Omega-3-rasvahapot säätelevät SIRT1/3:a, aktivoivat PGC:tä-1 deasetyloinnin kautta ja indusoivat Nrf1-tuotantoa 5/6-nefrektomiarottamallissa

edmund.chen@wecistanche.com

Johdanto

Munuaisetovat mukana useiden toimintojen säätelyssä, mukaan lukien erilaiset aineenvaihduntareitit, vesi- ja elektrolyyttitasapaino, verenpaineen säätely ja useiden hormonien tuotanto. Koska nämä toiminnot kuluttavat valtavasti energiaa,munuaisetovat runsaasti mitokondrioita [1]. Mitokondriot voivat sopeutua erilaisiin aineenvaihdunta-olosuhteisiin säätelemällä rapamysiinin (mTOR) ja AMP-aktivoidun proteiinikinaasin (AMPK) välittämien ravinteiden tunnistamisreittien mekaanisia kohteita ylläpitääkseen tervettä mitokondriopopulaatiota [2]. Mitokondrioiden tutkimusten joukossa on tähän mennessä vain muutamia mitokondrioiden biogeneesiä koskevia tutkimuksia. Useimmat mitokondrioiden biogeneesiin liittyvät tutkimukset perustuvat ei-munuaistenkudos [3,4] ja tutkimuksetmunuaisetliittyvät pääasiassa akuuttiinmunuaisvaurio(AKI) eläinmallit, proksimaaliset tubulussolut ja diabeettinen nefropatia [5–7]. Vaikka mitokondrioiden biogeneesi voi liittyä mitokondrioiden toimintahäiriön patogeneesiin ei-diabeettisessa kroonisessamunuaissairaus (CKD), myös tätä aihetta koskeva tutkimus on hyvin rajallista. CKD ja mitokondrioiden biogeneesi liittyvät sydän- ja verisuonisairauksiin [8,9]. Mitokondrioiden biogeneesin parantaminen voi olla hyödyllistä sydänsuojalle CKD:ssä. Tutkimus, joka osoitti, että omega-3-rasvahapot (FA:t) helpottavat mitokondrioiden biogeneesiä, suoritettiin käyttämällä ei-munuainenkudokset [3,10]. Äskettäinen tutkimus osoitti omega-3 FA:iden lupaavan roolin mitokondrioiden biogeneesissä eläinmalleissa, joilla on sydän- ja verisuonisairauksia ja hermostoa rappeuttavia sairauksia [11]. Siksi tässä tutkimuksessa pyrimme tutkimaan mitokondrioiden biogeneesiämunuaiset5/6 nefrektomia (Nx) rotista. Lisäksi arvioimme omega-3 FA:iden vaikutusta mitokondrioiden biogeneesiin käyttämällä tätä mallia.

Avainsanat:ydinhengitystekijä 1; ydintekijä erytroidi 2- liittyvä tekijä 2; sirtuiini 1; sirtuiini 3; omega-3-rasvahappo; munuainen, munuainen

CISTANCHE PARANTAA MUNUAIS-/munuaissairauksia

2. Tulokset

2.1. Muutokset munuaisten toiminnassa ja histologisissa löydöksissä

Verrokkiryhmään verrattuna veren ureatypen (BUN) taso omega{{0}} FA:lla hoidetuissa Nx- ja Nx-ryhmissä nousi merkittävästi (kontrolliryhmä 17,7 ±1,5, Nx-ryhmä 77,7 土 28,4 ja tiainen omega-3 FA-ryhmällä 63,9 土 17.0 mg/dl, p = 0.{{20}}07). Vaikka omega-3 FA-ryhmien Nx:n ja Nx:n välillä ei ollut merkittävää eroa, BUN-tasot olivat numeerisesti alhaisemmat omega-3 FA:lla hoidettujen Nx-ryhmässä. Seerumin kreatiniini (sCr) taso näissä kolmessa ryhmässä oli samanlainen kuin BUN:lla (kontrolliryhmä, 0.4 th 0.U; Nx ryhmä, 1.3 土 0.6; omega-3 FA, 1.0 ± ± 0,3 mg/dl; y=0.008). Verrattuna kontrolliryhmään, vakavaa tubulusten laajentumista ja surkastumista havaittiin käyttämällä PAS-värjäystä Nx-ryhmässä (lisäkuva S1). Lisäksi tulokset osoittivat, että omega-3 FA:lla käsitellyt Nx-ryhmät osoittivat vähemmän tubulointerstitiaalisia muutoksia kuin Nx-ryhmä. Themunuaisten toimintaja histologisia muutoksia näissä kolmessa ryhmässä on raportoitu jo aiemmassa tutkimuksessa [12].

22 Muutokset mitokondrioiden biogeneesiin liittyvissä tekijöissä

2.2.1. Nrf1 ja Nrf2 lauseke.Verrokkiryhmään verrattuna Nx-ryhmä osoitti merkittävästi alentunutta tuman hengitystekijän 1:n (Nefl) ja ydintekijän erytroidiin 2- liittyvän tekijän 2 (Nrf2) ekspressiotasoa. Kuitenkin omega-3 FA:lla hoidetussa Nx-ryhmässä Nrf1:n ja Nrf2:n ilmentymistaso kasvoi merkittävästi Nx-ryhmään verrattuna, mutta ei saavuttanut kontrolliryhmän tasoa (Oigure P, täydentävä kuva St) . Nämä tulokset löydettiin myös cn Nrf1 mRNA:n kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR-analyysillä (lisäkuva S3).

2.2.3. PGC:hen liittyvien tekijöiden ilmaiseminen-1 Aktiviteetti: pAMPK, SIRT1/3.Verrattuna kontrolliryhmään Nx- ja Nx-ryhmillä, joita käsiteltiin omega-3-ryhmillä, fosforyloituneen AMPK:n tasot (kurpitsan ja AMPK:n välinen suhde) olivat huomattavasti alhaisemmat (kuva 3A). Lisäksi Nx-ryhmä osoitti merkittävästi alhaisempaa sirtuiini 1:n (SIRT1) ekspressiota verrattuna kontrolliryhmään (kuva 3B, täydentävä kuva S6). Omega-3 FA:n lisäämisen jälkeen SIRT1:n ilmentyminen kuitenkin lisääntyi suhteellisen paljon, mutta tämä ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Nämä tulokset löydettiin SIRT1 mRNA:n kvantitatiivisessa reaaliaikaisessa PCR-analyysissä (lisäkuva S7). Sitä vastoin sirtuiini 3:n (SIRT3) ilmentyminen väheni merkittävästi Nx-ryhmässä verrattuna kontrolliryhmään, joka pelastui merkittävästi omega-3 FA:lla hoidetussa Nx-ryhmässä (kuva 3C).

2.2.4. Keap1-, mTOR-, FoxO1- ja FoxO3-ekspressio, Verrokkiryhmään verrattuna Kelchin kaltaisten EC H:hen liittyvien proteiinien 1 (Keap1) ja Forkhead box -proteiinien O1 ja O3 (FoxO1/3) ilmentyminen lisääntyi merkittävästi Nx-ryhmässä . Omega-3 FA:lla hoidetussa Nx-ryhmässä Keap1:n ja FoxO1/3:n ilmentymistaso oli merkittävästi alentunut Nx-ryhmään verrattuna (kuva 4C, E, F). Verrattuna kontrolliryhmään mTOR:n ilmentyminen väheni merkittävästi Nx-ryhmässä. Omega-3 FA:lla hoidetussa Nx-ryhmässä mTOR-ilmentyminen kuitenkin pelastui, mutta se ei saavuttanut kontrolliryhmän tasoa (kuva 4B).

2.2.5. Mitokondriaalisen DNA:n (mtDNA) pitoisuus Nx-ryhmässä havaittiin merkittävä mtDNA:n väheneminen kontrolliryhmään verrattuna. MtDNA:n vähentynyt määrä kuitenkin palautui merkittävästi Nx-käsitellyssä omega-3 Nx -ryhmässä (lisäkuva S9).

3. Keskustelu

PGC-1, joka aktivoituu fosforylaation ja deasetyloinnin kautta, on mitokondrioiden biogeneesin ja energiantuotannon pääsäätelijä. Löysimme PGC-1:n ilmentymisen ja deasetyloinnin vähentymisen CKD-mallissa. On huomionarvoista, että vähentynyt PGC-1-deasetylaatio on tärkein mekanismi, joka edistää dysfunktionaalista mitokondrioiden biogeneesiä ja vähentynyttä energiantuotantoa kroonisessa munuaissairossa. AMPK aktivoi PGC-1:n fosforyloimalla sen treoniini- tai seriinitähteet [13,14]. AMPK aktivoituu myös fosforylaatiossa, kun AMP/ATP-suhde on korkea. AMPK:n tiedetään kuitenkin inaktivoituvan CKD:ssä, koska korkeiden AMP-tasojen havaitseminen on heikentynyt [15,16]. Samoin kuin aikaisemmat tutkimukset, osoitimme, että AMPK:n fosforylaatio väheni merkittävästimunuainenNx-ryhmän kudos. Vaikka pPGC-1/PGC-1 näyttää lisääntyneen jossain määrin Nx-ryhmässä, on epätodennäköistä, että PGC-1-fosforylaatiotaso kasvaa vähentyneen PGC{{3}-arvon vuoksi. }} ilmaisu. Lisäksi omega-3 FA-ryhmällä hoidetut Nx:t osoittivat samanlaisia ​​tuloksia kuin Nx-ryhmä, mikä osoittaa, että omega-3 FA:n antaminen ei vaikuttanut AMPK:n ja PGC:n{{6} fosforylaatioon. } . Deasetylaatio voi tapahtua koko PGC-1 -sekvenssissä, ja SIRT1:llä ja 3:lla on tärkeä rooli deasetylaatioprosessissa [13,14]. Omega-3 FA:n antamisen jälkeen PGC-1:n, SIRT1:n ja 3:n ilmentymistaso nousi, mikä johti deasetyloidun PGC-1:n pelastumiseen samalle tasolle kuin normaalilla kontrolliryhmällä. . Pelastus Nrf1:n ja Nrf2:n ilmentymistasoissa, joka on osoitettu omega-3 FA-ryhmässä hoidetussa Nx:ssä, liittyy suoraan SIRT1- ja 3-ekspressiotason nousuun, mikä johti edelleen PGC{:n deasetylaatioon. {22}} .

CISTANCHE PARANTAA MUUNAISTEN/MUUNAISTEN TOIMINTAA

Tuoreet tutkimukset mitokondrioista vuonnamunuaissairausovat osoittaneet, että PGC{0}}- tai SIRT-ilmentymistason nousu geneettisten tai farmakologisten toimenpiteiden avulla paranimunuaisvaurioAKI-eläinmalleissa [5–7,17,18]. Taustalla oleva mekanismi sisältää FA:n hapettumisen paranemisen tai antioksidanttivasteen. Aiemmassa tutkimuksessa kerrottiin, että omega-3 FA:n antaminen paransi mitokondrioiden FA-beetahapetusta ja osoitti antioksidanttisia vaikutuksia 5/6 Nx-rottamallissa [19]. On myös raportteja, jotka viittaavat siihen, että omega-3 FA lisää PGC-1:n, Nrf1:n ja SIRT1:n ilmentymistä lihassoluissa, makrofageissa ja hermosoluissa [3,10,11]. Koska omega-3 FA:iden vaikutuksia mitokondrioihin CKD-mallissa ei ole vielä raportoitu, osoitimme, että omega-3 FA on tehokas mitokondrioiden biogeneesiin liittyvien molekyylien ja mtDNA:n talteenotossa käyttämällä CKD-mallia tässä mallissa. opiskella.

Sekä mTOR että AMPK osallistuvat mitokondrioiden biogeneesiin, mutta niiden roolit vaihtelevat ravitsemustilan mukaan. mTOR, rapamysiinikompleksin 1 (mTOC1) kohde, voidaan aktivoida energiaärsykkeiden, kuten aminohapon tai glukoosin, avulla ja se voi laukaista reittejä, jotka johtavat anabolisiin prosesseihin ja mitokondrioiden biogeneesiin. Toisaalta AMPK voi aktivoitua hypoksian ja ravitsemusvajeen kautta, mikä johtaa katabolisen prosessin ja mitokondrioiden biogeneesin aktivoitumiseen ja estää energiankulutusta mTOC1:n kautta [2]. Tässä tutkimuksessa emme vain osoittaneet pAMPK/AMPK:n laskua, vaan myös mTOR:n laskua CKD-mallissa. Lisäksi omega-3 FA:n antaminen johti mTOR:n ilmentymisen lähes palautumiseen, mutta pAMPK/AMPK:n laskuun ei palautumista. Siksi omega{5}}-FA:t saattavat lievittää vähentynyttä mitokondrioiden biogeneesiä lisäämällä mTOR-ilmentymistämunuaisetCKD-eläinmallista. Lisätutkimuksia tarvitaan kuitenkin sen selvittämiseksi, onko mTOR alentunut CKD-potilailla ja kuinka mTOR-ilmentymisen lisääntyminen omega-3 FA-hoidon avulla vaikuttaa mitokondrioiden terveyteen ja CKD:n etenemiseen.

FoxO1 ja 3 sitoutuvat PGC-1-promoottoriin ja tehostavat sen transkriptiota [20,21]. Tässä tutkimuksessa FoxO1:n ja 3:n havaittiin kuitenkin lisääntyneen Nx-ryhmässä ja vähentyneen omega-3 FA:lla hoidetuissa kontrolli- ja Nx-ryhmissä. Siksi oletetaan, että FoxO1:n ja 3:n ilmentyminen on relevanttia kompensaatiovasteen kannalta, joka vähentää PGC-1-arvoa CKD:ssä tai lisää PGC-1-arvoa omega-3 FA:n antamisen kautta. Nrf2:lla on tärkeä rooli solujen redox-homeostaasissa ja mitokondrioiden biogeneesissä. On olemassa kolme ubikvitiiniligaasijärjestelmää, jotka liittyvät Nrf2:n hajoamiseen (Keap1, -transdusiinitoistoja sisältävä proteiini ja E3-ubikvitiiniligaasi synovial) [22]. Tässä tutkimuksessa osoitimme merkittävän laskun Nrf2:ssa ja merkittävän nousun Keap1:ssä Nx-ryhmässä verrattuna kontrolliryhmään.d Kuitenkin omega-3 FA:lla hoidetussa Nx-ryhmässä Keap1:n ilmentymistä havaittiin vähennetään ja Nrf2:ta nostettiin. Tulokset viittaavat siihen, että omega-3 FA:n antamisen parantunut antioksidanttivaikutus CKD-rottamallissa saattaa liittyä Keap1:n ilmentymisen ja Nrf2:n hajoamisen vähenemiseen, mikä saattaa tehostaa mitokondrioiden biogeneesiä. Tässä tutkimuksessa saatujen tulosten perusteella tarvitaan lisätutkimuksia FoxO1/3:n ja Nrf2:n välisen syy-yhteyden selvittämiseksi CKD-ympäristössä sekä omega-3 FA:n antamisen vaikutuksen selvittämiseksi.

CISTANCHE PARANTAA MUNUAIS-/MUUNAISTUNNUSTA

Nrf2:n molekyylipainoksi havaittiin 68 kilodaltonia (kDa) tässä tutkimuksessa ja muissa viimeaikaisissa tutkimuksissa [23,24]. Aiemmat tutkimukset osoittivat kuitenkin, että Nrf2:n biologisesti merkityksellinen molekyylipaino on 95–110 kDa ja todisteita [25,26]. Löysimme myös vyöhykkeitä, joiden epäiltiin olevan biologisesti merkityksellisiä Nrf2 (lisäkuva S8). Lisätutkimukset ovat tarpeen biologisesti tärkeän Nrf2:n molekyylipainon löytämiseksi. Aiemmissa tutkimuksissa mitokondrioissa on raportoitu muutoksia 28. päivänä 5/6 Nx:n jälkeen, mikä osoitti beetahapettumiseen, oksidatiiviseen fosforylaatioon ja sisäkalvon rakenneproteiiniin liittyvän geenin tai proteiinin ilmentymisen vähenemistä, mutta tulosta ei saatu. liittyvät PGC-1-lausekkeeseen [27,28]. Tässä tutkimuksessa vahvistimme, että mitokondrioiden biogeneesiin liittyvät molekyylit ja mitokondrioiden biogeneesiä heijastava mtDNA moduloituivat kroonisen vaiheen aikana, koska muutokset havaittiin 45. päivänä rotilla 5/6 Nx:n jälkeen. Histologisista ja biologisista parannuksista huolimatta omega-3 FA-hoito ei johtanut funktionaaliseen palautumiseenmunuaisetverrattuna Nx-malliin. Siksi tarvitaan lisätutkimuksia sen määrittämiseksi, ovatko omega-3 FA:t tehokkaita palauttamisessamunuaisten toimintaaiheuttamalla vaikutuksia, jotka saattavat parantaa mitokondrioiden toimintaa. Tässä tutkimuksessa on useita rajoituksia. Ensinnäkin emme arvioineet sitraattisyntaasin aktiivisuutta ja superoksidin muodostumista mitokondrioiden hengitysketjussa. Toiseksi, emme kokeilleet, mitkä Omacorin FA-komponentit vaikuttavat pääasiassa mitokondrioiden biogeneesiin liittyviin molekyyleihin. Kolmanneksi emme osoittaneet selkeää mekanismia mitokondrioiden biogeneesiin liittyvien molekyylien parantamiseksi. Ehdotamme vain, että anti-inflammatorinen vaikutus, joka vähentää oksidatiivista stressiä ja itse omega-3-rasvahappoa metabolisina yhdisteinä, saattaa liittyä mekanismiin.

4. Materiaalit ja menetelmät Mitokondrioiden biogeneesi

4.1. Eläimet ja kokeellinen suunnitteluTutkimukset suoritettiin Sprague-Dawley-urosrotilla (9-viikon ikäisiä), jotka ostettiin Japan SLC, Inc:ltä (Shizuoka, Japani). Kaikki rotat altistettiin joko valekontrollille tai 5/6 Nx:lle. Kaikki eläimiä koskevat toimenpiteet suoritettiin Dong-A Universityn Institutional Animal Care Committeen (DIACUC-14-4) hyväksynnän mukaisesti. Rottia pidettiin normaaleissa olosuhteissa ja niille annettiin vapaa pääsy vesijohtoveteen ja standardiruokavalioon. Kaikki rotat jaettiin seuraaviin ryhmiin: ryhmä 1 (valekontrolli, n=6), kontrollirotat, joita pidettiin suolaliuoksella (1 ml/kg/vrk mahahuuhtelulla); ryhmä 2 (Nx ryhmä, n=6), Nx rotta pidettiin suolaliuoksella (1 ml/kg/vrk mahahuuhtelulla); ryhmä 3 (omega-3 FA-ryhmä), Nx rotta, joita hoidettiin omega-3 FA:illa. Omega-3 FA:iden (Omacor, 300 mg/kg/vrk mahaletkulla, Pronova Biocare, Sandefjord, Norja) annos ja antoreitti määritettiin aiempien tutkimusten perusteella [19]. Omacor on merestä peräisin oleva omega-3 FA, ja se koostuu 460 mg:sta eikosapentaeenihaposta (EPA) ja 380 mg:sta dokosaheksaeenihappoa (DHA) 1 g:ssa Omacoria. Omacoria määrätään yleensä sekundaariseen ehkäisyyn sydäninfarktin ja hypertriglyseridemian hoidon jälkeen [29]. Kaksi omega-3 FA:ta (EPA ja DHA) ovat Omacorin pääasiallisia (84 prosenttia) ja aktiivisia komponentteja, jotka on valmistettu farmaseuttisesti.

koostumukset, jotka ylittävät pienet komponentit (16 prosenttia). Valitsimme Omacorin omega-3 FA-lisäaineeksi, joka sisältää tulehdusta ja vähentää oksidatiivista stressiä, koska se vähensi sydän- ja verisuonitautien riskiä kliinisissä tutkimuksissa [30]. Rottia ruokittiin tasaisesti ja niiden painoa tarkkailtiin päivittäin. Rotille annettiin vapaa pääsy vesijohtoveteen 15 viikon ajan leikkauksen jälkeen, ja sitten ne lopetettiin dietyylieetteripuudutuksessa. Kuolleessa aortan verinäyte kerättiin ja sentrifugoitiin sitten 3000 rpm:llä 10 minuuttia. Tunnistaaksesi muutoksetmunuaisten toiminta, BUN- ja sCr-tasot mitattiin käyttämällä automaattista analysaattoria (Roche, Saksa).

4.2. Histopatologinen tutkimus.Formaliinikiinnitettymunuainenkudokset upotettiin parafiiniin, leikattiin viipaleiksi (4 um) ja värjättiin periodihappo-Schiffillä. Histopatologisia muutoksia havaittiin Aperio ScanScopella (Aperio Technologies, Vista, CA, USA).

4.3. RNA:n eristäminen ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi.Kokonais-RNA uutettiinmunuainenkudoksia käyttäen TRIzol-reagenssia. Sitten 1 ug kokonais-RNA:ta muutettiin yksijuosteiseksi cDNA:ksi käyttämällä M-MLV cDNA -synteesipakkausta (Enzynomics, Daejeon, Korea). Alukkeet suunniteltiin vastaavista geenisekvensseistä käyttäen Primer3- ja mfold-ohjelmistoa. Kvantitatiivista reaaliaikaista PCR-analyysiä varten cDNA:lle tehtiin PCR-monistus käyttämällä geenispesifisiä alukkeita: rotan PGC1 50- CCG AGA ATT CAT GGA GCA AT-30(sense), 50- GTG TGA GGA GGG TCA TCG TT-30(antisense); rotta Nrf1 50- GTT TCA TGG ACC CAA GCA TT-30(aisti), 50- GGT GGC CTG AGT TTG TGT CT-30(antisense); rotan SIRT3, 50- GAG ACT TGG TGG GGT CCT TT -30(sense), 50- ATC CTG CAG CTC TTG TGT CC -30(antisense); rotan SIRT1, 50- CAG GTT GCA GGA ATC CAA AG -30(sense), 50- CTC CAC GAA CAG CTT CAC AA -30(antisense); rotan -aktiini, 50- GCG CAA GTA CTC TGT GTG GA -30(aisti), 50- KISSA CGT ACT CCT GCT TGC TG -30 (antisense). Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttämällä SYBR Green PCR Master Mixiä (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ABI 7500 -instrumentilla (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA).

CISTANCHE PARANTAA MUNUAINEN/MUUNAISKIPUA

4.4. Western Blotting ja Immunoprecipitation.Western blot -analyysi analysoitiin aiemmin kuvatulla tavalla pienin muutoksin [10].Munuainenkudokset homogenisoitiin lyysipuskurilla (PRO-PREP-proteiinin uuttoliuos), inkuboitiin (30 min 4 ◦C:ssa) ja sentrifugoitiin (14,000 rpm 20 min 4 ◦C:ssa). Proteiinikonsentraatio määritettiin Bradfordin proteiinimääritysreagenssilla (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Sama proteiininäyte ladattiin 7,5–15-prosenttiselle SDS-PAGE:lle ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). Sitten proteiinit immunoblotattiin kullakin vasta-aineella. PGC-1- ja SIRT1-vasta-aineet hankittiin Santa Cruz Biotechnologylta (Santa Cruz, CA, USA). Vasta-aineet AMPK:ta, pAMPK:ta, Nrf1:tä, SIRT3:a, Fox01:tä, FoxO3a:ta ja mTOR:ta vastaan ​​ostettiin Cell Signaling Technologylta (Danvers, MA, USA). Vasta-aineet Nrf2:ta, Keapl:tä (monomeeri) ja -aktiinia vastaan ​​ostettiin Abcamilta (Cambridge, MA, USA) ja Sigmalta (St. Louis, MO, USA). Immunosaostusta varten yhteensä 500 µg proteiinia inkuboitiin PGC-1-vasta-aineiden (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) ja proteiini A/G plus agaroosihelmien (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) ja annettiin sekoittua 4 ◦C:ssa yön yli. Immunosakka erotettiin sitten käyttämällä SDS-PAG-elektroforeesia ja immunoblotattiin käyttämällä asetyylilysiini- (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) ja fosfoseriini- (MerckMillipore, Burlington, MA, USA) vasta-aineita. Tämän jälkeen kalvoja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasilla konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 60 minuuttia huoneenlämpötilassa. Proteiinitasot standardoitiin -aktiinilla (ImageJ-versio 1.48q). Western blot - ja immunosaostusanalyysi vasta-aineilla suoritettiin käyttämällä Super Signal West Pico -tehostettua kemiluminesenssisubstraattia (Thermo Scientific, Hudson, NH, USA) ja havaittiin käyttämällä LAS-3000 Plus:a (Fuji Photo Film, Tokio, Japani).

4.5 mtDNA-sisällön mittausqPCR:ää käytettiin mtDNA:n suhteellisen sisällön määrittämiseen. Reaktio suoritettiin SYBR Green -kemian avulla käyttäen templaattina 3 ng kokonais-DNA:ta ja seuraavia alukkeita: rotan mtDNA 5'-GGTTCTTACTTCAGGGCCATCA-3' (sense), 5,-TGATTAGACCCGTTACCA TCGA-3' ( antisense); rotan p-aktiini, 5'-CCCAGCCATGTACGTAGCCA (sense), C-CGTCTC-CGGAGTCCATCAC f (antisense). MtDNA-pitoisuus suhteessa tuman DNA:han raportoitiin julkaisussa [31].

4.6 Tilastollinen analyysiTilastolliset analyysit suoritettiin SPSS 18.{1}} -ohjelmistolla (IBM Corp., Armonk, NYP USA). Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona 土 SD. Ryhmien keskiarvoja verrattiin varianssianalyysillä, jota seurasi Tukeyn moninkertainen vertailu. p e 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitseväksi.

5. Johtopäätökset

Lopuksi, merkittäviä modulaatioita mitokondrioiden biogeneesiin liittyvien välittäjien ilmentymisessä havaittiin CKD-rottamallissa. Omega-3 FA voi parantaa mitokondrioiden biogeneesiä säätelemällä Nrf1:tä ja Nrf2:ta. Tämä suojamekanismi voi käynnistyä lisääntyneellä PGC-1-ilmentymisellä ja PGC-1:n deasetylaatiolla, jonka laukaisi lisääntynyt SIRT1/3-tuotanto (kuva 5). Kuva 5. Omega-3 FA:n vaikutus mitokondrioiden biogeneesiin CKD:ssä. Lihavoidut mustat nuolet osoittavat mitokondrioiden biogeneesiin liittyvien välittäjien ilmentymisen CKD-rottamallissa. Punaiset nuolet osoittavat välittäjien ilmentymisen omega-3 FA:n antamisen jälkeen. Ylös/alas osoittavat nuolet osoittavat välittäjien ilmentymisen lisääntymistä ja laskua.