Cistanche Tubulosa -uutteen aineenvaihdunta in vitro ja in vivo normaaleissa ja kroonisissa, arvaamattomissa stressin aiheuttamissa masennusrotissa

Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com

Yang Li, et ai

ABSTRAKTI

Cistanche tubulosa, yksi Cistanches Herba -lajeista, vahvistettiin äskettäin omaavan masennuslääketehoa kroonisen ennakoimattoman stressin (CUS) rotilla palauttamalla suoliston mikrobiotan homeostaasin. Tässä artikkelissa pyrimme tutkimaan C. tubulosan metabolista profiilia normaaleissa ja CUS-indusoiduissa masennusmallirotissa in vitro ja in vivo. Käyttämällä UPLC-Q-TOF-MS:ää in vitro ruoansulatuskanavan metaboliaCistanche tubulosa -uute(CTE) arvioitiin sekä normaaleille että CUS-rotille. Samaan aikaan CTE:n metabolia in vivo(Cistanche tubulosa -uute)normaaleissa ja masentuneissa rotissa tutkittiin myös rotan virtsasta ja ulosteista. Yhteensä 20 ja 26 metaboliittia karakterisoitiin in vitro ja in vivometaboliasta normaaleissa ja CUS-rotissa, vastaavasti. CTE(Cistanche tubulosa -uute)metaboloitui aglykoneiksi ja fenyylietanoidiglykosidien (PhG:t) ja iridoidiglykosidien hajoamistuotteiksi joko normaalin tai masentuneen rotan suoliston mikrobiotan vaikutuksesta in vitro. Aglykonien ja PhG:iden hajoamistuotteiden ja iridoidiglykosidien faasi II metaboliitit olivat päämetaboliitteja rotan virtsassa ja ulosteessa. Lisäksi aineenvaihduntakyky tuottaa sekundäärisiä glykosideja ja aglykoneja masentuneessa rotan suoliston mikrobiotassa oli paljon heikompi kuin normaalissa rotan suoliston mikrobiotassa, mikä johtui suoliston mikrobiotan tuottamasta häiriintyneistä glykosidihydrolaaseista CUS-depressiivisissä rotissa. Tämän tutkimuksen tulokset loivat pohjan CTE:n masennuslääkkeen aineenvaihduntaprosessin ja terapeuttisen mekanismin ymmärtämiselle.

Avainsanat: Cistanche tubulosa, MasennusMetabolismi, In vitro, In vivo, Suoliston mikrobiota

1. Esittely

Cistanches Herba on virallisesti kirjattu Cistanche deserticolan (YC Ma) ja C. tubulosan (Schrenk) kuivatuiksi meheviksi varreksi, joita käytetään munuaisten vajaatoiminnan, impotenssin, naisten hedelmättömyyden, sairastuneen leukorrean, runsaan metrorragian ja seniilin ummetuksen hoitoon [1]. Nykyaikaiset farmakologiset tutkimukset ovat osoittaneet, että Cistanches Herballa on erilaisia ​​biologisia vaikutuksia, kuten neurodegeneraatiota, immunosäätelyä ja tulehdusta ehkäisevää vaikutusta [2,3]. Aiemmat tutkimuksemme ovat vahvistaneet senCistanche tubulosa -uute(CTE), jotka koostuvat 48,6 prosentista fenyylietanoidiglykosideista (PhG:t), 6,9 prosentista iridoidiglykosideista ja 2 0,0 prosentista sakkarideja kokonaisuutena, voisivat merkittävästi lievittää kroonisen ennakoimattoman stressin (CUS) aiheuttamien masennusrottien masennusoireita. suoliston mikrobiotan homeostaasin palauttaminen [4]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että muutokset suoliston mikrobiston koostumuksessa liittyivät masennuksen kehittymiseen ja etenemiseen [5,6]. Mikrobisukujen suhteellinen runsaus oli selvästi häiriintynyt CUS-depressiivisillä mallirotilla verrattuna normaaleihin kontrolleihin [7]. Masennuspotilailla myös suoliston mikrobiston monimuotoisuus ja rikkaus muuttui merkittävästi [8]. Lisäksi erilaisia ​​yhdisteitä, mukaan lukien fenyylietanoidiglykosideja (PhG) ja iridoidiglykosideja, pidettiin Cistanches Herban [2,3] pääaineosina, jotka metaboloituivat helposti sekundäärisiksi glykosideiksi ja aglykoneiksi, mukaan lukien hydroksityrosoli (HT), 3,4-dihydroksifenetyyli. glykosidi, deglykosyloitu geniposidiinihappo jne. ihmisen suoliston mikrobiotassa. Nämä metaboliitit imeytyvät helpommin suolen läpi ja ne vaikuttavat prototyyppikomponentin mukaisesti[9–11]. Näin ollen uskomme, että masennuksen ilmaantumisen ja kehittymisen aikana suoliston mikroflooran rakenteen häiriö vaikuttaa väistämättä suun kautta otettavien perinteisten kiinalaisten lääkkeiden (TCM) aineenvaihduntaan maha-suolikanavassa sen lisäksi, että se vaikuttaa isännän fysiologiseen tilaan. Suurin osa Cistanches Herban olemassa olevista aineenvaihduntatiedoista on peräisin terveillä eläimillä tehdyistä aineenvaihduntatutkimuksista[12–15]. Siksi CTE:n metabolisen profiilin tutkiminen olisi kliinisesti tärkeämpää(Cistanche tubulosa -uute)patologisessa tilassa sen bioaktiivisten komponenttien selvittämisessä ja sen masennusta ehkäisevän tehon vaikutusmekanismin ymmärtämisessä.

Tässä tutkimuksessa pyrimme karakterisoimaan CTE:n metabolisia profiileja(Cistanche tubulosa -uute)sekä terveillä että CUS-indusoiduilla masennusmallirotilla ultra-suorituskykyisellä nestekromatografialla kvadrupolin lentoaikamassaspektrometrialla (UPLC-Q-TOF-MS). Normaalien ja masennusta aiheuttavien patologisten rottien mahanestettä, suolennestettä ja mikrobiota on käytetty simuloimaan CTE:n aineenvaihduntaa(Cistanche tubulosa -uute)ruoansulatuskanavassa in vitro, itsenäisesti ja peräkkäin. In vivo -metaboliitit selvitetään myös CTE:n oraalisen annon jälkeen(Cistanche tubulosa -uute)normaaleissa ja CUS-rotissa. Tämä tutkimus tarjoaa uusia näkemyksiä CTE:n aineenvaihdunnasta ja aktiivisista metaboliiteista(Cistanche tubulosa -uute)masennukseen.

2. Materiaali ja menetelmät

2.1. Materiaali

Kuivatut C. tubulosan varret kerättiin Hetian Countysta (Xinjiang, Kiina). Professori Xiaobo Li varmentaa lahjakorttinäytenäytteet, ja ne talletettiin Shanghai Jiao Tong -yliopiston (Shanghai, Kiina) Farmasian koulun herbaarioon. Uuttomenetelmää käytettiin edellisessä julkaisussamme [4] määritellyllä tavalla. TheCistanche tubulosa -uute(CTE) näytteet säilytettiin 4 asteessa ja liuotettiin uudelleen steriiliin veteen ennen käyttöä. CTE:n steriilit vesiliuokset(Cistanche tubulosa -uute)näytteet suodatettiin sitten 0,22 μm:n kalvon läpi ja suodokset kerättiin steriileihin putkiin.

Ekinakosidin toimitti tohtori Pengfei Tu:n laboratorio, PekingUniversity (Peking, Kiina). Akteosidi, isoakteosidi, 2'-asetyylilakteosidi ja cistanosidi A ostettiin Sichuan Weikeqi BiologicalTechnology Co., Ltd.:ltä (Chengdu, Kiina). Hydroksityrosoli, kahvihappo, 3,4-dihydroksibentseenipropionihappo, 3-hydroksifenyylipropionihappo ja 3-fenyylipropionihappo ostettiin Aladdin IndustrialInc:ltä. (Shanghai, Kiina). Kunkin komponentin puhtaudeksi määritettiin HPLC-UV:lla > 95 prosenttia. HPLC-laatuinen asetonitriili ostettiin Merckiltä (Darmstadt, Saksa). Deionisoitu vesi valmistettiin tislatusta vedestä käyttämällä Milli-Q-vedenpuhdistusjärjestelmää (Millipore, Bedford, MA, USA). Kaikki muut käytetyt reagenssit ja kemikaalit olivat analyyttistä laatua.

2.2. Eläinkokeet

Urospuoliset Sprague-Dawley-rotat (200 ± 20 g) hankittiin Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Companysta (Peking, Kiina) ja sijoitettiin Shanghai JiaoTong -yliopiston (Shanghai, Kiina) Laboratory Animal Centeriin. Eläimet pidettiin ryhmähuoneissa kontrolloidussa huoneenlämpötilassa (25 ± 2 astetta, 55 ± 10 % suhteellinen kosteus) 12:12 tunnin valo-pimeä-syklillä. Rotille annettiin vapaa pääsy tavallisiin laboratoriorottien ruokaan ja veteen 1 viikon ajan. Eläinten tilat ja protokollat ​​hyväksyttiin Shanghai Jiao Tong -yliopiston (Shanghai, Kiina) eläinetiikkakomiteassa.

Viikon sopeutumisen jälkeen kaksitoista naiivia rottaa jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään (n=6), kontrolliryhmään ja kroonisen ennakoimattoman stressin (CUS) ryhmään. CUS-rotat kehitettiin kuten edellisessä raportissamme [4], jotka altistettiin erilaisille stressitekijöille: valkokohina (100 dB) 1 tunnin ajan, yön yli matalan intensiteetin stroboskooppinen valaistus (120 välähdystä/min), veden puute 24 tuntia, tyhjä vesipullot 1 h (veden puutteen jälkeen), ruuan puute 24 h, fyysinen rajoitus (1-2 h), pakkouinti (5 min), likainen häkki 24 h (200 ml vettä 100 g sahanpurukuivaimessa), hännän puristus ( 1 min), isku 30 min, 45 asteen häkin kallistus 24 tuntia ja yön yli valaistus (12 h). Stressiä käytettiin jatkuvasti ja satunnaisesti 4 viikon ajan, yksityiskohtainen järjestely on kuvattu taulukossa S1. Neljän viikon stressin jälkeen sakkaroosipreferenssitesti, avoimen kentän testi ja uutuussuppressoitunut ruokintatesti suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla [4]. CUS:n ja käyttäytymistestin pääpiirteet on esitetty kuvassa S1. Käyttäytymistestien jälkeen jokaiselta rotalta otettiin vähintään 4 ulostepellettiä ja sijoitettiin steriileihin kartiomaisiin putkiin CTE:n in vitro -analyysiä varten.(Cistanche tubulosa -uute)aineenvaihduntaa.

2.3. CTE:n maha-suolikanavan metabolia(Cistanche tubulosa -uute)normaalilla ja CUS-rotalla in vitro

2.3.1. CTE:n aineenvaihdunta(Cistanche tubulosa -uute)simuloiduissa maha- ja suolistonesteissä

Viisikymmentä milligrammaa CTE:tä(Cistanche tubulosa -uute)lisättiin 10 ml:aan simuloitua mahamehua ja suolistomehua, vastaavasti. Sitten CTE(Cistanche tubulosa -uute)inkuboitiin 37 asteessa 4 tuntia mahanesteessä ja 6 tuntia suolistomehussa. Viljelty seos (1 ml) sammutettiin 3 ml:lla vedellä kyllästettyä n-butanolia välittömästi 0 ja 4 tunnin kohdalla mahanesteessä ja 0 ja 6 tunnin kohdalla suolistomehussa. Käytetyn näytteen käsittelymenetelmä oli aiemmin kuvattu [9].

2.3.2. CTE:n aineenvaihdunta(Cistanche tubulosa -uute)normaalilla ja CUS-rotan suoliston mikrobiotalla

Tuoreet normaalit ja CUS-rotan ulostenäytteet sekoitettiin ensin ja homogenisoitiin 25-kertaisella tilavuudella GAM-lientä. Sedimentit poistettiin suodattamalla kolmen sideharsopalan läpi. Sitten suspensiota inkuboitiin 37 asteessa anaerobisessa inkubaattorissa, jossa ilma korvattiin kaasuseoksella (H2 5 prosenttia, CO2 10 prosenttia, N2 85 prosenttia). Viisikymmentä milligrammaa CTE:tä lisättiin 5 ml:aan normaalia ja CUS-rotan ulostesuspensiota erikseen, ja suspensiota inkuboitiin 37 asteessa 48 tuntia. Viljelty seos poistettiin ja uutettiin vedellä kyllästetyllä butanolilla 0, 12, 24 ja 48 tunnin kohdalla. Näytteenkäsittelymenetelmä kuvattiin aiemmin [9].

2.3.3. CTE:n peräkkäinen metabolia(Cistanche tubulosa -uute)mahanesteestä, suolistomehusta, normaalista ja CUS-rotan suoliston mikrobiotosta

Ensinnäkin 100 mg CTE:tä(Cistanche tubulosa -uute)lisättiin 1{{10}} ml:aan simuloitua mahanestettä ja inkuboitiin 37 asteessa 4 tuntia. Koko reaktio sammutettiin 3-kertaisella tilavuudella vedellä kyllästettyä n-butanolia ja sentrifugoitiin 3000 rpm 15 minuuttia, minkä jälkeen supernatantti haihdutettiin typpivirran alla. kaasu 37 astetta. Toiseksi jäännös liuotettiin uudelleen 0,4 ml:aan steriiliä vettä, lisättiin 8 ml:aan simuloitua suolistomehua ja inkuboitiin 37 asteessa 6 tuntia. Näyte mahanesteellä valmistettiin samalla tavalla. Lopuksi jäännös liuotettiin uudelleen 0,3 ml:aan steriiliä vettä, lisättiin 6 ml:aan normaalia ja CUS-rotan ulostesuspensiota, vastaavasti, ja inkuboitiin 37 asteessa 48 tuntia anaerobisessa inkubaattorissa. Yksi millilitra reaktiota sammutettiin 3 ml:lla vedellä kyllästettyä n-butanolia välittömästi 0 ja 4 tunnin kohdalla mahanesteessä, 0 ja 6 tunnin kohdalla suolistomehussa ja 0, 12, 24 ja 48 tunnin kohdalla rotan suoliston mikrobiotassa. . Näyte käsiteltiin samalla tavalla kuin CTE(Cistanche tubulosa -uute)simuloidussa mahamehussa.

2.4. CTE:n aineenvaihdunta(Cistanche tubulosa -uute)normaalilla ja CUS-rotalla in vivo

Kukin rotta kahdessa ryhmässä pidettiin sitten yksittäisessä metabolisessa häkissä. Yön yli paaston jälkeen, joka salli vain vapaan pääsyn veteen, kaikille rotille annettiin suun kautta 2 ml vettä mahaletkun kautta. Tyhjät virtsa- ja ulostenäytteet kerättiin kaikilta rotilta 0 tunnin ja 12 tunnin välillä. Lisäksi CTE(Cistanche tubulosa -uute)(400 mg/kg) annettiin letkulla. Virtsa- ja ulostenäytteet kerättiin 0–24 tuntia. Kaikki virtsa- ja ulostenäytteet säilytettiin välittömästi -80 asteessa.

Virtsa- ja ulostenäytteet normaalista ja CUS-rotista esikäsiteltiin kuten aiemmin on kuvattu [12]. Kaikki saadut näytteet analysoitiin UPLC-Q-TOF-MS:llä.

2.5. Analyyttinen menetelmä

UPLC suoritettiin Waters ACQUITY UPLC -järjestelmällä (WatersCorp., Milford, MA, USA) ACQUITY UPLC BEH C18 -kolonnilla (100 mm × 2,1 mm id, 1,7 μm, Waters Corp. , USA) gradienttieluoimalla {{10}},1 % muurahaishappoasetonitriiliä (A) ja 0,1 % muurahaishappoa vedessä (B) virtausnopeudella 0,4 ml/min . Gradienttiprofiili oli: 0-5 min (A:5-20 prosenttia), 5-7,5 min (A: 20-30 prosenttia), 7,5-10 min (A: 30-70 prosenttia), 10-11 min (A) : 70–100 prosenttia), ja pidettiin 1,5 minuuttia. Gradientti kierrätettiin takaisin 5 prosenttiin 0,5 minuutissa ja sitä pidettiin 2,5 minuuttia seuraavaa ajoa varten. Injektiotilavuus oli 3 µl. Pylväsuunin lämpötila asetettiin 35 asteeseen.

Massaspektrometria suoritettiin käyttämällä Waters Vion IMS -massaspektrometria (Waters Corp., Milford, MA, USA). Ionisointi suoritettiin negatiivisessa sähkösumutustilassa (ESI−). MS-parametrit olivat seuraavat: kapillaarijännite, −2.0 kV; kartiojännite, 20 V; lähdelämpötila, 120 astetta ; desolvataatiolämpötila, 500 astetta ; kartiokaasuvirtaukset 50 ja desolvataatio 1000 l/h. Tarkkaa massanmittausta varten lukkomassana käytettiin leusiini-enkefaliinia [M-H]−-ionin muodostamiseksi (m/z 554,2615). MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) -koe kahdella pyyhkäisytoiminnolla suoritettiin seuraavasti: toiminto 1 (matala energia): m/z 50–1000, 0,25 s skannausaika, 0,02 s skannausten välinen viive, 6 eV törmäysenergia; toiminto 2 (suuri energia): m/z50–1000, 0,25 s pyyhkäisyaika, 0,02 s skannausten välinen viive, törmäysenergian ramppi 20–45 eV.

2.6. Tietojenkäsittely

Tiedot käsiteltiin käyttämällä UNIFI 1.8.1 -ohjelmistoa (Waters Corp., Milford, MA, USA) metaboliittien tunnistamiseksi MSE:n kautta kerätyssä tarkassa massakuvauksessa. Yhdisteet tunnistettiin tarkan massan perusteella, fragmentit korkean energian massaspektrometriassa. Voimakkuuden kynnysarvoksi asetettiin 100,0 laskua. Kohteen tunnistus, fragmentin täsmäystoleranssi ja muut parametrit asetettiin automaattisesti.

3. Tulokset

3.1. Käyttäytymismuutokset CUS:n aiheuttamassa masennuksessa rotassa

Rotat, joilla oli CUS:n aiheuttamia masennusoireita, arvioitiin käyttäytymistokeilla, mukaan lukien sakkaroosin mieltymystesti, avokenttätesti ja uutuussuppressoitu ruokintatesti. Studentin t-testi paljasti, että sakkaroosipreferenssi sakkaroosin mieltymystestissä (p < 0,001),="" ajettu="" kokonaisetäisyys="" avokenttätestissä="" (p="">< 0,001)="" ja="" syömislatenssi="" uutuussuppressoidussa="" ruokintatestissä="" (p="">< 0,01)="" olivat="" merkitsevästi.="" erilainen="" verrattuna="" kontrolliryhmään="" 4-viikon="" cus-hoidon="" jälkeen="" (kuva="" 1).="" nämä="" havainnot="" osoittivat,="" että="" kroonisen="" ennakoimattoman="" stressin="" malli="" on="" onnistuneesti="">

3.2. CTE:n kemiallisten aineosien karakterisointi(Cistanche tubulosa -uute)

Kattava analyysi CTE:n prototyyppikomponenteista(Cistanche tubulosa -uute)suoritettiin UPLC-Q-TOF-MS:llä. Yhteensä 27 ainesosaa CTE:stä(Cistanche tubulosa -uute)havaittiin ja alustavasti karakterisoitiin, mukaan lukien 20 PhG:tä, 5 iridoidia ja iridoidiglykosidia ja 2 oligosakkaridia. Yksityiskohtaiset tiedot, mukaan lukien retentioaika, tarkat MS- ja MS/MS-fragmentti-ionit, on lueteltu tukitiedoissa (taulukko S2), jotta saadaan käsitys näiden kemiallisten aineosien rakenteesta. CTE:n UPLC-Q-TOF-MS kokonaisionikromatogrammi (TIC) on esitetty kuvassa S2.

3.3. CTE:n maha-suolikanavan metabolia(Cistanche tubulosa -uute)normaalilla ja CUS-rotalla in vitro

Tässä tutkimuksessa CTE:n mahdolliset metaboliitit(Cistanche tubulosa -uute)Normaalit ja CUSrotit in vitro havaittiin TIC:istä ja tunnistettiin alkuainekoostumusten ja MS/MS-fragmenttien massaspektrien yhdistelmällä sen jälkeen, kun niitä oli verrattu kontrollinäytteisiin. Kaikki CTE:n metaboliitit(Cistanche tubulosa -uute)simuloiduissa maha- ja suolistonesteissä normaali ja CUS-rotan suoliston mikrobiota on lueteltu taulukossa 1.

3.3.1. CTE:n aineenvaihdunta(Cistanche tubulosa -uute)simuloiduissa maha- ja suolistonesteissä

Seitsemän CTE:n metaboliittia(Cistanche tubulosa -uute)simuloidussa mahanesteessä identifioitiin alustavasti tarkalla massa- ja MSE-fragmenttitiedolla: M1 (m/z315,1074, C14H20O8, 1,66 min), M4 (m/z 459,1501, C20H28O12, 2,36 min), M5 (m/z 45,0,1 H 145,1 H). 2,60 min), M7 (m/z 179,0338, C9H8O4, 2,85 min), M12 (m/z 785,2481, C35H46O20, 4,77 min), M16 (m/z 827,2580, C37H48O21, M3, 18, 6,8 min),/5 min. .1968, C29H36O15, 5,81 min). Deglykosylaatiota, dehydroksylaatiota, dehydrausta ja isomerointia pidettiin CTE:n pääasiallisina aineenvaihduntareitteinä mahanesteessä. M4:n ja M5:n molekyylipainon havaittiin olevan 2 Da ja 16 Da pienempi kuin niiden prototyyppikomponentin, kofeoyylilakteosidin, ja siten tunnistettiin sen dehydratuiksi ja dehydroksyloiduiksi tuotteiksi, vastaavasti. M12 tunnistettiin ekinakosidin isomeeriksi, joka tuottaa samoja ioneja kuin ekinakosidi m/z-arvoilla 623,2178, 477,1601, 315,1055, 161,0237.

Samat metaboliitit havaittiin CTE:n jälkeen(Cistanche tubulosa -uute)inkubointi suolistomehussa. On huomionarvoista, että kofeoyyliryhmä C-6'-asemassa PhG:issä metaboloitui helposti ruoansulatusentsyymien toimesta suolistomehussa tuottaen sen dekofeyylimetaboliitteja ja kofeiinihappoa.

3.3.2. CTE:n aineenvaihdunta(Cistanche tubulosa -uute)normaalilla ja CUS-rotan suoliston mikrobiotalla

Yhteensä 20 metaboliittia biotransformoitui CTE:stä(Cistanche tubulosa -uute)normaalissa rottisuolen mikrobiota havaittiin ja tunnistettiin (kuvio 2). Näistä tuloksista havaittiin, että PhG:t hajosivat aglykonihydroksityrosoliksi (HT) M2 (m/z 153,0550, C8H10O3, 1,78 min) ja kahvihapoksi (CA) M7 (m/z 179,0338, C9H8O4, 2,85 min). metaboloituivat edelleen M3:ksi (m/z 163,0390, C9H8O3, 2,02 min), M6:ksi (m/z 181,0501, C9H10O4, 2,76 min), M10:ksi (m/z 195,0655, C10H12O4, C10H12O4, 4,15 min),/z 4,15 (m) 4,15. , C9H10O3, 4,36 min) dehydroksyloinnin, pelkistyksen ja metyloinnin kautta. Lisäksi keskusaineenvaihduntareitit, jotka tuottivat PhG-prototyyppiyhdisteiden suoria metaboliitteja CTE:stä normaalissa rotan suoliston mikrobiotassa, ovat pelkistys, metoksylaatio, deglykosylaatio, kofeoyyli, dehydraus ja isomerointi.

Inkubaation jälkeen CUS:n aiheuttamassa masennuksessa rotan suoliston mikrobiot, CTE(Cistanche tubulosa -uute)muuttui 20 metaboliitiksi samojen metaboliareittien kautta kuin normaalit rotat.

3.3.3. CTE:n peräkkäinen metabolia mahanesteen, suolistomehun, normaalin ja CUS-rotan suoliston mikrobiotan toimesta

Peräkkäisen inkubaation jälkeen mahanesteessä, suolistomehussa, normaalissa ja CUS-rotan suoliston mikrobistossa, CTE(Cistanche tubulosa -uute)metaboloitui 14 aineenvaihduntatuotteeksi (mukaan lukien 8 mahanesteellä, 7 suoliston nesteellä, 11 normaalilla ja 10 CUS-rotan suoliston mikrobiotalla). Näistä M2(HT) ja M11 (3-hydroksifenyylipropionihappo, 3-HPP) olivat PhG:iden lopulliset aineenvaihduntatuotteet CTE:n peräkkäisen inkubaation jälkeen.(Cistanche tubulosa -uute)mahanesteessä, suoliston mehussa ja suoliston mikrobiotassa. Normaalin ja CUS-rotan metaboliiteissa ei ollut merkittävää eroa.

M8, M9, M14, M17, M19 ja M20 havaittiin vain CTE:n riippumattomassa metaboliassa normaalin ja CUS-rotan suoliston mikrobiston toimesta. Nämä metaboliitit olivat pääasiassa aineenvaihdunnan välituotteita, jotka olivat täysin metaboloituneet lopullisiksi metaboliiteiksi CTE:n peräkkäisen metabolian tutkimuksessa, ja siksi niitä on vaikea havaita.

3.3.4. Erot CTE:n aineenvaihduntanopeuden välillä normaalin ja CUS:n rottisuolen mikrobiotassa

Selvittääkseen CTE:n aineenvaihduntanopeuden välisiä eroja(Cistanche tubulosa -uute)Normaalin ja CUS-rotan suoliston mikrobiotosta määritettiin erikseen ja peräkkäin 27 prototyyppiyhdisteen ja 20 metaboliitin suhteellinen pitoisuus mahamehun, suolistomehun, normaalin ja CUS-rotan suoliston mikrobiotan kanssa inkuboinnin jälkeen (taulukot S3 ja S4). Tulokset osoittivat, että vaikka CTE:n välillä ei ollut merkittäviä eroja(Cistanche tubulosa -uute)normaalien ja masentuneiden rottien metaboliitteissa havaittiin merkittävä ero niiden aineenvaihduntanopeuksissa. Esimerkiksi C2 ja C5 tunnistettiin 8-epilogaanihapoksi tai sen isomeeriksi. Ne metaboloituivat täysin normaaleissa näytteissä 12 tunnin inkubaation aikana. Patologisesti masentuneessa rotan suoliston mikrobistossa ne kuitenkin metaboloituivat perusteellisesti 48 tunnin inkubaation jälkeen. Oli ilmeistä, että aineenvaihduntanopeus normaalilla rotalla oli nopeampi kuin CUS-rotalla. Samanlaisia ​​tuloksia löydettiin C18:sta (isoakteosidi). Lisäksi on huomionarvoista, että M12:n (ekinakosidin isomeroituminen) ja M16:n (tubulosidi A:n isomeroituminen) huippupinta-ala normaaleissa näytteissä oli paljon suurempi kuin CUS-näytteissä, mikä osoittaa, että CTE:n isomerointireaktio(Cistanche tubulosa -uute)oli yleisempää normaalissa rotan suoliston mikrobiotassa kuin masennuksessa rotan suoliston mikrobiotassa.

3.4. CTE:n aineenvaihdunta normaalilla ja CUS-rotalla in vivo

Vertaamalla CTE:llä hoidetun ryhmän biologisia näytteitä nollabiologisiin näytteisiin, saatiin yhteensä 26 CTE:n metaboliittia (yhdiste 1–26).(Cistanche tubulosa -uute)epänormaalit ja CUS-rotat havaittiin (taulukko 2). Tyypilliset UPLC-kromatogrammit normaaleista ja CUS-rotan virtsanäytteistä on esitetty kuvassa 3.

3.4.1. CTE:n metaboliittien karakterisointi normaalissa ja CUS-raturiinissa

Yhteensä 18 CTE:n in vivo metaboliittia(Cistanche tubulosa -uute)normaaleissa rotan virtsanäytteissä tunnistettiin alustavasti. PhG:iden hajoamismetaboliitit, mukaan lukien HT ja CA, ja niiden lisäsulfaatio (yhdiste 1, 2, 3, 5, 8 ja 16), metylaatio (6, 21, 22 ja 24) ja metoksylaatiometaboliitit (13 ja 14) olivat päämetaboliitit normaalissa rotan virtsassa. Iridoidiglykosidit metaboloituivat helposti aglykoneiksi (23, 25 ja 26) deglykosylaation kautta. On huomionarvoista, että mitään prototyyppikomponenttia ei havaittu normaalista rotan virtsanäytteestä.

Depressiivisessä rotan virtsanäytteessä 22 CTE:n metaboliittia(Cistanche tubulosa -uute)havaittiin ja karakterisoitiin. Yksi prototyyppiyhdiste, 8-epilogaanihappo, havaittiin patologisesta rotan virtsasta. Muut metaboliitit olivat samanlaisia ​​kuin normaalista rotan virtsasta, mukaan lukien sulfatoidut metaboliitit (1, 2, 3, 8, 10 ja 16), metyloidut metaboliitit (6, 11, 19 ja 22), metoksyloidut metaboliitit (13 ja 14). HT:n ja CA:n sekä iridoidiglykosidien aglykonit (25 ja 26).

3.4.2. CTE:n metaboliittien karakterisointi(Cistanche tubulosa -uute)normaaleissa ja CUS-rottien ulosteissa

Tässä tutkimuksessa vain yksi CTE:n metaboliitti (yhdiste 20, 3-HPP).(Cistanche tubulosa -uute)havaittiin normaaleissa rotan ulosteissa. Useimmat PhG:t hajosivat ensin CA:ksi ja sen seurauksena metaboloituivat edelleen sen tärkeimmäksi mikrobimetaboliitiksi, 3-HPP:ksi. CUS-rotan ulostenäytteessä karakterisoitiin perusteellisesti 3 metaboliittia, mukaan lukien sulfatoitu 3-HPP (yhdiste 16) ja sulfatoitu HT (yhdisteet 2 ja 3).

3.4.3. Erot CTE:n in vivo -metaboliittien välillä normaaleissa ja CUSrotissa

CTE:n suun kautta annon jälkeen(Cistanche tubulosa -uute), in vivo -metaboliitit osoittivat ilmeisiä eroja terveissä ja masentuneissa rotissa. Sekä terveistä että CUS-rotan näytteistä havaittiin 21 metaboliittia (yhdiste 1–3, 5, 6, 8–14, 16, 17 ja 19–26). Yhdiste 23 (deglykosyloitu geniposidiinihappo) tunnistettiin vain terveistä rotan näytteistä, kun taas yhdisteet 4 (HT), 7 (8-epilogaanihappo), 15 (3, 4-dihydroksibentseenipropionihappo) ja 18 ({{ 19}}HPP-glukuronidikonjugaatio) havaittiin vain CUS-mallirottanäytteissä. Yhteenvetona voidaan todeta, että prototyypin aineosia havaittiin vain CUS-rotissa, kun taas normaaleissa rotissa havaittiin enemmän faasin II metaboliitteja.

4. Keskustelu

Tässä tutkimuksessa kolmea in vitro -inkubaatiomallia, mukaan lukien mahaneste, suolistomehu, normaali ja CUS-rotan suoliston mikrobiootti, käytettiin itsenäisesti ja peräkkäin CTE:n maha-suolikanavan metabolisen profiilin tutkimiseksi.(Cistanche tubulosa -uute)in vitro. Todettiin, että PhGsja iridoidiglykosideja CTE(Cistanche tubulosa -uute)CUS-indusoidun rotan suoliston mikrobiot metaboloivat helposti sekundaarisiksi glykosideiksi ja aglykoneiksi. Sen jälkeen CTE:n metabolia in vivo(Cistanche tubulosa -uute)normaaleissa ja CUS-rotissa. Ehdotetut metaboliset reitit CTE:lle(Cistanche tubulosa -uute)Terveissä ja CUS-indusoiduissa masentuneissa rotissa on esitetty kuvassa 4. PhG:t, kuten ekinakosidi ja akteosidi, metaboloituivat HT:ksi ja CA:ksi, ja CA metaboloitui edelleen tärkeimmäksi mikrobimetaboliitiksi, 3-HPP:ksi. HT, CA ja 3-HPP metaboloituivat sitten sulfatoiduiksi, metyloiduiksi ja metoksyloiduiksi metaboliiteiksi. Iridoidiglykosidit, mukaan lukien geniposidiinihappo, kankanosidi A ja kankanosidi N, metaboloituivat aglykoneikseen deglykosylaation kautta. Nämä osoittivat lisäksi, että PhG:t ja iridoidiglykosidit CTE:ssä(Cistanche tubulosa -uute)metaboloituivat helposti toissijaisiksi glykosideiksi ja aglykoneiksi CUS-rotissa. Näillä metaboliiteilla on normaalisti parempi imeytyminen suolistosta ja biologinen hyötyosuus, jotta ne imeytyvät edelleen vereen ja saavat aikaan biologista aktiivisuutta [16–18]. On syytä huomata, että isomeroituminen oli yleistä PhG:ille maha-suolikanavassa, merkitykselliset metaboliitit tunnistettiin sen jälkeen, kun niitä verrattiin niiden prototyyppiyhdisteiden UPLC-retentioaikaan optimoituun ihanteelliseen UPLC-gradienttiprofiiliin perustuen.

Kofeiinihappo oli CTE:n ensisijainen hajoamistuote(Cistanche tubulosa -uute)depressiivisen patologisen rotan suoliston mikrobiotan vaikutuksesta. Aiemmissa julkaisuissa on raportoitu, että kofeiinihappo tuottaa masennuslääkettä muistuttavia vaikutuksia hiirten pakkouintitestissä. Sekä aivoista peräisin olevan neurotrofisen tekijän (BDNF) mRNA-taso otsakuoressa että TrkB-mRNA-taso theamygdalassa laskivat merkittävästi pakkouintitestin jälkeen, ja aiempaa vähentymistä esti merkittävästi kofeiinihappo [19]. Hydroksityrosoli oli PhG:iden aglykoni, joka suojaa neurogeneesiä ja kognitiivista toimintaa estämällä stressin aiheuttaman hermoproteiinin BDNF:n heikentymisen [20]. Siksi on tarpeen kiinnittää enemmän huomiota joihinkin bioaktiivisiin metaboliitteihin (eli HT ja CA), joita suoliston mikrobiota transformoi oraalisen annon jälkeen.

Lisäksi esillä olevat havainnot osoittavat, että masentuneessa suoliston mikrobiotassa metabolinen kyky tuottaa sekundaarisia glykosideja ja aglykoneja oli huomattavasti heikompi kuin epänormaalin rotan suoliston mikrobiot. Syynä on todennäköisesti masennuksen aiheuttamia suoliston mikrobiotan rakennemuutoksia, jotka johtavat suoliston mikrobiotan tuottamien metabolisten entsyymien aktiivisuuden vähenemiseen [21]. Mielenkiintoista on, että aikaisempi tutkimus osoitti, että phylum Bacteroidetes koodaa runsaimmat glykosidihydrolaasi- ja polysakkaridilyaasigeenit glykosidihydrolyysissä ja kompleksisten hiilihydraattien pilkkomisessa eliminaatiomekanismilla [22]. Erityisesti Bacteroides spp. mukaan lukien B. caccae, B. dorei, B. finegoldii, B. fragilis, B. intestinalis, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. uniformis ja B. ksylanisolvens osoitti hallitsevan kokonaismäärän GH:ita ja PL:itä koodaavia geenejä. Parabacteroides distasonisilla on myös samat ominaisuudet [22]. Aiemmat tutkimuksemme vahvistivat, että 28-päivän krooninen ennakoimaton stressistimulaatio vähensi Bacteroides-, Parabacteroides-, Butyricimonas- ja Weissella-sukujen suhteellista runsautta, kun taas lisäsi Ruminococcus- ja Deinococcus-bakteerien määrää rotilla [4]. On huomionarvoista, että Bacteroides ja Parabacteroides olivat kaksi yleisintä mikrobitaksonia, joiden suhteellinen runsaus normaaleissa rotissa oli noin 20 prosenttia. CUS-hoidon jälkeen Bacteroides- ja Parabacteroides-bakteerien suhteellinen määrä laski jyrkästi noin 5 prosenttiin masentuneilla mallirotilla. Siksi tämä johtaa väistämättä GH- ja PL-entsyymien kokonaismäärän vähenemiseen CUS-rotilla ja häiritsee edelleen CUS-depressiivisen suoliston mikrobiotan deglykosyloitunutta reaktiota CTE:n oraalisen annon jälkeen(Cistanche tubulosa -uute)mallirotissa.

5. Päätelmät

Tässä tutkimuksessa UPLC-Q-TOF-MS-tekniikka luotiin ja sitä sovellettiin aineenvaihduntatuotteiden seulomiseen ja tunnistamiseen.Cistanche tubulosa -uutenormaaleissa ja CUS-depressiivisissä rotissa in vitro ja in vivo. Tulokset osoittivat, että CTE(Cistanche tubulosa -uute)Se metaboloitui aglykoneiksi ja PhG:iden ja iridoidiglykosidien hajoamistuotteiksi sekä terveen että masentuneen suoliston mikrobiston toimesta. CTE:n suun kautta annon jälkeen(Cistanche tubulosa -uute), faasi II aglykonien metaboliitteja sekä PhG:iden ja iridoidiglykosidien hajoamistuotteita löydettiin pääasiassa rotan virtsasta. Aineenvaihduntakyky tuottaa sekundaarisia glykosideja ja aglykoneja masentuneessa rotan suoliston mikrobiotassa oli paljon heikompi kuin normaalin rotan suoliston mikrobiotassa, mikä johtui suoliston mikrobiotan tuottamasta häiriöttömästä glykosidihydrolaasista CUS-masentuneilla rotilla. Tämä tutkimus tarjoaa uuden näkökulman myöhemmälle CTE:n kehittäminen(Cistanche tubulosa -uute)mahdollisena masennuslääkkeenä.

Kiitokset

Tätä työtä tuettiin Kiinan kansallisen tutkimus- ja kehitysohjelman (2017YFC1702400) apurahoilla.

Liite A. Lisätiedot

Tämän artikkelin lisätiedot löytyvät verkosta osoitteesta HTTPS://doi.org/10.1016/j.jchromb.2019.121728

Lähde: ' In vitro ja in vivo -aineenvaihduntaCistanche tubulosa -uutenormaaleissa ja kroonisissa odottamattomissa stressin aiheuttamissa masentuneissa rotissaYang Li, et ai

--Journal of Chromatography B 1125 (2019) 121728

Viitteet

[1] Chinese Pharmacopoeia Commission, The Pharmacopeia of the People's Republic of China, 2015 toim., China Medical Science Press, Peking, Kiina, 2015, s. 135 Osa I.
[2] Y. Jiang, P.-F. Tu, Cistanche-lajin kemiallisten aineosien analyysi, J. Chromatogr. 1216 (2009) 1970–1979.
[3] Z. Fu, X. Fan, X. Wang, X. Gao, Cistanches Herba: katsaus sen kemiaan, farmakologiaan ja farmakokinetiikkaan, J. Ethnopharmacol. (2017), https://doi.org/10.1016/j.jep.2017.10.015.
[4] Y. Li, Y. Peng, P. Ma, H. Yang, H. Xiong, M. Wang, C. Peng, P. Tu, X. Li, Antidepressant-like effects ofCistanche tubulosa -uutekroonisissa odottamattomissa stressirotissa suoliston mikrobiotan homeostaasin palauttamisen kautta, Front. Pharmacol. (2018), https://doi.org/10.3389/fphar.2018.00967.
[5] JA Foster, MV Neufeld, Suolen ja aivojen akseli: kuinka mikrobiomi vaikuttaa ahdistukseen ja masennukseen, Trends Neurosci. 36 (2013) 305–312.
[6] E. Sherwin, TG Dinan, JF Cryan, Viimeaikainen kehitys suoliston mikrobiotan roolin ymmärtämisessä aivojen terveydessä ja sairauksissa, Ann. NY Acad. Sci. 12 (2017) e0177977.
[7] Y. Meng, H. Jia, Z. Chao, Y. Yong, Z. Yang, M. Yang, Z. Zou, Variations in gut microbiota and fecal metabolic fenotype asssociated with masennus by 16S rRNA geenisekvenssointi ja LC/ MS-pohjainen metabolomiikka, J. Pharm. Biomed. Anaali. 138 (2017) 231–239.

[8] JR Kelly, Y. Borre, BC O', E. Patterson, AS El, J. Deane, PJ Kennedy, S. Beers, K. Scott, G. Moloney, Transferring the blues: masennukseen liittyvä suoliston mikrobisto indusoi neurobehavioural changes in rot, J. Psychiatr. Res.. 82 (2016) 109–118.
[9] L. Yang, P. Ying, M. Wang, P. Tu, X. Li, Cistanches Herba -vesiuutteen ihmisen maha-suolikanavan metabolia in vitro: aineenvaihduntaprofiilin selvitys, joka perustuu kattavaan aineenvaihduntatuotteiden tunnistamiseen mahanesteessä, suolistossa mehu, ihmisen suolistobakteerit ja suoliston mikrosomit, J. Agric. Food Chem. 65 (2017) 7447–7456.
[10] Y. Li, G. Zhou, S. Xing, P. Tu, X. Li, Ihmisen suoliston bakteerien tuottamien ekinakosidi-metaboliittien tunnistaminen ultra-performance-nestekromatografialla/kvadrupolien lentoaikamassaspektrometrialla, J. Agric. Food Chem. 63 (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, G. Zhou, Y. Peng, P. Tu, X. Li, Cistanches Herbasta peräisin olevien kolmen tyypillisen fenyylietanoidiglykosidin metaboliitin seulonta ja tunnistaminen ihmisen suolistobakteerien toimesta käyttämällä UPLC/Q-TOF-MS:ää, J. Pharm. Biomed. Anaali. 118 (2016) 167–176.
[12] L. Yang, P. Ying, M. Wang, G. Zhou, Y. Zhang, X. Li, Cistanche deserticolan ja C. tubulosan vesiuutteen metaboliittien välisten erojen nopea seulonta ja tunnistaminen rotilla UPLC-menetelmällä. Q-TOF-MS yhdistetty kuviontunnistusanalyysi, J. Pharm. Biomed. Anaali. 131 (2016) 364–372.
[13] C. Q, P. Y, B. X, Z. W, C. L, L. X, Cistanche tubulosasta peräisin olevien ekinakosidin ja akteosidin metaboliittien systemaattinen karakterisointi rotan plasmassa, sapessa, virtsassa ja ulosteessa UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr. 30 (2016) 1406–1415.
[14] Y. Wang, H. Hao, G. Wang, P. Tu, Y. Jiang, Y. Liang, L. Dai, H. Yang, L. Lai, C. Zheng, lähestymistapa peräkkäisten metaboliittien tunnistamiseen tyypillinen fenyylietanoidiglykosidi, ekinakosidi, joka perustuu nestekromatografian ioniloukun aikaan
lentomassaspektrometriaanalyysi, Talanta 80 (2009) 572–580.
[15] C. Jia, H. Shi, W. Jin, K. Zhang, Y. Jiang, M. Zhao, P. Tu, Metabolism of ekinakosidi, hyvä antioksidantti, rotilla: sen sapen metaboliittien eristäminen ja tunnistaminen, Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 431–438.
[16] J. Xu, HB Chen, SL Li, Yrttilääkkeiden ja suoliston mikrobiston välisen vuorovaikutuksen molekyylimekanismien ymmärtäminen, Med. Res. Rev. 37 (2017) 1140–1185.
[17] H. Liu, J. Yang, F. Du, X. Gao, X. Ma, Y. Huang, F. Xu, W. Niu, F. Wang, Y. Mao, Ginsenosidien imeytyminen ja jakautuminen suun kautta Panax notoginseng -uutteen antaminen rotille, Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 2290–2298.
[18] JM Laparra, Y. Sanz, S. Schaffer, F. Visioli, Interactions of gut microbiota with functional food Components and nutraceuticals, Pharmacol. Res. 61 (2010) 219–225.
[19] H. Takeda, M. Tsuji, T. Yamada, J. Masuya, K. Matsushita, M. Tahara, M. Iimori, T. Matsumiya, Caffeic acid heikentää aivokuoren BDNF-mRNA-ilmentymisen vähenemistä, joka johtuu altistumisesta pakotetulle uintistressi hiirillä, Eur. J. Pharmacol. 534 (2006) 115–121.
[20] A. Zheng, L. Hao, C. Ke, X. Jie, Z. Xuan, L. Yuan, C. Cong, J. Liu, Z. Feng, Äidin hydroksityrosolin antaminen parantaa neurogeneesiä ja kognitiivisia toimintoja synnytystä edeltävässä stressissä. jälkeläinen, J. Nutr. Biochem. 26 (2015) 190–199.
[21] H. Li, J. He, W. Jia, Suoliston mikrobiston vaikutus lääkeaineenvaihduntaan ja toksisuuteen, Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 12 (2016) 31.
[22] KA El, F. Armougom, JI Gordon, D. Raoult, B. Henrissat, Hiilihydraattiaktiivisten entsyymien runsaus ja valikoima ihmisen suoliston mikrobiotassa, Nat. Rev. Microbiol. 11 (2013) 497–504.