NMR-pohjainen aineenvaihduntaprofilointi radikaaleja poistavia ja ikääntymistä estäviä ominaisuuksia varten Osa 2

Ota yhteyttäoscar.xiao@wecistanche.comLisätietoja

2.5. Yrttiuutteiden luokittelu pääkomponenttianalyysin mukaan

Metaboliitin vaihtelua testattujen yrttien lehtien välillä analysoitiin edelleen käyttämällä monimuuttujatietoanalyysiä (MVDA). Pääkomponenttianalyysi (PCA), hahmontunnistusmenetelmä, on valvomaton MVDA, joka antaa hyvän käsityksen näytteiden välisestä yhteydestä. PCA-pisteytyskäyrät osoittivat yrttien jakautumisen klusteriin, kun taas latauskäyrät korostivat erotuksen aikaansaavat metaboliitit [85,86]. PCA-mallilla oli hyvä kunto (R2X=0.997) ja hyvä ennustettavuus (Q2=0.993), jossa R2X(cum)- ja Q2(cum)-ero oli pienempi kuin 0 .3, mikä osoittaa, että jokainen yrttiuute vaikutti yhtäläisesti ja tasaisesti havaittuun ryhmien erottumiseen. Tämä havainto oli linjassa Wheelockin et al. [87].

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja

Pääkomponenttianalyysin pisteytyskäyrä osoitti, että valitut yrtit erotettiin kahteen klusteriin ilman merkittäviä poikkeavuuksia, kuten kuvassa 4A esitetään. Pääkomponentti (PC)1 osoitti suurinta näytevaihtelua, sitten PC2. PC1 ja PC2 vaikuttivat varianssiprosenttiin 29,7 prosenttia ja PC2 24,9 prosenttia. Siksi nämä PC:t kuvasivat noin 54,6 prosentin kokonaisvarianssia. Latauspylväskaavion tulokset paljastivat metaboliitit, jotka ovat vastuussa yrttien erottumisesta PC1:n positiiviselle puolelle (V.negundo ja C.longa) ja PC1:n negatiiviselle puolelle (P. minus, P. indica, O.javanica ja C. caudatus) (kuva 4B).

PC1:n latauspylväskaavion tiedoissa havaittiin, että fenoliyhdisteet, pääasiassa flavonoidiryhmä ja fenolihapot, olivat vastuussa valittujen yrttien erottamisesta. Kvertsetiini (1), kversetiini-3-O-ramnosidi (2), kversetiini-3-O-glukosidi (3), kversetiini-3-O-glukuronidi (4), kversetiini-3- O-arabinofuranosidi (5), rutiini (6), mvrisetiinijohdannaiset (7), katekiini (8), epikatekiini (9), isoramnetiini (10), astragaliini (11), klorogeenihappo (12), gallushappo (13), kumarihapon (14), askorbiinihapon (15), muurahaishapon (21), fumaarihapon (22), 3-metyyliksantiinin (26) ja apigeniinin (28) pitoisuudet olivat enimmäkseen korkeampia P. minus, P. indica , C. caudatus ja O.javanica, koska ne sijaitsivat juonen negatiivisella puolella. Sitä vastoin V.negundo ja C.longa erottuivat muista yrteistä serotoniinin (27) ja D-limoneenin (29) läsnäolon perusteella uutteissaan.

2.6. Bioaktiivisuuksien ja aineenvaihduntatuotteiden välinen korrelaatio osittaisella pienimmän neliösumman analyysillä (PLS)

Mitattujen bioaktiivisuuksien ja testatuista yrteistä löydettyjen aineenvaihduntatuotteiden välisen yhteyden ymmärtämiseksi PLS, valvottu MVDA-metodologia, otettiin käyttöön riippumattomien muuttujien tietojen (metaboliittien NMR-kemiallinen siirtymä) korreloimiseksi riippuvaisten muuttujien tietoihin. olivat DPPH-, ABTS- ja ORAC-määritysten sekä anti-elastaasi- ja anti-kollagenaasiaktiivisuuksien esto. Tätä menetelmää sovellettiin, koska PLS:llä on suuri saavutus testattujen bioaktiivisuuksien yhdistämisessä metaboliitteihin, joten se voi tarjota mallin ennusteelle [88]. PLS-analyysin avulla voitiin vahvistaa suhde bioaktiivisuuksien, kuten radikaaleja poistavien toimintojen, ja ikääntymistä ehkäisevien ominaisuuksien välillä näytteissä olevien metaboliittien kanssa. Näin ollen voidaan ehdottaa metaboliitteja, jotka olivat vastuussa bioaktiivisina markkereina.

Biplot on sekoitus PLS-analyysistä saatuja pisteitä ja latauskäyriä, kuten Mediani et ai. [80]. Osittainen pienimmän neliösumman biplot radikaaleja poistavalle aktiivisuudelle (kuva 5A) ja ikääntymistä estävälle ominaisuudelle (kuva 5B) osoitti, että kaikki näytteet olivat hyvin erotettuja ja ryhmitelty ilman merkittäviä poikkeavuuksia. PC1 erotti P. minus-, C.caudatus- ja P. indica -lehdet V. negundosta, O.jaoanicasta ja C.longasta. Perustuen biplottien radikaaleja poistaviin toimintoihin ja ikääntymisen estoominaisuuksiin, malli esitti hyvät kunto-arvot (R'Y) {{10}},988 ja 0,966, vastaavasti. Samaan aikaan ennustettavuus (Q4) radikaaleja poistaville toiminnoille ja ikääntymistä ehkäiseville ominaisuuksille oli 0,984 ja 0,951.

Kuten radikaalien sieppaustoimintojen PLS-kaksoiskuvauksesta (kuvio 5A) käy ilmi, bioaktiivisuudet (DPPH, ABTS ja ORACassay) suunnattiin biplotin positiiviselle puolelle, joka oli aktiivisimmat alueet ja lähinnä P.minus, P. indica ja C.caudatus. Sitä vastoin V. negundo, O.javanica ja C. longa ohjattiin biplotin negatiivisille puolille, joita pidettiin vähiten aktiivisina alueina ja jotka olivat kauempana DPPH-, ABTS- ja ORAC-määrityksistä, ja ne osoittivat negatiivista korrelaatiota. bioaktiivisuuksien kanssa. Tässä tilanteessa P. mimus, P. indica ja C.caudatus ovat ryhmittyneet erilleen vähiten aktiivisista yrteistä, mikä osoittaa, että näillä yrteillä oli voimakkaampi radikaaleja poistava vaikutus, mikä viittaa siihen, että nämä yrttiuutteet saattoivat sisältää korkeampia fenolipitoisuuksia yhdisteet. Kolmen aktiivisimman yrtin joukossa P. minusin havaittiin korreloivan vahvemmin DPPH- ja ABTS-määrityksen kanssa, jota seurasi ORAC-määritys.

Tämä havainto oli sopusoinnussa suoritettujen radikaalinpoistotoimintojen in vitro -tulosten kanssa. Tulokset osoittivat, että P. minus osoitti voimakkaan vapaita radikaaleja poistavan vaikutuksen muihin yrtteihin verrattuna. Tulokset paljastivat siten, että P. minus on aktiivisin yrtti reaktiivisten happilajien hävittäjänä. Merkittäviä sekundaarisia metaboliitteja, jotka vaikuttivat P. miinuksen radikaaleja poistavaan aktiivisuuteen, tunnistettiin kversetiiniksi, kversetiini-3-O-ramnosidiksi, katekiiniksi, isorhamnetiiniksi, astragaliiniksi ja apigeniiniksi.oteflavonoidiKaikki nämä metaboliitit sijaitsivat lähempänä P. miinusta ja myös DPPH- ja ABTS-radikaalinpoistomäärityksiä. Mediani et al:n edellinen tutkimus.[80] Havaitsi myös, että pakastekuivattu kasvinäyte osoitti suuremman määrän -glukoosia, -glukoosia, katekiinia ja klorogeenihappoa, mikä saattoi vaikuttaa yrtin tehokkaaseen DPPH-radikaaleja poistavaan kykyyn. Kuitenkin uutteen tunnistamattomat metaboliitit voivat myös myötävaikuttaa P. minuuksen voimakkaaseen radikaaleja poistavaan vaikutukseen.

Samanlaisia ​​löydöksiä löydettiin myös ikääntymistä ehkäisevistä ominaisuuksista. Kuvassa 5B on esitetty ikääntymistä ehkäisevien ominaisuuksien PLS:stä saatu biplot. Bioaktiivisuudet (anti-elastaasin ja anti-kollagenaasin aktiivisuudet) projisoitiin biplotin positiiviselle puolelle, joka oli aktiivisin alue ja oli lähempänä P.minus-, P. indica- ja C.caudatus -alueita. Sitä vastoin V.negundo, O.javanica ja C.longa ohjattiin biplotin negatiiviselle puolelle, jota pidettiin vähiten aktiivisena alueena ja joka oli kauempana anti-elastaasista ja anti-kollagenaasiaktiivisuudesta. Tämä osoitti negatiivista tai heikompaa korrelaatiota bioaktiivisuuksiin. Tässä tilanteessa P.mimus, P.indica ja C. caudatus ryhmiteltiin erilleen vähiten aktiivisista yrteistä, mikä osoitti, että näillä yrttiuutteilla oli suurempi elastaasin ja kollagenaasin esto. Kolmen aktiivisimman yrtin joukossa P. minusilla havaittiin jälleen olevan vahva korrelaatio näiden ikääntymistä ehkäisevien ominaisuuksien kanssa verrattuna muihin yrtteihin.

Tämä havainto oli sopusoinnussa aiemmin tehtyjen anti-aging-ominaisuuksien in vitro -tulosten kanssa. Tulokset paljastivat, että P.minus oli aktiivisin yrtti elastaasi- ja kollagenaasientsyymien estämisessä. Merkittäviä sekundaarisia metaboliitteja, jotka vaikuttivat P. miinuksen ikääntymistä ehkäiseviin ominaisuuksiin, tunnistettiin kversetiiniksi, kversetiini-3-O-ramnosidiksi, myrisetiinijohdannaisiksi, katekiiniksi, isorhamnetiiniksi, astragaliiniksi ja apigeniiniksi. Muut metaboliitit, kuten -glukoosi, -glukoosi, fumaarihappo ja rasvahappo, voivat myös olla vastuussa bioaktiivisuudesta. Kaikki nämä metaboliitit sijaitsivat lähempänä P. miinusta ja anti-elastaasi- ja anti-kollagenaasiaktiivisuuksia.

Cistanche voi estää ikääntymistä

Näiden valittujen yrttien erottelu oli sopusoinnussa erityisesti korkean radikaalinpoistoaktiivisuuden näytteiden kanssa. miinus, P.India ja C.caudatus, joiden odotettiin erottuvan muista sekundaaristen aineenvaihduntatuotteiden, erityisesti flavonoidien, suuren pitoisuuden vuoksi. Näiden fenoliyhdisteiden läsnäolon uskotaan myös osaltaan lisäävän elastaasia ja kollagenaasia estäviä vaikutuksia. nämä yrtit [67-79,89-92].

Kasviuutteiden bioaktiivisten yhdisteiden vaikutus vapaita radikaaleja sieppaavaan kykyyn ja ikääntymistä estävään toimintaan on dokumentoitu useissa tutkimuksissa [66,72,75,79,92-101]. Lisäksi metaboliittien, kuten flavonoidien (kversetiini, kaempferoli, myrisetiini, epikatekiini ja katekiini) ja muiden fenolien, kuten resveratrolin ja prosyanidiini B2:n, on osoitettu estävän merkittävästi elastaasia ja kollagenaasia [69-71,79].

Tässä tutkimuksessa metaboliittisignaalit, joilla oli vaihteleva merkitys projisointiarvoissa (VIP) tunnistettiin ja tarkasteltiin, jotta saatiin merkittävimmät metaboliitit, jotka korreloivat testattujen bioaktiivisuuksien kanssa. Tämä tehtiin tässä esitettyjen tulosten eheyden lisäämiseksi, ja niissä tutkittiin tunnistettujen metaboliittien erottelukykyä.puritaanit c-vitamiiniGenerally, the metabolites signal with VIP>{0}}.5 katsottiin olevan merkittävää syrjinnän kannalta [102]. Tässä tutkimuksessa kaikki aineenvaihduntatuotteet, jotka edistävät radikaaleja poistavia vaikutuksia ja ikääntymistä estäviä ominaisuuksia, voitiin luokitella merkittäviksi erottaviksi metaboliiteiksi, koska niiden VIP-arvot olivat yli 1,0 (taulukko 2). Kaksi PLS-biplots-mallia validoitiin käyttämällä 100 satunnaista permutaatiota alkuperäisen mallin validiteetin (R2) ja ennustavan (Q2) kyvyn vahvistamiseksi useilla malleilla, verraten sovituksen hyvyyttä. R2 havainnollisti mallin sopivuuden olevan merkittävää ja selitti mallin Y-muuttujien arvosanan, kun taas Q2 tarjosi mallille ennustuslaadun, joka oli samanlainen kuin Eriksson et al. [103].

Generally, when the values of R2 and Q² are nearing 1, it reflects an improved presentation of the model in relation to goodness of fit and predictive quality [80]. In this study, R2 and Q2 values for both of the PLS models fell in the range of 0.951-0.988, which indicated outstanding goodness of fit(R2Y(cum)>0.8)and superior predictive ability (Q2(cum)>0.8). Tulokset paljastivat, että kaikki R:n Y-akselin leikkauspisteet< and="" q-="" for="" the="" assays="" in="" radical="" scavenging="" activities="" and="" anti-aging="" properties="" were="" within="" the="" limits="" of=""><0.3 and=""><0.05.>SistancheR2- ja Q2-leikkausarvot olivat alueella 0.0367-0.0872 ja -0.444 --0.492, mikä viittaa siihen, että molemmat PLS-mallit olivat kelvollisia. eikä osoittanut ylikuormitusta. Siksi nämä kaksi PLS-mallia voitiin luokitella hyviksi suorituskykymalleiksi ja nämä havainnot lisäsivät mallien luotettavuutta.

2.7. Toissijaisten aineenvaihduntatuotteiden suhteellinen kvantifiointi

Joidenkin valituista yrteistä tunnistettujen sekundääristen metaboliittien suhteellinen kvantifiointi on esitetty kuvassa 6. Nämä metaboliitit havaittiin enimmäkseen korkeammiksi aktiivisimmista yrteistä, kuten P. minus, sijaitsivat biplotien positiivisella puolella. ja olivat lähempänä lähes kaikkia testattuja bioaktiivisuuksia.mikä on cistancheNämä tulokset paljastivat, että sekundaariset metaboliitit erityisesti flavonoidiryhmän yhdisteistä, joita esiintyy suuria määriä P. minusissa, saattoivat vaikuttaa tämän yrtin vapaiden radikaalien hävittäjiin ja ikääntymistä ehkäiseviin ominaisuuksiin?

Kun verrattiin flavonoidin eri rakenteita, jotka olisivat voineet vaikuttaa niiden tehokkuuteen, havaittiin, että B-renkaan hydroksylaatiokuvio saattaa olla yksi tärkeimmistä tekijöistä metaboliittien ikääntyvien entsyymien toimintaan estävässä vaikutuksessa[80]. . Sim et al.[104] paljasti myös, että sekä proteiini- että mRNA-tasolla näiden flavonoidien estovaikutus tuli voimakkaaksi B-renkaan ryhmien lisääntyessä, ja he tutkivat joidenkin flavonoidien rakenne-aktiivisuusyhteyttä MMP:ssä-1 geeniekspressio UV-säteilytetyissä ihmisen ihon fibroblasteissa.

3. Materiaalit ja menetelmät

3.1. Kemikaalit ja reagenssit

Merck Millipore International (Darmstadt, Saksa) toimitti deuteroidun metanolin-d4(CH3OH-d4), deuteroidun KH2PO4:n, natriumdeuteriumoksidin (NaOD), trimetyylisilyylipropionihappo-d4-natriumsuolan (TSP), etanolin ja metanolin. kversetiini, fosfaattipuskuri, 2,2-difenyyli-1-pikryylihydratsyyli (DPPH),2,2-atsinobis(3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonihappo)[ABTS ],Trolox,kaliumpersulfaatti,2,2'-atsobis(2-amidinopropaani)[AAPH, epigallokatekiinigallaatti (EGCG),HEPES-puskuri, elastaasientsyymit,N-metoksisukkinyyli-Ala-Ala-Pro-Chloro,N - Metoksisukkinyyli-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilidin ja deuteriumoksidin (D2O) toimitti Sigma (Aldrich, Saksa).

3.2. Kasvimateriaali ja näytteenotto

Tuoreet O.jacanica-, P. minus- ja C.longa-lehdet kerättiin Felda Sungai Koyan Satusta, Raubista ja Pahangista. V.negundon lehdet saatiin Institute of Biosciencesta, Universiti Putra Malesiasta. Tuoreet P. indican lehdet kerättiin University Agriculture Parkista, Universiti Putra Malesiasta, ja C. caudatus -lehtien tuoreet lehdet kerättiin Agricultural Institutesta, Serdangista, Selangorista. Näistä yrteistä saatu kuponkinäyte sijoitettiin herbaarioon, Institute of Bioscience, Universiti Putra Malaysia, ja kasvitieteilijä validoi jokaisen näytteen.Anti-aging -vesisäiliöKaikki lehdet korjattiin johdonmukaisesti aamulla aurinkoisina päivinä aineenvaihduntatuotteiden sisällön luotettavuuden varmistamiseksi. Kunkin yrtin avoimella kentällä oleva koeala jaettiin kuuteen osaan ja jokainen näyte kerättiin kustakin segmentistä kuudena rinnakkaisena.

3.3. Näytteen valmistelu

Keräyksen jälkeen tuoreet lehdet pestiin juoksevalla vesijohtovedellä kaikkien jäännösten poistamiseksi, kuivattiin laboratoriopaperilla ja jäädytettiin välittömästi nestetypellä kaikkien entsymaattisten reaktioiden pysäyttämiseksi ja metaboliitit säilytettiin ennen lyofilisointia. Sitten näytteet kuivattiin LABCONCO:ssa (Kansas City, MO, USA) pakastekuivaimessa, kunnes tasainen paino ja kosteuspitoisuus saavuttivat alle 10 prosentin. Kaikki kuivatut näytteet jauhettiin laboratoriosekoittimella hienoksi jauheeksi ja siivilöitiin käyttämällä laboratoriotestiseulaa (ENDECOTTS LTD.Lontoo, Englanti), jonka koko oli 300 um tasaisen koon saamiseksi. Jauhemaiset näytteet tyhjiöpakattiin alumiinipakkaukseen suojaamaan niitä valolta ja kosteudelta ja säilytettiin -80 asteessa ennen analyyseja.

3.4. Poisto

Uuttomenetelmä, jonka ovat kuvanneet Mediani et ai. [105] noudatettiin tietyin muutoksin. Lyhyesti sanottuna 10 g kutakin jauhettua näytettä upotettiin 100 ml:aan 60-prosenttista etanolia kullanruskeassa erlenmeyerpullossa ja sonikoitiin 1 tunnin ajan ultraäänikylpysonikaattorilla (WiseClean, malli WUC-D10H, Soul, Korea) kontrolloidussa lämpötilassa (alle 40 astetta). . Näytteet suodatettiin Whatman-suodatinpaperin nro 1 läpi ja jäännökset uutettiin uudelleen kahdesti ja suodatettiin ensimmäisen uuton päätyttyä. Uutteet yhdistettiin sitten ja konsentroitiin käyttämällä pyöröhaihdutinta tyhjössä 40 asteessa. Sen jälkeen saadut viskoosit aineet pakastekuivattiin LABCONCO-pakastekuivaimella veden täydellisen poistumisen varmistamiseksi ja säilytettiin -80 asteessa jatkokäyttöön asti. Lopuksi kuivatut raakauutteet laimennettiin tarvittaviin pitoisuuksiin kaikkia suoritettuja tutkimuksia varten.

3.5. DPPH radikaalinpoistotoiminto

Näytteiden radikaalinpoistoaktiivisuus määritettiin noudattamalla Kong et al. kehittämää tekniikkaa.[106], joka kehitettiin Brand-Williamsin et al. [107]pienillä muutoksilla. Lyhyesti sanottuna, 50 ul näyteuutteita metanolissa eri pitoisuuksilla (0 - 500 ug/ml) lisättiin 195 uL juuri valmistettuun 0,2 mM metanoli-2,2-difenyyli-1-pikryylihydratsyyli (DPPH) -liuokseen ja säilytettiin. Kaikki testinäytteet valmistettiin 96-kuoppaiselle levylle. Värinpoistoprosessi rekisteröitiin aallonpituudella 515 nm käyttämällä spektrofotometriä (Biotek EL 800 mikrolevylukija, Bio-Tek, Winooski, VT, USA) 60 minuutin pimeässä inkuboinnin jälkeen ja sitä verrattiin positiivisiin kontrolli- ja nollanäytteisiin. Radikaalien poistoaktiivisuuden prosenttiosuus mitattiin seuraavan yhtälön mukaisesti:

jossa A kontrolli on kontrollin absorbanssi ilman kasviuutteita ja Simple on kasviuutteiden absorbanssi.

Kasviuutteet tai positiiviset kontrollipitoisuudet, jotka pyyhkäisivät 50 prosenttia stabiilista vapaiden radikaalien DPPH:sta, laskettiin IC-arvoina käyttämällä lineaarista kuvaajaa radikaalinpoistoaktiivisuuden prosenttiosuudesta.

kasviuutteet/positiiviset kontrollipitoisuudet. Alempi IC-arvo osoitti korkeampaa antioksidanttiaktiivisuutta. Kaikki kokeet suoritettiin kuudessa rinnakkaisnäytteessä Troloxin ja kversetiinin kanssa positiivisina kontrolleina.

3.6.ABTS Radical Scavenging Assay

ABTS-radikaalinpoistomäärityksessä analyysi suoritettiin noudattaen Arnaon et al. kuvaamaa menettelyä.[108] joissakin muutoksissa. Valmistetut varastoliuokset olivat 7 mM ABTS plus -liuosta ja 2,45 mM kaliumpersulfaattiliuosta. Työliuoksen valmistamiseksi kahta kantaliuosta sekoitettiin samat määrät ja annettiin reagoida pimeässä 16 tuntia huoneenlämpötilassa. Sitten työliuos laimennettiin tislatulla vedellä, jotta saavutettiin 0,700 ± 0,005 yksikön absorbanssi 734 nm:ssä käyttämällä spektrofotometriä (UV-1650PC-spektrofotometri, Shimadzu, Kioto, Japani) ja joka tunnetaan nimellä ABTS plus ratkaisu. ABTS plus -liuos valmistettiin juuri jokaista määritystä varten. Tämän ABTS plus -liuoksen (900 µl) annettiin reagoida 100 µl:n kanssa yrttiuutteita 2 minuutin ajan. Absorbanssi luettiin sitten aallonpituudella 734 nm käyttämällä spektrofotometriä. Kehitettiin standardikäyrä, joka sisälsi 3,1 ug/ml ja 50 ug/ml Troloxia, ja tulokset ilmaistiin mg Trolox-ekvivalenttia antioksidanttikapasiteettia/g näytettä (mg TEAC/g näytettä).

3.7. ORAC Radical Scavenging Assay

ORAC-määritys peroksyyliradikaalien poistotehokkuuden mittaamiseksi toteutettiin, kuten Huang et ai. [109] käyttäen FLUOstar OPTIMA -mikrolevyfluoresenssilukijaa (BMG LABTECH, Ortenberg, Saksa). Jokainen yrttiuute ja Trolox (standardi) valmistettiin 75 mM fosfaattipuskuriliuokseen (PBS) pH 7,4. 96-kuoppaan mustaan ​​mikrolevyyn lisättiin yhteensä 150 µl fluoreseiinia (10 nM liuotettuna PBS:ään), minkä jälkeen lisättiin 25 µl Troloxia, kasviuutteita tai PBS:ää nollanäytteenä. Nämä liuokset pipetoitiin kolmeen rinnakkaiskuoppaan. Mikrolevyä inkuboitiin 15 minuuttia 37 asteessa ja peitettiin kannella. Fluoresenssi mitattiin viritysaallonpituudella 458 nm ja emissioaallonpituudella 520 nm. Taustasignaali määritettiin mittaamalla 90 sekunnin välein.

Sen jälkeen 25 ul juuri valmistettua 2,2'-atsobista (2-amidinopropaania) (AAPH, 240 mM PBS:ssä) syötettiin koneessa olevilla injektoreilla. Fluoresenssin vaimeneminen otettiin sitten 90 minuuttiin käyttämällä samoja viritys- ja emissioaallonpituuksia. Arviointi suoritettiin näytteiden käyrän alla oleville alueille (fluoresenssi vs. aika) miinus nollanäytteen käyrän alla oleva pinta-ala ja sitä verrattiin standardikäyrään (25-400 μM Trolox). Troloxiin liittyvät ORAC-arvot laskettiin käyttämällä yhtälöä seuraavasti:

3.8. Elastaasin estomääritys

Elastaasia estävä aktiivisuus määritettiin Krause et al. kuvaaman tekniikan mukaisesti.[110], pienin muutoksin Ndlovu et ai. [75]. Näytekuopat sisälsivät 25 µl 0,1 M HEPES-puskuria (pH 7,5), 25 µl yrttiuutetta (100 ug/ml) ja 25 µl elastaasientsyymiä (1 ug/ml). Nollakuopat sisälsivät vain 75 µl HEPES-puskuria ja negatiiviset kontrollikuopat sisälsivät 50 µl HEPES-puskuria ja 25 µl elastaasientsyymiä. Positiiviset kontrollikuopat sisälsivät 25 µl HEPES-puskuria, 25 µl N-metoksisukkinyyli-Ala-Ala-Pro-Chloroa (10 ug/ml) ja 25 µl elastaasientsyymiä. Liuotinkontrollikuopat sisälsivät 25 µl HEPES-puskuria, 25 µl 10-prosenttista metanolia ja 25 µl elastaasientsyymiä. Yrttiuutteen tyhjät kontrollit (jokaisen testatun uutteen värikontrollit) sisälsivät 150 µl HEPES-puskuria ja 25 ul yrttiuutetta. Mikrokuoppalevyä inkuboitiin sitten 20 minuuttia huoneenlämpötilassa. Tämän jälkeen lisättiin 100 µl substraattia (N-metoksisukkinyyli-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilidi, 1 mM). Sitten levyjä inkuboitiin vielä 40 minuuttia 25 °C:ssa. Inkuboinnin jälkeen absorbanssi luettiin käyttämällä spektrofotometriä (Biotek EL800 mikrolevylukija) 405 nm:ssä. Yrttiuutteiden estoprosentti laskettiin käyttämällä yhtälöä seuraavasti:

jossa A kontrolli on elastaasin ja liuottimen sisältävän puskurin absorbanssi ja Atest on puskurin, elastaasin ja yrttiuutteen tai N-metoksisukkinyyli-Ala-Ala-Pro-Chloron absorbanssi.

3.9. Kollagenaasin estomääritys

Kollagenaasin estoaktiivisuus suoritettiin noudattaen Van-Wartin ja Steinbrinkin [111] (1981) menetelmää Madronen et ai. [92]. Testi toteutettiin 50 mM TES-puskurissa (pH 7,4 ja 0,36 mM CaCl2). Clostridium histolyticumista peräisin oleva kollagenaasientsyymi (ChC-EC.3.4.23.3) valmistettiin pitoisuudella 0,8 yksikköä/ml (liuotettuna TES-puskurivarastoliuokseen). Synteettinen substraatti N-[3-(2-furyyli)akryloyyli]-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA) valmistettiin pitoisuutena 2 mM TES-puskurivarastoliuoksessa. Lopullisen reaktioseoksen kokonaistilavuus 150 µl sisälsi 46,3 µl TES-puskuria, 60 µl FALGPA (0,8 mM FALGPA:n lopullinen konsentraatio), 18,7 µl kollagenaasientsyymiä (0,1 yksikköä/ml hänen uutetta 25 s). 100 ug/ml). Yrttiuutteita ja entsyymejä TES-puskurissa inkuboitiin huoneenlämpötilassa 15 minuuttia ennen substraatin lisäämistä kemiallisen reaktion käynnistämiseksi. Negatiiviset kontrollit suoritettiin TES-puskurilla. Substraatin lisäämisen jälkeen absorbanssi luettiin välittömästi aallonpituudella 340 nm käyttämällä spektrofotometriä (Benchmark Plus Microplate, Bio-Rad 170-6930, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 96-kuoppaisilla mikrotiitterilevyillä ja mitattiin jatkuvasti toiselle. 20 min. Positiivinen kontrolli suoritettiin käyttämällä epigallokatekiinigallaattia (EGCG) pitoisuudella 12,5 ug/ml. Näytteiden estoprosentti laskettiin käyttämällä yhtälöä seuraavasti:

jossa A kontrolli on TES-puskurin absorbanssi ja Atest on TES-puskurin, kollagenaasientsyymin ja kasviuutteen tai FALGPA:n absorbanssi.

3.10. Metaboliitin profilointi 'H-NMR-mittauksella

Metaboliitin profilointi käyttäen valittujen yrttien H-NMR:ää suoritettiin Kimin et ai. kuvaaman protokollan perusteella. [47] pienin muutoksin. Raakoja yrttiuutteita (25 mg) siirrettiin ml:n mikrosentrifugiputkeen. Yrttinäytteisiin lisättiin metanoli-d4- ja KHPO4-puskurin seosta Dao:ssa (pH 6.0), joka sisälsi 0,1 prosenttia trimetyylisilypropionihapon natriumsuolaa (TSP) kokonaistilavuudella { {10}},7 ml (1:1)-suhteessa. Yrttiuutteita sisältäviä mikrosentrifugiputkia vorteksoitiin sitten 1 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, mitä seurasi ultraäänikäsittely 15 minuutin ajan. Sitten seosta sentrifugoitiin 1 0 min 5678 g:ssä supernatantin erottamiseksi kaikista liukenemattomista materiaaleista. Seuraavaksi 0,6 ml kirkasta supernatanttia lisättiin NMR-putkiin ja sille suoritettiin 'H-NMR-analyysi. 'H-NMR:n analyysi suoritettiin 500 MHz Varian INOVA NMR -spektrometrillä (Varian Inc., Palo Alto, CA, USA), joka toimi taajuudella 499,887 MHz ja spektrit tallennettiin 26 asteessa. Jokainen yksittäinen spektri käsitti 64 skannausta, joiden kuvausaika oli 3,53 minuuttia ja leveys 20 ppm. Tiedot analysoitiin käyttämällä Chenomx-ohjelmistoa (v.6.2) (Clhenomx Inc, Edmonton, AB, Kanada) vaiheistuksen ja perustason korjauksen suorittamiseksi yhdenmukaisella asetuksella. Monimuuttuja-aineiston analyysi suoritettiin käyttämällä SIMCA-ohjelmistoa (versio 13.0, Umetrics, Umea, Ruotsi). 3.11. 'H-NMR-spektrien ämpäriminen

H-NMR-spektrien ryhmittely toteutettiin käyttämällä Chenomx-ohjelmistoa (v.6.2, Edmonton, AB, Kanada). Kaikki spektrit yhdistettiin 0.5-10.0 pprn-alueelta samoilla parametreilla. Parametrit sisälsivät §0.04 spektrin leveyden, joka sai yhteensä 245 integroitua aluetta jokaiselle NMR-spektrille. Veden ja jäännösmetanolin-d kemiallinen siirtymä arvolla δ4.70-4.90 ja δ3.27-3.35, vastaavasti, eliminoitiin. Yhtenäiset yhdistetyt tiedot alistettiin sitten monimuuttujatietoanalyysille (MVDA).

3.12. Metaboliittien suhteellinen kvantifiointi

Tunnistetut metaboliitit tutkittiin niiden suhteellisen kvantifioinnin suhteen, joka laskettiin signaalien keskimääräisen huippualueen perusteella LH-NMR-spektrien yhdistämisen jälkeen.

3.13. Tilastollinen analyysi

Kaikki kuuden toiston tulokset ilmaistiin keskiarvoina ± standardipoikkeama. Radikaalia poistavien aktiivisuuksien, elastaasi- ja kollagenaasiaktiivisuuksien estämisen ja metaboliittien suhteellisen kvantifioinnin mittaamiseksi suoritettiin tilastolliset analyysit käyttämällä Minitab 16:ta (versio 16, Minitab Inc., State College, PA, USA). Varianssianalyysejä (ANOVA) käytettiin tutkimaan merkitseviä eroja keskiarvojen välillä p<0.05 considered="" as="" significantly="" different.="" principal="" component="" analysis="" (pca)="" and="" partial="" least="" square="" (pls)="" from="" the="" multivariate="" data="" analysis="" （mvda）,="" were="" implemented="" using="" simca-p="" software（v.="" 13.0,="" umetrics,="" umeå,="" sweden）using="" the="" pareto="" scaling="" method="" after="" the="" binning="" of="" nmr="" spectra="" was="" completed.="" the="" correlation="" between="" metabolites="" components="" and="" ics0="" values="" for="" dpph="" radical="" scavenging="" activity="" was="" converted="" to="" 1/ic5so="" in="" order="" to="" acquire="" the="" same="" trend="" as="" the="" functional="" properties="">

4. Johtopäätökset

H-NMR-analyysien käyttö yhdistettynä MVDA:han onnistui tutkimaan valittujen yrttien metaboliittien vaihtelua. PCA-pisteytyskäyrä osoitti yrttien selkeän erottelun niiden klustereiden mukaan. Tämä tutkimus paljasti, että P. minusilla oli suurin radikaaleja poistava vaikutus DPPH- ja ABTS-määritysten kautta ja että sillä oli korkein ikääntymistä estävä vaikutus. Kaksi PLS-analyysin biplottia vahvisti tämän tuloksen edelleen, koska P. minus -bakteerissa tunnistettujen metaboliittien ja testattujen bioaktiivisuuksien välillä havaittiin vahva yhteys. Aktiivisia metaboliitteja, joiden uskotaan edistävän P.minuksen radikaaleja poistavia vaikutuksia ja ikääntymistä estäviä ominaisuuksia, ovat olleet kversetiini, kversetiini-3-O-ramnosidi, myrisetiinijohdannaiset, katekiini, isorhamnetiini, astragaliini ja apigeniini. Siksi voidaan olettaa, että nämä metaboliitit olivat vastuussa P. miinuksen voimakkaasta radikaaleja poistavasta vaikutuksesta ja korkeista ikääntymistä estävistä ominaisuuksista. Nämä metaboliitit olivat pääasiassa flavonoidien ryhmästä, erityisesti flavonoleja. Siksi voidaan ehdottaa, että P. minus -bakteerin metaboliitit voisivat olla lupaava vapaiden radikaalien hävittäjä ja ikääntyvien entsyymien estäjä, jota voidaan käyttää ikääntymisen oireiden viivyttämiseen ja ikääntymiseen liittyvien kroonisten sairauksien hoitoon. Nämä havainnot auttavat vahvistamaan P. minusin tehokkuuden mahdollisena luonnollisena ikääntymistä ehkäisevien aineiden lähteenä ja luonnollisena vapaiden radikaalien hävittäjänä.

Tämä artikkeli on poimittu julkaisuista Molecules 2019, 24, 3208; doi:10.3390/molecules24173208 www.mdpi.com/journal/molecules