Neem-puusta johdetun anti-melanogeenisen geduniinin molekyylimekanismit
Mar 28, 2022
Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com
Hwang-Ju Jeon 1, Kyeongnam Kim 1, Chaeeun Kim 2, Myoung-Jin Kim 1, Tae-Oh Kim 3,4,5,† ja Sung-Eun Lee 1,2,*,†
Abstrakti:Melanogeneesi edustaa sarjaa prosesseja, jotka tuottavat melaniinia, suojaavaa ihopigmenttiä (ultraviolettisäteitä vastaan), ja määrittää ihmisen ihon värin. Melaniinin tuotantoa vähentävillä kemikaaleilla on aina ollut kysyntää kosmetiikkamarkkinoilla ihonhoitoon liittyvien intressien, kuten valkaisun, vuoksi. Päämekanismi melaniinin tuotannon estämiseksi on tyrosinaasin (TYR), melanogeneesin avainentsyymin, esto. Tässä arvioimme aitoa (Ged), edustavaa limonoidia, sen melanogeneesin vastaisen vaikutuksen vuoksi. Melaniinin tuotantoa in vitro stimuloi alfa-melanosyyttejä stimuloiva hormoni (-MSH) hiiren B16F10-melanoomasoluissa. Ged vähensi -MSH-stimuloitua melaniinin tuotantoa, estäen TYR-aktiivisuutta ja proteiinin määrää. Vahvistimme tämän tuloksen in vivo seeprakalamallissa melanogeneesille. Kaikissa käsitellyissä pitoisuuksissa ei havaittu merkkejä myrkyllisyydestä ja seeprakalojen epämuodostumista kehityksen aikana. Ged vähensi syntyneiden seeprakalan alkion pigmenttipisteiden määrää ja alkioiden melaniinipitoisuutta. Ged:n erittäin aktiivinen pitoisuus (100 uM) oli paljon pienempi kuin positiivisen kontrollin, kojiinihapon (8 mM). Siksi Ged voisi olla kiehtova ehdokas melanogeneesin vastaisille reagensseille.
Avainsanat: MITF; mikroftalmiaan liittyvä transkriptiotekijä; TYR; tyrosinaasi; DQ; dopakinoni;TRP-1; tyrosinaasin sukuinen proteiini 1; TRP-2; tyrosinaasiin liittyvä proteiini 2; MC1R; melanokortiini 1 -reseptori; -MSH; - melanosyyttejä stimuloiva hormoni; ACTH; adrenokortikotrooppinen hormoni; ASP; agoutisignaloiva proteiini; leiri; syklinen adenosiinimonofosfaatti; CREB; cAMP-vastauselementti
1. Esittely
Melaniini syntetisoituu melanosomissa, lysosomin kaltaisissa melanosyyttien organelleissa. Melanosomissa melaniinia tuotetaan kahdessa pigmentissä, eumelaniinissa ja feomelaniinissa, jotka edustavat ruskeanmustaa ja punakeltaista [1]. Näiden melaniinipigmenttien synteesi alkaa prekursorista, L-tyrosiinista, L-tyrosiinin hapetusreaktiolla dopakinoniksi (DQ) ja L-DOPA:ksi [2]. Tässä hapetusvaiheessa tyrosinaasi (TYR) toimii melaniinin kokonaisbiosynteesireitin nopeutta rajoittavana entsyyminä [2,3]. Melanogeneesiproteiineille läheistä sukua olevat TRP-1ja TRP-2 katalysoivat eumelaniinin biosynteesireittiä ja stabiloivat ja indusoivat TYR-aktiivisuutta [1]. Melaniinipigmenttien tuotantoprosessi (kutsutaan melanogeneesiksi) tapahtuu melanosyyttien melanosomissa, joka on formelaniinin synteesi- ja varastointipaikka [4]. Melanogeneesin signalointireitillä melanokortiini1-reseptori (MC1R) on G-proteiiniin kytkettyjen reseptoreiden jäsen. MCIR on melanogeneesisignaloinnin lähtökohta, ja sen aktivoivat MC1R-agonistit, kuten -melanosyyttiä stimuloiva hormoni (-MSH), adrenokortikotrooppinen hormoni (ACTH) ja agouti-signalointiproteiini (ASP) [1,2]. -MSH-MC1R-signalointireitin aktivaatio lisää syklisen adenosinemonofosfaatin (cAMP) pitoisuutta ja fosforyloi cAMP-vasteelementin (CREB). Fosforyloitu CREB indusoi mikroftalmiaan liittyvän transkriptiotekijän (MITF), transkriptiotekijän, joka säätelee melaniinin synteesiin liittyviä geenejä, TYR:ää, tyrosinaasille liittyvää proteiinia-1 (TRP-1) ja tyrosinaasille liittyvää proteiinia, proteiinitason. -2 (TRP-2) sitomalla näiden geenien M-laatikko [1,5,6]. Viiden melanokortiinireseptorin joukossa MC1R:llä on eniten melanosyyttejä. Se säätelee ensisijaisesti eumelaniinin (mustanruskean pigmentin) tuotantoa aktivoimalla MC1R:n, kun tämän reseptorin agonistit, kuten a-MSH ja ACTH, vaihdetaan tähän reseptoriin [2,4,7].
Vaikka nisäkkäiden ja kalojen välillä on eroja, seeprakaloilla on ekstrakopio MC5R:stä ja MC3R:stä, joita kaloilla ei ole [7], ja tämä signalointireitti on edelleen seeprakaloissa ja toimii täsmälleen samalla tavalla kuin nisäkkäiden melanosyyteissä [7]. melaniinipigmentin muodostumisen estämistä koskevien tutkimusten määrä on lisääntynyt sen tutkimusetujen, kuten alkuvaiheen alkioiden nopean kehityksen ja havainnoinnin helppouden vuoksi [8–11]. Näissä ilmiöissä monet aiemmat tutkimukset ovat havainneet, että tämän signalointireitin estäminen vähentää melaniinin tuotantoa ja löytänyt useita estäjiä, mukaan lukien bisabololi-Angelone, 4-hydroksi-3-metoksikanelimaldehydi ja difenyylimetyleenihydratsiinikarbotiamiini [12]. –14].
Geduniini (Ged), tunnettu lämpösokkiproteiini 90:n estäjä, on limonoidi, joka löytyy Meliaceae-kasvin suvuista. Tätä limonoidia on runsaasti pääasiassa nuorten intialaisten neempuun (Azadirachta indica) hedelmien epikarpissa, ja sillä on monipuolinen biologinen vaikutus, mukaan lukien syöpää ehkäisevä, malaria-, tulehdus-, diabetes-, allergia-, hyönteis-, rikkakasvien ja sienilääkkeiden torjunta [15–18]. Gedin melanogeenisuutta ehkäisevän vaikutuksen mekanismista ei ole raportoitu.
Lääkelääkkeenä tai kosmeettisena aineena melaniiniin liittyvien sairauksien tai ihon värimuutosten hoitoon Gedillä saattaa olla etuja sen turvallisten, luonnossa esiintyvien kasvien ominaisuuksien vuoksi [19]. Gedin anti-melanogeeninen vaikutus arvioitiin in vitro ja in vivo käyttäen hiiren B16F10 melanoomasoluja ja seeprakalan alkioita, jotta löydettiin sopiva valkoturska-ainekandidaatti, joka on yksi suurimmista kaupallisten kosmetiikkamarkkinoiden osista. Samanaikaisesti seeprakalan kautta akuutti myrkyllisyys. Testi tehtiin myös sen osoittamiseksi, kuinka Ged mahdollisesti vaikuttaa eläimiin.
2. Materiaalit ja menetelmät
2.1. Kemikaalit ja reagenssit
Ged ostettiin yhtiöltä Microsource Discovery Systems, Inc. (Gayloardville, CT, USA). Melanogeneesistimulaattori, -MSH, anti-melanogeeninen yhdiste ja kojiinihappo ostettiin Sigma-Aldrichilta (St. Louis, MO, USA). Kaikki muut reagenssit olivat korkeampia kuin molekyylibiologiset.
2.2. Soluviljely
Hiiren melanooma-karsinoomasolulinja, B16F10, hankittiin American TypeCulture Collection -kokoelmasta (ATCC, Manassas, VA, USA) ja sitä viljeltiin 10-prosenttisella naudan sikiön seerumilla (tilavuus/tilavuus), ja penisilliiniä toimitettiin Dulbeccolla modifioidulla Eagle-elatusaineella (GE) Healthcare, Chicago, IL, USA) kosteassa ilmakehässä, jossa on 5 prosenttia CO2:ta. Soluja viljeltiin, kunnes konfluenssi saavutti 80 prosenttia, ja jaettiin kolme kertaa viikossa jakautumissuhteella 1:8. Soluja tarkkailtiin 12 tunnin välein ja morfologiset muutokset tarkistettiin. Käytettyjen solujen läpikulkumäärä pidettiin pienenä.
2.3. Solujen elinkelpoisuusmääritys
Gedin proliferatiivisen vaikutuksen arvioimiseksi B16F10 hiiren melanoomasolulinjaan MTS-määritys suoritettiin aiemmin raportoidun protokollan mukaisesti [20] käyttäen CellTiter96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay -kittiä (Promega, Madison, WI, USA). Lyhyesti sanottuna 1 x 103 solua kylvettiin 96-kuoppalevyn kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 24 tuntia toipumista varten. Inkuboinnin jälkeen Ged käsiteltiin eri pitoisuuksilla: 0, 3,12, 6,25, 12.{14}}, 50 ja 75 µM. 48 tunnin kuluttua 20 µl MTS-määritysliuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan, joka sisälsi 100-µl väliainetta Ged:n kanssa ja ilman Ged:tä. 4 tunnin lisäinkuboinnin jälkeen absorbanssi mitattiin 490 nm:ssä käyttämällä Multiskan GO -spektrofotometriä (ThermoScientific, Waltham, MA, USA). Absorbanssitiedot normalisoitiin kontrollilla ja esitettiin prosentuaalisena inhibitiosuhteena.
2.4. Melaniinipitoisuuden määritys
Solunulkoiset ja intrasellulaariset melaniinipitoisuudet määritettiin aiemmin raportoidulla modifioidulla menetelmällä [21]. -MSH:lla (200 nM) esikäsiteltyjä melanoomasoluja inkuboitiin 72 tuntia kojiinihapon (200 uM) ja Ged:n (25 ja 50 uM) kanssa ja ilman niitä. Inkubaation jälkeen kerättiin fenolipunavapaa elatusaine ja viljellyt solut kerättiin talteen RIPA-lyysipuskurilla. Kerättyjä soluja sentrifugoitiin 4 ◦C:ssa, 13,000 rpm 15 minuuttia ja pelletit liuotettiin 1 M NaOH, 10 % DMSO-liuokseen 95 ◦C:ssa 2 tunnin ajan. Kerätyn väliaineen ja liuenneen melaniinin absorbanssi mitattiin 470 nm:ssä käyttäen spektrofotometriä. Kaikki näytteet normalisoitiin ja niiden proteiinipitoisuus määritettiin BCA-menetelmällä.
2.5. Solunsisäinen tyrosinaasin aktiivisuusmääritys
Solujen tyrosinaasiaktiivisuus määritettiin mittaamalla L-dihydroksifenyylialaniinin (L-DOPA) hapettumisnopeus, kuten aiemmin on raportoitu, pienin muutoksin [22]. B16F10-hiiren melanoomasoluja esikäsiteltiin 200 nM:lla -MSH:ta 1 tunnin ajan, mitä seurasi käsittely 200 uM:lla kojiinihappo, Ged:n kanssa ja ilman (25 ja 50 uM) ja inkuboitiin 72 tuntia. Inkuboinnin jälkeen solut kerättiin lyysipuskurilla, joka sisälsi proteinaasi-inhibiittoria, ja näytettä sentrifugoitiin 13,000×g, 4 ◦C:ssa 15 minuuttia. Supernatantti siirrettiin uuteen putkeen. Kukin näyte (20 µl) ja 80 µl 40 mM L-DOPAa sekoitettiin 96-kuoppalevyllä ja inkuboitiin 37 ◦C:ssa 2 tuntia. Oksidoituneen L-DOPA:n absorbanssi aallonpituudella 475 nm määritettiin käyttämällä mikrolevylukijaa. Absorbanssiarvo normalisoitiin kunkin näytteen proteiinipitoisuudella.
Cistanche-uutteen hyöty: estää tyrosinaasin ilmentymistä.
2.6. RNA:n eristäminen ja qRT-PCR
Kokonais-RNA:n eristäminen ja qRT-PCR suoritettiin aiemmin [18]:ssa kuvatulla menetelmällä. Kokonais-RNA uutettiin lyhyesti kustakin näytteestä käyttämällä Trizol-reagenssia (Ambion, Austin, TX, USA). Uutetun RNA:n kokonaispitoisuus määritettiin absorbanssilla 260 nm:ssä ja kokonais-RNA:n laatu tarkastettiin absorbanssisuhteilla 260:280 ja 260:230 nm käyttämällä Multiskan GO -mikrolevylukijaa (Thermo Scientific). TotalRNA (5 ug) syntetisoitiin cDNA:ksi Maxima ensimmäisen juosteen cDNA-synteesipakkauksella (Thermo Scientific) ja syntetisoitiin cDNA. Mitf, Tyr, Trp-1 ja Trp-2 mRNA:n ilmentymistasot määritettiin käyttämällä Luna Universal qPCR Master Mixiä (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) ja QuantStudio 3 Real-Time PCR -laitetta ( Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ohjaajan protokollan mukaan. Geenien ilmentymistaso normalisoitiin glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasilla (GAPDH).
2.7. Immunoblot-analyysi
Immunoblot-analyysi suoritettiin aiemmin kuvattujen menetelmien mukaisesti [23]. B16f10-solujen proteiinit kerättiin käyttämällä Ceti-lyysipuskuria (Translab, Daejeon, Korea), ja pitoisuus määritettiin Pierce BCA -proteiinimäärityspakkauksella (Thermo Scientific). Sama määrä proteiineja (30 ug) kustakin näytteestä ladattiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelille ja suoritettiin elektroforeesi. Erottamisen jälkeen proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvolle ja kalvo blokattiin 10-prosenttisessa rasvattomassa maitoliuoksessa 2 tunnin ajan. Tukkeutuneita kalvoja inkuboitiin primaarisen vasta-aineen kanssa yön yli 4 °C:ssa, mitä seurasi toinen inkubaatio sekundaarisen vasta-aineen kanssa 26 °C:ssa 2 tunnin ajan. Primaariset ja sekundaariset vasta-aineet laimennettiin suhteessa 1:1000 ja 1:3000, vastaavasti. Lopuksi blotatut kalvot dokumentoitiin käyttämällä ChemiDoc-ohjelmaa (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ECL-reagenssilla (SuperSignal, Thermo Scientific). Primaariset ja sekundääriset vasta-aineet ostettiin Santa Cruz Biotechnologylta (Dallas, TX, USA).
2.8. Seeprakalan alkiotesti
Wild-type zebrafish were thankfully obtained from Professor Tae-Lin Huh, the School of Life Science and Biotechnology, Kyungpook National University, Daegu, Republic of Korea. The strain was kept for more than eight generations in a laboratory condition of 26 ◦C ± 1 ◦C, and a day-to-night ratio of 8:16. General fish care and breeding conditions, as previously described, were followed [24]. Ten groups of zebrafish were mated to obtain embryos with a mating ratio (male: female, 1:2), and among obtained embryos, healthy embryos had >80 prosentin lannoitusaste ja ne valittiin ja käytettiin kokeeseen. Jokaisessa käsitellyssä ryhmässä 12 tervettä alkiota sijoitettiin 96-kuoppalevyn jokaiseen kuoppaan Ged:n (25, 50, 75 ja 100 µM) ja kojiinihapon (8 mM) kanssa ja ilman niitä suojausvaiheessa E3-väliaineessa. 24 tuntia hedelmöityksen jälkeen (h/pf) alkiot dekoriattiin ja poikkeavuus tarkastettiin 24 tunnin välein 72 h/pf asti. Alkioiden fenotyyppi valokuvattiin sivu- ja selkänäkymässä ryhmien välisten erojen vertaamiseksi käyttämällä BX53-pystymikroskooppia DP80CCD:llä (Olympus Life Science Solutions, Waltham, MA, USA). Kuvaamisen jälkeen alkiot homogenisoitiin Ceti-lyysipuskurilla (TransLab) ja suoritettiin melaniinipitoisuuden määritys, joka vastasi B16F10-solujen melaniinipitoisuuden määritystä.
2.9. Tilastollinen analyysi
Kaikki tässä tutkimuksessa esitetyt tilastolliset analyysit suoritettiin GraphPad Prismv.8:lla.{1}} (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Yksisuuntaista ANOVAa Tukeyn testillä käytettiin useisiin vertailuihin. Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± standardipoikkeamat. Merkittäviä eroja pidettiin tilastollisesti merkittävinä p <>
3. Tulokset
3.1. Piperlongumiinin sytotoksinen vaikutus B16F10-soluissa
Ennen Gedin melanogeenisen vaikutuksen tutkimista suoritimme B16F10-solulinjan elinkelpoisuustestin annosalueen asettamiseksi tässä tutkimuksessa. Konsentraatioalueella 3,12 - 50 uM solut eivät osoittaneet kasvua estävää vaikutusta, ja niiden suhteellinen lisääntyminen oli 91,0 - 118,7 prosenttia (kuvio 1). Sitä vastoin, vaikka ei ollut tilastollista merkitystä, 75 uM käsiteltyjen ryhmien kasvu oli hieman estynyt (89,3 prosenttia; kuva 1). Siksi korkein pitoisuus asetettiin 50 uM:ksi jäljellä olevissa solulinjakokeissa.
Kuva 1. Geduniinin (Ged) sytotoksisuus B16F10-soluissa
3.2. Geduniini estää melaniinin tuotantoa ja solunsisäistä tyrosinaasiaktiivisuutta B16F10-hiiren melanoomasoluissa
Arvioimme Gedin anti-melanogeenisen vaikutuksen hiiren B16F10 melanoomasoluissa. MC1R-agonisti, -MSH, indusoi tehokkaasti solunsisäistä ja solunulkoista melaniinin tuotantoa (kuvio 2a–c). Kerättyjen väliaineiden väri oli tumma -MSH:n kanssa (kuvio 2a). Väri haalistunut lisäämällä Ged, ja vaikutus oli annoksesta riippuvainen (kuva 2a). Melaniinin kokonaispitoisuuden tuloksena -MSH lisäsi melaniinin tuotantoa melanosyyteissä noin seitsemän kertaa enemmän kuin kontrolliryhmä ja stimuloi melaniinin vähenemistä lisäämällä kojiinihappoa, joka on hyvin tunnettu positiivinen kontrolli melanogeneesissä (kuvio 2d). Ged lyhensi myös ärsykkeitä indusoivaa melaniinin tuotantoa melanosyyteissä kaikissa tässä tutkimuksessa testatuissa pitoisuuksissa (kuvio 2d). Lisäksi tyrosinaasin aktiivisuustestissä Ged osoitti voimakasta estävää vaikutusta nopeutta rajoittavaan entsyymiin, tyrosinaasiin, melanogeneesissä (kuvio 2e). Tyrosinaasin suhteellinen aktiivisuus 50 uM Ged:llä käsitellyssä ryhmässä laski 20 prosenttia ja 12,24 prosenttia verrattuna vertailuryhmään ja vastaavasti a-MSH-stimuloituun ryhmään.
Kuva 2. Aidon (Ged) anti-melanogeeninen vaikutus alfa-melanosyyttejä stimuloivan hormonin (-MSH) stimuloimaan melaniinin tuotantoon B16F10-soluissa.
3.3. Geduniini vähentää -MSH-indusoitua melanogeneesiin liittyvää geeniekspressiota
-MSH (200nM) indusoi Mitf:n mRNA-taso; melanogeneesin transkriptiotekijä; ja kohdegeenit Tyr, Trp-1 ja Trp-2 (kuva 3). Ged-käsittely alensi kaikkien geenien mRNA-tasoa annoksesta riippuvalla tavalla pitoisuuksilla 25 ja 50 µM (kuvio 3). Verrattuna positiiviseen kontrolliin, kojiinihappoon (200 µM), Ged oli tehokkaampi vähentämään mRNA:ta. melanogeneesiin liittyvien geenien taso B16F10-soluissa. Lisäksi Mitfand Tyr -taso laski 010- ja 026-kertaa pienempi kuin -MSH-indusoidut solut, vastaavasti pitoisuudella 50 µM (kuvio 3a, b). Näiden geenien alhaalla säädellyt mRNA-tasot alensivat Tyr-tasoa ja vähensivät melaniinin TYR-tuotannon määrää vähemmän kuin kontrolliryhmä.
Kuva 3. Pelkistyksen vaikutus melanogeneesiin liittyviin geeneihin.
3.4. Gedunin alennettu TYR ja TYR-1 määrä
TYR:llä on ratkaiseva rooli melanogeneesissä, ja tämän entsyymin proteiinitaso vaikuttaa suoraan melanogeneesiin. Yritimme vahvistaa alentuneen mRNA-tason aiheuttamaa muutosta proteiinin määrässä, TYR, immunoblot-analyysillä. TYR väheni huomattavasti verrattuna kontrolliin, ja -MSH:ta hoidettiin annosriippuvaisesti (kuvio 4a). Lisäksi TRP-1, TYR:n olennainen transkriptiotekijä, väheni hieman (kuva 4a). Tulokset olivat ilmeisempiä, kun kunkin proteiinin vyöhyke normalisoitiin talonpitoproteiinilla GAPDH (kuvio 4b, c).
Kuva 4. Alfa-melanosyyttiä stimuloivan hormonin (-MSH) indusoimien B16F10-solujen Western blottaus aidolla hoidolla.
3.5. Geduninin toksisuus seeprakalaa vastaan alkuvaiheen kehityksessä
Gedin toksikologinen arviointi seeprakalan varhaisen vaiheen kehitykselle suoritettiin ennen Gedin anti-melanogeenisen testin arvioimista in vivo. Seeprakalan alkioiden morfologista poikkeavuutta ei havaittu missään käsitellyssä Ged-pitoisuudessa (kuvio 5a). Testatuilla Ged-pitoisuuksilla, 25, 50, 75 ja 100 uM, Ged-käsiteltyjen ryhmien eloonjäämisasteessa ei ollut merkittäviä eroja 72 tunnin kohdalla kemiallisesti käsitellystä ajanjaksosta (kuvio 5b).
Kuva 5. Aidon (Ged) toksisuus seeprakalan varhaisen vaiheen kehitykselle.
3.6. Gedunin vähensi melaniinipitoisuutta seeprakalan alkioissa
Koska Gedillä ei ole kehitystoksisuutta seeprakalan alkioissa, tutkimme melanogeenista vaikutusta Ged-pitoisuuksilla, 25, 50, 75 ja 100 µM. Teoptisessa havainnoissa tarkistimme seeprakalan pigmenttipisteet; sivukuva seeprakalan alkioista on esitetty kuvassa 5a. Kojihapolla on seeprakalan alkioiden pigmentintuotantoa estävä vaikutus. Ged-käsitellyillä seeprakalan alkioilla oli myös vähemmän pigmenttipisteitä päässä (kuva 6a). Lisäksi seeprakalan alkioiden kokonaisuudesta uutetun melaniinin kokonaispitoisuus pieneni 72 tunnin Ged-altistuksen jälkeen sekä kojiinihappo-, apositiivinen kontrolli- että Ged-käsitellyissä ryhmissä (kuva 6b, c)
Kuva 6. Aidon vaikutus melaniinin tuotantoon in vivo.
4. Keskustelu
Tässä tutkimuksessa arvioitiin Gedin esto-ominaisuuksia melaniinin tuotantoa vastaan. Löytöjemme perusteella Ged:n estokyky oli noin 1198- kertaa suurempi kuin kojiinihapon (kuva 2), ja Ged:n pitoisuus ( 50 uM) oli pienempi kuin positiivisen kontrollin kojiinihapon (200 uM). Se yhdistettiin heikentyneen solunsisäisen tyrosinaasiaktiivisuuden kanssa, entsyymin, joka muuttaa L-dopan DQ:ksi, eumelaniinin ja feomelaniinin ensisijaiseksi esiasteeksi. Tyr-aktiivisuuden väheneminen hidastaa koko melaniinin tuotantoprosessia ja pulaa molemmista lopputuotteista, eumelaniinista ja feomelaniinista [1–3]. Transkriptio- ja TYR-tasoja säätelivät sarja transkriptiotekijöitä: Mitf, Trp-1 ja Trp-2 [1,2]. Pienempi määrä proteiinia ja mRNA-tasoa tarkoittaa -MSH-MC1R-PKA-CREB-signalointiakselin kautta aktivoitua MC1R:ää säätelemällä alas käsiteltäessä Ged:tä pitoisuuksilla 25 ja 50 µM, annosriippuvaisesti sekä kvantitatiivisessa PCR:ssä että Western blottingissa. Kuten aiemmin on kuvattu, MITF:n määrän vähentäminen johtaa Tyr-, Trp-1- ja Trp-2-pulaan, koska sitoutuminen näiden geenien promoottorialueeseen vähenee [25–27]. Näiden transkriptiotekijöiden vähentäminen johtaa TYR:n alemmalle tasolle ja estää melaniinipigmentin tuotantoa B16F10-soluissa. Lisäksi nykyiset tulokset osoittavat Gedin, toisen melaniinin tuotannon kriittisen kohdan melanosyytissä, TYR:ää estävän vaikutuksen. Ged osoitti myös pigmentintuotantoa estävän vaikutuksen seeprakalan varhaisen vaiheen kehityksen aikana in vitro- ja in vivo -malleissa. Tuloksemme osoittivat, että 72 tunnin Ged-hoito vähensi merkittävästi seeprakalan alkionpigmentaatiota. Melaniinin kokonaispitoisuus ja sukulaisten geenien mRNA-tasot vähenivät Ged:n läsnä ollessa, ja näiden tulosten taipumus tuki vahvasti Gedin in vitro anti-melanogeneesiominaisuutta.
Lisäksi Gedin estokyky oli paljon vahvempi kuin kojiinihapon, joka on yksi kosmetiikkateollisuuden yleisimmin tunnetuista valkaisuainereagenssiyhdisteistä [6,28]. Pitoisuus, jossa Ged vaikutti, oli suhteellisen alempi kuin kojiinihapon. Lisäksi edellinen raportti osoitti, että toisella yleisellä valkaisuaineella, arbutiinilla, oli samanlainen melanogeeninen vaikutus kuin kojiinihapolla [2]. Siksi Gedia tulisi pitää valkaisuaineena nykyisen arbutiinin tai kojiinihapon korvaajana ja anti-melanomadrugina sen lupaavien ominaisuuksien vuoksi.
Gedin anti-melanogeenisiä ominaisuuksia ehdotettiin aiemmin [29, 30], mutta nämä tutkimukset eivät keskittyneet vaikutuksen spesifisiin mekanismeihin, vaan ne vain havaitsivat sytotoksisten vaikutusten ja melaniinin tuotannon määrän muuttumista in vitro, kun taas antiproliferatiivista aktiivisuutta ja estovaikutuksia HSP 90:n ilmentyminen on korostettu [31–33]. Ged:n mahdollisuudesta melanogeneettisenä aineena on raportoitu; Nämä tutkimukset eivät kuitenkaan keskittyneet vaikutuksen spesifisiin mekanismeihin, vaan ne vain havaitsivat sytotoksisten vaikutusten ja melaniinin tuotannon määrän muutoksia in vitro. Yritimme määrittää solutason mekanismia vahvistamalla melaniinin tuotantoon liittyvien geenien mRNA-tason ja proteiinimäärän. Yhdessä aikaisempien raporttien kanssa tämä tutkimus osoitti uuden näkökulman Gedakseen kosmeettisten ainesosien komponenttina kahdella edulla, erinomaisella syövän vastaisella ja melanogeneesillä, joita voidaan soveltaa sekä UV-indusoituun melanoomaan että pigmentin kertymiseen, etenkin samanaikaisesti.
cistanche-uutejauhe: kirkkaat vapaat radikaalit
5. Johtopäätökset
Yhteenvetona voidaan todeta, että kaikki nämä tulokset osoittivat, että uutta yhdistettä, Ged:tä, voidaan käyttää depigmentaatioreagenssina melaniinin biosynteesiin, joka lyhensi alavirran proteiineja TYR, TRP{0}} ja TRP-2 pienemmällä määrällä verrattuna pääaineeseen. säätelyproteiini, MITF, seeprakalamallin sekä in vitro että in vivo -järjestelmissä.
cistanche-tabletit