lisätietoja:ali.ma@wecistanche.com

Osa: II Munuaisten ja munuaisten ulkopuoliset ilmenemismuodot aikuisten seeprakalojen kystinoosin mallissa

2.3.5. Ctns−/− seeprakala lisää sarveiskalvon paksuutta

Kystinoosivaikuttaa silmiin, mikä johtaa kystiinin kertymiseen useisiin kudoksiin, kuten iirikseen, sidekalvoon ja verkkokalvon epiteeliin, mutta sarveiskalvo on kuitenkin eniten vahingoittunut osa kystiinin kertymisen vuoksi [19] ja sen paksuus on lisääntynyt [20]. H&E-värjäystä käyttämällä havaitsimme, että ctns-/-seeprakala osoitti sarveiskalvon stroomakerroksen paksuutta verrattuna villityypin (Kuva 10A, B, E) seeprakalaan. Emme kuitenkaan paljastaneet ilmeisiä poikkeavuuksia ctns-/-zebrafishin verkkokalvon epiteelissä (kuva 10C, D).

Kuva 9. Keskimääräinen uintinopeus villityypin ja ctns−/−seeprakaloissa. Keskinopeus on laskenut ctns−/−seeprakaloissa villityyppiin verrattuna molemmissa sukupuolissa. Keskimääräinen uintinopeus mitataan pikseleinä sekunnissa. Jokainen piste edustaa yhtä seepraa, yhteensä n=6 villityyppistä ja n=6 ctns−/−18- kuukauden ikäistä seepraa. Kaksisuuntainen ANOVA Fisherin pienimmän merkitsevän eron (PLSD) testillä: ** p <>

Kuva 10. Silmien histologia villityypin ja ctns−/− seeprakaloilla. (A, B) Edustavia kuvia villityypin (A) ja ctns−/− (B) 18-kuukauden ikäisen seeprakalan sarveiskalvosta. Sarveiskalvon stroomakerros (mustat nuolenpäät ja mustat viivat). H&E-värjäys. Asteikkopalkit edustavat 50 µm. (C, D) Edustavat kuvat villityypin (A) ja ctns−/− (B) seeprakalan verkkokalvosta. H&E-värjäys. Asteikkopalkit edustavat 50 µm. (E) Sarveiskalvon stroomakerroksen paksuuden suhteellinen kvantifiointi. Jokainen piste edustaa yhtä fikaatiota sarveiskalvon stroomakerroksen paksuudesta. Pariton t-testi Welchin korjauksella, kaksisuuntainen: * p <>

2.3.6. Muita Ctns−/− seeprakalan fenotyyppejä

Yllä mainittujen fenotyyppien lisäksi suoritimme aivojen ja munasarjojen histologisen analyysin löytämättä eroja villityypin seeprakalan ja sen välillä. Lisäksi arvioimme ctns-/-seepran ja villityypin seepran ruumiin pituuden ja painon 18 kuukauden ikäisinä ja havaitsimme lisääntyneen kehon painon ctns-/-seepran molemmissa sukupuolissa verrattuna villityyppiin (Supp. Kuva 1).

3. Keskustelu

Viime vuosikymmeninä,kystinoosion muuttunut kuolemaan johtaneesta lapsuuden sairaudesta hoidettavaksi aineenvaihduntahäiriöksi, jonka kanssa potilaat voivat selviytyä aikuisikään ja saavuttaa korkean iän [21,22]. Potilaiden pidempi eloonjääminen paljasti uusia sairauksien fenotyyppejä ja herätti uusia kysymyksiä hoitojen patogeneesistä ja pitkäaikaisvaikutuksista. Tässä suhteessa kystinoosin aikuisten eläinmallien tutkimisesta tulee yhä tärkeämpää.

Tässä tutkimuksessa tutkimme munuaista ja munuaisten ulkopuolista 18 kuukauden ikäisen kystinosiinin ja aikuisten seepramallin ilmenemismuotoja, mikä vastaa ihmisen ikää 40–50 vuotta [23,24]. Ensin vahvistimme, että aikuisen ctns−/− seeprakalamalli esittelee kystiinin kertymistä koko kehoon ja eri elimiin. VuonnamunuainenHistologisella tasolla havaitsimme merkkejä PTEC-vauriosta, joka heijastui lukuisten hyaliinin kaltaisten eosinofiilisten pisaroiden, sytoplasmisten vakuolien ja siveltimen rajojen osittaisen häviämisenä. Lisäksi ctns−/−urosseeprakalalle kehittyi glomerulusten hypertrofia. Lopuksi osoitimme, että katkaistun kaspaasi 3:n ilmentyminen lisääntyi ctns-/-seepran munuaisten PTEC:ssä, mikä osoittaa, että apoptoosi on osallisena seepran nefropaattisen kystinoosin patogeneesissä. Siitä asti kunkystinoosipotilailla on myös ekstrarenaalisia ilmentymiä, tutkimme ctns−/−-mutaation vaikutusta muihin elimiin seepramallissamme. Mielenkiintoista on, että havaitsimme, että ctns-/-mutaatio aiheutti vaurion ihon anatomiassa ja vaikutti hedelmällisyyteen, liikuntakykyyn ja silmiin.

Lysosomit ovat solunsisäisen ruoansulatuksen paikkoja, ja niitä pidetään solun aineenvaihdunnan tärkeimpinä koordinaattoreina [25]. Koska lysosomaalinen varastointisairaus, keskeinen piirrekystinoosion lysosomaalista kystiinin kertymistä [26,27]. Mielenkiintoista kyllä, havaitsimme 54-kertaisen kystiinin lisääntymisen 18-kuukausien kystiiniseepran koko kehossa villityyppiin verrattuna, kun taas aiemmassa tutkimuksessamme [10] kystiiniseepran toukat 6 päivää hedelmöityksen jälkeen esittivät 13-kertaiseksi. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että kystiini kerääntyy kystiiniseepran eliniän aikana. Nestekromatografia ja massaspektrometria-analyysi ovat vahvistaneet, että kaikkien elinten joukossamunuainenovat ensisijainen paikka kystiinin kertymiselle. Lysosomaalista turvotusta ja hyaliinin kaltaisia ​​eosinofiilisiä pisaroita lysosomien sisällä on raportoitu kystiinikuormitteisessa PTEC:ssä [28,29], ja ihmisen biopsioissa kystiinikiteet näkyvät polymorfisina muototiloina interstitiaalisissa makrofageissa ja PTEC-sytoplasmassa [27]. Ihmisen kudoksissa kystiinin kertyminen ja kiteytyminen on kumulatiivinen prosessi, joka tapahtuu eliniän aikana. Inline, kystiinikiteitä ei havaittu ctns-/-seeprassa toukkavaiheessa [10], kun taas pilottikokeissamme havaitsimme, että kystiinikiteiden polymorfinen muoto ilmaantuu 3 ja 6 kuukauden iässä ja on selvästi näkyvissä. 18-kuukauden iässä, mikä viittaa kystinoosin vaikutusten asteittaiseen pahenemiseenmunuainen.

NapsautaCistanchen vaikutukset munuaissairauteen

Kerästen histologisten muutosten arvioimiseksi mittasimme Bowmanin kapselin pinta-alat, glomeruluskimppu ja Bowmanin ctns−/−zebrafish-avaruuden PAS-värjätyiltä leikkeiltä. Havaitsimme, että ctns−/−zebrafishille kehittyi glomerulusten hypertrofia, mikä viittaa hyperfiltraatioon. Seeprassa havaitut lievät glomerulaariset vauriot saattavat johtua seepran uusiutumiskyvystämunuainen, pystyy lisäämään uusia nefroneja sekä korjaamaan olemassa olevia nefroneja [30].

Histologisen vaurion lisäksi kystiinin kertymisen on osoitettu aktivoivan proteinkinaasin, joka laukaisee apoptoosin PTEC:ssä[12]. Näin ollen arvioimme pilkotun kaspaasin-3 ilmentymisen PTEC:ssä ja havaitsimme, että ctns−/−seebrafish esitti lisääntynyttä kaspaasi-3- ja ydinfragmentaatiota. Katkaistun kaspaasin-3 esiintyminen havaittiin pääasiassa soluissa, jotka kerääntyivät sytoplasmisiin vakuoleihin, mikä viittaa siihen, että vaurioituneessa PTEC:ssä tapahtuu apoptoosia. Yksi lisämekanismi, joka voi selittää lisääntyneen apoptoosin, voi olla reaktiivisten happilajien läsnäolo, joka johtuu kystiinin kertymiseen liittyvästä vähentyneestä glutationista [31]. Lisätutkimukset ovat kuitenkin tarpeen sen arvioimiseksi, esiintyykö tämä mekanismi myös ctns−/−seeprakalassa.

Siitä huolimattamunuaisetovat ensimmäiset ja vakavimmin vahingoittuneet elimet,kystinoosion monisysteeminen sairaus, johon liittyy useita elimiä, kuten iho, sukurauhaset, silmät ja lihakset. Kirjallisuudesta tiedetään, että kystinoosipotilailla on usein ennenaikaista ihon ikääntymistä, vaaleat hiukset ja vaalea ihonväri [13]. Jälkimmäinen fenotyyppi johtuu kystinosiininkuljettajan osallistumisesta melaniinisynteesin säätelyyn[32] ja tummemman pigmentaation ylläpitämisestä äskettäin löydetyn kysteiininkuljettajan MFSD12 [33] kautta. Jännittävää on, että aikuisen ctns−/−zebrafish-mallimme esitti hypopigmentoituneen ja pilkullisen ihokuvion ja osoitti heikentynyttä melaniinin jakautumista, jota ei havaittu toukkavaiheessa [10].

Lisäksi,kystinoosiaiheuttaa hedelmättömyyttä miehillä, kun taas naisten tiedetään olevan hedelmällisiä [14]. Viimeaikaiset tiedot viittaavat siihen, että hedelmättömyys voi johtua progressiivisesta kivesten rappeutumisesta, joka johtaa siemennesteen laadun muuttumiseen, tai tukkeutumisesta miehen eritysjärjestelmän määrittelemättömässä osassa. Tukkeutuneet rakenteet voivat vaikuttaa siemennesteen laatuun, erityisesti alueilla, joilla kanavien halkaisija on hyvin pieni, esimerkiksi retetestis[16]. Seeprakalan siittiöt geneettiseen prosessiin ovat hyvin samankaltaisia ​​kuin nisäkkäillä; Yksi tärkeimmistä eroista on kuitenkin se, että kystissä tapahtuu spermatogeneesiä [34]. Tutkimuksessamme havaitsimme lisääntynyttä siittiösolua ctns−/−seebrafishin siittiöiden kystasta, mutta emme löytäneet merkkejä kivesten rappeutumisesta. Siksi kuvattu fenotyyppi voi viitata tukkeutumiseen kivesten tasolla, mikä johtaa vähemmän siittiöiden vapautumiseen ympäristöön, mutta lisätutkimukset ovat tarpeen tämän hypoteesin vahvistamiseksi. Toiminnallisella tasolla vähentynyt munien määrä ja vähentynyt hedelmöittyneiden munien määrä näyttävät heijastavan ctns−/−seepran hedelmällisyyden heikkenemistä.

Toinen kliininen ilmentymäkystinoosi, joka yleensä vaikuttaa potilaisiin toisesta iästä alkaen, on myopatia, jolle on ominaista lihasten kuihtuminen ja heikkous [1]. Mielenkiintoista on, että havaitsimme, että ctns-/-aikuinen seeprakala vähentää liikkumisaktiivisuutta kontrolliin verrattuna, mikä viittaa heikentyneeseen lihastoimintaan. On huomattava, että tätä fenotyyppiä ei esiintynyt toukissa [10], mikä viittaa siihen, että se vaikuttaa ctns−/−seeprafisiin taudin myöhemmässä vaiheessa. Tästä huolimatta lihaksissa ei havaittu näkyviä histologisia eroja. Vähentynyt liikuntaaktiivisuus saattaa johtua mitokondrioiden toimintahäiriöistä, joita ei voitu havaita rutiininomaisilla histologisilla tutkimuksilla [35–37]. Tästä syystä kystinoosiseeprakalan mitokondrioiden kattava karakterisointi vaatii lisäarviointia.

Edellä mainittujen fenotyyppien lisäksi useat tutkimukset ovat osoittaneet, että kystinoosipotilailla on myös silmäoireita, kuten valonarkuus ja blefarospasmi [1], ja sarveiskalvo on yksi silmän vahingoittuneimmista osista, mikä johtaa kystiinikiteiden kertymiseen ja paksuuden lisääntymiseen [20]. Sarveiskalvon lisääntyneen paksuuden syistä tiedetään kuitenkin vähän. Esitettiin esimerkiksi, että kuvattu fenotyyppi johtuu epiteelisolujen ja/tai endoteelisolujen subkliinisestä toimintahäiriöstä, joka johtaa tostomaledeemaan[20]. Tutkimuksessamme havaitsimme, että ctns−/−adultzebrafish-näytön lisääntyminen on sarveiskalvon stroomakerroksen paksuutta, mikä osoittaa, että mallimme osoittaa merkkejä sarveiskalvon toimintahäiriöstäkystinoosi.

Cistanche puolestamunuainentoiminto

Yksi tärkeimmistä aukoista, joka on täytettävä kattavan ymmärtämisen kannaltakystinoosion sellaisen eläinmallin puute, joka toistaa täysin ihmisen taudin. On kehitetty useita hiirimalleja, jotka osoittavat kystiinin kertymistä, mutta jotka eivät pysty toistamaan täydellistämunuaistenfenotyyppi [8,26]. Erityisesti C57BL/6-hiirellä esiintyi kystiinin kertymistä useisiin elimiin, mikä lisääntyy iän myötä [8]. Lisäksi C57BL/6-hiirimallissa on proksimaalisia tubulaarisia leesioita 6 kuukauden iästä alkaen. Samoin mallissamme proksimaaliset tubulaariset leesiot pahenevat ajan myötä. Kuitenkin glomerulaarisella tasolla C57BL/6-hiirimalli esitti normaalin fenotyypin, kun taas aikuisen seeprakalamallimme osoittaa glomerulusten hypertrofiaa. Lisäksi C57BL/6-hiirimalli ei jäljittele ihmisillä havaittua heikentynyttä hedelmällisyyttä, kun taas ctns-/-seebrafish-mallissa on siittiösoluja rikastettuja siittiösoluja ja vähentynyttä munantuotantoa. Silmän tasolla sekä hiiri[38] että seeprakalamalli edustavat silmän poikkeavuuksia. Päinvastoin, ihotasolla tämä hiirimalli ei osoita heikentynyttä melatoniinin tuotantoa [8], mikä näkyy aikuisten seeprakalojen mallissa hypopigmentoituneena ihokuviona. Lopuksi, käyttäytymistasolla ctns−/− seeprakalamallimme osoittaa heikentynyttä liikkumisaktiivisuutta, joka voi johtua mitokondrioiden vajaatoiminnasta tai se voi johtua lisääntyneen painon toissijaisesta vaikutuksesta.kystinoosiseeprakala. Kaiken kaikkiaan näyttää siltä, ​​​​että ctns−/− seeprakalamallimme kuvaa paremmin ihmisen sairauden. Äskettäin Shimizu et ai. loi uuden synnynnäisen Ctnsugl-mutaation rottakannassa, joka esiteltiinmunuaistenleesiot ja kystiinikiteet lysosomeissamunuainenaivokuori [7]. Tarkempi kuvaus mallista puuttuu kuitenkin vielä. Siksi on kiireellisesti kehitettävä ja karakterisoitava uusia toiminnallisia malleja, jotka koottavat yhteen ihmisen sairaudet.

Lopuksi osoitimme, että aikuisten ctns−/− seeprakalamallimme toistaa useita ihmisen fenotyyppejä kystiinihiekkakuopista, jotka voivat olla hyödyllisiä taudin patogeneesin tutkimisessa aikuisilla ja uusien munuais- ja ulkopuolisten lääkkeiden pitkäaikaisvaikutusten testaamisessa.munuaistenilmenemismuotoja.

4. Materiaalit ja menetelmät

4.1. Seepran huolto ja kasvatus

Seeprakalaa käsiteltiin ja huollettiin KU Leuvenin eläinsuojelumääräysten mukaisesti (eettinen hyväksyntä nro 142/2019). Tähän tutkimukseen sisällytimme ctns-/-seepran 18 kuukauden ikäisinä ja villityypin kontrolliseepran molemmissa sukupuolissa. Yksityiskohdat ctns−/−zebrafish:n muodostamisesta kuvattiin aiemmassa tutkimuksessamme [10].

4.2. Kystiinin mittaus

Kystiinitasot mitattiin seeprakalasta (villityypin uroskala,n=3ja ctns−/−uroskala, n=3) ja määrä ilmoitettiin nmol/mg proteiineja. Ensin seeprat uhrattiin upottamalla trikaiinimetaanisulfonaattiin MS-222 (300 mg/L), sen jälkeen kudosnäytteet sonikoitiin 200 µl:n 5 mM N-etyylimaleimidiä (NEM, St. Louis, MO, USA, Sigma-Aldrich E3876) Dulbeccon fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), enintään 200 mg kudosta kutakin lysaattia kohti. Sen jälkeen kuhunkin homogenaattiin lisättiin 100 µl 12-prosenttista sulfosalisyylihappoa (SSA) ja näytteet sentrifugoitiin 12,{15}} g 10 minuuttia, 4 °C. Kystiiniä sisältävät supernatantit säilytettiin -80 °C:ssa analyysiin asti, kun taas pelletit liuotettiin yön yli 4 °C:ssa 300 µl:aan 0,1 M NaOH:ta ja pidettiin -80 °C:ssa, kunnes proteiini mitattiin Pierce BCA Protein Assay Reagent Kit -sarjan avulla. Tämän jälkeen kystiinin määrä (nmol) normalisoitiin proteiinimäärään (mg) kustakin näytteestä. Seuraavaksi 50 µl:aa kystiiniä sisältävää supernatanttia lisättiin 50 µl:lla sisäistä standardiliuosta (Cystine d6) ja vorteksoitiin 5 sekuntia; sitten seos uutettiin 200 ul:lla asetonitriiliä, vorteksoitiin 30 sekuntia ja sitten sentrifugoitiin 16,000 g:llä 9 minuuttia. Nestekromatografia ja massaspektrometrianalyysi suoritettiin UHPLCAgilent1290InfinityII6470-laitteella (Agilent technology, Santa Clara, CA, USA), joka oli varustettu ESI-JET-STREAM-lähteellä, joka toimii positiivisessa ionitilassa (ESI plus). Tämän laitteen ohjaamiseen ja tietojen analysointiin käytetty ohjelmisto oli MassHunter (Work station Agilent Technologies, Barcelona, ​​Espanja). Käytetty erotuskolonni oli InfinityLab Poroshell 120 HILIC 1,9 µm 100 x 2,1 mm (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).

4.3. Hematoksyliini ja eosiini ja jaksollinen happosiirtymävärjäys

Seepra (villityypin naaraskala, n=3; villityypin uroskala, n=3; ctns−/−naaraskala, n=3; ctns−/−uroskala, n=3) uhrattiin upottamalla trikaiinimetaanisulfonaattiin MS-222 (300 mg/l), sen jälkeen koko seepra fiksoitiin 4 % puskuroituun paraformaldehydiin (4 % PFA) 4 ◦C:ssa 1 viikon ajan. . Sen jälkeen, kun seepra oli pesty kahdesti PBS:llä, ne siirrettiin EDTA-liuokseen (100 mM, pH=8) kalkinpoistoa varten vielä 1 viikon ajaksi, minkä jälkeen ne upotettiin parafiiniin. Parafiiniin upotettu seeprakalan kudosleikkaus (paksuus 4-µm) Leicamikrotomissa (LeicaBiosystems, Wetzlar, Saksa). Leikkeet värjättiin H&E:llä ja PAS:lla standardiprotokollien mukaisesti.

Seeprakalojen (villityypin naaraskalat,n=3ja ctns-/-naaraskalat, n=3) histologisia tutkimuksia varten silmät poistettiin nukleoimalla ja kiinnitettiin 4-prosenttiseen PFA:han huoneenlämmössä 4 tunnin ajan. Seuraavat upotukset optimaalisen leikkauslämpötilan väliaineeseen (Tissue-Tek® VIP®; Sakura Finetek, Japani), tehtiin 10-µm:n kryosektiot (Cryostar NX70, Thermofisher Scientific, Tokio, Japani). Leikkeet värjättiin H&E:llä standardiprotokollien mukaisesti. Kuvat tehtiin Leica-kirkaskenttämikroskoopilla (Leica DM6, Wetzlar, Saksa).

4.4. Immunohistokemia (pilkkotun kaspaasi-3 värjäys)

Leikkeistä, joissa oli tuoreleikattua seeprakalakudosta, parafiini poistettiin ja hydratoitiin uudelleen. Leikkeet altistettiin lämmön aiheuttamalle antigeenin hakuun käyttämällä 10 mM sitraattipuskuria (pH=6). Sen jälkeen kun leikkeitä oli blokattu 5 prosentilla normaalilla vuohen seerumilla (NGS) dPBS:ssä, leikkeitä inkuboitiin kanin katkaisua estävällä kaspaasilla-3 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA, 1:200 laimennus) ja sen jälkeen anti-kanin kanssa. -Envision, HRP-leimattu sekundaarinen vasta-aine (Dako Products, Agilent, Santa Clara, CA, USA). Negatiivisena kontrollina käytettiin normaalia kanin seerumia. Kromogeenina käytettiin diaminobentsidiiniä (DAB, DAKO, Glostrup, Tanska). Tämän jälkeen osat vastavärjättiin H&E:llä, kuivattiin ja kiinnitettiin.

Munuaissairauden hoito: Cistanche

4.5. Toluidiinisininen värjäys ja TEM

Seeprakalamunuaistenkudokset (villityypin urosseepra, n=3 ja ctns−/−urosseepra, n=3) kerättiin ja kiinnitettiin EM-kiinnityspuskuriin (1,5 % glutaraldehydiä/1 % paraformaldehydiä) . Myöhemmin munuaiskudokset jälkifiksoitiin 2,5 % glutaraldehydillä/1,2 % akroleiinilla fiksaatiopuskurissa (0,1 mol/l kakodylaatteja, 0,1 mol/l sakkaroosia, pH 7,4) ja 1 % osmiumtetroksidia ja upotettu hartsiin. Puoliohuet osat (paksuus 0.5-µm) värjättiin toluidiinisinisellä. Ultraohuet leikkeet värjättiin uranyyliasetaatilla. Kuvat kerättiin JEM-1200 EX-transmissioelektronimikroskoopilla (JEOL Ltd, Tokio, Japani) eri suurennoksilla.

4.6. Digitaalinen kuva-analyysi

Värjättyt objektilasit digitoitiin käyttämällä Philips Ultra-Fast Scanner 1.6 RA -laitetta (Philips, Eindhoven, Alankomaat)

4.6.1. Glomerulaarisen hypertrofian analyysi

Seeprakalan munuaiskerästen hypertrofian analysoimiseksi mitattiin Bowmanin kapselin pinta-alat (µm2), Bowmanin tila ja glomeruluskimppu PAS-värjätyiltä objektilaseilta. Kaikki saatavilla olevat glomerulukset leikkausta kohti sisällytettiin ja mitattiin ImageJ-ohjelmistolla. Tilastolliseen analyysiin käytettiin kunkin seepran mittausten keskiarvoa.

4.6.2. Cleaved Caspase-3 Expression Analysis

Twoobserversscoredthecleavedcaspase-3expressioninthetubulesofeachzebrafish. The semiquantitative score was conducted on the three randomized tubular fields in each zebrafish(20×magnification). Thepercentageofcaspase-3positivearearelativetothetotal area of tubules was scored as 1 (negative staining), 2 (1–10% positive staining), 3 (10%–25% positive staining), 4 (>25 prosenttia positiivista värjäytymistä). Kunkin seepran pistemäärän keskiarvoa käytettiin tilastolliseen analyysiin.

4.6.3. Sarveiskalvon stroomaanalyysin paksuus

Seepran sarveiskalvon strooman paksuus (10-kertainen suurennus) mitattiin samoilla etäisyyksillä silmän keskipisteestä käyttämällä seepran ImageJ-ohjelmistoa. Jokaiselle kuvalle otettiin n=7 mittausta eri kohdista silmäosassa (keskellä, keskellä, reunalla) pitkin sarveiskalvoa 100 µM:n välein. Mittausten keskiarvoa käytettiin tilastolliseen analyysiin.

4.7. Hedelmällisyystutkimus

Hedelmällisyys arvioitiin pariuttamalla seepranaaras ja -uros (villityypin uroskala, n=4 ja villityypin naaraskala, n=6 ja ctns−/−uroskala, n=4 ja ctns−/−naaraskalat, n=6) kutualustalla. Seuraavana aamuna, tunti valon jälkeen, alkiot kerättiin ja tuotettujen munien kokonaismäärä kirjattiin. Hedelmöityneet munat seulottiin ja laskettiin hedelmättömistä valomikroskopialla. Jalostus suoritettiin n=7 kertaa kerran viikossa peräkkäin. Kaksi koetta, jotka eivät johtaneet munantuotantoon samanaikaisesti sekä villityypin että ctns-/-seeprakaloissa, suljettiin pois.

4.8 Liikkumistoiminta

Seepra (villityypin naaraskala, n=6; villityypin uroskala, n=6; ctns−/−naaraskala, n=6; ctns−/−uroskala, n=6) sijoitettiin tavallisiin asuntoihin ja 5 minuutin sopeutumisajan jälkeen niitä kuvattiin 5 minuutin ajan. Videotallenne tehtiin säiliön päälle sijoitetulla GoPro® HERO 7:llä, mikä tarjosi ylhäältä katsottuna uintia. Resoluutio ja kuvanopeus asetettiin vastaavasti 1080 p (1920×1080) ja 30 fps. Videoita analysoitiin idTrackerilla.airautamalla yksittäisen seepran lentoratoja koko kokeen ajan. Sen jälkeen liikeradat analysoitiin mukautetulla python-koodilla keskimääräisen liikkumisnopeuden (pikseli/s) johtamiseksi kussakin ryhmässä [39].

Cistanche-munuaiset

4.9. Kehon painon ja pituuden mittaukset

Seeprat poistettiin upottamalla 300 mg:aan/Loftricainemethanesulfonaattiin MS-222. Ulkoisiin ärsykkeisiin kohdistuvan vasteen puuttumisen todentamisen jälkeen lopetetut seeprakalat asetettiin paperipyyhkeelle ja kuivattiin. Teurastetun seepran pituus arvioitiin jarrusatulalla, joka mitattiin suun kärjestä kaudaaliseen kantaan. Teurastetun seepran paino arvioitiin analyyttisellä vaa'alla.

4.10. Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä SPSS:ää (IBM, New York, NY, USA) ja GraphpadPrismia (GraphPadSoftware, LaJolla). Kahden ryhmän tiedot analysoitiin parittomalla t-testillä Welchin korjauksella, kaksisuuntainen. Kahden kategorisen riippumattoman muuttujan tiedot analysoitiin kaksisuuntaisella ANOVA:lla Fisherin vähiten merkitsevän eron (PLSD) testillä. Erot, joiden p < 0,05,="" katsottiin="" tilastollisesti="">

4.11. Hedelmällisyystutkimus

Villityypin ja ctns-/-seeprakalan munantuotantomäärien vertailua varten suoritettiin Poisson-regressioanalyysi käyttämällä yleistettyjä estimointiyhtälöitä, joissa oli vankka keskivirhe, jotta nopeuksien korrelaatio kokeiden kanssa voitaisiin ottaa huomioon. Todennäköisyystarjouksen vertailuun käytettiin munia villityypin ja ctns-/-zebrakalan välillä. Suoritettiin alogistinen regressioanalyysi, jossa käytettiin yleistettyjä estimointiyhtälöitä, joissa oli vankat standardivirheet kertoimien korrelaation huomioon ottamiseksi kokeiden sisällä.

Täydentävät materiaalit: Seuraavat ovat saatavilla verkossa osoitteessa https://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms22179398/s1.

Tekijän panokset: Conceptualization, SPB, JH, LvdH, HJB, EL; metodologia, SPB, JH, LDG, HT, TN, PB, SC, BG; ohjelmistot SPB, JH, LDG, HT, TN; validointi, SPB, JH, LDG, PB, LvdH, HJB ja EL; muodollinen analyysi, SPB, JH, LDG, HT, TN; tutkimus, LvdH, HJB, EL; resurssit, HJB ja EL; tietojen kuratointi, SPB, JH, LDG, LvdH, HJB, EL; kirjoitus – alkuperäisen luonnoksen valmistelu SPB, JH; kirjoittaminen – arvostelu ja editointi, LvdH, HJB, EL; visualisointi, LvdH, HJB, EL; valvonta, PdW, LvdH, HJB, EL; hankehallinto, LvdH, HJB, EL; rahoituksen hankinta, HJB, EL Kaikki kirjoittajat ovat lukeneet käsikirjoituksen julkaistun version ja hyväksyneet sen.

Rahoitus: Tekijät haluaisivat tunnustaa sisäisen rahoituksen KULeuvenC1GranttoE.L:ltä. (C14/17/113), Kiinan stipendiaattineuvoston apuraha JH:lle (CSC n◦ 201508500109) ja FWO:n postdoc-apuraha LDG:lle (12I3820N).

Institutional Review Boardin lausunto: Tutkimus suoritettiin Helsingin julistuksen ohjeiden mukaisesti ja KU Leuvenin eettisen toimikunnan hyväksymä n.142/2019. Kiitokset: Haluamme kiittää: Didier Cagniniä aivojen histologian arvioinnista sekä ctns-/-- että villityyppisissä seeprakaloissa, KathleeenLambaerts, FrédéricHendrickx ja KimvanKelst jatkuvasta tuesta ja avusta KU Leuvenin vesilaitoksessa, Peter Neessin tekniselle tuelle. TEM:stä ja Ron Wolterbeek tilastollista analyysiä varten.

Eturistiriidat: Tekijät julistivat eturistiriidan. Rahoittajilla ei ollut merkitystä tutkimuksen suunnittelussa; tietojen keräämisessä, analysoinnissa tai tulkinnassa; käsikirjoituksen kirjoittamisessa tai tulosten julkaisupäätöksessä.

Viitteet

1. Elmonem, MA; Veys, KR; Soliman, NA; van Dyck, M.; van den Heuvel, LP; Levtchenko, E. Kystinoosi: Katsaus. Orphanet J. Rare Dis. 2016, 11, 47. [CrossRef]

2. Jezegou, A.; Llinares, E.; Anne, C.; Kieffer-Jaquinod, S.; O'Regan, S.; Aupetit, J.; Chablis, A.; Sagne, C.; Debacker, C.; ChadefauxVekemans, B.; et ai. Heptahelical proteiini PQLC2 on lysosomaalinen kationisten aminohappojen viejä, joka on kysteamiinin toiminnan taustallakystinoositerapiaa. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2012, 109, E3434–E3443. [CrossRef] [PubMed]

3. Besouw, MT; Levtchenko, EN Nefropaattisen kystinoosin ennusteen parantaminen. Int. J. Nephrol. Renova. Dis. 2014, 7, 297–302. [CrossRef]

4. Brodin-Sartorius, A.; Tete, MJ; Niaudet, P.; Antignac, C.; Vieras, G.; Ottolenghi, C.; Charbit, M.; Moyse, D.; Legendre, C.; Lesavre, P.; et ai. Kysteamiinihoito hidastaa nefropaattisen kystinoosin etenemistä myöhäisillä nuorilla ja aikuisilla. KidneyInt. 2012, 81, 179–189. [CrossRef]

5. Cherqui, S. Kysteamiinihoito: Kystinoosin hoito, ei parannuskeino. Kidney Int. 2012, 81, 127–129. [CrossRef]

6. David, D.; Princero Berlingerio, S.; Elmonem, MA; Oliveira Arcolino, F.; Soliman, N.; van den Heuvel, B.; Gijsbers, R.; Levtchenko,E.Kystinoosin molekyyliperusta: maantieteellinen jakautuminen, CTNS-geenin mutaatioiden toiminnalliset seuraukset ja korjauspotentiaali. Nephron 2019, 141, 133–146. [CrossRef] [PubMed]

7. Shimizu, Y.; Yanobu-Takanashi, R.; Nakano, K.; Hamase, K.; Shimizu, T.; Okamura, T. Ctns-geenin deleetio aiheuttaa munuaistiehyiden toimintahäiriöitä ja kystiinin kertymistä LEA/Tohm-rotissa. Mamm. Genomi 2019, 30, 23–33. [CrossRef]

8. Nevo, N.; Chol, M.; Bailleux, A.; Kalatzis, V.; Morisset, L.; Devuyst, O.; Gubler, MC; Antignac, C. Munuaisten fenotyyppikystinoosihiiren malli riippuu geneettisestä taustasta. Nephrol. Soita. Transplant 2010, 25, 1059–1066. [CrossRef] [PubMed]

9. Elmonem, MA; Berlingerio, SP; van den Heuvel, LP; de Witte, PA; Lowe, M.; Levtchenko, EN GeneticMunuaisetSairaudet: Seepramallien nouseva rooli. Cells 2018, 7, 130. [CrossRef] [PubMed]

10. Elmonem, MA; Khalil, R.; Khodaparast, L.; Khodaparast, L.; Arcolino, FO; Morgan, J.; Pastore, A.; Tylzanowski, P.; Ny, A.; Lowe, M.; etal. Kystinoosi(ctns)seeprafishmutantit osoittavat pronefrista glomerulus- ja tubulustoimintaa. Sci. Rep. 2017, 7, 42583. [CrossRef]

11. Lusco, MA;Najafian,B.;Alpers,CE;Fogo,ABAJKDAmunuaispatologian luettelo:Kystinoosi. Olen. J. KidneyDis. 2017,70,e23–e24. [CrossRef]

12. Park, MA; Pejovic, V.; Kerisit, KG; Junius, S.; Thoene, JG Lisääntynyt apoptoosi kystinoottisissa fibroblasteissa jamunuaistenproksimaaliset tubulusepiteelisolut johtuvat proteiinikinaasi C -deltan kysteinylaatiosta. J. Am. Soc. Nephrol. 2006, 17, 3167–3175. [CrossRef]

13. Veys, KRP; Elmonem, MA; Dhaenens, F.; Van Dyck, M.; Janssen, M.; Cornelissen, EAM; Hohenfellner, K.; Reda, A.; Quatresooz, P.; van den Heuvel, B.; et ai. Tehostettu sisäinen ihon ikääntyminen nefropaattisessa kystinoosissa tarkasteltuna teräväpiirtooptisella koherenssitomografialla. J. Invest. Dermatol. 2019, 139, 2242–2245. [CrossRef]

14. Besouw, MT; Kremer, JA; Janssen, MC; Levtchenko, EN Hedelmällisyystila miespuolisten kystinoosipotilaiden, joita hoidetaan kysteamiinilla. Hedelmällinen. Steriili. 2010, 93, 1880–1883. [CrossRef]

15. Veys, KR; D'Hauwers, KW; van Dongen, A.; Janssen, MC; Besouw, MTP; Goossens, E.; van den Heuvel, LP; Wetzels, A.; Levtchenko, EN Ensimmäinen onnistunut hedelmöitys miespuolisen kystinoosipotilaan aikaansaamana. JIMD Rep. 2018, 38, 1–6. [CrossRef] [PubMed]

16. Rohayem, J.; Haffner, D.; Cremers, JF; Huss, S.; Wistuba, J.; Weitzel, D.; Kliesch, S.; Hohenfellner, K. Kivesten toiminta miehillä, joilla on infantiili nefropaattinen kystinoosi. Hyräillä. Reprod. 2021, 36, 1191–1204. [CrossRef] [PubMed]

17. Blakey, H.; Proudfoot-Jones, J.; Knox, E.; Lipkin, G. Raskaus naisilla, joilla on kystinoosi. Clin. Kidney J. 2019, 12, 855–858. [CrossRef]

18. Dogulu, CF; Tsilou, E.; Rubin, B.; Fitzgibbon, EJ; Kaiser-Kupper, MI; Rennert, OM; Gahl, WA Idiopaattinen kallonsisäinen hypertensio kystinoosissa. J. Pediatr. 2004, 145, 673–678. [CrossRef] [PubMed]

19. Dixon, P.; Christopher, K.; Chauhan, A. Stroomakollageenin mahdollinen rooli kystiinikiteytymisessä kystinoosipotilailla. Int. J. Pharm. 2018, 551, 232–240. [CrossRef]

20. Katz, B.; Melles, RB; Schneider, JA; Rao, NA Sarveiskalvon paksuus nefropaattisessa kystinoosissa. Br. J. Ophthalmol. 1989, 73, 665-668. [CrossRef] [PubMed]

21. Nesterova, G.; Gahl, WA Kystinoosi: Hoidettavan sairauden kehitys. Pediatr. Nephrol. 2013, 28, 51–59. [CrossRef] [PubMed]

22. Ariceta, G.; Giordano, V.; Santos, F. Pitkäaikaisen kysteamiinihoidon vaikutukset potilailla, joilla onkystinoosi. Pediatr. Nephrol. 2019, 34, 571–578. [CrossRef] [PubMed]

23. Gilbert, MJ; Zerulla, TC; Tierney, KB Zebrafish (Danio rerio) mallina ikääntymisen ja liikunnan tutkimukselle: Fyysinen kyky ja harjoittelukyky heikkenevät iän myötä. Exp. Gerontol. 2014, 50, 106–113. [CrossRef] [PubMed]

24. Gerhard, GS; Kauffman, EJ; Wang, X.; Stewart, R.; Moore, JL; Kasales, CJ; Demidenko, E.; Cheng, KC Elinajat ja vanhenevat fenotyypit kahdessa seeprakalakannassa (Danio rerio). Exp. Gerontol. 2002, 37, 1055–1068. [CrossRef]

25. Saftig, P.; Klumperman, J. Lysosomien biogeneesi ja lysosomaaliset kalvoproteiinit: Trafficking meets function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2009, 10, 623–635. [CrossRef]

26. Cherqui, S.; Sevin, C.; Hamard, G.; Kalatzis, V.; Sich, M.; Pequignot, MO; Gogat, K.; Abitbol, ​​M.; Broyer, M.; Gubler, MC; et ai. Intralysosomaalinen kystiinin kertyminen hiirillä, joilta puuttuu kystinoosi, proteiini, joka on puutteellinen kystinoosissa. Mol. Cell. Biol. 2002, 22, 7622–7632. [CrossRef]

27. Raggi, C.; Luciani, A.; Nevo, N.; Antignac, C.; Terryn, S.; Devuyst, O. Erilaistuminen ja endolysosomaalisen osan poikkeamat luonnehtivat nefropaattisen kystinoosin alkuvaihetta. Hyräillä. Mol. Genet. 2014, 23, 2266–2278. [CrossRef]

28. Hard, GC Jotkut auttavat hyaliinipisaroiden nefropatian histologisessa tunnistamisessa 90 päivän toksisuustutkimuksissa. Toxicol. Pathol. 2008, 36, 1014–1017. [CrossRef]

29. Sakarcan, A.; Timmons, C.; Baum, M. Kystiinin solunsisäinen jakautuminen kystiiniladattuissa proksimaalisissa tubuluksissa. Pediatr. Res. 1994, 35, 447-450. [CrossRef]

30. Kroeger, PT, Jr.; Wingert, RA Seeprakalan käyttäminen podosyyttien geneesin tutkimiseen munuaisten kehityksen ja regeneraation aikana. Genesis. 2014, 52, 771–792. [CrossRef]

31. Sumayao, R.; McEvoy, B.; Newsholme, P.; McMorrow, T. Lysosomaalisen kystiinin kertyminen edistää mitokondrioiden depolarisaatiota ja redox-herkkien geenien induktiota ihmisen munuaisten proksimaalisissa tubulussoluissa. J. Physiol. 2016, 594, 3353–3370. [CrossRef]

32. Chiaverini, C.; Sillard, L.; Flori, E.; Ito, S.; Briganti, S.; Wakamatsu, K.; Fontas, E.; Berard, E.; Cailliez, M.; Chat, P.; et ai. Kystinosiini on melanosomaalinen proteiini, joka säätelee melaniinin synteesiä. FASEB J. 2012, 26, 3779–3789. [CrossRef]

33. Adelmann,CH;Traunbauer,AK;Chen,B.;Condon,KJ;Chan,SH;Kunchok,T.;Lewis,CA;Sabatini,DMMFSD12välittää kysteiinin tuontia melanosomeihin ja lysosomeihin. Luonto 2020, 588, 699–704. [CrossRef]

34. Leal, MC; Cardoso, ER; Nobrega, RH; Batlouni, SR; Bogerd, J.; Franca, LR; Schulz, RW Seeprakalan (Danio rerio) spermatogeneesin histologinen ja stereologinen arviointi painottaen siittiöiden sukupolvia. Biol. Reprod. 2009, 81, 177–187. [CrossRef] [PubMed]

35. Sansanwal, P.; Sarwal, MM Epänormaali mitokondrioiden autofagia nefropatiassakystinoosi. Autofagia 2010, 6, 971–973. [CrossRef] [PubMed]

36. Bellomo, F.; Signorile, A.; Tamma, G.; Ranieri, M.; Emma, ​​F.; De Rasmo, D. Epätyypillisen mitokondrioiden syklisen AMP-tason vaikutus nefropaattisessa kystinoosissa. Cell. Mol. Life Sci. 2018, 75, 3411–3422. [CrossRef] [PubMed]

37. De Rasmo, D.; Signorile, A.; De Leo, E.; Polishchuk, EV; Ferretti, A.; Raso, R.; Russo, S.; Polishchuk, R.; Emma, ​​F.; Bellomo, F. Proksimaalisten tubulaaristen epiteelisolujen mitokondriodynamiikka nefropaattisessa kystinoosissa. Int. J. Mol. Sci. 2019, 21,192. [CrossRef]

38. Kalatzis, V.; Serratrice, N.; Hippert, C.; Payet, O.; Arndt, C.; Cazevieille, C.; Maurice, T.; Hamel, C.; Malecaze, F.; Antignac, C.; et ai. Silmän poikkeavuudet kystinoosieläinmallissa jäljittelevät taudin patogeneesiä. Pediatr. Res. 2007, 62, 156–162. [CrossRef]

39. Romero-Ferrero, F.; Bergomi, MG; Hinz, RC; Heras, FJH; de Polavija, GG idtracker.ai: Kaikkien yksilöiden seuranta pienissä tai suurissa merkitsemättömien eläinten ryhmissä. Nat. Methods 2019, 16, 179–182. [CrossRef]