Bioaktiiviset bakteerinanoselluloosakalvot, jotka on rikastettu Eucalyptus Globulus Labillilla. Jättää vesipitoisen uutteen ikääntymistä estävään ihonhoitoon

Ota yhteyttäoscar.xiao@wecistanche.comLisätietoja

Abstrakti:Bakteerien nanoselluloosa (BNC) kalvot, joilla on merkittäviä fysikaalisia ja mekaanisia ominaisuuksia, nousivat monipuoliseksi bioaktiivisten yhdisteiden biopolymeeriseksi kantajaksi ihonhoitosovelluksiin. Tässä tutkimuksessa BNC-kalvoihin lisättiin glyserolia (pehmittimenä ja kosteuttavana aineena) ja eri annoksia (1-3 ug cm-2) vesipitoista uutetta, joka saatiin Eucalyptus globulus Labillin hydrotislauksesta. lehdet (HDE), käytettäväksi arkkinaamioina. Kaikki kalvot ovat kestäviä ja erittäin muokattavia kuivassa ja märässä tilassa, ja niillä on samanlaiset tai jopa paremmat mekaaniset ominaisuudet kuin kaupallisilla BNC-naamioilla. Lisäksi HDE:n havaittiin antavan annoksesta riippuvaa antioksidanttiaktiivisuutta puhtaalle BNC:lle. Lisäksi 3 kuukauden varastoinnin jälkeen 22-25 asteessa ja 52 prosentin suhteellisessa kosteudessa (RH) tai 40 °C:ssa ja 75 prosentin suhteellisessa kosteudessa vahvistettiin, että kalvon antioksidanttiaktiivisuus ja makroskooppinen puoli 2 ug cm{10 }} HDE:stä säilytettiin. Kalvojen osoitettiin myös olevan sytotoksisia HaCaT- ja NIH/3T3-soluja kohtaan, ja kalvo, jossa oli 2 ug cm-2 HDE:tä, aiheutti merkittävän vähenemisen vanhenemiseen liittyvässä -galaktosidaasiaktiivisuudessa NIH/3T3-soluissa. Nämä havainnot viittaavat saatujen kalvojen soveltuvuuteen ja potentiaaliin bioaktiivisina kasvonaamina ikääntymistä ehkäistävissä sovelluksissa.

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja

Avainsanat:bakteeri nanoselluloosa; Eucalyptus globulus Labill. lehdet; vesipitoinen uute; antioksidanttiaktiivisuus; arkki kasvonaamiot; ikääntymistä vastaan; ihonhoitosovelluksia

1. Esittely

Maailman väestö ikääntyy huomattavasti johtuen syntyvyyden laskusta ja eloonjäämiskyvyn paranemisesta ja sitä seuranneesta keskimääräisen elinajanodotteen kasvusta, mikä liittyy viime vuosikymmeninä saavutettuun lääketieteen ja teknologian kehitykseen [1,2]. Maailman 60-vuotiaiden tai sitä vanhemman väestön odotetaan nousevan noin 2,1 miljardiin vuoteen 2050 mennessä, mikä merkitsee noin kaksinkertaista kasvua vuodesta 2017, ja 80-vuotiaiden ja sitä vanhempien ihmisten määrän odotetaan lähes kolminkertaistuvan samana ajanjaksona 3]. Parantuneesta pitkäikäisyydestä huolimatta ihon ikääntyminen on kuitenkin väistämätön prosessi, ja siksi anti-aging-ihonhoitotuotteiden kysynnän odotetaan kasvavan.

Ihon ikääntyminen on monimutkainen biologinen prosessi, jossa yhdistyvät endogeeniset ja eksogeeniset mekanismit [4]. Endogeenisen ikääntymisen määräävät pääasiassa geneettiset tekijät ja hormonaaliset muutokset, jotka tapahtuvat normaalin ikääntymisprosessin yhteydessä [4]. Toisaalta ulkoista ikääntymistä välittävät ulkoiset tekijät (esim. liiallinen altistuminen ultraviolettisäteilylle (valokuvavanheneminen), painovoima, tupakointi, saastuminen ja huono ravitsemus)[5]. Molemmissa ikääntymisprosesseissa, mutta erityisesti eksogeenisessa, on hyvin hyväksyttyä, että reaktiivisten happilajien (ROS) aiheuttamalla lisääntyneellä oksidatiivisella stressillä, joka johtuu ROS-tuotannon ja antioksidanttipuolustuksen välisestä epätasapainosta, on ratkaiseva rooli [{{3} }]. Iän myötä myös ihmisen ihosolujen kyky korjata vaurioitunutta DNA:ta heikkenee, mikä vaikuttaa myös ihon ikääntymiseen [8].Cistanche-uute Anti-säteilySiten ikääntymisprosessi aiheuttaa useita biokemiallisia muutoksia ihon koostumuksessa, mikä vaikuttaa sen rakenteeseen ja toimintaan [9], mikä johtaa näkyviin merkkejä, kuten ryppyjä, kuivuutta, elastisuuden menetystä, ohenemista, karkeaa rakennetta tai epäsäännöllistä pigmentaatiota [7,10] . Tästä syystä terveyteen ja hyvinvointiin pyrkiessä, johon myös ihon terveys ja estetiikka sisältyvät, on kehitetty kosmetiikkaa, joka sisältää bioaktiivisia yhdisteitä ehkäisemään tai vähentämään ihon ikääntymistä ja sen ulkoisia merkkejä ja siten parantamaan ihon ulkonäköä. kosmetiikkateollisuuden tutkimuksen ja innovaatioiden edelläkävijä viime vuosikymmeninä. Tässä yhteydessä ja paikalliseen hoitoon tarkoitetun kosmetiikan joukossa kauneusnaamiot ja erityisesti arkkinaamiot ovat kasvavat markkinat, ja niiden vuotuisen kasvuvauhdin (CAGR) odotetaan olevan 8,1 prosenttia vuosina 2019–2027 [11]. Tämäntyyppinen maski on erityisen houkutteleva nykyajan kuluttajille, mikä johtuu suurelta osin sen yksinkertaisesta ja helposta levittämisestä, nopeasta käytöstä ja tehokkuudesta]12. Näiden arkkinaamarien tukimatriisina voidaan käyttää useita materiaaleja, nimittäin synteettisiä polymeerejä (esim. poly(vinyylialkoholi) ja silikonia), kankaita (esim. kuitukangas ja puuvilla), hydrogeelejä (esim. kollageeni- ja silkkipohjaiset hydrogeelit) )tai selluloosan nanokuituja, kuten bakteerinanoselluloosaa (BNC)[13]. Luonnosta johdettujen ihonhoitotuotteiden kasvavan kysynnän myötä BNC on tullut yhä tärkeämmäksi ja on nyt erinomainen biopohjainen materiaali, jota jotkut ovat jo tutkineet ja kaupallistaneet parhaat kosmetiikkayritykset (esim. Lancome, Elizabeth Arden ja DHC)[14], jotka seuraavat vihreiden kuluttajien kysyntää.

Bacterial nanocellulose is an extracellular polysaccharide produced by several non-pathogenic bacteria from different genera (e.g., Komagataeibacter (formerly Gluconacetobacter), Agrobacterium, Rhizobium, Escherichia, and Aerobacter), through fermentation in the presence of oxygen and carbon sources(e.g., glucose)[1516]. BNC is synthesized in the air-culture medium interface as an ultrafine 3D nanofiber network, showing high water content(>90 prosenttia), korkea hydrofiilisyys ja nanohuokoinen rakenne [17]. Staattisessa viljelmässä valmistettuna BNC saadaan hyytelömäisenä hydrogeelimäisenä kalvona, jonka paksuus ja viljelyastian muoto vaihtelevat (eli in situ -muovattavuus), mikä on etu, kun halutaan ennalta määrätty muoto [18]. BNC:n ainutlaatuisten ominaisuuksien joukkoon kuuluu myös korkea kiteisyys ja puhtaus, huomattava mekaaninen lujuus ja lämpöstabiilisuus [19]. Sen lisäksi, että BNC on biohajoava, se on myös osoittanut hyvää ihonsietokykyä ja biologista yhteensopivuutta useissa in vivo -tutkimuksissa [20-22], mikä tekee siitä ihanteellisen materiaalin ihonhoitotuotteille. Tältä osin ja huokoisen nanorakenteensa vuoksi BNC:n soveltuvuus ja tehokkuus ihon aktiivisten yhdisteiden kantajana on ollut useiden töiden painopisteenä, esimerkiksi kofeiinin [23], silkki-serisiinin toimittamisessa. [24], retinoli [25] tai rutiini [26]. Lisälukemista varten tuore katsaus tarjoaa kattavan yleiskatsauksen BNC:n monipuolisuudesta ja soveltuvuudesta vihreässä kosmetiikassa, myös ihon aktiivisten aineiden kantajana [27].

cistanche voi estää ikääntymistä

Luonnollisia bioaktiivisia yhdisteitä käytetään laajalti ikääntymistä estävässä ihonhoitokosmetiikassa [28].cistanche herbaErityisesti kasviuutteet ovat runsas bioaktiivisten yhdisteiden (mm. polyfenolien, terpenoidien, vitamiinien) lähde, joilla voi olla useita ihoon kohdistuvia vaikutuksia, ja tyrosinaasia inhiboivien vaikutusten antioksidanttiset ja antimikrobiset vaikutukset ovat tärkeimmät tähän mennessä raportoidut edut. 29]. Siksi, kun otetaan huomioon luonnontuotteiden nykyinen suuntaus kosmetiikassa, kasviuutteet ovat lupaavimpia ainesosia ihonhoitotuotteiden kehittämisessä. Lisäksi luonnonuutteiden sisällyttämistä BNC-kalvoihin on tutkittu myös kosmeettisiin tarkoituksiin. Esimerkkejä ovat teokset, joissa kerrotaan propolis-uutteen, jolla tiedetään olevan antiseptinen ja supistava vaikutus[13,30], kaura- ja rosmariiniuutteet, joilla on kosteuttavia vaikutuksia [13], tai kosmeettinen koostumus, joka koostuu Adansonia digitata -hedelmästä, Hibiscus sabdariffa -kukasta, Coffea arabica -siemenkakku, Kigelia Africana -hedelmät sekä Acacia- ja Crocus chrysanthus -sipuliuutteet, joilla on ikääntymistä estäviä ominaisuuksia, nimittäin ryppyjä tasoittavia [21]. Äskettäin tehdyssä katsauksessa käsiteltiin kriittisesti BNC:n ja kasvifenolien yhdistämisen tärkeyttä UV-säteilyn aiheuttamien ihovaurioiden estämiseksi [31].

Eucalyptus globulus Labill. ikivihreä puu on tunnettu bioaktiivisten yhdisteiden, nimittäin fenoliyhdisteiden, kuten fenolihappojen, flavonoidien tai hydrolysoituvien tanniinien lähde [32-36]. Näitä yhdisteitä sisältävien E. globulus -uutteiden antioksidanttiset ja antimikrobiset vaikutukset on osoitettu useissa tutkimuksissa [34,35]. Kosmetiikan alalla tehdyssä äskettäisessä tutkimuksessa osoitettiin kuivatusta kaupallisesta E.globulus-biomassasta saadun 50-prosenttisen etanoliuutteen suojaava vaikutus sekä in vitro (ihmisen ihon fibroblasteissa) että in vivo (karvattomat hiiret) UV-indusoitua valovanhenemista vastaan. , joilla on lupaavia tuloksia ryppyjen muodostumisen ja ihon kuivumisen ehkäisyssä [37]. Kuitenkin parhaan tietomme mukaan E.globulus-uutteita ei ole koskaan tutkittu yhdessä polymeerisubstraatin kanssa bioaktiivisten ihonaameiden tuottamiseksi ikääntymistä ehkäisevään ihonhoitoon.

Tästä näkökulmasta tämän työn tarkoituksena oli tuottaa BNC-membraaneja, jotka on ladattu E.globulus-lehtien vetytislauksesta (hydro-tislausuute, HDE) saadulla vesipitoisella uutteella. Hydrotislaus on teollisuudessa yleisesti käytetty menetelmä eteeristen öljyjen uuttamiseen [38]. Lisäksi glyserolia (G), joka on laajalti käytetty kosteuttava ainesosa kosmetiikassa [39], lisättiin myös BNC-kalvoihin (7,5 mg cm-2) ​​niiden joustavuuden ja samalla niiden mukautuvuuden lisäämiseksi. iho. Näin ollen tämän työn tavoitteena oli saada aikaan täysin biopohjainen materiaali, jolla on toiminnallisia ominaisuuksia mahdollista käyttöä ikääntymistä estävänä arkkinaamiona. BNC-kalvot, jotka oli ladattu eri annoksilla hydrotislausuutetta, karakterisoitiin niiden morfologian, mekaanisten ominaisuuksien, lämpöstabiilisuuden ja kosteudenottokyvyn suhteen. Lisäksi arvioitiin myös eri kalvojen kemiallinen antioksidanttiaktiivisuus sekä niiden sytotoksisuus in vitro (ihmisen keratinosyyttien ja hiiren fibroblastien solulinjoissa). Lisäksi antioksidanttiaktiivisuus pysyy stabiilina 3 kuukauden varastoinnin jälkeen, pimeässä, 22-25 asteessa ja 52 prosentin suhteellisessa kosteudessa (RH) tai 40 asteessa ja 75 prosentin suhteellisessa kosteudessa kalvon ollessa 2 ug cm{{19} } HDE:stä arvioitiin. Lopuksi tutkittiin edelleen BNC-kalvon in vitro vanhenemista estävää aktiivisuutta 2 ug cm-2 HDE:llä.

2. Materiaalit ja metodit

2.1. Kemikaalit ja materiaalit

Citric acid (≥99.5%), dimethyl sulfoxide (DMSO) (≥99.0%), disodium hydrogen phosphate(≥99.0%), glucose(≥99.5%), glycerol(≥99.5%), magnesium nitrate hexahydrate (≥99.0%), potassium chloride(≥99.0%), potassium dihydrogen phosphate (≥99.0%), potassium sulphate (>99.0%), sodium bicarbonate (>99.5%), sodium chloride (>99.0 prosenttia ), ja 3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) (suurempi vähintään 97,5 prosenttia ostettiin Sigma-Aldrichilta (Lissabon, Portugali). Kaikki muut kemikaalit olivat laboratoriolaatua.cistanche peniksen kasvuKalsiumkloridi, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), etoposidi, Folin-Ciocalteun fenolireagenssi, magnesiumkloridi, natriumpyruvaatti, trypsiini-EDTA-liuos, N-(2-hydroksietyyli)piperatsiini-N'-({{6}) }etaanisulfonihappo),4-(2-hydroksietyylipiperatsiini-1-etaanisulfonihappo (HEPES) ja 2,2-difenyyli-1-pikryylihydratsyyli (DPPH) toimitti Sigma-Aldrich (Lissabon, Portugali) Peptoni ja hiivauute hankittiin Himedia Laboratories GmbH:lta (Einhausen, Saksa) Naudansikiön seerumi (FBS), penisilliini ja streptomysiini ostettiin Gibcolta (Carlsbad, CA, USA).

Näytteitä BNC:n kaupallisesta arkkinaamarista käytettiin mekaanisissa ja kosteudenottomäärityksissä vertailua varten. Kaupallisen BNC-kasvonaamion (Superstart Probiotic Boost Skin Renewal Biocellulose Mask, Elizabeth Arden, New York, NY, USA) kuvataan olevan peräisin luonnollisesta kookosvedestä ja upotettuna kosmeettiseen koostumukseen, jolla on ihoa uudistavia ominaisuuksia ja joka sisältää muun muassa probiootit (Lactococcus ferment lysaatti, Lactobacillus), kasviuutteet (Althea-ruusun kukkauute, Polymnia sonchifolia -juuren mehu, Crithmum maritimum -uute), kofeiini ja kosteuttavat aineet, kuten glyseroli, hyaluronihappo tai polyetyleeniglykoli (PEG)-450 . Näytteet BNC-kaupallisesta levystä kuivattiin tuuletetussa uunissa 358 C:ssa ennen käyttöä.cistanche-salsan edutTuore E.globulus Labill. lehdet kerättiin aikuisista puista The Navigator Companyn teollisuusviljelmältä lähellä Aveiroa Sever do Vougassa (Bracal) (Aveiro, Portugali) ja niille tehtiin vetytislausprosessi, kunnes eteerinen öljyfraktio on uutettu kokonaan (2-3). h) käyttämällä modifioitua Clevenger-tyyppistä laitetta. Lopulta vesipitoinen uute, HDE, otettiin talteen ja lyofilisoitiin, säilytettiin ja suojattiin valolta eksikaattorissa huoneenlämpötilassa käyttöön asti [40].

2.2. HDE:n fenolinen kokonaispitoisuus

HDE:n kokonaisfenolipitoisuus (TPC) määritettiin käyttämällä Folin-Ciocalteu-menetelmää, kuten muualla [41] on kuvattu, tietyin muutoksin. Lyhyesti, 96-kuoppalevyllä 150 µl Folin-Ciocalteu-reagenssia, joka on laimennettu (1–10, o/ø) vedellä ja 120 l natriumkarbonaatin vesiliuosta (75 g L-). ) lisättiin 30 µl:aan HDE:n vesiliuosta pitoisuuksina 1,95 ug - 500 ug ml-1 uutetta. Reaktioseoksia inkuboitiin pimeässä huoneenlämpötilassa 60 minuuttia. Inkubointijakson jälkeen absorbanssi mitattiin aallonpituudella 760 nm nollakoetta vastaan ​​(vesi uutteen sijaan) Thermo Scientific MultiskanTM FC -mikrolevylukijassa (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). TPC laskettiin gallushapon ekvivalentteina (GAE) gallushapon standardiliuosten kalibrointikäyrästä (5.13-205,0 ug ml-1) ja ilmaistiin mg:na lyofilisoidun uutteen GAE:tä. Määritys suoritettiin viisi kertaa ja jokainen näyte analysoitiin kolmena rinnakkaisena.

2.3. BNC-kalvojen tuotanto

BNC-kalvot valmistettiin laboratoriossamme käyttämällä Hestrin-Schramm (HS)-nestemäistä viljelyalustaa (20g L-1glukoosia, 5g L-1 peptonia, 5g Ll hiivauutetta, 2,7g L -1 dinatriumvetyfosfaatti, 1,15 g L-sitruunahappoa, pH 5) ympättynä etikkahappobakteerilla Gluconacetobacter sacchari staattisissa viljelyolosuhteissa [42]. 4-6 päivän viljelyn jälkeen 30 asteessa BNC-kalvot kerättiin ja käsiteltiin kahdesti 0,5 M NaOH:lla 80 asteessa 30 minuutin ajan. Sen jälkeen kalvot pestiin useita kertoja tislatulla vedellä jäljellä olevien väliainekomponenttien ja bakteerisolujen poistamiseksi. Lopuksi BNC-kalvot valkaistiin 1-prosenttisella natriumhypokloriitin vesiliuoksella, mitä seurasi toistuva pesu tislatulla vedellä, kunnes saavutettiin neutraali pH. Puhdistettuja kalvoja säilytettiin ultrapuhtaassa vedessä plus 4 asteessa käyttöön asti.

2.4. BNC-G-HDE-kalvojen valmistelu

Märkä BNC-kalvo (halkaisija∶ noin 7.{1}}±0,5 cm; paksuus ∶ 7000± 1000 μm) ladattiin eri annoksilla HDE:tä (ilmaistuna HDE:n massana kalvon pinta-alaa kohti) ja glyserolia (7,5 mg cm-2) ​​(taulukko 1) kyllästysmenetelmää käyttäen. Tiivistetysti märät BNC-kalvot punnittiin (noin 180 mg kuivaa BNC:tä) ja valutettiin käsin puristamalla laboratoriolaatuisella imukykyisellä paperilla, kunnes vesipitoisuus laski lähes 40 prosenttiin (arvioitu painonpudotuksen perusteella). Sitten kalvoja liotettiin 5 ml:aan vesiliuosta, joka sisälsi vastaavat annokset sekä HDE:tä että glyserolia, ja pidettiin huoneenlämpötilassa, kunnes HDE-G-liuos oli imeytynyt täydellisesti. Lopuksi BNC-kalvoja kuivattiin (petrimaljoissa) 35 asteessa tuuletetussa uunissa (Venticell Eco line, MMM-ryhmä, Planegg, Saksa) vähintään 20 tuntia. Kuivatut kalvot säilytettiin ja suojattiin valolta eksikaattorissa huoneenlämpötilassa käyttöön asti. Vertailutarkoituksia varten puhtaat BNC-kalvot (ilman uutetta ja glyserolia) kuivattiin, kuten aiemmin on kuvattu, ja kalvot, jotka oli ladattu glyserolilla (BNC-G), valmistettiin noudattaen samaa menettelyä.

2.5. Kalvojen luonnehdinta

2.5.1 Paksuus

Kuivien kalvojen paksuus mitattiin viidestä satunnaisesta paikasta kädessä pidettävällä digitaalisella mikrometrillä (Mitutoyo Corporation, Tokio, Japani) 1 μm:n tarkkuudella

2.5.2. Morfologia

Kalvojen pinnan ja poikkileikkauksen (kryomurtuneen) morfologiat analysoitiin pyyhkäisyelektronimikroskoopilla (SEM). Mikrokuvat otettiin käyttämällä suurjännitemikroskooppia (HR-FESEMSU 70 Hitachi, Tokio, Japani), joka toimi 4,0 kV jännitteellä. Ennen kuvan ottamista näytteet asetettiin teräskannattimelle ja päällystettiin hiilellä.

2.5.3. Mekaaninen suorituskyky

Kalvojen mekaaninen suorituskyky kuivassa ja märässä (80 % kosteus) tilassa arvioitiin vetokokeilla. Märkien kalvojen kosteuspitoisuus määritettiin kaupallisessa BNC:ssä määritetyn kosteuspitoisuuden mukaan. Vetokokeet suoritettiin yksiakselisella Instron 5564 -testauskoneella (Instron Corporation, Norwood, MA, USA) vetotilassa ristipään nopeudella 10 mm min-I käyttäen 500 N staattista punnituskennoa. Kaikki mittaukset suoritettiin vähintään viidessä rinnakkaiskappaleessa käyttämällä suorakaiteen muotoisia testinäytteitä (5 × 1 cm²) ja mittauspituutta 30 mm. Jännitys (MPa) ja venymä (prosentti) käyrät piirrettiin, ja Youngin moduuli, vetolujuus ja murtovenymä määritettiin käyttämällä Instron BlueHill 3 -ohjelmistoa. Näissä määrityksissä kaupallisen BNC-kasvonaamion näytteet testattiin myös samoissa olosuhteissa vertailun vuoksi.

2.5.4. Lämpöstabiilisuus

Termogravimetrinen analyysi (TGA) suoritettiin SETSYS Setaram TGA -analysaattorilla (SITARAM Instrumentation, Lyon, Ranska), joka oli varustettu platinakennolla. Näytteet kuumennettiin huoneenlämpötilasta 800 C:een vakionopeudella 10 astetta min-1 typpiatmosfäärissä.

2.5.5. Kosteudenottokyky

Kaikkien kalvojen kosteudenottokyky arvioitiin asettamalla kuivatut näytteet (2 x 2 cm-) kustakin kalvosta eksikaattoriin, huoneenlämpötilaan, suhteellisen kosteuden ollessa n. 52 prosenttia käyttäen kyllästettyä magnesiumnitraatin vesiliuosta (52,89 ± 0,22 prosenttia 25 asteessa)[43]. Näytteet otettiin eksikkaattorista ja punnittiin 0,5 h, 1 h, 2,5 h, 24 h ja 48 h kuluttua. Kaikki kalvot testattiin kolmena rinnakkaisena. Kosteudenotto laskettiin seuraavasti:

missä Who on näytteen alkuperäinen paino ja Wwis kunkin ajankohdan paino.

2.6. Chermicon antioksidanttitoiminnassa

HDE-kuormitettujen kalvojen antioksidanttiaktiivisuus arvioitiin käyttämällä DPPH-vapaiden radikaalien poistamismenetelmää, noudattaen aiemmin raportoitua menettelyä [44], joissain muutoksilla. Reaktio perustuu DPPH-liuoksen absorbanssin laskuun, joka johtuu antioksidanttiyhdisteiden radikaalien poistamisesta, minkä seurauksena DPPH-liuoksen väri muuttuu violetista vaaleankeltaiseksi [45]. Lyhyesti sanottuna kunkin kalvon näytteet (2 × 5 cm²) lisättiin 3,75 ml:aan etanolia (EtOH) ja fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) -liuosta (60-40); pH 5,5). Sitten lisättiin 250 µl DPPH (1 mM) liuosta etanolissa ja saatuja seoksia inkuboitiin pimeässä kevyesti sekoittaen (100 rpm) 22 asteessa 0,5 h, 1 h ja 2,5 h ja sitten absorbanssi 517 nm luettiin nollakoetta vastaan ​​(EtOH: PBS1 × pH 5,5) käyttämällä MultiskanTM FC -mikrolevylukijaa (Thermo Scientific, Waltham, Massachusets, EUA). Vertailun vuoksi reaktioseokset, jotka sisältävät HDE:tä laimennettuna EtOH:iin: PBS1 × pH 5,5 lopullisessa pitoisuudessa, joka vastaa maksimimäärää HDE:tä, joka voi vapautua kustakin kalvosta (HDE 1:2,5 ug ml-1; HDE1. Määritykseen sisältyi myös 5–3,75 ug ml-1; HDE 2–5,0 ug ml-1; HDE 3–7,5 ug ml-）. Kontrolli, joka koostui EtOH:sta: PBS 1 × pH 5,5 DPPH:lla ja ilman kalvoa käytettiin. Kullekin näytteelle suoritettiin kolme riippumatonta määritystä. DPPH-radikaaleja poistava aktiivisuus laskettiin kunkin näytteen absorbanssista (A-näyte) suhteessa kontrolli-DPPH-absorbanssiin (AppH) seuraavasti:

2.7. Varastointikohdassa olevan BNC-G-HDE2-kalvon vakauden arviointi

BNC-G-HDE2:n varastointikestävyys arvioitiin "Kosmeettisten tuotteiden stabiilisuustestausta koskevien ohjeiden"[46] perusteella. Tätä varten näytteet (14 cm²) BNC-G:stä (kontrollina) ja BNC-G-HDE2-kalvoista pantiin lasipulloihin ja säilytettiin 3 kuukautta pimeässä odotetussa normaalissa säilytystilassa huoneenlämmössä ({{10) }} astetta ) ja 52 prosenttia RH (ehto I, käyttäen magnesiumnitraatilla kyllästettyä liuosta [43]) ja kiihdytetyssä tilassa 40 astetta C ja 75 prosenttia RH (ehto I, käyttäen natriumkloridin kyllästettyä liuosta [43]). ). Suhteellista kosteutta tarkkailtiin ajoittain termohydrometrillä, jotta varmistettiin tasainen kosteus koko varastointiajan. Kaikki näytteet analysoitiin ennen ja jälkeen 1, 2 ja 3 kuukauden säilytyksen niiden antioksidanttiaktiivisuuden suhteen (kuten on kuvattu kohdassa 2.6). Myös kalvojen makroskooppinen puoli tallennettiin. Jokaisen tilan osalta kaikki näytteet analysoitiin kolmena rinnakkaisena.

2.8. In vitro -biologiset määritykset

2.8.1. Soluviljely

Ihmisen keratinosyyttien (HaCaT, CLS, Cell Lines Service, Eppelheim, Saksa) ja hiiren fibroblastien (NIH/3T3, ATCC CRL-1658, Manassas, VA, USA) solulinjoja viljeltiin käyttämällä Dulbeccon Modified Eagle's Mediumia (DMEM) , 37 asteessa, kostutetussa 5 prosentin CO{5}} prosentin ilmakehässä. Väliaineeseen lisättiin 10 prosenttia (o/v) lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS), 1 prosenttia (o/ø) pen/strep, 3,7 g L-natriumbikarbonaattia ja 1 mM natriumpyruvaattia. Solut irrotettiin trypsiini-EDTA-liuoksella 1 x.

2.8.2. Sytotoksisuusmääritys

Kalvojen sytotoksisuus arvioitiin käyttämällä MTT-pelkistysmääritystä. Näytteet (2,5 cm²) kalvoista (BNC-G, BNC-G-HDE1, BNC-G-HDE1.5, BNC-G-HDE2, BNC-G-HDE3) steriloitiin kahdesti UV-säteilyllä kummaltakin puolelta 20 vuoden aikana. min ja inkuboitiin edelleen 24 tuntia 2,5 ml:ssa täydellistä DMEM-väliainetta 37 asteessa kostutetussa 5 % CO, -95 % ilmakehässä kunkin kalvouutteen valmistamiseksi.

Sillä välin 2×10 ja 1×104 solua/kuoppa kylvettiin 96-kuoppalevyille HaCaT- ja NIH/3T3-soluille, vastaavasti. 24 tunnin kuluttua sama tilavuus kalvouutetta käytettiin korvaamaan viljelyväliaine, ja soluja inkuboitiin edelleen 24 tuntia 37 °C:ssa. Kontrollina soluja käsiteltiin samalla tavalla kuin näytteille kuvattiin, mutta altistettiin vain DMEM-elatusaineelle. 24 tunnin kuluttua väliaine poistettiin ja sytotoksisuus määritettiin aiemmin kuvatulla tavalla [47]. Lyhyesti sanottuna tuore MTT-liuos (0,5 mg L-1), joka oli valmistettu Krebs-elatusaineeseen (pH 7,4), lisättiin ja inkuboitiin 37 asteessa 2 tuntia (HaCaT-solut) tai 4 tuntia (NIH/3T3-solut). Sen jälkeen MTT-liuos korvattiin DMSO:lla ja inkuboitiin 10 minuuttia ravistellen formatsaanikiteiden täydelliseksi liuottamiseksi. Inkuboinnin jälkeen absorbanssi mitattiin 570 nm:ssä spektrofotometrillä (SLT-spektrit I). Kolmen riippumattoman kokeen tulokset, joissa kussakin oli 3 toistoa, ilmaistiin prosentteina (prosenttina) kontrollissa saadusta absorbanssiarvosta ja esitettiin graafisesti prosentteina MTT-vähennyksestä.

2.8.3. Vanhenemisen vastainen toiminta

BNC-G-HDE2-kalvon vanhenemista estävä aktiivisuus arvioitiin käyttämällä -galaktosidaasi(-gal) -värjäysmääritystä. BNC-G-kalvoa käytettiin kontrollina. Kalvouutteiden valmistamiseksi steriloituja näytteitä (10 cm) inkuboitiin 10 ml:ssa täydellistä DMEM-elatusainetta, kuten aiemmin on kuvattu sytotoksisuusmäärityksessä.

NIH/3T3-solut kylvettiin 12-kuoppalevyille tiheydellä 2,5 × 104 solua/kuoppa ja annettiin stabiloitua 24 tuntia. Myöhemmin 12,5 µM etoposidia käytettiin indusoimaan solujen vanhenemista NIH/3T3:ssa 24 tunnin ajan. Etoposidilla stimuloituja soluja käsiteltiin sitten BNC-G-HDE2-kalvouutteella vielä 24 tuntia.cistanche tubulosa annostus redditKontrollina käsittelemättömiä soluja inkuboitiin DMEM-elatusaineen tai BNC-G- ja BNC-G-HDE-kalvojen uutteiden kanssa. Inkuboinnin jälkeen elatusaine poistettiin ja solut pestiin PBS:llä ja merkittiin -gal-liuoksella, joka oli valmistettu valmistajan kuvauksen mukaisesti (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Positiivisten solujen ikääntymisen analyysi suoritettiin 20-kertaisella suurennuksella käyttäen laajakenttämikroskooppia (Carl Zeiss, Oberkochen, Saksa). Vähintään 3 riippumatonta koetta suoritettiin rinnakkain, ja -gal-positiivisten solujen prosenttiosuus määritettiin käyttämällä neljää mikroskooppista kuvaa.

2.9. Tilastollinen analyysi

Käsiteltäessä kalvojen karakterisoinnin, antioksidanttiaktiivisuuden ja varastointistabiilisuustestin tuloksia, käytettiin yksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA) ja sen jälkeen Tukeyn testiä merkitsevyystason arvioimiseksi. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskiarvon standardipoikkeama. Mitä tulee in vitro -määrityksiin, tietojen jakauman normaalius arvioitiin D'Agostino-Pearson- ja Shapiro-Wilk-normaalisuustesteillä. Ryhmien väliset tilastolliset vertailut suoritettiin ANOVA:lla, jota seurasi Dunnettin post-hoc-testi tai pariton Studentsin t-testi. Tulokset esitetään keskiarvona ± keskivirhe ilmoitetun kokeiden lukumäärän keskiarvosta.

Merkitys hyväksyttiin arvoilla p<0.05. all="" statistical="" calculations="" were="" performed="" using="" graphpad="" prism="" software(8.0.2,="" graphpad="" software="" inc.,="" san="" diego,="" ca,="">

Tämä artikkeli on poimittu julkaisusta Materials 2022, 15, 1982. https://doi.org/10.3390/ma15051982 https://www.mdpi.com/journal/materials