P-gp-välitteisten lääkkeiden ja lääkkeiden yhteisvaikutusten in vitro -arviointi ihmisen munuaissolumallilla RPTEC/TERT1

edmund.chen@wecistanche.com

Johdanto P-glykoproteiinin (P-gp) estopotentiaalin in vitro -arviointi on tärkeä kysymys lääkekehitysprosessin aikana, koska se mahdollistaa kliinisesti merkittävien lääkeaineiden välisten interaktioiden (DDI:t) ennustamisen [1–3]. P-gp kuuluu ATP-sitoutumiskasetti (ABC) -kuljettajien superperheeseen, ja sitä koodaa monilääkeresistenssigeeni MDR1 (tunnetaan myös nimellä ABCB1). Tämän kalvon kuljettajan tiedetään yli-ilmentyvän kasvainsoluissa ja aiheuttavan vastustuskykyä monille syöpälääkkeille [4]. Sijaitsee kaikissa fysiologisissa esteissä, mukaan lukien suolistossa, maksassa jamunuaiset, P-gp suojaa ksenobiootteja vastaan ​​rajoittamalla näiden substraattien imeytymistä ruoansulatuskanavasta ja helpottamalla niiden ulosvirtausta sappeen ja virtsaan. Siten P-gp:llä on merkittävä rooli eri terapeuttisten luokkien farmakokinetiikassa [5–7]. Lukuisten lääkkeiden, kuten syöpälääkkeiden, sienilääkkeiden ja sydän- ja verisuonilääkkeiden tiedetään olevan P-gp:n substraatteja ja/tai estäjiä, ja monet niistä liittyvät kliinisesti merkittäviin yhteisvaikutuksiin [8–10]. Siksi Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkevirasto (FDA) määrää, että P-gp:n estopotentiaali on arvioitava lääkekehityksen alkuvaiheessa. Tätä tarkoitusta varten tehdyt in vitro -määritykset perustuvat yleensä lääkekuljetustutkimuksiin, joissa käytetään P-gp:tä ilmentäviä solulinjoja. Tarkemmin sanottuna FDA:n ohjeissa suositellaan in vitro puolimaksimaalisen estopitoisuuden (IC50) määrittämistä, jotta voidaan arvioida P-gp:n estämisestä johtuvien kliinisen DDI:n riski. Tätä varten on tehty monia kokeellisia määrityksiä, ja useimmat niistä ovat keskittyneet suolistosta imeytymiseen liittyviin lääkevuorovaikutuksiin käyttämällä Caco-2- tai MDCK-MDR1-malleja [11–13]

CISTANCHE PARANTAA MUNUAIS-/munuaissairauksia

Siitä asti kunmunuaistenEliminaatio on myös yleinen eliminaatioreitti eri lääkeluokille, ja aktiivinen tubuluseritys ABC-kuljettajien kautta voi myös olla avainasemassa näissä yhteisvaikutuksissa [14]. Kuitenkin in vitro -tiedotmunuaistenP-gp:n välittämiä DDI:itä on rajoitetusti. Tämä johtuu osittain siitä, että in vitro -malleja ei ole kehitetty ja karakterisoitumunuaistenhuumeiden kuljetus. Eri ihmissolulinjoista RPTEC/TERT1-malli näyttää lupaavan arvioidamunuaistenlääkkeiden yhteisvaikutukset. Tämä solulinja on peräisin terveeltä ihmisluovuttajalta ja se on luotu immortalisoiduista proksimaalisista tubulussoluista. Lisäksi P-gp:n ilmentyminen ja toiminnallisuus on osoitettu tällä mallilla, mikä vahvistaa sen kykyä ennustaa.munuaistenhuumeefuxit [15, 16]. Tässä yhteydessä tämä tutkimus suunniteltiin tutkimaan P-gp:n estopotentiaalia käyttämällä RPTEC/TERT1-mallia. Ensin suoritettiin rodamiini 123:n (R123) kertymisen seulontamääritys, jotta saatiin kunkin testatun lääkkeen estoprofiili. Tämän seulonnan perusteella valittiin neljä lääkettä arvioimaan niiden pitoisuudesta riippuvaisia ​​vaikutuksia kahden P-gp-substraattilääkkeen: apiksabaanin ja rivaroksabaanin solunsisäiseen kertymiseen.

Avainsanat:munuaissolu, munuaismalli, munuaislääke, eliminaatio munuaisten kautta, munuaiset.

Materiaalit ja menetelmät

ReagenssitApiksabaani, [2H71 3C ] - apixa ban , ri va r oxa ban , [13C6]-rivaroksabaani, nilotinibi, krisotinibi, erlotinibi, aksitinibi, idelalisibi, varfariini ja dabigatraanieteksilaatista ostettiin Ranska). Verapamiili, ketokonatsoli, simvastatiini, amiodaroni, rodamiini 123, Hankin tasapainotettu suolaliuos (HBSS) ja HEPES-liuos ostettiin Sigma-Aldrichilta (Saint-Quentin-Fallavier, Ranska).

Soluviljely  RPTEC/TERT1-solut saatiin American Type Culture Collectionista (ATCC, Molsheim, Ranska) ja niitä viljeltiin hormonaalisesti määritellyssä, seerumivapaassa alustassa, joka koostui Dulbeccon Modifed Eagle's Medium F12:sta (ATCC), jota oli täydennetty kasvutekijäpakkauksella (ATCC) ja 1 prosentti antibiootti/antimykoottiseosta (penisilliini-streptomysiini, amfoterisiini B) 37 asteessa ja 5 % CO 2. Kaikissa kokeissa solut kylvettiin 96-kuoppalevyille tiheydellä 50,000 soluja kuoppaa kohti ja niitä käytettiin kasvatukseen 14 päivän viljelyn jälkeen. Elatusaine uusittiin 2 päivän välein ja soluja käytettiin siirrostuksesta 27 viljelyyn 34. Caco-2-soluja ostettiin myös ATCC:ltä. Soluja pidettiin viljelyalustassa, joka koostui Eagle's Minimal Essential -elatusaineesta (Sigma–Aldrich, Missouri, USA), jota oli täydennetty 10 prosentilla FBS:llä, 1 prosentilla ei-välttämättömiä aminohappoja ja 1 prosentilla antibiootti/antimykoottiseosta (penisilliini-streptomysiini, amfoterisiini B). ) 37 asteessa ja 5 prosentin CO2:ssa. Caco-2-soluja kylvettiin 96-kuoppalevyille tiheydellä 5 × 10 3 solua kuoppaa kohti ja niitä käytettiin kasvatukseen 14 päivän viljelyn jälkeen. Ihmisen proksimaaliset tubulaariset epiteelisolut (HPTEC:t) saatiin BIOPREDIC:ltä (Rennes, Ranska) ja niitä viljeltiin DMEM/F12:ssa, jota oli täydennetty hydrokortisonilla, EGF:llä, insuliinilla, transferriinillä ja natriumseleniitillä. Solut kylvettiin 96-kuoppa kollageenipäällysteisille viljelylevyille tiheydellä 6 600 solua kuoppaa kohti, ja niitä käytettiin kasvatukseen 11 päivän viljelyn jälkeen.

Rodamiini 123:n akkumulaatioseulontamääritys  P-gp:n estopotentiaali määritettiin mittaamalla rodamiini 123:n solunsisäinen kertymä RPTEC/TERT1-soluissa erilaisten lääkeluokkien läsnäollessa ja poissa ollessa. 14 testatun lääkkeen joukossa P-gp:n estäjinä käytettiin syklosporiini A:ta (10 uM), ketokonatsolia (50 uM), verapamiilia (100 uM) ja amiodaronia (50 uM). Apiksabaania, rivaroksabaania ja dabigatraanieteksilaattia – kolmea suoraa oraalista antikoagulanttia (DOAC) – käytettiin P-gp-substraatteina (10 µM). Varfariinia (50 µM) käytettiin ei-inhibiittorina, ja viittä syöpälääkettä, mukaan lukien nilotinibi, krisotinibi, erlotinibi ja idelalisibi, käytettiin tietämättä niiden estoprofiileja pitoisuutena 10 µM. Useita olosuhteita toistettiin Caco-2-soluilla, jotka FDA on hyväksynyt lääkekuljetustutkimuksiin. Tällä tavalla rodamiini 123:n solunsisäinen retentio määritettiin Caco-2-soluissa verapamiilin (100 µM), syklosporiini A:n (10 µM), nilotinibin (10 µM) ja DOAC:ien (10 µM) läsnä ollessa ja ilman niitä. ). Lyhyesti sanottuna, 14 päivän viljelyn jälkeen 96-kuoppalevyillä soluja esi-inkuboitiin 10 minuuttia 37 asteessa jokaisen lääkkeen kanssa, joka oli liuotettu HBSS:ään, jossa oli 10 mM HEPES (tilavuus/tilavuus). Sitten soluja inkuboitiin 10 uM rodamiini 123:n kanssa 45 minuuttia 37 asteessa. Lopuksi kolmen pesun jälkeen kylmässä HBSS/HEPES-liuoksessa soluja lyysattiin huoneenlämpötilassa 45 minuuttia liuoksessa, jossa oli natriumdodekyylisulfaattia (SDS), joka sisälsi 1 % natriumboraattia. Solunsisäisen rodamiinin 123 määrä kvantifioitiin käyttämällä Infnite M -nanospektrofuorometriä (Life Sciences, TECAN, Sveitsi) ja aallonpituuksiksi asetettiin 485/535 nm. Tiedot ilmaistiin prosentteina rodamiini 123:n kertymisestä kontrollisoluissa, jotka eivät olleet altistuneet millekään mahdolliselle P-gp:n inhibiittorille, ja asetettiin mielivaltaisesti 100-prosenttiseen kertymiseen.

DOAC intrasellulaarisen kertymisen määritys ja IC50:n määritys Edellisestä rodamiini 123 -seulontamäärityksestä valittiin neljä lääkettä tutkimaan niiden pitoisuudesta riippuvaisia ​​vaikutuksia apiksabaanin ja rivaroksabaanin (10 µM) solunsisäiseen kertymiseen RPTEC/TERT1-soluissa. Ketokonatsoli, krisotinibi ja nilotinibi valittiin P-gp:n estäjiksi ja varfariini ei-inhibiittoriksi. Syklosporiini A:ta (10 µM) käytettiin kuljettajien laajakirjoisena estäjänä. Tutkimukset DOAC:iden ja nilotinibin välisistä vuorovaikutuksista IC50-arvojen määrittämiseksi toistettiin Caco-2-soluissa näiden kahden solumallin vertailemiseksi. Kaikki yhdisteet laimennettiin joko yksinään tai siihen liittyvän inhibiittorin kanssa HBSS-kuljetuspuskuriin, jota oli täydennetty 1 prosentilla HEPES:llä (tilavuus/tilavuus) ja 1 prosentilla DMSO:ta (tilavuus/tilavuus). Ennen inkubointia kaikki liuokset esilämmitettiin 37 asteeseen ja pH säädettiin arvoon 7,4. Syöpälääkkeiden krisotinibin ja nilotinibin pitoisuudet vaihtelivat 0,1 - 25 µM niiden huonon liukoisuuden ja sytotoksisuuden vuoksi. Ketokonatsolin ja varfariinin pitoisuudet vaihtelivat välillä 0,1-100 µM. Lyhyesti, 14 päivän viljelyn jälkeen kaikkia lääkkeitä, jotka oli liuotettu HBSS:ään, jossa oli 1 % HEPES:ää (tilavuus/tilavuus), esi-inkuboitiin 10 minuuttia 37 asteessa. Sitten soluja inkuboitiin 10 uM:n kanssa apiksabaania tai rivaroksabaania 60 minuuttia 37 °C:ssa. Lopuksi kolmen pesun jälkeen kylmässä HBSS/HEPES-liuoksessa soluja lyysattiin huoneenlämpötilassa 45 minuuttia 0,2-prosenttisessa Triton X-100 -liuoksessa. Solunsisäisen DOAC:n määrä mitattiin sitten nestekromatografia-massaspektrometrialla (LC-MS). Tiedot ilmaistiin prosentuaalisina lisäyksinä DOAC:n kerääntymisessä, ja DOAC:n solunsisäinen kertymä asetettiin mielivaltaisesti 100 prosenttiin kontrollisoluissa. P-gp-aktiivisuuden estämisen IC50-arvot, jotka vastaavat puolta maksimaalista efektiivistä konsentraatiota (EC50) DOAC-kertymän lisäämiselle, määritettiin painottamattomalla epälineaarisella pienimmän neliösumman regressiomallinnuksella lisääntyneestä kertymisestä nls()-funktiolla R:ssä. ohjelmisto seuraavan yhtälön mukaisesti (yhtälö 1):

Nestekromatografia-massaspektrometria-analyysiApiksabaanin (m/z 460.19793) ja rivaroksabaanin (m/z 436.07285) kvantifiointi suoritettiin käyttämällä Ultimate U300{{18 }} nestekromatografiajärjestelmä (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) yhdistettynä Q-Exactive Plus -massaspektrometriin (ThermoFisher, Bremen, Saksa). LC-erotukset suoritettiin käyttämällä Hypersil Gold C18 (3 µm, 50 × 2,1 mm) analyyttistä kolonnia (ThermoFisher Scientifc, Waltham, MA, USA) ja virtausnopeutta 0,6 ml/min . Liikkuva faasi A oli vesi, jossa oli 0,1 prosenttia muurahaishappoa (FA) ja liikkuva faasi B asetonitriili, jossa oli 0,1 prosenttia FA:ta. Rivaroksabaanin gradientti oli: 0–0,3 min, 10 prosenttia B; 0,3–1 min, lineaarinen 10 prosentista 70 prosenttiin B; 1–1,5 min, 70 prosenttia B; 1,51 min, palaa lähtöolosuhteisiin 3 min asti. Apiksabaanin gradientti oli: 0–0,3 min, 10 prosenttia B; 0,3–0,7 min, lineaarinen 10–90 prosenttia B; 0,7–1,5, 90 prosenttia B; 1,51 min, palaa lähtöolosuhteisiin 3 min asti. Havaitseminen suoritettiin sähkösumutuspositiivisessa rinnakkaisreaktion monitorointitilassa (PRM) resoluutiolla 35,000 (m/z 200). Sisäiset standardit (IS:t) olivat [13C,2H7]-apiksabaani (m/z 468,2452) apiksabaanille ja [13C6]-rivaroksabaani (m/z 442,09297) rivaroksabaanille. Jokaisen lääkkeen ja sen vastaavan IS:n kohdalla tarkkailtiin kohde-ionia (kvantifiointia varten) ja konfring-ionia. Rivaroksabaanin ja sen IS:n kohdeioni oli m/z 144,95125 ja konfring-ionit olivat m/z 231,11280 ja m/z 237,13298. Apiksabaanin ja sen IS:n kohde-ioni oli m/z 199,08656 ja vastaavat ionit olivat m/z 282,12387 ja m/z 241,06062.

Tulokset

Rodamiini 123:n akkumulaatioseulontamääritysRodamiini 123:n kertymisen seulontamääritys suoritettiin RPTEC/TERT1-soluissa 14 lääkkeellä, joilla oli erilaiset estoprofiilit (kuvio 1). Kuten odotettiin, rodamiini 123:n solunsisäinen kertyminen syklosporiini A:n, laajakirjoisen inhibiittorin, läsnäollessa oli korkeimpien joukossa, ja kertyminen lisääntyi 75 prosenttia kontrollisoluihin verrattuna. Verapamiilin, spesifisen P-gp:n estäjän, läsnäolo johti rodamiini 123:n kertymisen lisääntymiseen 57 prosentilla, mikä osoittaa P-gp:n osallisuuden. Samalla tavalla ketokonatsoli, jota kuvataan vahvaksi P-gp:n estäjäksi, johti suurempaa nousuun (66 prosenttia) rodamiini 123:n solunsisäiseen kertymiseen verapamiiliin verrattuna, mikä vahvisti sen estoprofiilin. Sitä vastoin kohtalaiseksi P-gp:n estäjäksi luonnehditun amiodaronin lisääminen lisäsi kertymistä 59 prosenttia, mikä on samanlaista kuin verapamiilin aiheuttama. Syöpälääkkeillä nilotinibillä, aksitinibillä, krisotinibillä, erlotinibillä ja idelalisibilla havaittiin erilaisia ​​estoprofiileja. Nilotinibin lisääminen lisäsi rodamiini 123:n kertymistä voimakkaasti (71 prosenttia), mikä viittaa merkittävään estopotentiaaliin, jota seurasi aksitinibi, joka lisäsi retentiota 57 prosenttia. Toisaalta krisotinibillä ja erlotinibillä oli kohtalainen tai alhainen estopotentiaali, rodamiini 123:n kertymisen lisääntyessä 23 prosenttia ja erlotinibissä 16 prosenttia. Idelalisibi ei vaikuttanut rodamiini 123:n kertymiseen; sama koski varfariinia, joka oli

valittu ei-inhibiittoriksi. Kolmesta DOAC:sta apiksabaani ja rivaroksabaani lisäsivät hieman rodamiini 123:n retentiota: 33 prosenttia ja 12 prosenttia. Mielenkiintoista on, että dabigatraanieteksilaatti, dabigatraanin aihiolääke ja P-gp:n tunnettu substraatti, aiheutti rodamiini 123:n retention noin 50 prosentin lisäyksen, vaikka sitä ei kuvata mahdolliseksi P-gp:n estäjäksi. Lopuksi simvastatiinin lisäys aiheutti vain vähäisen lisäyksen fuoresoivan substraatin kertymiseen (32 prosenttia). Tämän seulonnan perusteella valittiin neljä lääkettä arvioimaan niiden pitoisuudesta riippuvaisia ​​vaikutuksia apiksabaanin ja rivaroksabaanin solunsisäiseen kertymiseen RPTEC/TERT1-mallissa. Ketokonatsoli valittiin positiiviseksi kontrolliolosuhteiksi P-gp:n estämiselle, ja varfariini valittiin P-gp:n ei-inhibiittoriksi negatiiviseen kontrollitilaan. Nilotinibi ja krisotinibi valittiin vahvoiksi ja kohtalaisiksi P-gp:n estäjiksi, vastaavasti. Viitemallissa Caco-2 toistettiin useita ehtoja. R123:n solunsisäinen kertyminen soluihin määritettiin, kun niitä oli yhdistetty (tai ei) apiksabaanin ja rivaroksabaanin (10 µM), nilotinibin (10 µM) ja syklosporiini A:n (10 µM) ja verapamiilin (100 µM) kanssa eston kontrolliolosuhteissa. (kuvio 2A). Kuten odotettiin, verapamiili ja syklosporiini A lisäsivät R123:n retentiota voimakkaasti, 297 prosenttia ja 275 prosenttia. Samalla tavalla nilotinibi lisäsi voimakkaasti R123:n solunsisäistä kertymistä (229 prosenttia), mikä vahvisti sen estopotentiaalin. R123:n yhdistäminen DOAC-lääkkeisiin johti vähäiseen lisääntymiseen R123:n kertymiseen (40–44 prosenttia) muihin lääkkeisiin verrattuna. Lisäksi rodamiini 123:n solunsisäinen kertyminen syklosporiini A:n puuttuessa ja läsnä ollessamunuaistenprimaarisia ihmisen soluja tutkittiin myös tässä tutkimuksessa RPTEC/TERT1-soluilla saatujen tulosten luotettavuuden tarkistamiseksi (kuvio 2B). Nämä analyysit osoittivat, että syklosporiini A:n läsnäolo lisäsi R123:n retentiota 71 prosentilla. Tämä arvo oli lähellä arvoa, joka saatiin samoissa olosuhteissa RPTEC/TERT1-soluilla (75 prosentin lisäys syklosporiini A:lla). Siksi P-glykoproteiinin aktiivisuus oli samanlainen RPTEC/TERT1-mallissa ja primäärisissä ihmissoluissa.

DOAC:n solunsisäisen kertymisen määritys: IC50- ja I1/IC50-suhteen määritys Solunsisäistä kertymistä koskevia tutkimuksia suoritettiin apiksabaanin ja rivaroksabaanin P-gp-välitteisen kuljetuksen arvioimiseksi vakiopitoisuudessa 10 µM RPTEC/TERT1-soluissa in vitro ja kasvavien nilotinibin, krisotinibin ja ketokonatsolin pitoisuuksien läsnä ollessa. ja varfariini (kuvat 2, 3). Apiksabaanin ja rivaroksabaanin lisääntyneen retention mallinnus arvioitiin IC50-arvojen määrittämiseksi. DOAC:ien yhdistäminen nilotinibin kanssa johti alhaisimpiin IC50-arvoihin: 0,85 uM ja 1,37 uM rivaroksabaanille ja apiksabaanille, vastaavasti (kuvat 4, 5). Yhdistelmä krisotinibin kanssa tuotti IC50-arvot 10,1 µM rivaroksabaanille ja 12,2 µM apiksabaanille, vastaavasti. Yllättäen DOAC:ien yhdistäminen ketokonatsolin kanssa ei tuottanut alhaisimpia IC50-arvoja (16,5 uM ja 16,9 uM rivaroksabaanille ja apiksabaanille, vastaavasti). Lopuksi odotetusti yhdistelmä varfariinin kanssa, mikä oli

valittu ei-inhibiittoriksi, ei vaikuttanut kahden DOAC:n solunsisäiseen retentioon. Sekä apiksabaanin että rivaroksabaanin solunsisäistä kertymistä Caco-2-soluissa nilotinibin kasvavien pitoisuuksien läsnä ollessa tutkittiin sen vuoksi solumalleihin verrattuna. Mielenkiintoista on, että kuten RPTEC/TERT1-mallissa havaittiin, rivaroksabaanin (4,16 µM) IC50-arvo oli pienempi kuin apiksabaanilla (9,35 µM). On myös mielenkiintoista huomata, että Caco-2-soluissa havaitut IC50-arvot olivat korkeammat kuin RPTEC/TERT1-soluissa saadut arvot samalla inhibiittorilla. DDI:n kliininen merkitys voidaan ennustaa in vitro -tiedoista. FDA:n ohjeiden mukaan [I1]/IC50-suhteet laskettiin jokaiselle lääkeyhdistelmälle. Tämä suhde mahdollistaa in vivo -pitoisuuksien verrauksen niihin, joiden tiedetään tuottavan relevanttia vaikutusta in vitro. Apiksabaanille RPTEC/TERT1-soluissa suhteet olivat 3,1, 0,06 ja 17,4 nilotinibin, krisotinibin ja ketokonatsolin kanssa, vastaavasti (taulukko 1). Caco-2-soluissa apiksabaanin ja nilotinibin välisen vuorovaikutuksen [I1]/IC50-suhde oli 0,46 (taulukko 1). Rivaroksabaanilla suhteet olivat hieman korkeammat kuin apiksabaanilla RPTEC/TERT1-soluissa: 5,1, 0,08 ja 17,7 nilotinibillä, krisotinibillä ja ketokonatsolilla (taulukko 2). Samalla tavalla [I1]/IC50-suhde, joka havaittiin rivaroksabaanin ja nilotinibin välisessä vuorovaikutuksessa Caco-2-soluissa, oli 1,03, mikä oli korkeampi kuin apiksabaanilla saatu suhde (taulukko 2).

Keskustelu

Lukuisat viime vuosikymmeninä tehdyt tutkimukset ovat raportoineet P-gp:n merkittävästä roolista lääkkeiden farmakokinetiikassa [17–19]. Ottaen huomioon kasvavan sääntelyn kiinnostuksen P-gp:n välittämiä lääkevuorovaikutuksia kohtaan, in vitro -testit lääkkeiden estopotentiaalin tutkimiseksi ovat tärkeä osa lääkekehitystä ja kliinistä käytäntöä. Tätä tarkoitusta varten on suoritettu monia in vitro -määrityksiä, ja suurin osa asiaan liittyvistä tiedoista ennustetusta suolistosta imeytymisestä on saatu Caco-2- ja MDCK-MDR1-solulinjoista [20–22]. Lääkkeiden aktiivisesta tubuluserittämisestä, jolla on myös keskeinen rooli lääkkeiden jakautumisessa ja joka riippuu ABC-kuljettajien läsnäolosta, on kuitenkin vain vähän tietoa. Tämä havainto liittyy selvästi karakterisoinnin puutteeseenmunuaistensolulinjat lääkkeen ennustamiseenmunuaistenefux. Tämä tavoite vaatii in vitromunuaistenmalli, joka jäljittelee läheisesti fysiologista estettä. Ihmisen solulinja RPTEC/TERT1, joka ilmentää useita ABC-kuljettajia (erityisesti P-gp:tä), näyttää olevan hyvä vaihtoehto, kuten aikaisemmassa tutkimuksessa osoitettiin [16]. Tässä yhteydessä tässä työssä tutkittiin RPTEC/TERT1-mallin soveltamista P-gp:n estopotentiaalin arvioimiseen. Tietojemme mukaan tämä työ on ensimmäinen, joka tarjoaa tietoja P-gp:n estotutkimuksista ihmisillämunuaistensoluja.

In vitro -määritykset P-gp:n estopotentiaalin määrittämiseksi perustuvat yleensä spesifisen referenssi-P-gp-substraatin, kuten digoksiinin tai rodamiini 123:n, käyttöön [23–25]. Helppokäyttöisyytensä vuoksi fuoresoivat koettimet ovat edullisia suuritehoisissa määrityksissä. Lisäksi rodamiini 123:a on käytetty laajasti P-gp-aktiivisuuden havaitsemiseen monissa tutkimuksissa [26–28]. Tällä tavalla määrityksiä rodamiini 123:n kertymisestä RPTEC/TERT1-soluihin suoritettiin tässä tutkimuksessa 14 lääkkeen estoprofiilien tunnistamiseksi. Näistä lääkkeistä syklosporiini A, ketokonatsoli ja verapamiili valittiin vahvoiksi P-gp:n estäjiksi. Näitä estäjiä on karakterisoitu laajasti niiden merkittävän P-gp:n estopotentiaalin vuoksi, mikä johtaa sekä digoksiinin että rodamiini 123:n kuljetuksen modulaatioon [27, 29, 30]. Kuten odotettiin, nämä lääkkeet aiheuttivat suurimmat rodamiini 123 -retentiot RPTEC/TERT1-soluissa. Sitä vastoin R123:n retentiossa ei havaittu lisääntymistä varfariinilla, jota käytettiin negatiivisena kontrollina, mikä vahvistaa RPTEC/TERT1-mallin luotettavuuden. Mielenkiintoista on, että kaikista testatuista lääkkeistä DOAC:t – mukaan lukien dabigatraanieteksilaatti, apiksabaani ja rivaroksabaani – lisäsivät selvästi R123:n retentiota, vaikka niitä ei aiemmin luonnehdittu estäjiksi, vaan ainoastaan ​​P-gp-substraateiksi [31, 32]. Tämä havainto voi johtua niin kutsutusta "kilpailevasta" inhibitiosta, jossa lääkkeet voivat olla vuorovaikutuksessa P-gp:n samojen sitoutumiskohtien kanssa. P-gp:n parhaiten karakterisoidut kohdat ovat H-kohta (Hoechst 33342:n sitomiseen) ja R-kohta (rodamiini 123:n sitomiseen). Kuitenkin useat muut tuntemattomat lääkettä sitovat kohdat voivat olla osallisia näissä yhteisvaikutuksissa, mikä voisi selittää DOAC:ien erilaiset vaikutukset R123:n kertymiseen [33, 34]. Tietyllä lääkkeellä havaittu P-gp:n esto riippuu siksi in vitro -tutkimuksissa käytetystä substraatista [28, 35]. Erilaisten P-gp-substraattien käyttöä, jotka ovat vuorovaikutuksessa eri lääkkeitä sitovien kohtien kanssa, tulee siksi harkita, jotta voidaan kuvata tarkasti lääkkeiden oletettua P-gp:tä estävää tehoa. On myös mielenkiintoista huomata, että useita rodamiini 123 -seulonnan ehtoja suoritettiin myös Caco-2-soluissa RPTEC/TERT1-solujen vertaamiseksi vertailumalliin lääkekuljetustutkimuksissa. Kuten odotettiin, syklosporiini A, verapamiili ja nilotinibi lisäsivät eniten rodamiinin retentiota. Samat estoprofiilit havaittiin sekä Caco-2- että RPTEC/TERT1-soluilla. Vuorovaikutusten aiheuttamat rodamiini 123 -retention lisäykset Caco-2-mallissa olivat kuitenkin suurempia kuin RPTEC/TERT1-soluissa havaitut, mikä viittaa mahdolliseen eroon P-glykoproteiinin ilmentymisessä mallien välillä. Tutkimuksessa toista menetelmää käytettiin arvioimaan ja vahvistamaan lääkkeiden mahdollinen P-gp:n esto.

CISTANCHE PARANTAA MUNUAIS-/MUUNAISDIALYYSIÄ

Rodamiini 123:n akkumulaatiomäärityksen perusteella valittiin neljä lääkettä määrittämään niiden pitoisuudesta riippuvaiset vaikutukset apiksabaanin ja rivaroksabaanin solunsisäiseen kertymiseen. P-gp:llä on osoitettu olevan päärooli apiksabaanin ja rivaroksabaanin efuxissa [32, 36]. Siksi nilotinibin, krisotinibin ja ketokonatsolin IC50-arvot arvioitiin ja DOAC:t valittiin "uhrilääkkeiksi". Tietojemme mukaan tämä tutkimus on ensimmäinen, jossa on suoritettu solunsisäisiä kertymistutkimuksia DOAC:illa ihmisillä.munuaistensoluja. Nilotinibille ja krisotinibille saadut IC50-arvot olivat niiden estoprofiilien mukaisia, jotka saatiin rodamiini 123:n kerääntymismäärityksestä. Nilotinibi, joka aiheutti voimakkaan lisäyksen R123:n retentiossa, esitti alhaisimman IC50-arvon kahdelle DOAC:lle, mikä vahvistaa sen korkean estopotentiaalin. Tämä tulos on myös yhdenmukainen aiemman tutkimuksen kanssa, joka osoitti [3H]-paklitakselin pitoisuudesta riippuvaa kasvua solunsisäisessä kertymisessä MDR1--transfektoiduissa soluissa, mikä viittaa siihen, että sillä on inhibiittoriprofiili [37]. Krisotinibin osalta R123-määritys osoitti kohtalaista estopotentiaalia, ja R123-retentio lisääntyi vähemmän kuin nilotinibin aiheuttama. Tätä havaintoa tukee aikaisempi tutkimus, jossa krisotinibi lisäsi R123:n ja doksorubisiinin solunsisäistä kertymistä MDR{12}}transfektoiduissa soluissa [38]. Tämä tulos on myös yhdenmukainen DOAC:illa määritettyjen IC50-arvojen kanssa, jotka olivat korkeampia kuin vastaavat nilotinibin arvot, mikä vahvistaa sen kohtalaisen estoprofiilin. On kuitenkin mielenkiintoista huomata, että 10 µM nilotinibin tai krisotinibin pitoisuus ei aiheuttanut samoja lisäyksiä rodamiini 123:n ja DOAC:ien retentiossa. Rodamiiniseulonnassa nilotinibi lisäsi substraatin retentiota noin 71 prosenttia, kun taas DOAC:iden se oli noin 40 prosenttia. Sitä vastoin krisotinibi aiheutti pienen lisäyksen rodamiinin retentiossa (23 prosenttia), mutta suurempi lisäys DOAC:iden retentiossa (noin 50 prosenttia) samalla pitoisuudella. Kuten aiemmin keskusteltiin, tämä havainto voidaan selittää eroilla P-gp:n sitoutumiskohdissa. Tiedetään, että monet lääkkeet ovat vuorovaikutuksessa ja kilpailevat H-sitoutumiskohdan kanssa R-sitoutumiskohdan sijaan (johon rodamiini 123 sitoutuu) ja päinvastoin [39]. Mielenkiintoista on, että ketokonatsoli, jonka tiedetään olevan vahva P-gp:n estäjä, aiheutti hieman pienemmän lisäyksen rodamiini 123:n retentiossa kuin nilotinibi (66 prosenttia vs. 71 prosenttia). Samanlainen arvo havaittiin kuitenkin Caco-2-soluilla, joissa ketokonatsolin läsnäolo aiheutti 60 prosentin lisäyksen R123:n kertymiseen [40]. DOAC:ien solunsisäinen kertyminen IC50-arvojen määrittämiseksi osoitti myös korkeampia arvoja verrattuna nilotinibiin ja krisotinibiin. Mielenkiintoista on, että useimmat LLC-PK1- tai Caco-2-malleista löydetyt IC50-arvot, joissa käytettiin digoksiinia P-gp-substraattina, olivat välillä 3-4 µM ketokonatsolille [41, 42]. Nämä arvot eroavat melkoisesti tässä tutkimuksessa löydetyistä arvoista (16,5 µM ja 16,9 µM apiksabaanin ja rivaroksabaanin kanssa, vastaavasti). Tämä havainto vahvistaa, että substraatin ja käytetyn mallin valinnat ovat ratkaisevia vaikutteita määritettäessä P-gp:n estopotentiaalia. Lisäksi äskettäinen tutkimus raportoi, että ABC-kuljettajien ilmentymistasoilla in vitro solumalleissa on vaikutusta lääkekuljetusmäärityksiin ja siten P-gp:hen liittyvien DDI:iden arviointiin [43]. Itse asiassa verapamiilin IC50-arvojen määrittäminen käyttämällä rivaroksabaania P-gp-substraattina paljasti heterogeenisyyden MDCKMDR1- ja Caco{53}}-solumallien välillä, kun IC50-arvot olivat 6,94 µM ja 21,2 µM [43]. Lisäksi nilotinibin pitoisuudesta riippuvaista vaikutusta apiksabaanin ja rivaroksabaanin solunsisäiseen kertymiseen tutkittiin myös Caco{61}}-soluissa tässä tutkimuksessa. Mielenkiintoista on, että nilotinibin IC50-arvot olivat merkittävästi korkeammat Caco-2-soluissa kuin RPTEC/TERT1-soluissa. Tämä havainto voidaan selittää P-gp:n ilmentymisen erolla näiden mallien välillä. Lisäksi tiedetään, että P-gp:n jakautuminen riippuu tarkasteltavasta kudoksesta. Fallon et ai. osoittivat, että P-gp:n taso oli korkeampimunuainenkuin ihmisen maksakudoksessa [45]. Toisaalta P-gp:n ilmentymistaso näyttää olevan korkeampi suolistossa kuin suolistossamunuainenkudos [46]. Ihmissolujen, kuten RPTEC/TERT1-mallin käyttö, jotka eivät yli-ilmentä kuljettajia, voisi siksi tarjota lisätietoa. Näitä tietoja voidaan käyttää ja imputoida fysiologisesti perustuvassa farmakokineettisessä mallintamisessa (PBPK) integroimalla useita parametreja, kuten P-gp:n määrä kudoksessa tai in vitro -mallissa tai IC50-arvot.

Vaikka ketokonatsolille RPTEC/TERT1-mallissa havaitut IC50-arvot olivat korkeammat kuin kirjallisuudessa havaitut, [I1]/IC50-suhde, joka on validoitu ennakoimaan mahdollisia kliinisesti merkittäviä DDI:itä suun kautta annetuille lääkkeille, osoitti. korkeat arvot, jotka ylittivät FDA:n määrittämän kynnyksen 0,1. Tämä tulos on yhden kliinisen tutkimuksen mukainen, joka osoitti apiksabaanialtistuksen kaksinkertaistuneen ketokonatsolin samanaikaisen käytön yhteydessä [44]. Yhdessä kaikki nämä tulokset osoittavat, että RPTEC/TERT1-malli on lupaava työkalu P-gp:n estopotentiaalin arvioimiseen.

CISTANCHE PARANTAA MUNUAINEN/MUUNAISKIPUA

Johtopäätös

Tutkimuksemme osoitti, että RPTEC/TERT1-mallin soveltaminen on kätevää eri lääkeluokkien P-gp:n estopotentiaalin arvioinnissa. Rodamiini 123:n akkumulaatiomääritykset mahdollistivat ensimmäisen lääkeseulonnan suorittamisen. Kuitenkin sellaisten lääkkeiden P-gp:n estopotentiaalit, jotka eivät ole vuorovaikutuksessa P-gp:n R-kohdan kanssa, on myös tutkittava käyttämällä lisäsubstraatteja ennusteiden vahvistamiseksi. Apiksabaanin ja rivaroksabaanin solunsisäisen kertymisen perusteella määritetyt IC50-arvot ovat rodamiini 123:lla havaittujen estoprofiilien mukaisia. Lisäksi ketokonatsolin ja varfariinin käyttö voimakkaana P-gp:n estäjänä ja vastaavasti ei-inhibiittorina vahvisti RPTEC/TER1-mallin luotettavuus, kun sitä käytetään in vitro -tietojen saamiseksi lääkkeiden estopotentiaalista P-gp:tä vastaan. Lopuksi RPTEC/TERT1-mallilla saatujen tulosten vertailu Caco-2-soluilla saatuihin tuloksiin korosti, kuinka tärkeää on suorittaa in vitro -tutkimuksia eri solumalleilla tietyn lääkkeen estoprofiilin varmistamiseksi.