Mycobacterium Tuberculosis -bakteerin vastaisen kimeerisen moniepitooppirokotteen in Silico suunnittelu osa 1

Abstrakti

Tuberkuloosi (TB) on maailmanlaajuinen terveysuhka, joka tappaa noin 1,5 miljoonaa ihmistä vuosittain. Tuberkuloosin pääasiallisen aiheuttajan Mycobacterium tuberculosis -bakteerin hävittäminen on yhä haastavampaa laajojen lääkeresistenttien kantojen ilmaantuessa. Rokotusta pidetään tehokkaana tapana suojata isäntä patogeeneiltä, ​​mutta ainoalla kliinisesti hyväksytyllä tuberkuloosirokotteella, Bacillus Calmette-Guérinilla (BCG), on rajoitettu suoja aikuisilla. Moniepitooppirokotteiden on havaittu lisäävän immuniteettia sairauksia vastaan ​​yhdistämällä selektiivisesti epitooppeja useista ehdokasproteiineista.

Tuberkuloosi on Mycobacterium tuberculosis -bakteerin aiheuttama tartuntatauti, joka vaikuttaa pääasiassa keuhkoihin, mutta voi vaikuttaa myös muihin elimiin. Immuniteetilla on tärkeä rooli tuberkuloosin kehittymisessä ja hoidossa.

Jos immuniteetti on riittämätön, Mycobacterium tuberculosis voi helposti tunkeutua ihmiskehoon ja kehittyä tuberkuloosiksi. Esimerkiksi tiettyjen sairauksien tai lääketieteellisten hoitojen aiheuttama heikentynyt immuunijärjestelmä lisää tuberkuloositartunnan riskiä. Lisäksi aliravitsemus, huono elämänlaatu ja liiallinen stressi voivat heikentää vastustuskykyä ja johtaa tuberkuloosin kehittymiseen.

Siksi hyvän terveyden ylläpitäminen ja immuniteetin vahvistaminen on erittäin tärkeää tuberkuloosin ehkäisyssä. Vastustuskykyä voidaan vahvistaa terveellisellä ruokavaliolla, säännöllisillä elämäntavoilla, oikealla liikunnalla ja riittävällä unella, mikä voi tehokkaasti vähentää riskiä sairastua erilaisiin sairauksiin, kuten tuberkuloosiin.

Immuniteetti on tärkeä myös hoidossa ja toipumisessa, kun tuberkuloosi on jo esiintynyt. Mitä vahvempi immuunijärjestelmä on, sitä tehokkaammin elimistö pystyy puolustautumaan tuberkuloosibasillin hyökkäykseltä ja tuottamaan riittävästi vasta-aineita taudin torjumiseksi. Siksi riittävä ravitsemus, oikea liikunta ja positiivinen asenne voivat parantaa vastustuskykyä ja edistää palautumista.

Yhteenvetona voidaan todeta, että immuniteetin ja tuberkuloosin välillä on vahva yhteys. Hyvän terveyden ylläpitäminen ja vastustuskyvyn vahvistaminen on yksi tärkeimmistä tavoista ehkäistä ja hoitaa tuberkuloosia. Suhtaudukaamme elämään positiivisesti, ylläpitäkäämme terveitä elämäntapoja ja pysykäämme erossa sairauksista. Tästä näkökulmasta meidän on parannettava vastustuskykyämme. Cistanche voi parantaa merkittävästi koskemattomuutta, koska lihatuhka sisältää erilaisia ​​biologisesti aktiivisia komponentteja, kuten polysakkarideja, kaksi sientä, Huang Li jne. Nämä komponentit voivat stimuloida immuunijärjestelmää. Erityyppiset solut järjestelmässä lisäävät niiden immuunitoimintaa.

Napsauta cistanchen terveyshyötyjä

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli suunnitella moniepitooppirokote tuberkuloosia vastaan ​​käyttämällä immunoinformatiikan lähestymistapaa. Toiminnallisen rikastamisen avulla tunnistimme kahdeksan M. tuberculosiksen erittämää proteiinia, joita tarvitaan joko patogeneesiin, erittyvät solunulkoiseen tilaan tai molemmat. Analysoimme sitten näiden proteiinien epitoopit ja valitsimme 16 auttaja-T-lymfosyyttiepitooppia, joilla oli interferonia indusoivaa aktiivisuutta, 15 sytotoksista T-lymfosyyttiepitooppia ja 10 lineaarista B-soluepitooppia, ja konjugoimme ne adjuvantilla ja Pan HLA:n DR-sitoutumisepitoopilla (PADRE) käyttämällä asianmukaisia linkittäjät.

Lisäksi ennustimme tämän rokotteen tertiaarisen rakenteen, sen mahdollisen vuorovaikutuksen Toll-Like Receptor-4 (TLR4) -reseptorin (TLR4) kanssa ja sen mahdollisesti aiheuttaman immuunivasteen. Tulokset osoittivat, että tällä rokotteella oli voimakas affiniteetti TLR4:ää kohtaan, joka voi merkittävästi stimuloida CD4 plus- ja CD8 plus -soluja erittämään immuunitekijöitä ja B-lymfosyyttejä erittämään immunoglobuliineja hyvän humoraalisen ja sellulaarisen immuniteetin saavuttamiseksi. Kaiken kaikkiaan tämän moniepitooppiproteiinin ennustettiin olevan stabiili, turvallinen, erittäin antigeeninen ja erittäin immunogeeninen, ja sillä on potentiaalia toimia maailmanlaajuisena rokotteena tuberkuloosia vastaan.

1. Esittely

Tuberkuloosi (TB), Mycobacterium tuberculosis -bakteerin aiheuttama erittäin tarttuva sairaus, on Maailman terveysjärjestö (WHO) luokitellut yleisimmäksi yksittäisen tartuntatautien aiheuttaman kuolinsyyn [1–3]. Vuonna 2021 tuberkuloosikuolemien ja uusien tapausten arvioitu määrä oli 1,6 miljoonaa ja 10,6 miljoonaa [4]. Tällä hetkellä tuberkuloosin kliininen hoito on suhteellisen niukkaa ja pääasiassa käytetään useiden mikrobilääkkeiden yhdistelmää.
Tämä kemoterapiasykli on hyvin pitkä, yleensä yhdeksästä kahteentoista kuukauteen tai jopa pidempään [5], mikä lisää lääkeresistenttien mutaatioiden riskiä M. tuberculosis -bakteerissa [6,7]. Viime vuosina kemoterapia on heikentynyt useille lääkkeille ja laajalti lääkeresistenttien M. tuberculosisin ilmaantuessa ja lisääntyessä [6]. Tuberkuloosin kehittymisen estäminen voi olla tehokkaampaa kuin sen hoitaminen. Rokotuksen tiedetään olevan tehokas tapa suojata isäntä patogeenisiltä bakteereilta [8].

Tällä hetkellä yli 100 vuotta sitten kehitetty Bacillus Calmette-Guérin (BCG) on ainoa kliinisesti hyväksytty tuberkuloosirokote [9]. Valitettavasti BCG suojaa vain vastasyntyneitä ja imeväisiä, ja se on suurelta osin tehoton nuoria ja aikuisia vastaan ​​[2,10], vaikka WHO:n mukaan 89 prosenttia tuberkuloositapauksista vuonna 2021 oli aikuisia [4]. Siksi on kiireellisesti kehitettävä uusi ja tehokas tuberkuloosirokote erityisesti nuorille ja aikuisille.

Tuberkuloosirokotteen kehittämistä vaikeuttavat monet mykobakteerien ominaisuudet, kuten piilevä infektio, pysyvyys ja immuunivasteen kierto [11–13]. Ihanteellinen tuberkuloosirokote tulisi suunnitella kohdistamaan proteiineja/reittejä, jotka ovat vastuussa näistä ominaisuuksista M. tuberculosis -bakteerissa ja kyettävä indusoimaan tehokkaasti CD4 plus- ja CD8 plus T-soluvälitteisiä immuunivasteita [14].

Lisäksi tehokkaan rokotteen tulisi kohdistua myös isännän tärkeimpiin histokompatibiliteettikomplekseihin (MHC), jotka ovat erittäin polymorfisia [15]. Nämä ominaisuudet asettavat erittäin korkeat vaatimukset rokotteen monipuolisuudelle, jota ei tietenkään voida saavuttaa yhdellä luonnollisella proteiinilla. Moniepitooppirokote, rekombinanttiproteiini, joka koostuu sarjasta päällekkäisiä epitooppeja (peptidejä) [16], on uudenlainen rokoteehdokas, joka voi ratkaista yllä olevat ongelmat.

Viime vuosina moniepitooppirokotteet ovat herättäneet paljon huomiota, koska niiden etuina ovat korkeampi immuniteetti ja pienempi allergeenisuus kuin tavanomaisilla rokotteilla [17,18]. Tällä hetkellä moniepitooppirokotteita on suunniteltu monia patogeenisiä mikro-organismeja vastaan, mukaan lukien Shigella spp. [19], suu- ja sorkkatautivirus [20], Helicobacter pylori [21,22], hepatiitti B-virus [23], Toxoplasma gondii [24], Leishmania infantum [25], Nipah-virus [26], Onchocerca volvulus [27], Pseudomonas aeruginosa [28] ja leukoosivirus [29].

Erityisesti COVID{0}}-pandemian ilmaantuminen on vahvistanut tämän tekniikan soveltamista [16,30–32]. Mitä tulee tuberkuloosiin, useita moniepitooppirokotteita on suunniteltu kohdistamaan luontaisesti aktiiviseen tuberkuloosiin [33–39] ja piilevään tuberkuloosiin [40,41]. Niiden joukossa kolme rokoteehdokasta suunniteltiin DNA:n muodossa [34, 36, 40], ja kaksi niistä sisällytti epitooppeja proteiinien rungoihin rekombinanttirokotteiden tuottamiseksi [34, 36].

On huomattava, että joidenkin yllä olevien moniepitooppirokotteiden kandidaattiproteiinit valitaan satunnaisesti, ja näiden rokotteiden populaatiokattavuus vaatii lisätutkimuksia.

Lisäksi suunniteltiin kaksi moniepitooppiista TB-rokoteehdokasta, joilla oli laaja populaatiokattavuus, yksi epitooppi valittiin immunogeenisten eksosomien vesikkeliproteiineista, joilla on patogeenisiä ominaisuuksia [39], ja toinen ei keskity ehdokasproteiineihin, vaan se valitsee suoraan erittäin konservoituneita ja kokeellisesti validoituja. epitoopit Immune Epitope Database (IEDB) -tietokannasta [38]. Näistä ehdokasproteiineista puuttuu kuitenkin toiminnallinen rikastus, ja rokoteehdokkaiden kykyä indusoida interferonin (IFN-) eritystä on edelleen parannettava.

Aiemmassa tutkimuksessa on päätelty, että epitooppien rationaalinen optimointi voidaan saavuttaa yhdistämällä MHC-sitoutumiskyky ja epitoopin kyky reagoida T-solureseptorien kanssa [42]. Lisäksi he ennustivat, että rokotteet, joissa on sytotoksisia T-lymfosyyttejä (CTL) A1-, A2-, A3-, A24- ja B7-sitovia epitooppeja, kattaisivat lähes 100 prosenttia suurimmissa etnisissä ryhmissä (mustat, aasialaiset, latinalaisamerikkalaiset ja valkoihoiset).

Toistaiseksi ei kuitenkaan ole ollut samanlaista lähestymistapaa tuberkuloosirokotteen suunnitteluun. Tässä tutkimuksessa suunnittelimme erittäin moniepitooppiisen tuberkuloosirokotteen käyttämällä kahdeksan toiminnallisesti rikastetun proteiinin erilaisia ​​antigeenisiä ominaisuuksia. Kimeerisellä rokoteehdokkaalla on 15 CTL-epitooppia, 16 auttaja-T-lymfosyyttiepitooppia (HTL), joilla on IFN- --indusoivia ominaisuuksia, ja 10 lineaarista B-soluepitooppia. Immunoinformatiikka-analyysi osoitti, että tämä rokoteehdokas oli "kaikenkattava", mikä teki siitä mahdollisen kulmakiven "The End TB -strategian" saavuttamiselle.

2. Materiaalit ja menetelmä

2.1. Proteiinin valinta ja sekvenssin haku

Moniepitooppisen rokotteen rakentamiseksi tuberkuloosia vastaan ​​valitsimme ensin M. tuberculosis -kompleksin proteiinit, jotka on talletettu IEDB-tietokantaan [43] ja jotka on validoitu MHC-luokan I ja II MHC-sitoutumisepitoopeiksi. M. tuberculosis H37Rv -kannan proteiinien aminohapposekvenssit (primäärirakenne) saatiin UniProt-tietokannasta [44]. Fysikaalis-kemiallisiin ominaisuuksiin perustuvat mahdollisten antigeenien kohdistuksesta riippumattomat ennusteet saatiin VaxiJen 2.0 -palvelimelta [45], jossa proteiinisekvenssit muunnettiin automaattisesti ja ristikovarianssilla (ACC) yhtenäiseksi tärkeimpien aminohappojen vektoriksi. antigeenisyyden kynnysarvoksi on asetettu 0,4 jokaiselle bakteeriproteiinille [45,46].

Proteiinien toiminnallinen annotaatio arvioitiin käyttämällä Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) 6.8:aa [47]. Eritettyjä proteiineja rikastettiin edelleen käyttämällä kahta luokkaa: solunulkoinen tila ja patogeneesi DAVID- ja BioCyc [48] -tietokantojen kautta, vastaavasti. Homo sapiens GRCh38.p13:n proteomi ladattiin FASTA-muodossa National Center for Biotechnology Information (NCBI) -tietokannasta [49]. BLASTp:tä käytettiin ennustamaan homologiaa (E-arvo =1e-5) erittyneiden proteiinien ja H. sapiens -proteiinien välillä.

2.2. T-soluepitoopin ennuste

Epitooppien ennustaminen ja valinta ovat ratkaisevia vaiheita moniepitooppien rokotteiden rakentamisessa. MHC I -molekyylit sitovat lyhyitä peptidejä (9–11 aminohappoa), koska yhdestä ketjusta koostuvien MHC I -molekyylien peptidiä sitova rako on suljettu [50]. Vapaasti saatavilla olevaa NetMHCpan-4.1 [51] -ohjelmaa käytettiin CTL-epitooppien ennustamiseen, joka käyttää NNAlign_MA:ta prosenttiluokkien luomiseen MHC I -sitoutumisaffiniteetin ja eluoituneiden ligandien yhdistelmän perusteella. .

Kyselysekvenssin "prosenttisijoitus" määritettiin vertaamalla sen ennustepisteitä asiaankuuluvan MHC:n ennustepisteiden jakaumaan, joka oli laskettu käyttämällä sarjaa satunnaisesti valittuja luontaisia ​​peptidejä. Epitooppeja, joiden prosenttiarvo oli < 0,5 prosenttia, pidettiin vahvoina sitovina, kun taas epitooppeja, joiden prosenttiarvo oli < 2 prosenttia, pidettiin heikkoina sitovina [51].

Vaikka palvelimella voidaan ennustaa jopa 12 supertyypin MHC luokan I epitooppia, käytimme vain A1, A2, A3, A24 ja B7, koska nämä viisi supertyyppiä kattavat 100 prosenttia tärkeimmistä ihmisroduista [42] . Valitsimme vahvat sitojat ja ennustimme niiden antigeenisyyden käyttämällä VaxiJen2.0:aa [45], sitten ennustimme luokan I immunogeenisyyden käyttämällä kansainvälistä epitooppitietokantaa (IEDB) [52], joka käyttää 3-kertaista ristiinvalidointia.

Lopuksi järjestimme epitoopit, jotka olivat sekä antigeenisiä että immunogeenisiä prosenttiluokituksen mukaan, ja valitsimme 15 matalan pistemäärän saavaa epitooppia, kolme kullekin supertyypille ja vähintään yhden jokaiselle kandidaattiproteiinille, paitsi ehdokasproteiinille, jolla ei voinut olla vahvaa CTL:ää sitovaa epitooppia. joka on antigeeninen ja immunogeeninen. Lopuksi IC50-arvot kullekin CTL-epitoopille ennustettiin NetMHC-4.0:sta [53].
Luokan II MHC-molekyylit sitoutuvat antigeenisiin peptideihin, ja HTL voi tunnistaa tuloksena olevan kompleksin. Tyypillisesti antigeeniset peptidit ovat pituudeltaan 12-20 aminohappotähdettä, mutta 13-16 tähteen pituisia peptidejä havaitaan usein [54].

{{0}}meerit olivat M. tuberculosisin yleisimmät MHC II -epitoopit, ja ne on talletettu IEDB:hen. Tämän seurauksena käytimme NetMHCIIpan-4.0 [51,55] ennustaaksemme 15-mer-peptidien sitoutumista ihmisen leukosyyttiantigeeni-DR:hen (HLA-DR), HLADQ:hen, HLA-DP:hen, ja H-2-1-alleeli. Ennuste perustui myös NNAlign{11}}MA:han, jonka prosentuaalinen sijoitus oli < 2 prosenttia ja < 10 prosenttia, jota pidettiin vahvoina ja heikoina sideaineina [51].

Ennustimme myös 15-mer IFN:ää indusoivia epitooppeja ehdokasproteiineille käyttämällä IFNepitope-palvelinta [56], joka käyttää tukivektorikonehybridilähestymistapaa, joka mahdollistaa IFN- --indusoivan peptidin/epitoopin virtuaalisen seulonnan peptidissä. kirjasto, joka koostuu IFN- --indusoituvista ja indusoitumattomista MHC II -sitojista, jotka aktivoivat T-auttajasoluja. Sitten ennustimme IFN:ää indusoivien epitooppien antigeenisyyden [45], ja lopuksi valitsimme 16 kaikkein epävakainta epitooppia, jotka olivat vahvasti MHC-II:ta sitovia, IFN:ää indusoivia ja antigeenisiä.

On tärkeää huomata, että signaalipeptidit poistettiin ehdokasproteiineista ennen epitooppien ennustamista. Tässä tutkimuksessa signaalipeptidit seulottiin käyttämällä SignalP 5:tä.0 [57] ja TargetP2.0 [58].

2.3. Lineaarinen B-soluepitoopin ennuste

Lineaariset B-soluepitoopit (16-meerit) ennustettiin käyttämällä ABCpred [59,60] oletuskynnysarvoa 0,51. Lisäksi ennustustulosten luotettavuuden lisäämiseksi käytimme myös BepiPred 2:ta.{11}} [61] lineaaristen B-soluepitooppien ennustamiseen. Näistä kahdesta ohjelmistosta saadut epitoopit alistettiin edelleen antigeenisyyden ennusteelle käyttämällä VaxiJen2.0:aa [45]. Lopuksi valitsimme kymmenen lineaarista B-soluepitooppia korkeiden ABCpred-pisteiden ja antigeenisyyden perusteella, jolloin kullekin ehdokasproteiinille valittiin vähintään yksi epitooppi.

2.4. Kimeeristen ominaisuuksien omaavan moniepitooppirokoteehdokkaan rakentaminen

Suunniteltu moniepitooppirokote sisältää yhden HBHA:n (hepariinia sitovan hemagglutiniinin) adjuvantin, yhden Pan HLA DR:ää sitovan epitoopin (PADRE), 15 CTL:n, 16 HTL:n, 10 lineaarista B-soluepitooppia ja yhden His×6-tunnisteen (kuva 1). 3). Linkkereitä käytettiin yhdistämään epitooppeja, estämään liitosepitooppien tuotanto ja tehostamaan yksittäisten epitooppien kulkua ja regeneraatiota kimeerisissä rokotteissa [62].

Tämän rokoteehdokkaan rakentamista varten HBHA-adjuvantti (UniProt ID: P9WIP9) sijoitettiin N-päähän ja liitettiin alavirran PADRE:hen EAAAK-linkkerin kautta. Sitten GPGPG-linkkereiden yhdistämät HTL-epitoopit yhdistettiin PADRE:hen. Lisäksi AAY-linkkerin liittämät CTL-epitoopit yhdistettiin HTL-epitooppeihin HEYGAEALERAG-linkkerin kautta, joka myös liittyi CTL-epitooppiyksikköön lineaarisiin B-soluepitooppeihin, jotka oli liitetty käyttämällä KK-linkkereitä. Lopuksi Hisx6-leima kiinnitettiin kimeerisen proteiinin C-päähän.

2.5. Antigeenisyys, allergeenisuus ja fysikaalis-kemialliset ominaisuudet

Useita epitooppeja sisältävän rokotteen ja kahdeksan komponenttiproteiinin antigeenisyyden ennusti VaxiJen 2.0 -palvelin [45], kun taas näiden proteiinien allergeenisuuden ennusti AllerTOP 2.0 -palvelin [ 63]. AllerTOP 2.0 käyttää aminohappojen E-kuvaajia, proteiinisekvenssien ACC-transformaatiota ja k-lähimpiä naapureita (kNN) allergeenien luokittelussa.

Menetelmällä saavutettiin 85,3 prosentin tarkkuus 5-kertaisella ristiinvalidaatiolla. Tämän usean epitooppirokotteen fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien, kuten puoliintumisajan, isoelektrisen pisteen, epästabiilisuusindeksin, alifaattisen indeksin ja hydropaattisuuden suuren keskiarvon (GRAVY) ennustamiseen käytettiin ExPASy ProtParam -palvelinta [64].
Lisäksi moniepitooppirokotepeptidin liukoisuus arvioitiin käyttämällä proteinSol (PROSO II) -palvelinta [65], joka perustui luokittimeen, joka hyödyntää hienovaraisia ​​eroja TargetDB:n hyvin tunnettujen liukenemattomien proteiinien ja sekä TargetDB:n että PDB:n liukenevien proteiinien välillä. 66]. Kun arvioitiin käyttämällä 10-kertaista ristiinvalidointia, se saavutti 71.0 prosentin tarkkuuden (ROC-käyrän alla oleva alue=0,785).

2.6. Immuunijärjestelmän simulointi

Immuunivasteprofiilin ja rokotteen immunogeenisyyden karakterisoimiseksi suoritettiin in silico -immuunisimulaatioita käyttämällä C-ImmSim-palvelinta [67]. C-ImmSim ennustaa immuunivuorovaikutuksia käyttämällä paikkaspesifisiä pisteytysmatriiseja, jotka on johdettu koneoppimistekniikoista peptidien ennustamiseen.
Se simuloi samanaikaisesti kolmea osastoa, jotka edustavat kolmea erillistä anatomista aluetta, joita löytyy nisäkkäistä: (i) luuydintä, jossa hematopoieettisia kantasoluja simuloitiin tuottamaan uusia lymfosyyttejä ja myeloidisoluja; (ii) kateenkorva, jossa naiivit T-solut valittiin autoimmuniteetin välttämiseksi; ja (iii) imusolmukkeet, kuten imusolmukkeet.

Rokotteen tehostamiseksi ja tehostamiseksi noudatimme lähestymistapaa [68], jossa annettiin kaksi injektiota neljän viikon välein. Kaikki simulointiparametrit asetettiin oletusarvoihin, aikaaskeleen ollessa 10 ja 94 (jokainen aikavaihe on kahdeksan tuntia).

2.7. Epäonnistunut alueen ennuste

Sisäisesti häiriintyneitä alueita (IDR:t) on läsnä monissa proteiineissa. Epäjärjestynyt alue ennustettiin käyttämällä DISOPRED3:a [69], joka käyttää DISOPRED2:ta ja kahta muuta koneoppimiseen perustuvaa moduulia, jotka on koulutettu suurilla IDR:illä tunnistamaan häiriintyneitä jäämiä. Ne olivat silloin anno

2.8. Toissijaisen ja tertiäärisen rakenteen ennustaminen

Suunnitellun rokotteen toissijaisen rakenteen ennusti PSIPRED 4.0 -palvelin [70], joka käyttää ensin PSI-BLASTia tunnistaakseen sekvenssit, jotka liittyvät läheisesti kyselyproteiiniin. Tämän rokotteen tertiäärinen rakenne ennustettiin käyttämällä Iterative Threading Assembly Refinement (I-TASSER) -palvelinta [71].

ITASSER-mallinnuksessa on neljä avainvaihetta; a) ketjutusmallin tunnistus; b) iteratiivinen rakennekokoonpanosimulaatio; c) mallin valinta ja hiominen; ja d) rakenteeseen perustuva toiminnallinen annotaatio [72,73].

I-TASSER loi viisi mallia, jotka seulottiin ProSA-webin avulla [74] ja malli, jolla oli pienin Z-pistemäärä, valittiin jatkojalostettaviksi. ProSA-web vertaa mallipisteitä, jotka on saatu kokeellisesti varmennetuista rakenteista, jotka on tallennettu PDB:hen. Paikallinen laatupistekaavio auttaa tunnistamaan ongelmalliset alueet mallissa, ja samat pisteet esitettiin värikoodilla 3D-rakenteen esittelyssä. Tämä on hyödyllistä varhaisessa rakenteen määrittämisessä ja tarkentamisessa.

2.9. Tertiäärisen rakenteen hienosäätö

ITASSERin hankkima "karkea" 3D-malli rokoteehdokkaasta jalostettiin kahdessa vaiheessa käyttämällä kahta palvelinta; ensin ModRefiner [75] ja sen jälkeen GalaxyRefine [76]. ModRefiner käyttää C-jälkiä vaikuttaakseen kaksivaiheisella atomitason energian minimoimalla saatujen proteiinien rakenteeseen ja jalostukseen.

Ensin C-jäljistä rakennettiin pääketju, jota seurasi sivuketjun rotameerien ja runkoatomien jalostaminen fysiikka- ja tietopohjaisten yhdistelmävoimakenttien avulla. GalaxyRefine käyttää useita malleja luotettavien ydinrakenteiden luomiseen, kun taas epäluotettavat silmukat tai terminaalit luotiin optimointiin perustuvalla mallinnuksella.

2.10. Tertiäärisen rakenteen validointi

Rokotekandidaatin hienostunut rakenne validoitiin PROCHECK [77]- ja MolProbity [78] -tietokannoista luoduilla Ramachandran-kaavioilla. Ramachandran-kaaviot arvioivat proteiinien rungon konformaatiota jakamalla aminohappotähteet kahteen alueeseen: sallittuun ja kiellettyyn. PROCHECK käyttää stereokemiaa arvioidakseen proteiinirakenteiden nettolaatua vertaamalla niitä samalla resoluutiolla oleviin jalostettuihin rakenteisiin ja esittämällä sitten lisäanalyysiä vaativat alueet.

Molprobity validoi paikallisia ja globaaleja makromolekyylimalleja (proteiinit ja nukleiinihapot) röntgen-, NMR-, laskennallisten ja kryoEM-kriteerien yhdistelmällä [79]. Tehoa ja herkkyyttä vedyn sijoittelun ja kaikkien atomien kosketusanalyysin optimoimiseksi käytetään laajalti kovalenttisen geometrian ja vääntökulman kriteerien päivitetyssä versiossa [80].

2.11. Epäjatkuvat B-soluepitoopit

Epäjatkuvat B-soluepitoopit natiivissa proteiinirakenteessa ennustettiin käyttämällä ElliProa [81]. ElliPro toteuttaa kolme algoritmia arvioidakseen proteiinin muotoa ellipsoidina, laskee jäännösulokeindeksin (PI) ja klusteroi viereiset tähteet niiden PI-arvojen perusteella. ElliPro tarjoaa jokaiselle ulostuloepitoopille pistemäärän, joka kuvataan epitooppitähteen keskimääräisenä PI-arvona. Ellipsoidi, jonka PI-arvo on 0,9, koostuu 90 prosentista sen sisältämistä proteiinitähteistä, kun taas loput 10 prosenttia tähteistä on ellipsoidin ulkopuolella. Jokaiselle epitooppitähteelle PI-arvo lasketaan suurimman mahdollisen ellipsoidin ulkopuolella olevan tähteen massakeskipisteestä.

2.12. Kimeeristen proteiinien molekyylitelakka

Suunnitellun rokotteen (ligandin) molekyylitelakka Toll-Like Receptor-4 (TLR4) (PDB ID: 3FXI) immuunireseptorilla suoritettiin Patchdockilla [82]. 10 parasta mallia jalostettiin sitten FireDockin avulla [83]. PatchDock korvaa molekyylien Connolly-pistepinnan esityksen koverilla, kuperilla ja litteillä laastareilla.

Mallit pisteytettiin sitten geometrisen sovituksen ja atomien desolvaation perusteella. [82]. FireDock optimoi sivuketjujen konformaatiot ja jäykän kappaleen suunnan ja tuottaa 3D-jalostetun kompleksin, joka perustuu sitoutumisenergiaan [83]. Valitsimme telakointikompleksiksi ensimmäisen globaaliin energiaan perustuvan Firedockin mallin. Lopuksi sitoutumisenergia- ja dissosiaatiosisältö telakointikompleksissa ennustettiin PRODIGY-palvelimella [84].

2.13. Molekyylidynamiikan simulointi

Molekyylidynaamisia simulaatioita suoritettiin proteiineille käyttämällä nopeaa ja vapaasti saatavilla olevaa verkkopalvelinta, sisäisten koordinaattien normaalimoodianalyysipalvelinta (iMODS) [85], ja johdonmukaiset ja optimaaliset telakointitulokset saatiin PatchDock-FireDock-palvelimelta. Normaalimoodin analyysi (NMA) luo sisäisissä koordinaateissa makromolekyylien toiminnalle kriittisiä kollektiivisia liikkeitä. iMODS esittelee mekanismeja näiden tilojen tutkimiseen, kuten värähtelyanalyysiin, liikeanimaatioihin ja lentoratojen morfointiin, jotka suoritettiin lähes interaktiivisesti eri resoluutioilla [85].

2.14. Käänteinen translaatio, kodonin optimointi ja rokotteen kloonaus in silico

Rokoteehdokkaan ekspressoimiseksi tehokkaasti Escherichia coli -soluissa cDNA luotiin in silico kodonioptimoinnin ja käänteisen translaation avulla käyttämällä Java Codon Adaptation Tool (JCAT) -työkalua [86].

Optimointiin sisältyi (i) rho-riippumattomien transkription terminaattorien välttäminen, ii) prokaryoottisten ribosomien sitoutumiskohtien välttäminen, (iii) restriktioentsyymien NcoI ja XhoI katkaisukohdan välttäminen, joka toimii N-terminaalisina ja C-terminaalisina restriktiokohtina cDNA:n liittämistä varten. rokotteen mallipohja, ja (iv) vain osittainen optimointi kohdennetun mutageneesin soveltamiseksi. Kodonin adaptaatioindeksi (CAI) ja GC-sisältö ennustivat cDNA:n laadun opaalipysäytyskodonilla (TGA), joka oli lisätty His×6-tunnisteen jälkeen. Sitten kimeerisen rokoteehdokkaan optimoitu DNA-fragmentti integroitiin pET-28a(plus) käänteisjuosteeseen SnapGene-työkalulla [87].

For more information:1950477648nn@gmail.com