Makrofagien ehtyminen vähentää sairauspatologiaa tekijä H:sta riippuvaisessa immuunikompleksivälitteisessä glomerulonefriitissä

TäydennystekijäH (FH) on avainsäätelijä vaihtoehtoisessa komplementtireitissä ihmisellä ja hiirellä. Aikaisemmin tutkimuksemme paljastivat, että FH:n puuttuminen aiheuttaa C57BL6-hiiren herkkyydenkrooninen seerumitauti(CSS) sekä sen kasvumunuaisten sisäänFimakrofagien suodatusverrattuna kontrolleihin. Ymmärtääkseen, onko makrofagien lisääntynyt rekrytointi (Mϕs) munuaiseen ajoi sisäänFLammaatiosta ja leviävästä vauriosta, tutkimme eFfect of Mϕ poistaminen klodronaatilla FH-poistohiirillä, joilla on CSS. Kahdeksan viikon ikäisiä FHKO-hiiriä käsiteltiin apoferritiinillä (4 mg/hiiri) 5 viikon ajan ja joko vehikkelillä (PBS) tai klodronaatilla (50 mg/kg ip, 3 kertaa/vko viimeisen 3 viikon ajan). Hallintoklodronaatti vähensi monosyyttejä ja Mϕs munuaisissakirjoittaja>80%. 

Munuaisten toimintaBUN arvioi ja albumiini pysyi lähempänä normaalia M:n ehtyessäϕs. Klodronaattihoito esti sytokiinien, TNF:n, muuttumisen ja IL-6, ja sidekudoskasvutekijän (CTGF, TGF) geeniekspression lisääntyminen -1, matriisin metalloproteinaasi-9 (MMP9),fibronektiini, laminiini ja kollageeni FHKO-hiirillä, joilla on CSS (P < 0:05). Klodronaattihoito johti suhteelliseen suojaanimmuunikompleksi- (IC-) -välitteinen sairauspatologia CSS:n aikana arvioitunasigniFiheikentynyt glomerulaarinen patologia(GN) ja solunulkoinen matriisi. Tuloksemme viittaavat siihen, että komplementin aktivaatio on yksi mekanismeista, jotka säätelevät makrofagimaisemaa ja sitä kauttaFibrosis. Tarkka mekanismi on vielä selvitettävä. Lyhyesti sanottuna tietomme osoittavat, että Mϕs on tärkeä rooli FH-riippuvaisessa ICGN:ssä ja Mϕ ehtyminenvähentää taudin etenemistä.

NAPSAUTA TÄSTÄ SAADAksesi LUONNOLLISTA ORGAANIISTA CISTANKSIUUTEtta, JOKA SISÄLTÄ 25 % KINAKOOSIDEA JA 9 % AKTEOSIDIA MUUNAISTEN TOIMINTAAN

1. Esittely

Krooninen munuaissairaus(CKD) on maailmanlaajuinen terveysongelma; Joista 10 % on immuunikompleksi- (IC-)-välitteistä ja esiintyy seerumitaudissa, infektioissa ja autoimmuunisairauksissa. [1]. USA:n munuaistietojärjestelmän vuosiraportti toteaa tämänCKD-potilaat"on selvästi suuri kuolemanriski", ja ilmaantuvuus 10-kertaistui kolmen vuosikymmenen aikana, jolloin sairaat potilaat menettivät 70 % eliniästään. NIDDK:n mukaan noin 14 prosentilla aikuisväestöstä on diagnosoitu munuaissairaus, mikä tekee siitä yhdeksänneksi yleisin kuolinsyyn [2]. Munuaiset ovat erittäin herkkiä komplementtivälitteisille vaurioille erityisesti autoimmuuni- ja tulehdustiloissa [3, 4].

Komplementtijärjestelmä osallistuu synnynnäisiin ja adaptiivisiin immuunivasteisiin ja tarjoaa ensimmäisen puolustuslinjan mikro-organismeja vastaan ​​[5, 6]. Se koostuu kolmesta aktivaatioreitistä, jotka alkavat ainutlaatuisella tavalla ja jotka koostuvat yli 30 plasma- ja soluproteiinista [7]. Vaihtoehtoinen reitti on jatkuvasti hereillä, ja sitä säätelevät proteiinit, kuten komplementtitekijä H (FH). FH on kiertävä proteiini, jota enimmäkseen syntetisoi maksa [8]. Apoferritiinillä hoidetuilla FH-puutteisilla (fh-/-) hiirillä kehittyy krooninen seerumitauti (CSS), joka johtaa diffuusiin proliferatiiviseen glomerulonefriittiin (GN) viiden viikon kuluessa hoidosta, kun taas C57BL/6-poikuehiirillä, jotka ovat H-tekijää (FH) riittävästi, kehittyy vain vähän glomerulaarinen tulehdus [9]. F4/80+-makrofagien infiltraatio tapahtuu munuaisissa, ja sitä havaitaan fh-/--hiirten IC-kertymien ympärillä. Komplementin aktivaatio tuottaa anafylatoksiineja, C3a ja C5a, jotka osallistuvat Mϕs:n kuljettamiseen tulehduskohtaan. C5a/C5aR1-signaloinnin esto vähensi Mϕ:tä munuaisissa [10]. Tässä asetuksessamunuaisvaurioliittyy munuaisten infiltraatioon, mutta mekanismeihin, jotka voivat olla mukana aiheuttamassamunuaisvauriojää tuntemattomaksi.

Kuva 1: FH muuttaa makrofagimarkkerigeenejä hiirten munuaisissa, joilla on FH-riippuvainen ICGN. Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR CD204:lle ja CD206:lle käyttämällä munuaisista eristettyä mRNA:ta 5 viikon suolaliuoksen tai apoferritiinin käytön jälkeen. Lauseke normalisoidaan muotoon GAPDH (n=6/ryhmä). ∗P < 0:01. Kaaviot kuvaavat geenien käänteismuutosta apoferritiinillä hoidetuissa fh-/- hiirissä (n=6) verrattuna suolaliuoksella käsiteltyihin fh-/- hiiriin (n=6).

Hematopoieettisten solujen [11] tuottamat monosyytit (Mo) kulkeutuvat endoteelin kautta kudoksiin, missä ne erilaistuvat Mϕs:ksi. Markkerit, kuten F4/80-, CD11b-, CD68- ja Fc-reseptorit, voivat tunnistaa Mϕ:t. Mϕ:t ovat kriittisesti mukana munuaisvauriossa, korjaamisessa ja fibroosissa munuaissairauden eri kokeellisissa malleissa [12, 13]. Äskettäin tutkimuksemme osoittivat, että munuaisvaurio FH-riippuvaisessa ICGN:ssä liittyy Mϕs:n munuaisten infiltraatioon. Lisäksi aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että munuaisten Mϕ-infiltraation estäminen alentaa valtimopainetta ja estää glomerulusvaurioita ja fibroosia erilaisissa nefropatian eläinmalleissa [14, 15]. Tietojemme mukaan Mϕ:n ehtymisen vaikutusta FH-riippuvaiseen ICGN:ään liittyvän munuaisvaurion aikana ei kuitenkaan ole käsitelty. Siksi tässä tutkimuksessa tutkittiin Mϕs:n roolia munuaisvauriossa, joka liittyy FH-riippuvaiseen ICGN:ään käyttämällä liposomiklodronaattia. Klodronaatti (klodronihappo) on bisfosfonaatti, joka metaboloituu ei-hydrolysoituvaksi ATP-analogiksi [16]. Kokeemme osoittavat, että Mϕ:llä on keskeinen rooli munuaisten toiminnan menetyksessä säätelemättömän komplementin aktivaation olosuhteissa. Siksi Mϕ:n vähentäminen tai Mϕ:n ohjeistaminen olettamaan korjausfenotyyppi voisi vähentää sairauden patologiaa ja sitä voidaan hyödyntää terapeuttisesti.

2. Materiaalit ja metodit

2.1. Koeeläimet.

Fh−/−-hiirikannan kehitti ja ystävällisesti toimitti Drs. Matthew Pickering ja Marina Botto (Imperial College of London) ja palasivat jatkuvasti takaisin C57BL/6-kantaan laboratoriossamme yli 10 sukupolven ajan. Pentueen FH-riittävät hiiret toimivat kontrolleina (n=8/ryhmä) Genotyypitys suoritettiin käyttämällä PCR-pohjaisia ​​lähestymistapoja. Hiiriä pidettiin 20–22 asteen lämpötilassa 12 tunnin valo-12 tunnin pimeässä valaistusjaksossa steriileissä, tuuletetuissa häkeissä, joissa oli ruokaa ja vettä ad lib. Chicagon yliopisto ja Buffalon yliopiston institutionaaliset eläinten hoito- ja käyttökomiteat hyväksyivät kaikki tutkimukset.

2.2. Kroonisen seerumin sairauden protokolla.

CSS indusoitiin 6–8 viikon fH−/− tai villityypin hiirillä antamalla päivittäin intraperitoneaalisesti 4 mg hevospernan apoferritiiniä (Calzyme Laboratories) ilman adjuvanttia [10, 17, 18] 5 viikon ajan. Poikuekontrollit saivat vatsaontelonsisäisiä injektioita suolaliuosvehikkeliä samanaikaisesti

2.3. Munuaisten toiminnan arvioinnit.

Veren ureatypen (BUN) pitoisuudet määritettiin Beckman Autoanalyzer -laitteella (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Virtsan albumiinipitoisuudet mitattiin hiiren albumiinin ELISA-sarjalla (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) ja normalisoitiin virtsan kreatiniiniin, joka mitattiin kolorimetrisesti (Stanbio Laboratory, Boerne, TX), kuten aiemmin on kuvattu [19].

Kuva 2: Klodronaatti vähentää yhä enemmän munuaisten makrofageja hiirissä, joilla on FH-riippuvainen ICGN. Annetaan F4/80+ monosyyttien/Mϕs virtaussytometriaprofiilit päivinä 0, 2, 4 ja 7, edustavasti. F4/80+-solujen ilmentyminen määritettiin virtaussytometrialla. Tiedot analysoitiin käyttämällä FlowJo V10 -ohjelmistoa. F4/80+-solut vähenevät merkittävästi jokaisessa ajankohdassa saavuttaen alle 10 % 7. päivänä. Jokainen aikapiste n=6.

2.4. Histologia.

Munuaiset upotettiin parafiiniin ja malin-kiinnitettiin, ja luotiin neljän mikrometrin leikkeet. Leikkeet värjättiin Periodic Acid-Schiffillä, ja munuaispatologi (AC) tutki ne sokeutetulla tavalla. Jokaisen objektilasien osalta proliferatiivinen glomerulonefriitti ja glomeruloskleroosi luokiteltiin arvosta 0 4:ään, kuten aiemmin on kuvattu [20]. Immunofluoresenssimikroskopiaa varten munuaiskudos pikajäädytettiin 2-metyylibutaanissa, joka oli esijäähdytetty kuivajäässä. Neljän mikronin kryostaattileikkeitä käsiteltiin immunofluoresenssivärjäystä (IF) varten. Leikkeet kiinnitettiin 4-prosenttisessa paraformaldehydissä ja värjättiin Alexa{12}}konjugoidulla anti-hiiri C3:lla (Cappel) ja Alexa 555 anti-hiiri IgG:llä. Värjäytymisen intensiteetin ja jakautumisen puolikvantitatiivinen pistemäärä 0 - 4 toimitettiin sokkomenetelmällä, kuten aiemmin on kuvattu [19].

2.5. qRT-PCR.

Munuaiset otettiin talteen ja kokonais-RNA uutettiin kudoksista käyttämällä TRIzol-reagenssia valmistajan ohjeiden mukaisesti (Invitrogen, USA). cDNA syntetisoitiin käyttämällä SuperScript III -käänteistranskriptaasia (Invitrogen). qRT-PCR suoritettiin käyttämällä Power SYBR Green PCR Master -sekoitusta ABI 7700 -sekvenssidetektorilla (Applied Biosystems). PCR-monistus suoritettiin 25 ul:n kokonaistilavuudessa, joka sisälsi 12,5 ui 2x TaqMan Universal PCR Master Mixiä (Applied Biosystems), 6,25 ui nukleaasivapaata vettä, 5 ui cDNA:ta ja 1,25 ul sopivia alukkeita (IDT). Kaikki qPCR-alukkeet (taulukko 1) suunniteltiin käyttämällä Primer3-ohjelmistoa (Whitehead Institute for Biomedical Research) spesifisyyden ja herkkyyden varmistamiseksi. MRNA-tasojen kvantifioimiseksi normalisoimme kohdegeenien ilmentymisen glyseraldehydi-3--fosfaattidehydrogenaasiksi. Suhteelliset mRNA:n ilmentymistasot laskettiin käyttämällä 2-ΔΔCt-menetelmää ja normalisoitiin GAPDH:n ilmentymistasoille.

2.6. Tilastot.

Kaikki tulokset ovat keskiarvoja ± SD vähintään {{0}} hiireltä kussakin ryhmässä. Joko paritonta kaksisuuntaista testiä (tiedot normaalijakaumalla) tai Mann–Whitney U -testiä (tiedot ilman normaalijakaumaa) käytettiin kahden ryhmän vertailuun GraphPad Prism 5:llä.0. Tilastollinen merkitsevyys ilmaistaan ​​seuraavasti: ∗P < 0:05; ∗∗P < 0:01; ja ns: ei merkitsevä.

Wecistanchen tukipalvelu - Kiinan suurin vesisäiliön viejä:

Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Puhelin:+86 15292862950

Osta lisätietoja teknisistä tiedoista:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop