Immuunigeenin ilmentyminen ja toiminnalliset verkot erillisissä lupus-nefriittiluokissa Ⅰ

ABSTRAKTI

Tavoite Tutkia NanoString-alustan hyödyllisyyttäselvittää munuaistaimmuunitranskriptit luokan III, IV ja V lupus nefriittiä (LN) varten käyttäen retrospektiivistä kohorttiaformaliinikiinnitetty parafiini-upotettu(FFPE) munuaisbiopsiakudos.

Menetelmät: Immuunigeenin transkriptianalyysi suoritettiin käyttämällä NanoString nCounter -alustaa RNA:lle LN:stä (n=55), ohuesta tyvikalvosta (TBM) (n=14) ja kalvonefropatiasta (MN) (n{) {2}}) FFPEmunuaisbiopsiakudosta. LN-näytteet koostuivat yksittäisistä luokan III (n=11), IV (n=23) ja V (n=21) biopsioista, joissa ei ollut sekavaurioita. Differentiaalinen geeniekspressio suoritettiin NanoString nSolverilla, visualisoimalla tulivuoren tontteja ja lämpökarttoja, jotka luotiin R:ssä. Merkittäviä transkriptejä tutkittiin funktionaalisten verkkojen tunnistamiseksi käyttämällä STRING- ja Gene-ontogeniatermejä.

NAPSAUTA TÄSTÄ SAADAksesi yrttiseoksen Cistanchelle munuaisille

Tulokset Verrattuna TBM:ään tunnistimme 52 merkitsevästi eri tavalla ilmentynyttä geeniä, jotka ovat yhteisiä kaikille kolmelle LN-luokalle. Reittianalyysi osoitti tyypin I interferonin (IFN) signalointi-, komplementti- ja MHC II -reittien rikastumista, ja useimmat osoittivat korkeimman ilmentymisen luokan IV LN:ssä. Luokan IV LN-biopsiamme osoittivat myös merkittävää NF-KB-signaloinnin ja immunologisen rikastumisen lisääntymistä verrattuna luokan V LN-biopsioihin. Tyypin I IFN-reitin transkriptit erottivat luokan V LN:n MN:stä.

Johtopäätös Koko munuaisosan transkriptominen analyysimme antoi käsityksen luokan III, IV ja V LN:n molekyyliprofiilista. Tiedot korostivat tärkeitä polkuja, jotka ovat yhteisiä kaikille kolmelle luokalle, ja reittejä, joita oli rikastettu luokan IV LN-biopsioissamme. Kyky paljastaa LN:n molekyylireittejä käyttämällä FFPE:n kokonaisia ​​biopsialeikkeitä voisi olla kliinistä hyötyä LN:n hoidon valinnassa.

JOHDANTO

Lupus-nefriitti(LN) on tärkeä ilmentymä systeemisestälupus erythematosus(SLE) ja kehittyy noin 40 %:lla potilaista.1 Sen esiintyvyyteen vaikuttavat ikä (suurempi lapsuudessa alkaneessa SLE:ssä) ja etnisyys (korkeampi ei-valkoihoisilla potilailla), ja se liittyy käänteisesti sosioekonomiseen asemaan.2munuaisbiopsiaon tärkeä osa LN3 4:n hallintaa, ja biopsiassa havaitut muutokset on pyritty yhdistämään patogeneesiin, hoidon valintaan ja ennusteeseen.1 Tämän kannalta kriittistä oli LN-luokitusjärjestelmän kehittäminen, joka sisälsi biopsiavaurioiden standardoidut määritelmät raportoinnin välisen vaihtelun vähentämiseksi.

International Society of Nephrology/Renal Pathology Society (ISN/RPS) vuoden 2003 konsensusluokitus LN5:lle kuvaili kuusi luokkaa: minimaalinen mesangiaalinen LN (luokka I); mesangiaalinen proliferatiivinen LN (luokka II); fokaalinen LN (luokka III); diffuusi LN, joka voitaisiin edelleen jakaa diffuusi segmentaaliseen (luokka IV-S) ja diffuusiin globaaliin (luokka IV-G) proliferatiiviseen LN:ään; kalvomainen LN (luokka V) ja pitkälle edennyt sklerosoiva LN (luokka VI). Aktiiviset (A, esim. endokapillaarinen hypersellulaarisuus, fibrinoidinekroosi, solu- ja mikrosolukuutiot) ja krooniset (C, esim. glomerulaarinen skleroosi, sidekudospuoliset) glomerulaariset vauriot määriteltiin ja merkittiin myös luokkia III ja IV kuvattaessa. Esimerkiksi luokka IV-G (A) kuvasi diffuusia globaalia proliferatiivista LN:tä, jossa oli aktiivisia vaurioita. Tähän luokitukseen on ehdotettu päivitystä.6 Suositukset sisälsivät luokkien IV-S ja IV-G alajaottelun poistamisen, koska ne eivät vaikuta lopputulokseen. Meta-analyysissä jommankumman esiintyminenloppuvaiheen munuaissairaustaiseerumin kreatiniinin kaksinkertaistumineneivät eronneet IV-S- ja IV-G-luokkien välillä.7 Lisäksi ehdotettiin, että aktiiviset ja krooniset kuvaajat korvattaisiin aktiivisuus- ja kroonisuusindekseillä, jotka on johdettu NIH lupus -aktiivisuudesta ja pisteytysjärjestelmästä8, mikä mahdollistaa aktiivisuuden kvantitatiivisen arvioinnin (a pisteet 0 - 24) ja kroonisuus (pistemäärä 0 - 12).

LN-luokka on kriittinen hoidon tiedottamisen kannalta.3 Immunosuppressiota suositellaan aktiivisen luokan III ja IV LN:ssä, mutta ei luokan II LN:ssä. Päätökseen käynnistää immunosuppressio luokan V LN:ssä vaikuttaa proteinurian aste ja sen vaste reniini-angiotensiini-aldosteronisalpaukseen. Jos proteinuriaa ei saada hallintaan 12 kuukautta hoidon jälkeen, se liittyy kroonisen munuaissairauden etenemiseen9–11, joten hoidon tavoitteena on vähentää proteinuriaa täydelliseen kliiniseen vasteeseen (<0.5–0.7 g per 24 hours).

Pelkästään LN-luokka on vähemmän vankka tulosten ilmoittamisessa, koskariskitekijöitä kroonisen munuaissairauden kehittymisellesisältääkliiniset ominaisuudetja koska ne sisältävät histologisia piirteitä, joita LN-luokkamääritykset eivät kaappaa. Näitä ovat interstitiaalisen fibroosin ja tubulaarisen atrofian (IFTA) aste ja spesifiset glomerulaariset vauriot, kuten fibrinoidinekroosi ja kuitupuoliset puolikuut.12 Valittujen ja tarkasti määriteltyjen yksittäisten munuaisvaurioiden kvantifiointi voi auttaa ennustamaan ennustetta. Tämä on ilmeistä IgA-nefropatiassa, jossa mesangiaalisen solun, endokapillaarin hypersellulaarisuuden, segmentaalisen skleroosin, tubulaarisen atrofian, interstitiaalisen fibroosin ja puolikuun pisteytyksen MEST-C-pistemäärän muodostamiseksi on osoitettu auttavan riskin ennustamista.13–15 Ehdotetut muutokset ISN:ään. /RPS 2003 LN:n konsensusluokitus saattaa korjata nämä puutteet6, mutta se perustuu silti morfologian käyttöön. Tästä syystä on tarpeen tutkia LN-biopsioiden molekyylireittejä ja ymmärtää, kuinka ne liittyvät LN-luokkiin16 17 ja hoitotuloksiin.18 19 Kliinisen hyödyn kannalta munuaisbiopsioiden transkriptominen analyysi on tärkeintä. edistynyt vasta-ainevälitteisen munuaisten hyljintäreaktion diagnosoinnissa, jossa geenitranskriptien ilmentymisen lisääntyminen biopsiakudoksessa on validointia odotettaessa lisätty validoituihin morfologisiin kriteereihin.20 Sen määrittämiseksi, onko transkriptiotietoa hyödynnettävä munuaisten kliinisen hyödyn parantamisessa. biopsia SLE:ssä, käytimme NanoString-teknologiaa tutkiaksemme 750 immuunijärjestelmään ja tulehdukseen liittyvän transkriptin ilmentymistä formaliinilla kiinnitetyissä parafiiniin upotetuissa (FFPE) osissa 55 LN-biopsiasta, 14 biopsiasta ohuesta tyvikalvosta (TBM) ja 9 biopsiasta kalvonefropatia (MN).

MENETELMÄT

Näytteet: FFPE-munuaisbiopsiakudosta saatiin arkistoiduista LN-, TBM- ja MN-näytteistä, jotka olivat ylijäämäisiä kliiniseen käyttöön ja kun riittävästi kudosta oli saatavilla analysoitavaksi. Lupus-biopsiat, joissa oli joko sekavaurioita tai merkittäviä arpia, jätettiin pois. TBM:ää käytettiin taudin torjuntaan, koska normaaleja munuaisbiopsioita ei ollut saatavilla. Kliiniset parametrit kerättiin terveyskertomuksista takautuvasti. Interferoni (IFN) -pistematriisi saatiin, kuten aiemmin on raportoitu.21 Täydellinen vaste määriteltiin virtsan proteiini/kreatiniinisuhteeksi (uPCR).<50mg/mmol and an estimated glomerular filtration rate (eGFR) of ≥60mL/min, or if <60mL/min at baseline not fallen by >20% 1 vuoden kuluttua biopsian jälkeen. Osittainen vaste määriteltiin uPCR:ksi<300mg/mmol with a≥50% improvement from baseline and eGFR criteria the same as for complete response. Non-response was defined as failing to achieve partial response by 1 year.

RNA:n uuttaminen

Jokaisesta FFPE-lohkosta saatiin mikrotomilla kuusi 10 μm paksua koko kudosleikkaa kahden 4 μm:n leikkeen poistamisen jälkeen. Ristikontaminaation estämiseksi laitteet puhdistettiin RNase Awaylla näytteiden välillä ja jokaiselle näytteelle käytettiin uutta terää. Koko kudoksen RNA:n eristys suoritettiin samana päivänä käyttämällä RNeasy FFPE Kit -sarjaa (Qiagen, #73504) ja RNA-pitoisuus arvioitiin NanoDrop ND1000 -spektrofotometrillä (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA; online-lisätiedot S1).

Transkriptioanalyysi

Transcriptome analysis was performed using 100ng of total RNA on the NanoString nCounter platform (NanoString nCounter FLEX Dx analysis system, NanoString Technologies, Seattle, Washington, USA) with a probe CodeSet comprising the human PanCancer immune profiling panel (730 immune-related genes, 40 housekeeping genes, 6 positive control genes, 8 negative control genes) and additional 20 custom probes selected based on literature review (online supplemental table 1). Samples were run using two CodeSets which differed only by 10 unique probes, enabling us to analyze 750 endogenous transcripts across the 78 samples. CodeSet One: LN class III (n=6), class IV (n=9), class V (n=8), TBM (n=8), MN (n=1). CodeSet Two: LN class III (n=5), class IV (n=14), class V (n=13), TBM (n=6), MN (n=8). All samples passed NanoString quality control parameters (image quality control, binding density, positive control linearity and limit of detection). To control for inter-CodeSet variation and batch variability we used the nSolver Cross Reporter Library File (RLF) function to calibrate raw counts of overlapping probes using an identical sample run on both CodeSets. To reduce technical bias, and increase confidence and reproducibility, background thresholding was set at 100 counts, which is >kaksinkertainen (keskiarvo+2 SD) negatiivisten kontrollikoettimien määrä. Lukumäärät normalisoitiin 10 taloudenhoitogeenin (FCF1, HPRT1, MRPS5, MTMR14, POLR2A, PRPF38A, SDHA, SF3A3, TUBB ja ZC3H14) geometriseen keskiarvoon, jotka valittiin sellaisina kuin ne ilmentyivät kaikissa näytetyypeissä. Kaikkien näytteiden normalisoidut lukemat on lueteltu online-lisätiedoissa S2.

Tilastollinen analyysi

Differentiaalinen geeniekspressio (DGE) suoritettiin käyttämällä Solver Advanced Analysis (V.4) Fast/Approxi mate -algoritmia, joka käyttää yksinkertaistettua negatiivista binomiaalimallia kaikille koettimille paitsi silloin, kun algoritmi ei konvergoi ja käytetään lineaarista regressiomenetelmää. LN, MN tai LN-luokka (III, IV ja V) käytettiin riippumattomina muuttujina ja TBM vertailuryhmänä. Kynnysmääräksi asetettiin 100 ja havainnointitiheydeksi näytteiden sisällä 8 %; P-arvoa säädettiin Benjamini-Hochberg-menetelmällä väärän havaitsemisen kynnysarvolla 0.05. Tulivuorikaaviot tuotettiin käyttämällä Enhanced Volcano -pakettia (https://github.com/kevinblighe/EnhancedVolcano) R.22:ssa. Functional protein-assosiation network visualisointi suoritettiin käyttämällä STRING-tietokantaa (https://string-db.org/). , käyttäen koko STRING verkkoa. Verkon reunat määritettiin luotettavuuden perusteella, ja vuorovaikutuksille asetettiin korkein luottamusvuorovaikutuspiste (Suurempi tai yhtä suuri kuin 0,9). Verkkojen katkaistuja solmuja ei näytetä. Merkittäviä eri tavalla ilmentyneitä geenejä arvioitiin geeniontologian (GO) termien (biologiset prosessit, molekyylifunktiot, solukomponentti), reaktomireittien ja STRING paikallisverkkoklusterien rikastamisen suhteen. Visuaaliset vuorovaikutusverkostot luotiin toiminnallisilla rikastuksilla GO-termeillä (biologiset prosessit) ja STRING-analyysillä. Pinta-alasuhteinen Venn-kaavio LN-alaluokkien päällekkäisistä differentiaalisesti ilmentyneistä geeneistä luotiin BioVennillä (www.biovenn. nl).23 Edistyneen analyysin ratkaisijaohjelmiston tiedot luettiin R-tilastoympäristöön ja datan visualisointi suoritettiin käyttämällä boxploteja, pääkomponenttianalyysiä, tulivuoren tontit ja lämpökartat. Lämpökartat luotiin käyttämällä Z-pisteitä normalisoiduista lukemista ja pheatmap:sta R:ssä. Klusterit analysoitiin käyttämällä Fisherin tarkkaa testiä. Useiden ryhmien vertailuun käytettiin varianssianalyysiä Sidakin monivertailutestillä. Tiedot analysoitiin käyttämällä GraphPad Prismia (V.8.0).

Potilaan ja julkisen osallistumisen (PPI) lausunto

Tämä tutkimus oli osa MASTERPLANS-konsortiota, ja potilasyhteistyökumppanit osallistuivat jokaiseen työn osaan, mukaan lukien tämä tutkimus. PPI on tuottanut termien sanaston mahdollistaakseen yhteydenpidon laajemman potilasyhteisön kanssa, ja tutkimustulokset sisällytettiin maallikoiden arviointipäiviin. Julkaisujen arvostelut jaetaan MASTERPLANS-verkkosivustolla (https://sites. manchester.ac.uk/masterplans).

Wecistanchen tukipalvelu - Kiinan suurin vesisäiliön viejä:

Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Puhelin:+86 15292862950

Osta lisätietoja teknisistä tiedoista:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

SAAT LUONNOLLINEN ORGAANIINEN KISTANSSIUUTE, JOISSA 25 % KIINAKOOSIDEA JA 9 % AKTEOSIDIA MUUNAISILLE