Lukuisia terapeuttisia yhdisteitä on eristetty luonnollisesti runsaista orgaanisista luonnonvaroista

Ota yhteyttäoscar.xiao@wecistanche.comLisätietoja

Luonnollisesti runsaista orgaanisista resursseista on eristetty lukuisia terapeuttisia yhdisteitä, jotka voivat tarjota taloudellisia ja kestäviä yhdistelähteitä, joilla on turvallinen ja tehokas biologinen aktiivisuus. Kosmetiikkateollisuudessa etsitään innokkaasti luonnollisia yhdisteitä, joilla on ikääntymistä estäviä vaikutuksia. Näin ollen valmistimme erilaisia ​​uutteita Rubusfraxinifolius-lehdistä ja käytimme entsyymien estomäärityksiä eristääksemme yhdisteitä, joilla on suojaavia vaikutuksia ihon ikääntymistä vastaan. Kaksi triterpenoidia eristettiin Rubus fraxinifolius Poirista. lähtee. Rakenteet karakterisoitiin spektroskooppisilla analyyseillä (LC-ESI-MS,1D/2D NMR) ja vertailulla raportoituihin tietoihin. Yhdiste 1 ja 2 määritettiin 2,3-O-etyleeniglykoliksi,19-hydroksiuriksi-12-en-23,28-dihappoksi ja 2,{{15} }O-propaanidioli, 19-hydroksiurs-12-en-28-öljyhappo. Metanoliuutteen ja isolaattien elastaasia ja tyrosinaasia inhiboivat vaikutukset arvioitiin. Yhdisteet 1 ja 2 estivät elastaasia ICso:lla 122,199 ug/ml ja 98,22 ug/ml, ja myös tyrosinaasia ICso:lla 207,79 ug/armeija ja 221,51 ug/ml, vastaavasti. Molekyylitelakka osoitti, että molemmilla yhdisteillä on affiniteettia entsyymejä kohtaan.

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja

Vaikka onkin haastavaa saavuttaa, ihmisille turvallisia luonnollisia ikääntymistä estäviä aineita voidaan korjata taloudellisesti ja kestävästi runsaista luonnonvaroista. Noin 700 Rubus (Rosaceae) -lajia on levinnyt maailmanlaajuisesti, vaikka harvat lajit tavataan tropiikissa. Tämä suku sisältää ravintoaineita (sokeria, vitamiineja jne.), sekundaarisia metaboliitteja (triterpenoidit, flavonoidit, polyfenolit jne.) ja sillä on monia ikääntymistä estäviä vaikutuksia (antioksidantti, muurahaiselastaasi, muurahaistyrosinaasi, kollagenaasi, anti-UV, tulehdusta ehkäisevä, haavojen parantaminen jne.)1. Lisäksi Rubus-lajit ilmoittivat myös sisältävän erilaisia ​​triterpeenejä, joilla on erilaisia ​​biologisia vaikutuksia -'.

Indonesiassa R. fraxinifolius Poir. (Rosaceae) levitetään Javalla, Borneolla jne., ja se tunnetaan yleisesti nimellä "urbaani".mikä on cistancheLisäksi jotkut paikalliset viljelijät korjaavat näitä kasveja, ja marjat kulutetaan yleensä joko tuoreina tai pakastettuina. Edellinen tutkimuksemme osoitti, että R. frascinifolius -varsiuutte estää elastaasia, tyrosinaasia ja toimii antioksidanttina8. Jotkut muut tutkimukset osoittivat myös, että R. fraxinifolius -lajin lehdillä ja hedelmillä on voimakas antioksidanttivaikutus?10. R. fraxinifoliuksen tutkimusta on kuitenkin tutkittu vähän, eikä kemiallisia komponentteja ole raportoitu.

Cistanche voi estää ikääntymistä

Elastaasi on seriiniproteaasientsyymi, jolla on ratkaiseva rooli ihon rypistymisessä tai roikkumisessa ihon elastisen kuidun (elastiinin) hajoamisen vuoksi ja joka aiheuttaa ihon kimmoisuuden menetystä. Yksi niistä on ihon fibroblastista peräisin oleva elastaasi. Täten elastaasi-inhibiittorit ovat ihon ikääntymistä aiheuttavan elastiinikuitujen hajoamisen hidastajina herättäneet huomiota kosmeettisten valmisteiden aineina12. Tyrosinaasi välittää melanogeneesiä ja säätelee melaniinin biosynteesiä kaksivaiheisen reaktion kautta. Alkuvaiheessa L-tyrosiini hydroksyloidaan L-3,4-dihydroksifenyylialaniiniksi (L-DOPA). Toisessa vaiheessa L-DOPA hapetetaan vastaavaksi O-kinoniksi. Siksi luonnollisia yhdisteitä, joilla on tyrosinaasia estävää vaikutusta, käytetään yleisesti kosmetiikassa, jotka estävät hyperpigmentaatiota melaniinilla ja edistävät siten ihon valkaisua.Anti-aging -vesisäiliöElastaasi- ja tyrosinaasientsyymi-inhibiittoreita voitaisiin kehittää ihoa valkaiseviksi, ikääntymistä ehkäiseviksi tai ryppyjä ehkäiseviksi aineiksi ihosairauksien hoitoon44.

Tässä tutkimuksessa eristettiin ursaanitriterpenoidit R. fraxinifolius -lehdistä ja selvitettiin niiden rakenteita spektroskooppisissa analyyseissä käyttäen sähkösumutusionisaatiomassaspektroskopiaa (ESI-MS) ja 'H NMR:tä, |3CNMR:ää ja 2D NMR:ää (DEPT, HSQC, HMQC ja HMBC). Tämän jälkeen suoritimme määrityksiä raakauutteiden, fraktioiden ja eristettyjen yhdisteiden elastaasia ja tyrosinaasia inhiboivista vaikutuksista.

Kahden valitun yhdisteen aktiivisuutta havaittiin myös tässä tutkimuksessa in silico -menetelmällä. Molekylaarinen telakointimenetelmä suoritettiin DockThorl516:lla. Tässä tutkimuksessa käytetyt makromolekyylit saatiin proteiinitietopankista (RCSB PDB, 2000), joiden identiteetit olivat 2y9x ja 3hgp tyrosinaasille ja elastaasille, vastaavasti 718. Makromolekyylit optimoitiin UCSF-kimeerin molekyyleissä. havaittiin PyMOL1920:lla.

tulokset ja keskustelu

The ethyl acetate and methanolic extracts of R. fraxinifolius leaves showed potential as elastase inhibitors with percent inhibitory>40 prosenttia 100 ug/ml:ssa, kun taas n-heksaaniuutteella ei ollut aktiivisuutta (kuvio 1). Jotkut Rubus osoittivat myös elastaasia inhiboivaa aktiivisuutta, kuten R. Sanctus (inhibitioprosentti 14.68-49.20 in 100 ug/ml), R.compactus,R. robustus jne.221. Tästä syystä fraktioimme aktiiviset uutteet käyttämällä tyhjiönestekromatografiaa/VLC:tä ja keräsimme kustakin 11 fraktiota. Etyyliasetaattiuutteesta saadut fraktiot osoittivat heikkoa elastaasia estävää aktiivisuutta (<20% in="" 100="" ug/ml),but="" some="" methanol="" fractions="" showed="" potential="" activity="" in="" these="" assays.="" we="" choose="" metha-nol="" fraction="" 8(m8)for="" further="" isolation="" because="" it="" hadthe="" largest="" yield(57%)="" and="" also="" have="" elastase="" inhibitory="" activity(44.82%).m8="" was="" further="" partitioned="" and="" purified="" over="" silica="" gel="" and="" through="" a="" sephadex="" column,="" and="" two="" amorphous="" powders="" were="">

Isolaatit tunnistettiin ja karakterisoitiin käyttämällä nestekromatografia-massaspektroskopiaa (LCMS), 'H- ja 13CNMR:ää, DEPT:tä, heteronukleaarista yksikvanttikoherenssia (HSQC), heteronukleaarista monikvanttikorrelaatiota (HMQC) ja heteronukleaarista monisidoskorrelaatiota (HMBC). Taulukko 1 osoitti yhdisteiden NMR-spektritiedot.

Yhdiste 1: eristettiin amorfisena valkoisena jauheena. Tämän yhdisteen LCMS-ESI-spektrit osoittivat molekyyli-ionihuipun m/z:ssä 543,32 [MH]t, mikä viittaa molekyylikaavaan C32H48O- ja yhdeksän tyydyttymättömyyden ekvivalenttia. IR-spektrit paljastivat absorptiomaksimit, jotka vastaavat hydroksyyliä (3,343,4 cm-l) ja olefiiniset (1,684 cm-1) funktionaaliset ryhmät. Lisäksi yhdisteen I 'H NMR -spektrit paljastivat metiiniprotonin (CH) singlettisignaalin arvolla 2,6, tyypillinen signaali ursane-tyypin H-18:lle triterpeenit, joissa on 19-O-substituutioita. Triterpeenityypin 19a-hydroksi-ursaanilla on myös tyypillinen protonisignaali alueella noin 2,6 ppm. Tämä suojattu signaali voi erota huomattavasti muista ordinaalI metyleeniprotonisignaaleista, ja siinä on tyypillinen siirtymä, joka johtuu olefiinisesta protonista (H12) arvolla 5,28 (t, J=6 Hz).cistanche benefíciosHMQC(13Cx'H)- ja HMBC(15Cx'H)-spektrit auttoivat täydellisiä ja yksiselitteisiä 'H- ja l3C-kemiallisia siirtymämäärityksiä. HMBC-ristipiikistä protoni kohdassa ou 2,60 vahvistettiin H{ {5}}(Kuva 2a). Muita spesifisiä merkkejä löydettiin viidelle metyylisingletille arvolla 1,89,1.02,0,82,1,32,1,20(kukin,H24-27;29), metyylidubletti og:lla 0,92(d, J=6 Hz) ja olefiininen protonisignaali 5,30:ssa (t, J=7 Hz, H-12). Nykyiset13CNMR-spektrit osoittavat 32 hiiliresonanssia ja DEPT- ja HMQC-spektreillä kaksi karbonyylihiiltä (δC183.70,C-28 ja 8-178.96,C-23), olefiinihiili. oc 127,23,C-12,olefiininen kvaternaarinen hiili (oc139,49,C-13),happipitoinen kvaternaarinen hiili （o-72.7, C-19 ）, kymmenen alifaattista metyleeniä ja kuusi metyylihiiltä. Kaksi olefiinista hiiltä δ-127.23（C-12) ja 139.49(C-13) olivat tyypillisiä ursaani-triterpenoidityypille. Toinen signaali osoitti etyleeniglykolin (-OCH-CH-O-) läsnäolon signaaleissa δ4,62（d, J=11.5 Hz）, 4,05（d, J=11. 5 Hz）, 3,52（d, J=11,5 Hz）ja 4,06（d, J=11,5 Hz）ja tuettu arvoilla δ61,27（t） ja 63,20（t）. Se sijaitsi C-2ja C-3 perustuu pitkän kantaman korrelaatioon HMBC-spektreissä. Tästä syystä yhdiste 1 tunnistettiin 2,3-O-etyleeniglykoliksi,19-hydroksiursiksi-12-en-23,28-dihapoksi (kuva 3a).

Yhdiste 2: saatiin valkoisena amorfisena jauheena. MS-ESI m/z 527,33 [MH]t (lask. 528,3815). LCMS-ESI-spektreissä molekyyli-ionihuippu on läsnä m/z:ssä 527,33 [MH]t, mikä osoittaa molekyylikaavan CH Os, joka vaati 8 tyydyttymättömyysastetta." IR-spektri sisälsi absorptiomaksimit, jotka vastaavat hydroksyyliä (2 927,8 cm{). {15}}) ja olefiiniset (1 686 cm-1) funktionaaliset ryhmät. Lisäksi 'HNMR-spektrit yhdisteelle 2 osoittivat singletin kohdassa 2,42, mikä on ominaista ursaanityyppisen triterpeenin H18:lle, jossa on {{24 }}O-korvaus.Cistanche-uute Anti-säteilyMuita spesifisiä ominaisspektrejä olivat kuuden metyylisingletin läsnäolo kohdassa og1.22 0.76, 0.97, 0.69,1.30ja 1.17(kukin,H -24-28,H-30), metyylidubletti 0,91 (d,J=7Hz) ja olefiininen protonisignaali ou:ssa 5,37 (d, J=7 Hz, H-12). Vastaava l3 (CNMR- ja DEPT-spektrit osoittavat 33 hiiliresonanssia, ja HSQC- ja HMQC-spektrit osoittavat karbonyylihiilen (oc 182,23, C-28), olefiinisen hiilen （δ-129.36, C -12）, olefiininen kvaternaarinen hiili （δ-140.24, C-13）, happea sisältävä kvaternaarinen hiili (oc73,68, C-19), yksitoista alifaattista metyleeni ja seitsemän metyylihiiltä. Nämä tiedot osoittivat, että yhdiste 2 sisältää ursaani-triterpenoidirungon. Muut signaalit osoittavat 1,3-propaanidiolin funktionaalisen ryhmän läsnäolon, og 3,22(d,J=11 0,5 Hz), 3,42 (d, J=10,5 Hz), 1,38 (m), 1,51 (m) ja 4,02 (d, J=11,5 Hz) ja 3,36 (t, J{ {57}}.5 Hz).Sen funktionaalisella ryhmällä on pitkän kantaman korrelaatio C2-C3:n kanssa. Näiden tulosten perusteella yhdiste 2 tunnistettiin siten nimellä 2,3-O-propaanidioli,{{ 66}}hydroksiurs-12-en-28-öljyhappo (kuvat 2b ja 3b). Samanlainen yhdiste on 2,3-O-isopropylideenipiinahappo, eristetty Rubus xanthocarpus.7:stä

Taulukossa 1 kaikkia 'H- ja 'C NMR-spektrejä verrattiin kärsimyshappoon (TA/2a,3a, 19-trihydroksi-12-ursen-28-oic acid）², joka on ursaanitriterpenoidi, joka on löydetty useista Rubus-lajeista-p Tormenttihapolla oli voimakkaita yhtäläisyyksiä yhdisteiden 1 ja 2 kanssa, paitsi että C-23:aan ja C31-33:aan liittyvät kemialliset siirtymät erosivat. Tämä osa vahvistettiin myös DEPT-, HMQC- ja HMBC-kokeet (kuva 2).

Triterpenoidi piinaa happoa on laajalti levinnyt luonnollisiin kasviruokiin. Sillä on erilaisia ​​bioaktiivisuuksia: hypoglykeemiset vaikutukset, anti-inflammatoriset ja antiaterogeeniset ominaisuudet vähentävät verisuonten sileän lihaksen solujen lisääntymistä ja antiproliferatiivisia vaikutuksia munuais-, eturauhas- ja melanoomasyöpäsolulinjoissa2426. Siksi, koska näillä yhdisteillä on sama luuranko, niillä ei ole mahdollista asianmukaista potentiaalista aktiivisuutta.

Kuvio 4 esittää isolaattien estävää elastaasi- ja tyrosinaasiaktiivisuutta. In vitro -entsyymi-inhibitiomäärityksistä saadut tiedot ilmaistiin standardipoikkeamana (SD). Yhdisteet 1 ja 2 estivät elastaasia ICso:lla 122,199 ja 98,22 ug/ml, ja myös tyrosinaasia ICso 207,79:llä ja 221,51 ug/ml:lla, vastaavasti. Joillakin pentasyklisillä triterpenoideilla (ursolihappo ja oleanolihappo) on raportoitu olevan elastaasia estävä vaikutus2728. Myös yhdisteen 2 elastaasin estoarvo on alhaisempi kuin yhdisteen 1. Molemmilla yhdisteillä oli vähemmän estoaktiivisuutta kuin positiivisella kontrollilla oleanolihapolla, jonka ICso-arvo oli 90,39 ug/ml. Aiemmat tutkimukset osoittivat oleanolihapon ICso-arvon olevan 76,5 ug/ml ja ursolihapon ICso-arvon 31,0 ug/ml28. Aiemmin raportoidut pentasyklisten triterpeenien kineettiset analyysit osoittivat, että nämä yhdisteet estävät kilpailevasti ja palautuvasti neutrofiilien elastaasia. Samassa tutkimuksessa molekyylitelakointikokeet osoittivat, että molekyylin tukirakenneosa 28-COOH ja kaksoissidokset pentasyklisissä triterpeeneissä ovat välttämättömiä niiden estovaikutuksille.

Yksi iän myötä ilmenevistä ongelmista on hyperpigmentaatio.cistanche herbaSiksi etsitään jatkuvasti ihoa vaalentäviä aineita tai uusia depigmentointiaineita. Tyrosinaasin suppressio voi toimia melanogeneesiä vastaan. Kuten kuviossa 4 esitetään, metanoliuutteella ja yhdisteillä I ja 2 oli kohtalaisia ​​aktiivisuuksia tyrosinaasin estäjinä.

Tässä tutkimuksessa molekyylitelakointia käytettiin myös analysoimaan valittujen yhdisteiden sitoutumisaktiivisuutta kohteinaan tyrosinaasiin ja elastaasiin. Käytetyt kiderakenteet olivat 2Y9X, Agaricus bisporus -lajin tyrosinaasin kiderakenne inhibiittorin tropolonin kanssa; ja BHGP, sian haiman elastaasin kiderakenne kompleksoituneena tehokkaan peptidyyli-inhibiittorin FR130180 kanssa. Molemmat valittiin, koska ne saatiin samasta organismista, jota käytettiin tämän tutkimuksen in vitro -testissä. Makromolekyylit on myös sidottu vastaaviin estäjiinsä, jotta entsyymikonformaatioiden aktiivinen tila voitaisiin saada. Sekakiteitä käytettiin molekyylin telakointikohteen keskipisteenä yhdisteen sitoutumistodennäköisyyksien kaventamiseksi, jotta pisteytysprosessista tulee tehokkaampi.

Molekyylitelakoinnista saatiin keskimääräiset sitoutumisaffiniteetit molemmille yhdisteille, kuten kuvissa 5 ja 6 on esitetty. Affiniteettiennustetta käytetään eri ligandien luokitteluun ottaen huomioon kunkin yhdisteen huippuenergia-asennon. Paremman energia-asennon ennuste on esitetty alemmat sitoutumisaffiniteettipisteet16. Nimetyn inhibiittorin tropolonin telakointi tehtiin keskimääräisillä sitoutumisaffiniteetilla -7,41 kcal/mol. Yhdisteiden 1 ja 2 keskimääräiset sitoutumisaffiniteetit tyrosinaasiin olivat -7,84 kcal/mol ja -8,37 kcal/mol, vastaavasti (taulukko 2). Molemmilla yhdisteillä ennustettiin olevan parempi affiniteetti kuin inhibiittorilla.

Sillä välin elastaseredockingin keskimääräinen sitoutumisaffiniteetti oli -7,84 kcal/mol. Yhdisteiden 1 ja 2 keskimääräiset sitoutumisaffiniteetit elastaasiin olivat -7,58 kcal/mol ja -8,06 kcal/mol, vastaavasti. Vaikka tulos osoitti, että yhdisteellä 1 on pienempi affiniteetti kuin sekakiteellä, se on hieman erilainen (<0.5 kcal/mol)compared="" to="" the="" inhibitor="" used="" hence="" the="" scores="" may="" ovelrlap31.="" these="" scores="" showed="" that="" both="" compounds="" were="" predicted="" to="" have="" affinities="" toward="" the="" enzymes,="" which="" is="" in="" conjunction="" with="" the="" in="" vitro="" assay="">

menetelmät

Yleiset kokeelliset menettelyt. 'H- ja ' NMR-spektrit tallennettiin 500 MHz:llä käyttämällä JEOL JNM-ECZ500R/S1 -laitetta. Infrapunaspektrit (IR) mitattiin FTIR:llä, IRPrestige-21, Shimadzu. Muut analyysit suoritettiin käyttämällä Waters UPLC-MIS XEVO G2-XS QTof -instrumenttia, VersaMax Microplate -lukijaa ja BioTek ELX800 Microplate Reader -laitetta, lore-pinnoitettuja alumiinilevyjä TLC-Silica gel 60 GF254 (Merck, Darmstadt, Saksa) , pylväskromatografia (CC) suoritettiin käyttämällä Silica gel 60:tä (Merck, Darmstadt, Saksa), jossa oli 70-230 mesh avoin kromatografia ja 230-400 mesh tyhjiökromatografia. Kasvimateriaalit. R. fraxinifolius -lehdet kerättiin istutusalueelta Pangrango-vuorella Länsi-Jaavalla 4 343 jalan korkeudelta joulukuussa 2018. Kasvitieteilijä (Dr. Joni Setijo) tunnisti näytteen Indonesian instituutin biologian tutkimuskeskuksessa. Sciences, Indonesia, näytteen numero 033/IPH.1.01/If.07. Kasvimateriaalin kerääminen oli saanut viljelijän luvan ja noudattanut viranomaismääräyksiä ja ohjeita.

Poisto ja eristäminen. Ilmakuivatut jauhemaiset lehdet (23 00 g) uutettiin käyttämällä Soxhlet-laitetta gradienttiliuottimella (n-heksaani, EtOAc ja MeOH) vastaavien uutteiden saamiseksi, minkä jälkeen ne haihdutettiin pyöröhaihduttimella. ja tyhjiöuuni. Metanoliuute (291 g) ja etyyliasetaattiuute (65 g) adsorboitiin silikageeliin ja suoritettiin tyhjönestekromatografia/VLC eluoiden vaiheittaisella EtOAc:MeOH-gradientilla (1:0 - 0:1) - tuottaa fraktioita jokaisesta uutteesta (Eal-Hall ja M{10}}Mill and). Samanlaiset fraktiot, joilla oli positiivisia reaktioita vanilliinirikkireagenssien kanssa TLC:ssä, yhdistettiin. Fraktion saanto: Eal-3 (2,27 g);Ea4-6 (8,47 g);Ea7-8 (12,9 g);Ea9-11 (22,3 g); ja M1-3 (4,89 g);M4-5 (5,1 g);M6-7 (6,02 g); M8 (166,42 g); M9 (10,53 g); M{{38 }}(2,9 g).Kaikista fraktioista tehtiin inhibiittorielastaasiaktiivisuus, Fr. M8 antoi suurimman sadon ja sillä oli voimakasta aktiivisuutta. Fr. M8 jaetaan peräkkäin CC:llä silikageelillä (eluentti CH2Cl2/MeOH vaiheittain gradientilla) ja puhdistettiin Sephadex LH-20 -kolonnilla (eluoiden CHCl3-MeOH:lla 100:10, tilavuus/tilavuus. Kaksi fraktiota osoittivat kiinteää luonnetta ja ne kiteytettiin kloroformilla ja metanolilla, jolloin saatiin kaksi isolaattia: yhdiste 1 (18 mg) ja: 2 (31 mg) Kaikkien isolaattien puhtaus arvioitiin kaksiulotteisella TLC:llä ja täplän visualisoimalla käyttämällä 5-prosenttista rikkihappoa. happoa metanolissa, minkä jälkeen levyjä kuumennettiin 110 asteessa 5 minuuttia.

Kiteet tunnistettiin ja karakterisoitiin käyttämällä nestekromatografia-massaspektroskopiaa (LCMS), LH- ja '3C-vääristymien parantamista polarisaation siirron (DEPT) NMR:llä, heteronukleaarista yksikvanttikoherenssia (HSQC), heteronukleaarista monikvanttikorrelaatiota (HMQC) ja heteronukleaarista moninkertaista. sidoskorrelaatio (HMBC).

Elastaasin estomääritys. Elastaasi-inhibitiomääritys suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla joillakin modifikaatioilla32. Lyhyesti, Nunc-96-kuoppamikrotiitterilevyillä, 20-μL:n alikvootit 0.8-yksikköä/ml PPE Trizma-asteen peruspuskurissa (pH 8.0 ) sekoitettiin 20-μL näytteiden kanssa ja seokset laimennettiin sitten 180 μL:ksi Trizma-asteisessa emäspuskurissa. Testiuutteita esi-inkuboitiin entsyymin kanssa 15 minuuttia ja lisättiin 20-μL:n alikvootteja substraatista N-sukkinyyli-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilidiä (A3PVN; 2,9 mM) ja inkuboitiin vielä 15 minuuttia. Positiivinen kontrolli ja nollakuopat sisälsivät oleanolihappoa ja vettä, vastaavasti. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja inhibitionopeudet määritettiin imeytymisen mukaan; 401 nm:ssä käyttämällä VersaMax-mikrolevylukijaa. Inhibitioprosentti laskettiin käyttämällä seuraavaa yhtälöä:

missä Ei on entsyymireaktion absorbanssi, Eb on entsyymin nollanäytteen absorbanssi, T on testinäytteen absorbanssi ja Tb on testinollan absorbanssi. myös arvot määritettiin lineaarisesta kaaviosta elastaasi-inhibitioprosentista suhteessa pitoisuuteen (50,75,100,125,150 ug/ml). Tyrosinaasin estomääritys. Tyrosinaasin esto määritettiin käyttämällä DOPA-kromin muodostusmenetelmää, kuten aiemmin on kuvattu pienin muutoksin13. Lyhyesti, 96-kuoppalevyillä 20 µl:n eriä DMSO:ta (kontrolli) tai eri pitoisuuksia koeyhdisteitä sekoitettiin 40 µl:n erien kanssa 30 U/ml sienityrosinaasia (Sigma Aldrich) ja {{11}μl:aa. 0.{13}}M fosfaattipuskuri (pH 6,8). Niitä esi-inkuboitiin 10 minuuttia huoneenlämmössä. Reaktiot aloitettiin lisäämällä 10 mML-DOPA:n alikvootteja 4 µl jokaiseen kuoppaan ja inkuboimalla 37 asteessa 20 minuuttia. Tyrosinaasiaktiivisuus määritettiin sitten mittaamalla absorbanssi 475 nm:ssä. Kojihappoa käytettiin positiivisena kontrollina. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena. Tyrosinaasin eston prosenttiosuus laskettiin käyttämällä seuraavaa yhtälöä:

missä E on entsyymireaktion absorbanssi, Eb on entsyymin nollanäytteen absorbanssi, T on testinäytteen absorbanssi ja Tb on testinollan absorbanssi. myös arvot määritettiin lineaarisesta kaaviosta elastaasi-inhibitioprosentista suhteessa konsentraatioon (250,125,62,5,31,25,15,6 ug/ml).

Molekyylitelakka. Tässä tutkimuksessa in silico farmakologista aktiivisuutta ennustettiin molekyylitelakalla lääkärin avulla. Kohdennettu molekyylitelakka tehtiin käyttämällä kokiteytettyä ligandia aktiivisen kohdan keskustana. Rakennetta 2Y9X käytettiin tyrosinaasin molekyylitelakointiin tropolonilla, joka on sienityrosinaasin estäjä, sen kokiteteenä. Molekylaarisen telakointikohdan keskipiste on määritetty X-, Y- ja Z-ulottuvuuksiksi -10.032;-28.769 ja -43.467. Ketju A erotettiin käyttöä varten ja Holmium-atomi poistettiin rakenteesta käyttämällä UCSF Chimeraa.

Tässä tutkimuksessa käytettiin myös 3HGP:n, sian elastaasin rakennetta.FR130180, koska kokidealia käytettiin molekyylin telakointikohdan keskipisteenä. Koordinaatit olivat 12.453, 9.237 ja 1.199 X, Y, Z mitoille, vastaavasti. Sitoutumisaffiniteetti analysoitiin kunkin molekyylitelakointilaskelman kymmenestä parhaasta konformeerista.

Tämä artikkeli on poimittu Scientifc-raporteista|(2021) 11:20452|https://doi.org/10.1038/s41598-021-99970-x