysi

Analyysissa käytettiin näytteitä seuraavista kolmesta Gene Expression Omnibus (GEO)RNA-seq -tietojoukosta: GSE102639 (GSM2742113-GSM2742114 ja GSM2742121-GSM2742122 vastaavasti kontrolli- ja vanheneville A549-soluille); GSE122081 (GSM3454482-GSM3454484 ja GSM3454500-GSM3454502 vastaavasti kontrolli- ja vanheneville IMR-90-soluille); ja tietojoukkomme GSE160702 (GSM{14}}GSM4877898 ja GSM{16}}GSM4877910 vastaavasti ohjaus- ja vanheneville END-MSC:ille). Kaikkien tietojoukkojen tiedot käsiteltiin samalla tavalla.

Raakalukudatalle tehtiin laatusuodatus ja sovittimen leikkaus BBtools-paketin (versio 38.75) FilterByTile- ja BBDuk-komentosarjojen avulla oletusasetuksia käyttäen. Loput lukemat suodatettiin ja leikattiin lisäksi käyttämällä FastqPuri-paketin (versio 1.0.7) kolmanneksen komentosarjaa.cistanche UKTrimmaustoimintoa sovellettiin lukujen molempiin päihin, jos ne sisälsivät N:tä tai niiden laatu oli alle 27:ään asetetun laatukynnyksen, kaikki alle 25 emäksen mittaiset lukemat hylättiin. Trimmauksen laadunvalvonta suoritettiin FastQC-ohjelmistolla (versio 0.11.7) ja FastqPuri-skripteillä. Kaikki toiminnot läpäisseet lukemat muodostavat vähintään 90 prosenttia lähtötiedoista.

Transkriptiomäärät arvioitiin käyttämällä Salmon lightweight -kartoitusta (versio 1.1.0), joka on käynnissä valikoivassa kohdistustilassa. Luettelo houkuttimista luotiin Gencode-ihmisen referenssigenomin GRCh38.p13 (julkaisu 33) perusteella ja sitä käytettiin edelleen indeksin rakentamiseen ketjutettuihin transkripti- ja genomigencode-viitetiedostoihin (julkaisu 33) käyttämällä kmer-kokoa 21. Kartoitusoperaatiot ajettiin lisälippujen kanssa——numBootstraps 30——paljetteja——gcBias——tarkista kartoitukset. Tuloksena saadut kartoitusasteet olivat noin 70 prosenttia.

KSL30

Tietojen jatkokäsittely suoritettiin käyttämällä R-versiota 3.6.3 Tidyverse-pakettikokoelman kanssa (versio 1.3.0). Arvioidut geenimäärät, metatiedot ja transkriptioalueet ladattiin R:hen ja niistä tehtiin yhteenveto geenitasolle käyttämällä tximetaa (versio 1.4.5). Tuloksena oleva laskentamatriisi suodatettiin sisältämään rivit, joissa oli vähintään 5 arvioitua lukua kaikissa näytteissä, tuloksena saatu matriisi sisälsi 20 400 geeniä.

PCA- ja lämpökarttaesitystä varten lukumäärät normalisoitiin käyttämällä lokimuunnoksia DESeq2-paketista (versio 1.26.0).cistanche wirkungLämpökartat rakennettiin käyttämällä geenisuodatin (versio 1.38.0) ja lämpökartta (versio 1.0.12)R-paketteja. Jakautumisnäytteiden validointi vanhenemismuuttujan mukaan suoritettiin alijoukkoina normalisoidut lukumäärät geenien mukaan, jotka liittyvät geeniontologian termiin "solujen vanheneminen" (GO 0090398). Differentiaalinen ilmentymisanalyysi ja log-kertaismuutosten estimointi laskettiin käyttämällä DESeq2:ta viimeiselle muuttujalle suunnittelukaavassa solujen vanhenemisen tilan, ouabaiinikäsittelyreaktion ja osoitettujen tekijöiden vuorovaikutuksen osalta. Differentiaalisen ilmentämisen testauksen tehostamiseksi käytettiin logaritmien taittomuutoskorjausta käyttämällä kämmenpaketin mukautuvan kutistumisestimaattorin yhdistelmää (versio 1.8.0) ja määrittämällä ylimääräinen logaritmien laskostumismuutoskynnys, joka on 0,667. Tuloksena saatuja kutistettuja arvioita käytettiin edelleen geenien luokitteluun ja Gene Set Enrichment Analysis -analyysin suorittamiseen käyttämällä klusteriprofiilia (versio 3.14.3) ja fuse (versio 1.12.0)R-paketteja, joissa p-arvot oli säädetty useita vertailuja varten Benjamin-Hochbergin menetelmän mukaisesti. Affymetrix-mikrosirunäytteet kontrollia ja vanhentuneita AD-MSC:itä varten hankittiin GEO-tietokannasta (GSE66236) ja käsiteltiin Phantasus-verkkosovelluksella log2- ja kvantiililaskujen normalisoinnilla. Geenisarjan rikastusanalyysi suoritettiin käyttämällä sulakepakettia (versio 1.12.0)R.

RNA:n uutto, käänteistranskriptio ja reaaliaikainen PCR

RNA:n uutto, käänteistranskriptio ja reaaliaikainen PCR suoritettiin edellisessä tutkimuksessamme kuvatulla tavalla [32]. Reagenssit RNA:n uuttamiseen (ExtractRNA-reagenssi), käänteistranskriptioon (MMLV RT -pakkaus) ja reaaliaikaiseen PCR:ään (HS SYBR -kitti) hankittiin Evrogenilta. Geenien ilmentymistasot arvioitiin käyttämällä reaaliaikaista PCR BioRad CFX-96 -vahvistinta (BioRad) seuraavalla ajo-ohjelmalla kaikille tutkituille geeneille: 40 sulatussykliä 10 s 95 asteessa, pariutus 15 s 57,5 asteessa. ja synteesi 15 s 72 asteessa. Sulamiskäyräanalyysiä käytettiin reaktioiden spesifisyyden säätelemiseksi. Saatujen tietojen seuraava analyysi suoritettiin käyttämällä Bio-Rad CFX Manager -ohjelmistoa (BioRad) standardi 2deltaCt-kvantifiointimenetelmällä käyttäen GAPDH-ilmentymää referenssinä. Alukesekvenssit on lueteltu taulukossa 1.

Tilastollinen analyysi

Kahden ryhmän välisen eron merkitsevyyden saamiseksi käytettiin Studentin t-testiä tai Welchin t-testiä. Useita ryhmien välisiä vertailuja varten käytettiin ANOVAa Tukeyn HSD:n kanssa. Ellei toisin mainita, kaikki kvantitatiiviset tiedot esitetään keskiarvoina±SD ja tähdet osoittavat merkittäviä eroja seuraavasti: ns, ei merkitsevä,*p<0.05,><><0.001. statistical="" analysis="" was="" performed="" using="" r="">

Tulokset

H2O2-käsitellyt END-MSC:t vanhenevat ennenaikaisesti

Tässä tutkimuksessa käytimme ihmisen mesenkymaalisia kantasoluja, jotka oli eristetty desquamated endometriumista (END-MSC:t), jotka täyttävät ISCT:n ehdottamat vähimmäiskriteerit hMSC:iden määrittämiseksi [41]. Aiemmin olemme kehittäneet luotettavan kokeellisen mallin tutkiaksemme END-MSC:iden ennenaikaisen vanhenemisen eri näkökohtia [30]. Olemme nimittäin osoittaneet, että subletaalille oksidatiiviselle stressille altistetut END-MSC:t saivat vähitellen kaikki ikääntyvien solujen tyypilliset piirteet, mukaan lukien pysyvät DNA-vauriokohtaukset ja aktiivisen DNA-vauriovasteen, klassisen p53/p21/Rb:n välittämän peruuttamattoman solusyklin pysähtymisen. polku, proliferaation menetys, solujen hypertrofia, SA- -Gal-värjäytymisen ilmaantuminen ja ikääntymiseen liittyvän erittyvän fenotyypin kehittyminen [30, 32, 42]. Tässä sovelsimme suunniteltua mallia tutkimaan ouabaiinin senolyyttistä vaikutusta sekä paljastamaan taustalla olevat solunsisäiset muutokset ionien homeostaasissa. Aluksi arvioimalla yleisimmät parametrit vahvistimme, että kerta-annos (1 h, 200 µM) H O-hoito oli riittävä indusoimaan vanhenemista END-MSC:issä. Tärkeää on, että stressaantuneiden END-MSC:iden katsottiin vanhentuneiksi kaksi viikkoa oksidatiivisen stressin jälkeen; siksi kaikki vanhenemismerkit arvioitiin aikaisintaan 14 päivää H-Oz-käsittelyn jälkeen. Itse asiassa END-MSC:iden H-Oz-käsittely johti proliferaation estoon, solujen hypertrofiaan, kuten lisääntynyt solukoko osoittaa, lipofussiinin kerääntymiseen, joka havaittiin lisääntyneen autofluoresenssin perusteella, SA- -Gal:n ilmaantumisen, solujen aktivoitumiseen. p21/Rb-reitti ja HMGB1:n menetys yhdessä tukevat vanhenemisen muodostumista valituissa koeolosuhteissa (kuvio ac, e, f).

Vanhenevien solujen haitallisimpien kudos- ja organismitasojen vaikutusten uskotaan johtuvan niiden pitkittyneestä elinvoimasta. Tämän kohdan mukaisesti HO2-käsitellyt END-MSC:t säilyttivät korkean elinkelpoisuuden jopa ikääntymisen kehityksen myöhäisissä vaiheissa (vanhenevien END-MSC:iden elinkelpoisuus arvioitiin 17 päivää (14 päivää ＋3 päivää) alkuperäisen oksidatiivisen stressin jälkeen) (kuvio 1d) ). Yhteenvetona voidaan todeta, että END-MSC:iden subletaalinen HO2--hoito on sopiva malli ennenaikaiselle vanhenemiselle ja se on olennaista tutkittaessa senolyyttisten yhdisteiden vaikutuksia END-MSC:iin.

Sydänglykosidi-ouabaiinilla ei ole senolyyttistä aktiivisuutta vanhenevia END-MSC:itä kohtaan laajalla pitoisuusalueella

Viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen, että sydänglykosidit, mukaan lukien ouabaiini, digoksiini ja bufaliini, edustavat ryhmää yhdisteitä, joilla on hemolyyttistä aktiivisuutta [25,26]. Vaikka nykyään sydämen glykosideja pidetään laajakirjoisina senolyyttisinä aineina, tiedot niiden vaikutuksista vanheneviin hMSC:ihin puuttuvat. Siksi täällä testasimme, onko ouabaiinilla potentiaalia aiheuttaa kuolemaa selektiivisesti vanhenevissa END-MSC: issä. Tätä varten arvioimme kontrollien ja vanhenevien END-MSC:iden elinkelpoisuuden ouabaiinikäsittelyn jälkeen laajalla pitoisuusalueella (10-' - 10~ M). Mielenkiintoista on, että kumpikaan käytetty konsentraatio ei johtanut huomattavaan laskuun sekä kontrolli- että vanhenevien solujen elinkelpoisuudessa ensimmäisenä päivänä ouabaiinin levittämisen jälkeen (kuva 2 ja täydentävä kuva S1).

Kuitenkin kolmantena päivänä ouabaiinihoidon jälkeen havaitsimme merkittävän annoksesta riippuvan heikkenemisen kontrollien END-MSC:iden elinkelpoisuudessa (kuva 2a ja täydentävä kuva S1). Yllättäen vanhenevat solut osoittautuivat resistenteiksi ouabaiinille jokaisella testatulla pitoisuudella. Tämän tuloksen mukaisesti 10-M ouabain johti alttiimpaan apoptoottiseen kuolemaan kontrollisoluissa (20,75 prosenttia An plus /PI- ja 36,47 prosenttia An plus /PI plus ) verrattuna vanheneviin soluihin (15,01 prosenttia An＋/PI -ja 12,15 prosenttia An plus /PI plus )(kuvio 2b). Saadut tulokset osoittavat selvästi, että vanhenevien END-MSC:iden yhteydessä ouabaiinilla ei ole senolyyttistä aktiivisuutta.

Suljemme pois mahdolliset vaikutukset, jotka liittyvät vanhenemista indusoivien ärsykkeiden vaihteluun ouabaiinin senolyyttiseen vaikutukseen, suoritimme lisäkokeita. Nimittäin käsittelimme END-MSC:itä etoposidilla oksidatiivisen stressin sijasta ennenaikaisen vanhenemisen indusoimiseksi.sitrushedelmien bioflavonoiditEtoposidilla käsitellyt END-MSC:t osoittivat kaikki ikääntyville soluille tyypilliset piirteet (kuvat 3a-e).

Tärkeää on, että ouabaiinilla ei ollut hemolyyttistä vaikutusta etoposidilla käsiteltyjä vanhenevia END-MSC:itä kohtaan (kuva 3f ja täydentävä kuva S2). Nämä tiedot tarjoavat lisävahvistusta yllä oleville tuloksille ja todisteita siitä, että ouabaiinin aiheuttaman analyysin puuttuminen ei ole seurausta vanhenemisen indusoimiseen käytetystä konkreettisesta vanhenemislaukaisusta.

Kuva 1 Oksidatiivisen stressin aiheuttaman END-MSC:n ennenaikaisen vanhenemismallin validointi. Vanhenevat END-MSC:t a löysä proliferaatio, b joutuvat hypertrofiaan, c saavuttavat kohonneen autofluoresenssin, säilyttävät korkean solujen elinkelpoisuuden d ja e osoittavat SA- -Gal-aktiivisuutta kontrolliin verrattuna. f P53:n ja Rb:n fosforylaatiotasot ja p21- ja HMGBI-proteiinien ilmentymistasot kontrollissa ja vanhenevassa END-Ouabainilla ei ole hemolyyttistä vaikutusta eri alkuperää olevia ihmisen mesenkymaalisia kantasoluja kohtaan. Analysoimme ouabaiinin vaikutuksia muista lähteistä, mukaan lukien rasvakudoksesta, hammasmassasta ja Whartonin hyytelöstä, eristettyihin hMSC:ihin. Tietojemme vahvistamiseksi sovelsimme erilaisia ikääntymismalleja - replikatiivista vanhenemista AD-MSC:ille, doksorubisiinin aiheuttamaa vanhenemista DP-MSC:ille ja oksidatiivisen stressin aiheuttamaa vanhenemista WJ-MSC:ille (kuvat 4a-f).

Kuten kuvasta 4g näkyy, eri tyyppisten hMSC:iden elinkelpoisuus erosi ouabaiinikäsittelyssä, esimerkiksi sekä kontrolli- että vanhenevat DP-MSC:t olivat paljon vastustuskykyisempiä ouabaiinin vaikutukselle kuin WJ-MSC:t (kuva 4g ja täydentävä kuva S3b, c). Siitä huolimatta, ouabain ei kyennyt indusoimaan senolyysiä kummassakaan vanhenevien hMSC:iden tyypissä (kuva 4g ja täydentävä kuva S3). Yhdessä saadut tiedot osoittavat, että ouabaiinin aiheuttaman analyysin puuttuminen on yhteinen piirre eri tyyppisille hMSC:ille. MSC:t. Esitetyt arvot ovat keskiarvo±SD. Useiden ryhmien vertailuissa kohdissa a ja d käytettiin yksisuuntaista ANOVAa, n=3, ns ei merkitsevää,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="">

GAPDH:ta käytettiin latauskontrollina

Sydänglykosidibufaliini ei pysty tappamaan vanhenevaa END-MSCS:ää

Varmistaaksemme, ettei sydämen glykosidien senolyyttistä vaikutusta hMSC:itä kohtaan ole, käytimme bufaliinia, toista yhdistettä, jolla on ilmoitettu senolyyttinen aktiivisuus ja joka kuuluu sydänglykosidien perheeseen [25]. Bufaliinilla ei ollut juuri mitään vaikutusta kontrollin ja H2O{2}}käsiteltyjen vanhenevien END-MSC:iden elinkelpoisuuteen laajalla pitoisuusalueella (10-7 - 10-5 M) (Kuva 5a ja täydennys kuva S4a).

Kuten havaitsimme ouabaiinihoidossa, bufaliinin analyysin puuttuminen oli riippumatonta vanhenemista indusoivista ärsykkeistä, koska joko oksidatiivisen stressin tai etoposidin seurauksena vanhentuneiden ESC:iden elinkelpoisuus ei muuttunut (kuvat 5a, b, täydentävä kuva S4a, b). Yllä kuvatut tulokset vahvistavat, että sydämen glykosidit osoittautuivat tehottomiksi kohdistetussa kuoleman induktiossa vanhenevissa END-MSC:issä. MSC:t. Esitetyt arvot ovat keskiarvo±SD. Useiden ryhmien vertailuissa kohdissa a ja d käytettiin yksisuuntaista ANOVAa, n=3, ns ei merkitsevää,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" um.="" gapdh="" was="" used="" as="" a="" loading="">

Sydänglykosidibufaliini ei pysty tappamaan vanhenevaa END-MSCS:ää

Kuva 2 Ouabainilla ei ole hemolyyttistä aktiivisuutta HO2-käsiteltyjä vanhenevia END-MSC:itä kohtaan laajalla pitoisuusalueella. Kontrollin ja vanhenevien END-MSC:iden suhteellinen solujen elinkelpoisuus (prosenttia) 3 päivän aikana 1077,10-6,10-5 M ouabaiinilla käsittelyn jälkeen. b Apoptoosin induktio END-MSC:issä 10-6 M ouabaiinilla arvioituna anneksiini V/DAPI-kaksoisvärjäyksellä. n=3 itsenäistä kokeilua. Kaikki tiedot vastaavat keskiarvoa±SD. Tilastollinen merkitsevyys arvioitiin Welchin t-testillä:ns ei merkitsevä,***p<>

Sekä sydämen glykosidit ouabaiini että bufaliini pystyvät indusoimaan solukuolemaa selektiivisesti vanhentuvissa A549- ja SK-Hep1-soluissa

Ottaen huomioon sen tosiasian, että tuloksemme eivät vastaa äskettäin julkaistua näyttöä sydänglykosidien laajakirjoisesta senolyyttisesta vaikutuksesta, päätimme toistaa tämän vaikutuksen käyttämällä asiaankuuluvissa tutkimuksissa kuvattua solumallia [25,26]. Siten suoritimme sarjan kokeita käyttämällä kontrolli- ja vanhenevia A549-keuhkokarsinoomasoluja. A549-solujen vanheneminen indusoitiin etoposidikäsittelyllä. Etoposidin aiheuttama A549-solujen vanheneminen on usein käytetty ja siten hyvin karakterisoitu malli terapian aiheuttamasta vanhenemisesta [4]. Ouabaiinin osoitettiin myös tappavan selektiivisesti etoposidilla käsitellyt vanhenevat A549-solut[25]. Todistaaksemme A549:n vanhenemisen arvioimme proliferaationopeuden, solukoon, lipo-fine-pitoisuuden, SA- -Gal-värjäytymisen ja aktivaatiotilan. p53/p21/Rb-reittiä ja HMGB1:n ilmentymistasoa (kuviot 6a-e).

Ouabaiinin hemolyyttisen aktiivisuuden tarkistamiseksi vanhenevia syöpäsoluja kohtaan arvioimme ensin annoksesta riippuvan solujen elinkelpoisuuden. Yllä kuvattujen tulostemme mukaisesti emme pystyneet havaitsemaan merkittävää laskua elinkelpoisten kontrolli-tai vanhenevien A549-solujen määrässä 24 tunnin kuluessa ouabaiinisovelluksen jälkeen (lisäkuva S5a). Kuitenkin 3 päivää hoidon jälkeen ouabaiini vähensi merkittävästi vanhenevien A549-solujen elinkelpoisuutta annoksesta riippuvaisella tavalla, kun taas kontrolli-A549-solujen määrä väheni paljon vähemmän (kuva 7a ja täydentävä kuva S5a). Nimittäin noin 90 prosenttia kontrollisoluista säilytti elinkelpoisuuden 10- M ouabaiinilla verrattuna 50 prosenttiin vanhenevista A549-soluista, joita käsiteltiin samalla annoksella (kuva 7a). Lisäksi vanhenevat A549-solut olivat alttiimpia bufaliinin aiheuttamalle solukuolemalle kuin niiden kontrollivastineet (kuvio 7b) (kuvio 5b ja täydentävä kuva S5b).

Julkaistujen tietojen mukaan ouabaiini laukaisi kaspaasista -3-riippuvaisen apoptoosin vanhenevissa A549-soluissa [26]. Todellakin, havaitsimme merkittävän kasvun kaksoispositiivisessa ja/tai PI-fraktiossa vanhenevissa syöpäsoluissa, joita käsiteltiin 10-6M ouabaiinilla (kuva 7c). Lisäksi fluoresoivaa määritystä käyttämällä havaitsimme kaspaasin -3 aktivoitumisen ouabaiinilla käsitellyissä vanhenevissa A549-soluissa (kuvio 7d). Yhdessä nämä tulokset ovat täysin yhdenmukaisia muiden kirjoittajien kuvaamien tietojen kanssa ja vahvistavat ouabaiinin hemolyyttisen aktiivisuuden A549:ää kohtaan.

Käytimme myös doksorubisiinia etoposidin sijasta A549:n vanhenemisen aiheuttamiseen (kuvat 8a-e). Kuten odotettiin, doksorubisiinilla käsitelty vanheneva A549 sekä etoposidilla käsitelty osoittivat korkeampaa herkkyyttä sekä ouabaiinille että bufaliinille verrattuna kontrollivastineisiinsa (kuva 8g ja täydentävä kuva S6). Jälkimmäinen vahvistaa, että sydänglykosidien senolyyttiset vaikutukset ovat riippumattomia vanhenemista indusoivista ärsykkeistä. Siten sydänglykosideilla on todellakin senolyyttistä vaikutusta

Kuva 3 Ouabain ei pysty indusoimaan senolyysiä etoposidilla käsitellyissä vanhenevissa END-MSC:issä. Episodien aiheuttaman vanhenemismallin validointi END-MSC:ille: proliferaatiokyky, b-solukoko, c autofluoresenssitasot ja dSA- -Gal-aktiivisuus, e Rb:n fosforylaatiotaso ja p21- ja HMGBI-proteiinien ilmentymistasot. f Kontrollisolujen ja vanhenevien solujen suhteellinen solujen elinkelpoisuus (prosenttia) 10-6 ouabaiinihoidon jälkeen. Arvot ovat keskiarvo±SD. Useille ryhmille sovellettiin vertailuja yksisuuntaisella ANOVA:lla,n=3, ns ei merkitsevää,***p<0.001.for pair="" comparisons="" at="" b,c,d,f="" welch's="" t-test="" was="" used,="" n="3" for="" b,="" c,f="" n="50" for="" d,="" ns="" not="" significant,=""><0.05,><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" μm.="" gapdh="" was="" used="" as="" loading="" control="" activity="" towards="" a549,="" but="" these="" compounds="" turned="" out="" to="" be="" ineffective="" for="" targeted="" death="" induction="" in="" senescent="">

Lopuksi päätimme toistaa analyysikokeita etoposidilla käsitellyillä maksasyöpäsoluilla SK-Help, toinen solumalli, jolla on todistettu sydänglykosidien senolyyttinen vaikutus Guerreron et al. tutkimus [25] (kuvat 9a-e). Etoposidilla käsitelty ikääntyvä SK-Help osoitti korkeampaa herkkyyttä molemmille aineille verrattuna kontrollivastineisiinsa, mikä osoitti sydänglykosidien hemolyyttisen vaikutuksen tätä solutyyppiä kohtaan (kuva 9f ja täydentävä kuva S7).

Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että sydämen glykosidien aiheuttaman hemolyysin selektiivisyys riippuu enemmän solun luonteesta kuin konkreettisesta vanhenemislaukaisusta.

Tämä artikkeli on poimittu julkaisusta Cellular and Molecular Life Sciences (2021) 78:7757–7776 https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x