Maapähkinänkuoresta eristettyjen bioaktiivisten yhdisteiden ihoa valkaisevat ja ryppyjä ehkäisevät vaikutukset ultraääniavusteisella uutolla

Ota yhteyttä:ali.ma@wecistanche.com

Da Hye Gam 1, Ji Woo Hong 1, Jun Hee Kim 1 ja Jin Woo Kim 1,2,3,*

Abstrakti:Vastepinnan metodologiaa käytettiin optimoimaan ultraääniavusteisen uuton (UAE) olosuhteet riippuvien muuttujien, mukaan lukien DPPH-radikaalinpoistoaktiivisuuden (RSA), tyrosinaasin aktiivisuuden eston (TAI) ja kollagenaasiaktiivisuuden eston (CAI) maapähkinänkuoriuutteiden samanaikaista optimointia varten. Päämuuttujien vaikutukset mukaan lukien uuttoaika (5.0~55.0 min, X1), uuttolämpötila (26.0~94.0 ◦C , X2) ja etanolipitoisuus (0.0 prosenttia ~99,5 prosenttia ,X3) optimoitiin. Jokaisen ehdon kokeellisten arvojen perusteella johdettiin neliöllinen regressiomalli optimiolosuhteiden ennustamiseksi. Riippumattoman muuttujan determinaatiokerroin (R2) oli välillä 0,89~0,96, mikä osoittaa, että regressiomalli sopii ennustukseen. Ennustettaessa optimaalisia Yhdistyneiden arabiemiirikuntien olosuhteita päällekkäisyysmenetelmän perusteella tunnistettiin uuttoaika 31,2 minuuttia, uuttolämpötila 36,6 ◦C ja etanolipitoisuus 93,2 prosenttia. Näissä olosuhteissa RSA:ksi ennustettiin 74,9 prosenttia, TAI:ksi 50,6 prosenttia ja CAI:ksi 86,8 prosenttia, mikä osoitti hyvää yhtäpitävyyttä kokeellisten arvojen kanssa. Käänteistranskriptiopolymeraasiketjureaktio osoitti, että maapähkinänkuoriuute alensi mRNA-tasojatyrosinaasiliittyvät proteiini-1 ja matriksin metalloproteinaasi-3 -geenit B16-F0-soluissa. Siksi tunnistimmeihon valkaisuunja maapähkinänkuoriuutteiden ryppyjä ehkäisevät vaikutukset proteiinien ja geenien ilmentymistasoilla, ja tulokset osoittavat, että maapähkinän kuori on tehokas kosmeettinen materiaaliihon valkaisuunja ryppyjä estäviä vaikutuksia. Tämän tutkimuksen perusteella sivutuotteena pidettyä maapähkinän kuorta voidaan käyttää terveellisten elintarvikkeiden, lääkkeiden ja kosmetiikan kehittämiseen.

Avainsanat:maapähkinän kuori; optimointi;ihon valkaisuun; Rypistymisen esto; antioksidantti;tyrosinaasi; kollagenaasi; ihmisen tyrosinaasiin liittyvä proteiini-1 (TRP-1); matriisin metalloproteinaasi (MMP)

Klikkaa orgaaniseen käyttööncistanche valkaisevia ihonhoitotuotteita.

1. Esittely

Melaniini on ruskean tai mustan värinen polymeeripigmentti, joka syntetisoituu orvaskeden melanosyyttien melanosomeista. Sen päätehtävä on estää ultraviolettisäteitä (UV) ihon suojaamiseksi. Vaihtoehtoisesti sen liiallinen tuotanto voi aiheuttaa pigmentin tummumista, kuten melasmaa, luomia ja ikääntymistä [1–3]. Tyrosinaasi on tärkeä entsyymi, joka katalysoi autohapetus- ja polymerisaatioreaktioita, joiden kautta tyrosiini muuttuu dopakinoniksi dihydroksifenyylialaniinin kautta ja tuottaa melaniinia dopakromedoivan melaniinin biosynteesin kautta [4]. Siten sitä käytetään laajalti melaniinin tuotannon vähentämiseen tai heikentämiseen estämällätyrosinaasitoimintaa kosmetiikan valkaisevan vaikutuksen lisäämiseksi [5]. Nopea teollistuminen ja lisääntynyt kloorifluorihiilivetyjen käyttö vaurioittivat vakavasti maan suojaavaa otsonikerrosta, mikä johti siihen, että suurempi määrä UV-säteilyä pääsi maahan ja paljastaa ihon. Tämä UV-säteilyn lisääntyminen indusoi siten reaktiivisten happilajien (ROS) aktiivista muodostumista ihmiskehossa, kuten superoksidianioneja, vetyperoksideja ja hydroksyyliradikaaleja. Tällaiset lajit ovat edistäneet tyrosiinin jatkuvaa hapettumista, mikä on johtanut lisääntyneeseen melaniinin tuotantoon. Tältä osin tutkimuksia tehdään aktiivisesti estämistätyrosinaasitoimintaa sekä ROS:n poistamista kehittääkseenihon valkaisuunaineet [6]. Kollageeni on tärkeä solunulkoinen matriisi, joka käsittää 90 prosenttia ihosta. Kollageeni suojaa ihoa ja antaa sille elastisuutta ja osallistuu ihon mekaaniseen jäykkyyteen, vastustuskykyyn, sidekudosten sitoutumiseen sekä solujen lisääntymiseen ja erilaistumiseen [7]. Solunulkoisen matriisin muodostavat proteiinit, kuten kollageeni, hajoavat kollagenaasin, kuten matriisin metalloproteinaasin (MMP) vaikutuksesta, aiheuttaen ryppyjä, vähentäen elastisuutta ja ihon veltostumista [8]. Erilaiset ROS:n ilmentämät MMP:t hydrolysoivat kollageeniketjua, ihon sidekudosta ja synnyttävät sen epänormaalia silloittumista lisäämään kollageenin hajoamista ja nopeuttamaan ryppyjen muodostumista [9]. Tästä syystä melaniinin tuotannon ja kollageenin hajoamisen estäminen vähentämällä ROS-tuotantoa on ollut pääpaino ihon valkaisussa ja ryppyjen ehkäisyssä [10]. Arbutiini, kojiinihappo ja linoleenihappo valkaisevana kosmetiikkana sekä retinoli, gallaatti ja andadenosiini antioksidanttina. -ryppykosmetiikkaa, on käytetty laajasti viime vuosina. Näiden materiaalien käyttö on kuitenkin rajoitettua, koska ne ovat epävakaita valon ja lämmön läsnäollessa sekä haittavaikutuksia, kuten ihoärsytystä ja kosketusihottumaa [11]. Kasvava kiinnostus luonnollisiin antioksidantteihin tavanomaisten valkaisu- ja ryppyjä ehkäisevien ainesosien puutteiden voittamiseksi, kasviperäisiä uutteita on käytetty aktiivisesti bioaktiivisten yhdisteiden kehittämiseksi ihoystävällisiksi ja turvallisiksi.valkaisuja ryppyjä estävät kosmeettiset aineet [12,13].

Bioaktiivisten yhdisteiden uuttamiseen kasveista on tällä hetkellä käytössä erilaisia ​​uuttomenetelmiä. Bioaktiivisten yhdisteiden uuttaminen luonnonlähteistä, erityisesti kasveista, on kuitenkin tehty pääasiassa liuotin-, kuumavesi- ja Soxhlet-uuttomenetelmillä, jotka ovat osoittaneet erilaisia ​​haittoja, kuten alhainen uuttotehokkuus, ainesosien hajoaminen, alhainen stabiilisuus ja korkeat käyttökustannukset. [14]. Näin ollen uuttomenetelmiä on viime aikoina testattu, mukaan lukien ultraääniavusteinen, mikroaaltoavusteinen ja ylikriittinen uutto [15]. Erityisesti ultraääni on ääniaalto, jonka taajuus on noin 20 kHz tai enemmän ja joka johtaa nesteen puristumiseen, kavitaatioon ja harvennukseen, mikä maksimoi molekyylin liikkeen lyhyessä ajassa korkean uuttotehokkuuden saavuttamiseksi [16]. Lisäksi ultraääni on edullinen, koska sen lyhyt uuttoaika minimoi bioaktiivisten yhdisteiden hajoamisen ja se on arvioitu tehokkaaksi menetelmäksi luonnollisten ainesosien uuttamiseen antioksidantilla,valkaisu, ja ryppyjä ehkäiseviä ominaisuuksia monista kasveista ja yrteistä [17]. Uuttoolosuhteiden optimointi on välttämätöntä ultraääniavusteisen uuton (UAE) tehokkuuden lisäämiseksi, ja optimointiprosessi voidaan suorittaa joko kokeellisilla tai tilastollisilla menetelmillä. Perinteinen yksi tekijä kerrallaan -menetelmä, jossa kaikki muuttujat pysyvät vakioina ja muuttuvat. vain yksi tekijä kerrallaan, on rajoituksia vuorovaikutteisten vaikutusten määrittämisessä, jos kyseessä on monimuuttujakoe. Toisaalta RSM tarjoaa tilastotietoja monimuuttujakokeiden muuttujien välisestä korrelaatiosta sekä tehokkaita kokeita, joissa käytetään minimaalista määrää näytteitä, sekä tärkeitä matemaattisia ja tilastollisia tekniikoita regressiomallin tehokkuuden ja sopivuuden arvioimiseksi. Tilastolliseen optimointiin erilaisia ​​RSM-malleja, kuten täystekijäsuunnittelu, Box-Behnken-suunnittelu ja keskuskomposiittisuunnittelu (CCD), on käytetty laajalti. Niistä CCD on erittäin tehokas ja tarjoaa siten paljon tietoa kokeen muuttuvista vaikutuksista ja kokeellisista kokonaisvirheistä vähimmäismäärällä vaadittuja ajoja [18]. Siksi CCD:tä on käytetty monissa olemassa olevissa tutkimuksissa laajasti prosessin kehittämiseen, parantamiseen ja optimointiin. olosuhteet erilaisten antioksidanttien ja muiden aineenvaihduntatuotteiden uuttamiseksi luonnontuotteista.

Maapähkinä (Arachis hypogaea) on palkokasvien perheeseen kuuluva yksivuotinen kasvi. Sitä kasvatetaan yli 50 maassa ympäri maailmaa, mukaan lukien Etelä-Korea, Intia, Kiina ja Yhdysvallat [19]. Maapähkinät ovat runsaasti proteiinin (25 prosenttia), lipidien (47 prosenttia) ja hiilihydraattien (16 prosenttia) lähteitä sekä mineraaleja, vitamiineja, niasiinia, tyydyttymättömiä rasvahappoja ja andolihappoja [20]. Niitä kulutetaan joko jalostamattomina tai prosessoituina tuotteina, mukaan lukien pähkinä, voi ja ruokaöljy. Maailman maapähkinöiden vuotuisen tuotannon arvioidaan olevan yhteensä 4,1 miljoonaa tonnia ja maapähkinän kuoren osuus maapähkinän kokonaispainosta on 35–40 prosenttia [21]. On arvioitu, että yli 1,5 miljoonaa tonnia maapähkinänkuoria hävitetään vuosittain sivutuotteina. Ottaen kuitenkin huomioon, että vain osa maapähkinänkuorista käytetään eläinten rehuna ja että suurin osa niistä poltetaan tai sijoitetaan kaatopaikalle, mikä aiheuttaa hävityskustannuksia ja ympäristöongelmia, on välttämätöntä tuottaa korkean lisäarvon omaavia materiaaleja maapähkinän kuorista sivutuoteongelman ratkaisemiseksi [22] ]. Aiemmat tutkimukset antioksidanteista ovat osoittaneet, että maapähkinän ihouutteiden anti-inflammatorisia ja liikalihavuutta ehkäiseviä vaikutuksia on raportoitu [23,24]. Toistaiseksi ei kuitenkaan ole tutkittu toiminnallisten kosmeettisten materiaalien valmistusta parantamista vartenvalkaisuja ryppyjä estäviä vaikutuksia käyttämällä maapähkinänkuorista peräisin olevia bioaktiivisia yhdisteitä. Siksi tässä tutkimuksessa uutettiin bioaktiivisia yhdisteitä maapähkinän kuoresta käyttämällä ultraääni-avusteista uuttoa (UAE) niiden hapettumisenesto-, valkaisu- ja ryppyjä ehkäisevien vaikutusten vahvistamiseksi, ja lisäksi se esitti optimaalisen Yhdistyneiden arabiemiirikuntien tilan vastepintamenetelmällä (RSM) ja lisäsi uutteiden toimivuutta. varmistaakseen sen käytön elintarvikkeina, kosmetiikka- ja lääkeaineina.

2. Tulokset ja keskustelu

2.1. RSM-mallien sovitus

Tässä työssä uuttolämpötila, uuttoaika ja etanolipitoisuus valittiin CCD:n päämuuttujiksi käyttämällä alustavaa yksi tekijä kerrallaan -koetta määrittääkseen UAE:iin vaikuttavat merkittävät muuttujat (taulukko 1).

Sitten rakennettiin 17 koeajoa, mukaan lukien 3 toistoa keskipisteessä käyttämällä 3-muuttujia ja 5-tason CCD:tä. Kokeelliset virheet minimoitiin satunnaisttamalla koejärjestys selittämättömän vaihtelun vaikutuksen minimoimiseksi. DPPH-radikaalinpoistoaktiivisuuden (RSA) kokeelliset ja ennustetut tulokset,tyrosinaasiaktiivisuuden esto (TAI) ja kollagenaasiaktiivisuuden esto (CAI) on esitetty taulukossa 2.

CCD-koeolosuhteiden 17 kokeellisen ajon ja koetulosten välisen korrelaation määrittämiseksi ehdotettiin useita regressiomalleja näiden kolmen muuttujan optimitason ennustamiseksi. Soveltamalla moninkertaista regressioanalyysiä koetietoihin riippuvat muuttujat (Y) ja testatut muuttujat suhteutettiin seuraavilla toisen asteen regressioyhtälöillä (taulukko 3).

Varianssianalyysi (ANOVA) on tilastollinen testi kokeellisten tietojen analysointiin. Se jakaa tietojoukon kokonaisvaihtelun komponenttiosiin, jotka liittyvät tiettyihin vaihtelulähteisiin, jotta voidaan testata hypoteesia mallin muuttujista tai arvioida varianssikomponentteja [25]. Vastepinta-analyysiä ja ANOVAa käytettiin kertoimien määrittämiseen, mallitermien tilastollisen merkitsevyyden arvioimiseen ja kokeellisten tietojen matemaattisten mallien sovittamiseen, joilla pyrittiin optimoimaan vastemuuttujien kokonaisalue [26]. Mallin mukaan korrelaatiokertoimet (R2), joita käytettiin määrittämään kokeellisten ja ennustettujen vasteiden välinen suhde regressiomallien avulla, olivat välillä 0,8862-0,9622. Tämä viittaa siihen, että analysoidut prosessimuuttujat selittävät yli 88,6 prosenttia riippumattomista muuttujista. Design-Expert-ohjelmistolla laskettiin toisen asteen regressioyhtälöiden kertoimet ja mallin soveltuvuus testattiin ANOVA:lla. Taulukossa 4 on lueteltu toisen asteen regressioyhtälöiden monomikerroinarvo ja riippumattomien muuttujien tärkeimpien vaikutusten prioriteettijärjestys on etanolipitoisuus (X3) > uuttolämpötila (X2) > uuttoaika (X1).

2.2. Uuttoolosuhteiden vaikutus RSA:han

Taulukossa 2 esitetään RSA:n kokeelliset tiedot eri Arabiemiirikuntien olosuhteissa. Maapähkinänkuoriuutteen RSA määritettiin välillä 7,6-89,9 prosenttia. Suurin RSA tunnistettiin seuraavissa uutto-olosuhteissa: uuttoaika 55.0 min, uuttolämpötila 60.{{10}} ◦C ja etanolipitoisuus 5 °C 0.0 prosenttia (Ajo #10). Alin RSA, 7,6 prosenttia, uuttoajalla 30.0 min, uuttolämpötila 60,0 ◦C ja etanolipitoisuus 0,0 prosenttia tunnistettiin kokeelliseksi arvoksi (ajo #13). . Käyttämällä moninkertaista regressioanalyysiä kokeelliset tiedot ja vastaukset yhdistettiin toisen asteen regressioyhtälöillä (taulukko 3). Tilastollinen analyysi paljasti, että theregressiomallin R2 oli 0,9308 (p=0.0027), mikä osoittaa, että tämä yhtälö voisi selittää 93,0 prosenttia koeolosuhteiden tuloksista, mikä tarkoittaa, että malli oli erittäin merkittävä ja sitä voitiin käyttää ennustamaan tarkasti. vastaustoiminto.

Yksittäisen UAE-muuttujan vaikutus muiden muuttujien kiinteillä tasoilla RSA:han on ennustettu ja esitetty kuvassa 1a. RSA:lla on taipumus kasvaa ja sitten laskea kaikkien UAE-muuttujien kasvaessa. Etanolipitoisuudella oli suurin vaikutus RSA:han kolmesta UAE-muuttujasta, kun taas uuttoaika ja uuttolämpötila vaikuttivat vähiten RSA:han. Tämä tulos on yhdenmukainen ANOVA-tulosten kanssa, joissa etanolipitoisuudet osoittivat merkittävämpää vaikutusta (p=0.0002) RSA:han taulukon 4 mukaisesti. Riippumattomien muuttujien välinen vuorovaikutus RSA:ssa visualisoitiin 3D:llä vasteen pintakäyrät. Uuttolämpötilaa ja uuttoaikaa muutettiin samanaikaisesti kiinteällä etanolipitoisuuden tasolla (kuva 2A). Kun kaksi muuttujaa (uuttolämpötila ja aika) nousivat, RSA nousi maksimitasolle ja laski sitten taas. Korkein RSA saatiin uuttolämpötilassa 56,1 ◦C, mikä viittaa siihen, että antioksidanttipotentiaalia omaavien bioaktiivisten yhdisteiden, kuten polyfenolien, uuttaminen lisääntyy kasvin seinämien, kuten ligniinin, tuhoutuessa jopa 56,1 ◦C:n lämpötiloissa; korkeammissa lämpötiloissa RSA kuitenkin väheni antioksidanttiaineosien hajoamisen tai polymeroitumisen vuoksi. Kuviot 2B, C osoittavat, että uuttoaika tai lämpötila ei vaikuttanut merkittävästi RSA:han, kun taas RSA:han vaikutti merkittävästi etanolipitoisuus, joka oli korkein 61,0 prosentin etanolipitoisuudella ja joka myös laski jälleen. Tämä tulos on yhdenmukainen Kimin et al.:n Lespedeza cuneatan kuumavesiuuttokokeen kanssa. jossa etanolipitoisuus vaikutti RSA:han enemmän kuin uuttolämpötila, ja RSA oli maksimi etanolin pitoisuusalueella 60–70 prosenttia [27]. Nämä tulokset osoittavat, että binäärisen liuottimen (vesi ja etanoli) uuttotehokkuus on tehokkaampi yhden liuotinuuton osalta maapähkinän kuorten UAE:ssa.

2.3. Poistoolosuhteiden vaikutus TAI:hen

Tyrosinaasion entsyymi, joka edistää melaniinin tuotantoa hapettamalla tyrosiinia orvaskeden pohjakerroksessa ja tämän entsyymin estäminen on välttämätöntäihon valkaisuun [28]. The TAI of peanut shell extracted via UAE, according to 17 extraction conditions, ranged from 0.34% to 51.8% (Table 2). Based on experimental values, the relationship between independent variables (X1, X2, X3) and the dependent variable (TAI) was modeled using quadratic regression equations as shown in Table 3. To evaluate the agreement between the experimental and predicted values derived by the quadratic regression models, the goodness-of-fit of the model was evaluated based on ANOVA. The R2 was 0.9622, which is close to 1 and indicates a high degree of correlation between the experimental and predicted values. p-value is used as a tool to evaluate the significance of each coefficient and interactions between each independent variable. The UAE variables will be more significant if the p-value becomes smaller and significance was confirmed at the level of p < 0.05 [29,30]. In evaluating the effects of independent variables, the significance was determined in the order of ethanol concentration (p < 0.0001) >uuttolämpötila (p < {0}},0598) > uuttoaika (p < 0,4329), mikä vahvisti, että etanolipitoisuuden vaikutus oli merkittävin TAI:ssa.

Yhdistyneiden arabiemiirikuntien olosuhteiden vaikutuksen vertaamiseksi TAI:hin häiriökäyrää käytettiin arvioimaan yksittäisten muuttujien vaikutusta TAI:hen kiinnittämällä kaksi muuttujaa keskipisteeseen. Kuten kuvasta 1b näkyy, TAI osoitti erilaisen kuvion edelliseen RSA-kokeeseen verrattuna; se kasvoi etanolipitoisuuden noustessa, kun taas uuttoaika ei merkittävästi vaikuttanut TAI:hen. TAI:n merkittävä suhteellinen kasvu etanolipitoisuuden kanssa voidaan selittää ANOVA-tuloksilla. TAI:aan vaikutti merkittävästi etanolipitoisuuden ensisijainen termi (X3), ja (p < 0.05)="" neliöllinen="" termi="" ei="" ole="" tilastollisesti="" merkitsevä,="" joten="" se="" osoittaa="" vahvan="" suhteellisen="" suhteen="" tai:n="" ja="" etanolipitoisuuden="" välillä.="" 3d-vasteen="" pintakäyrä="" on="" graafinen="" esitys="" neliöllisen="" regressioyhtälön="" ja="" tai:n="" tuloksista,="" joihin="" vaikuttavat="" uuttolämpötila="" (x1),="" uuttoaika="" (x2)="" ja="" etanolipitoisuus="" (x3).="" kuvio="" 3a="" havainnollistaa="" uuttoajan="" ja="" etanolipitoisuuden="" vuorovaikutusta="" tai:hen.="" tulos="" vahvisti,="" että="" uuttoaika="" ei="" osoittanut="" merkittävää="" vaikutusta="" tai:hen,="" kun="" taas="" etanolipitoisuudella="" oli="" vahva="" verrannollinen="" suhde="" tai:han.="" samoin,="" kuten="" kuviossa="" 3b="" esitetään,="" tai="" oli="" enemmän="" riippuvainen="" etanolipitoisuudesta="" kuin="" uuttolämpötilasta="" ja="" suurin="" tai="" saavutettiin,="" kun="" etanolipitoisuus="" nousi="" 99,5="" prosenttiin.="" tutkittaessa="" yhdistyneiden="" arabiemiirikuntien="" olosuhteita="" suurimman="" tai:n="" muodossa="" tai-olosuhteiden="" enimmäisarvoiksi="" ennustettiin="" 3{{20}},0="" min,="" 26,3="" ◦c="" ja="" 99,5="" prosenttia.="" tämä="" tulos="" on="" samanlainen="" kuin="" nakamura="" et="" ai.="" [31]="" sitruunanlehtien="" biologista="" aktiivisuutta="" koskevassa="" tutkimuksessa,="" kun="" uuttoliuottimena="" käytettiin="" 20,0–80,0="" prosenttia="" etanolia,="" tai="" nousi="" suhteessa="" etanolipitoisuuden="" kasvuun="" ja="" osoitti="" maksimiarvon="" uuttamisessa="" käyttämällä="" 80="" prosentin="" etanolia.="" tämä="" viittaa="" siihen,="" että="" korkeamman="" etanolipitoisuuden="" käyttäminen="" on="" edullista="" bioaktiivisten="" yhdisteiden="">ihon valkaisuunpähkinänkuoren tai muiden kasvien vaikutus.

2.4. Poistoolosuhteiden vaikutus CAI:hen

Collagen is the most abundant protein in mammals and the main structural component of the extracellular matrix with gly-pro-hyp repeating units longer than 1400 amino acids. Collagenase is an enzyme that breaks down peptide bonds of collagen that form skin, bones, tendons, and ligaments. The collagen present in the dermis is decomposed by collagenase, which causes skin wrinkles and reduces skin elasticity; therefore, it is necessary to reduce the activity of collagenase to prevent skin wrinkles [32,33]. The optimization of the UAE condition was performed to maximize the CAI of peanut shell extract. A total of 17 runs were needed for optimizing the three individual variables and the experimental data of CAI obtained under experimental sets were 25.2%~92.3% (Table 2). Based on the 17 experimental runs, by applying multiple regression analysis on the experimental data, response and independent variables were related by the following quadratic regression equation in terms of the coded parameters given in Table 3. Then, ANOVA was applied to determine the regression coefficients, statistical significance, and to fit the mathematical models. The mean-square values were calculated by dividing the sum of the squares of each variation source by their degrees of freedom, and a 95% confidence level (α = 0.05) was applied to determine the statistical significance in the analysis of the quadratic model. The ANOVA results confirmed that R2 of the quadratic regression equation was 0.8862 and that the p-value was 0.0134, which is less than the significance level (p < 0.05), thus indicating a good model of fit and statistical significance for predicting CAI values. In the primary term, the X2 and X3 showed significant effects and the interaction effect terms were significant in the X1X2 and X2X3 (p < 0.05). The effect of UAE conditions on CAI production was confirmed to be in the order of: extraction temperature (p = 0.0236) >etanolipitoisuus (p=0.0240) > uuttoaika (p=0.8505), mikä osoittaa, että uuttolämpötilan ja etanolipitoisuuden vaikutus CAI:hen oli merkittävä.

Kuvassa 1c on häiriökäyrä, jossa kaksi muuttujaa on kiinnitetty ja se visualisoi yhden muuttujan vaikutuksen CAI:hen. Kaikkien kolmen muuttujan vaikutusten CAI:hen osoitettiin olevan samanlaisia, ja kolmella muuttujalla oli merkittäviä vaikutuksia ja ne lisäsivät ja myöhemmin laskivat CAI:ta kunkin riippumattoman muuttujan kasvaessa. Tutkimuksessamme kehitettiin 3D-pintavastekäyrät visualisoimaan kahden itsenäisen muuttujan vuorovaikutus CAI:ssa käyttämällä toisen asteen regressioyhtälöitä (kuva 4). Kun etanolipitoisuus kiinnitettiin keskipisteeseen, uuttoajan ja lämpötilan vaikutus CAI:hen arvioitiin kuvassa 4A. Kun kaksi muuttujaa vaihtuivat samanaikaisesti, CAI nousi 33,4 minuuttiin ja 76,8 ◦C ja laski jälleen 92,8 prosentin CAI:n maksimiarvon jälkeen. Kuten kuviosta 4B, C näkyy, CAI:lla oli korkein arvo etanolipitoisuudella 64,3 prosenttia, mikä osoittaa asteittaista laskua myöhemmin, mikä viittaa siihen, että binäärinen liuotin, joka sisältää 64,3 prosenttia etanolia, on sopivampi uuttoliuottimeksi. Tämä tulos on yhdenmukainen aiempien tutkimusten kanssa, joissa kerrottiin, että veden ja etanolin binääriliuotin osoitti korkeampaa CAI:ta kuin vesi Orostachys japonica -kasvin bioaktiivisten yhdisteiden uuttamisessa, mikä viittaa siihen, että 50-prosenttinen etanoli olisi edullisempi uuttamisessa.ihon valkaisuunainesosat [34]. Maapähkinänkuoriuutteen maksimi CAI neliöregressiomallilla ennustettu oli 94,5 prosenttia, joka saatiin olosuhteissa, joissa uuttoaika oli 45,1 minuuttia, uuttolämpötila 93,6 ◦C ja etanolipitoisuus 42,3 prosenttia. Tutkimuksessamme saatu CAI oli 94,5 prosenttia, mikä on yli kaksi kertaa enemmän kuin Oh et al. raportoimien vihreän teen uutteiden 39,4 prosentin ja 40,3 prosentin CAI-arvot. [35].

2.5. Optimaaliset poistoolosuhteet

Antioksidantti,ihon valkaisuunja ryppyjä ehkäisevät vaikutukset ovat kaikki tärkeitä tehtäviä kosmetiikkalle, ja on välttämätöntä johtaa olosuhteet, jotka voivat maksimoida nämä kolme toimintoa samanaikaisesti optimoitaessa Yhdistyneiden arabiemiirikuntien olosuhteita. Kuvassa 5 esitetään optimointimenettely, joka voi samanaikaisesti maksimoida RSA:n (Y1), TAI:n (Y2) ja CAI:n (Y3) limittämällä toisen asteen regressioyhtälön avulla johdetun ääriviivakaavion jokaisen optimaalisen tilan. Riippumattomien muuttujien alueet kolmen muuttujan optimoimiseksi rajoitettiin uuttoaikaan 5.0~55.0 min, uuttolämpötila 26.{{10}}~94 .0 ◦C ja etanolipitoisuus 0,0 prosenttia ~99,5 prosenttia (taulukko 5). Yksittäisten optimaalisten uutto-olosuhteiden mukaan optimaaliset UAE-olosuhteet olivat 31,2 minuuttia uuttoaikaa, 36,6 ◦C uuttolämpötilaa, 93,2 prosenttia etanolipitoisuudesta ja yllä olevissa olosuhteissa RSA 74,9 prosenttia, TAI 50,6 prosenttia ja CAI 86,8 prosenttia ennustettiin. Kun ennustettuja RSA-, TAI- ja CAI-arvoja verrattiin validointikokeista saatuihin arvoihin, validointitestin arvot olivat samankaltaisia ​​kuin ennustettujen arvojen arvot, joissa arvot olivat vastaavasti 78,2 prosenttia, 52,3 prosenttia ja 87,7 prosenttia.

2.6. SE:n ja Arabiemiirikuntien vertailu

Yhdistyneiden arabiemiirikuntien uuttotehokkuuden vahvistamiseksi vertaamme maapähkinän kuoriuutteen RSA-, TAI- ja CAI-uutetta, joka on valmistettu UAE- ja Soxhlet-uuttotekniikoilla (SE). Kun SE suoritettiin yleisissä SE-olosuhteissa käyttämällä 99,5-prosenttista etanolia 70 ◦C:ssa 4 tunnin uuttoajan ajan, RSA:n, TAI:n ja CAI:n todettiin olevan 75,5 prosenttia, 60,2 prosenttia ja 74,4 prosenttia, jotka eivät olleet. poikkeavat paljon tuloksista, jotka saatiin optimaalisissa Yhdistyneiden arabiemiirikuntien olosuhteissa. Kuitenkin, kun SE-olosuhteet asetettiin vastaaviksi Arabiemiirikuntien optimaalisten olosuhteiden 31,2 min ja 93,2 prosentin etanolin kanssa, RSA, TAI ja CAI laskivat vastaavasti 62,0, 28,3 ja 45,6 prosenttia. verrattuna Arabiemiirikuntiin optimaalisissa olosuhteissa. Ultraäänen etu hyödyllisten materiaalien tuottamisessa maapähkinänkuorista arvioitiin prosessiksi, joka soveltuu korkeaan tuottavuuteen ja teollistumiseen vähäisen liuottimen kulutuksen ja lyhyen uuttoajan vuoksi.

2.7. MMP-3 ja TRP-1 mRNA-ilmentyminen

Nisäkkäiden melanosyyteissä melanogeneesiä ja kollageenin hydrolyysiä säätelevät TRP- ja MMP-geenit, vastaavasti, ja TRP{0}} ja MMP-3 tunnetaan melanogeneesin ja kollageenin hydrolyysin säätelyn päägeeneinä; siksi suoritettiin RT-PCR-analyysi B16-F0-solujen kokosolulysaateista ja Yhdistyneistä arabiemiirikunnista tuotetun maapähkinänkuoriuutteen vaikutus optimaalisissa olosuhteissa (31,2 min, 36,6 astetta, 93,2 prosenttia) MMP-3- ja TRP-1-mRNA-ilmentymistä tutkittiin. Kuten kuva 6 osoittaa, maapähkinänkuoriuute vähensi merkittävästi MMP-3- ja TRP-1-ilmentymistä B16-F0-soluissa, kun geenin ilmentymiskokeet suoritettiin maapähkinällä kuoriuutteen pitoisuusalue 0~1 mg/ml. Maapähkinänkuoriuute vähensi merkittävästi MMP-3- ja TRP-1-ilmentymistä 61--kertaisesti ja 8{26}}-kertaisesti annoksella 10 mg. /ml. Nämä tulokset viittaavat siihen, että maapähkinänkuoriuute estää kollageenin hajoamista B16F0-soluissa inaktivoimalla MMP 3:n MMP-1 inaktivaatioksi ja häiritsee MMP-9 yhteistyötä [36]. Olemassa olevat tutkimukset ovat osoittaneet, että käsittely kasviuutteilla esti mikroftalmiaan liittyvän transkriptiotekijän (MITF) ilmentymisen fosforyloimalla ekstrasellulaarista signaalisäädeltyä proteiinikinaasia (ERK). Siten pähkinänkuoriuutteen melaniinin tuotantoa estävän vaikutuksen katsotaan johtuvan mmtyrosinaasiaktiivisuus ERK:n ja MITF:n ilmentymisen eston kautta [37]. Siten maapähkinänkuoriuutteet vähensivät TRP-1- ja MMP-3-mRNA-ekspressiotasoja, mikä osoittaa, että maapähkinänkuoriuutteella on voimakasta kollagenolyysiä ja melanogeneesiä estävää vaikutusta, mikä tekee siitä erinomaisen kosmeettisen materiaalin.ihon valkaisuunja ryppyjä estäviä vaikutuksia.

3. Materiaalit ja menetelmät

3.1. Materiaalit ja reagenssit

Maapähkinänkuoret ostettiin Nonghyup martista (Gochang, Jeonbuk, Korea) 2. maaliskuuta019 ja kuoret kuivattiin 60 ◦C:ssa kuivassa uunissa (FC 49, Lab House, Soul, Korea) 24 tuntia, kunnes kuivapaino pysyi vakiona. Kuivatut maapähkinän kuoret jauhettiin monitoimikoneessa (Hanil HMF-3800, Soul, Korea) ja vietiin sitten 600 µm:n seulan läpi. Etanoli ostettiin Samchun Chemicalilta (95,0 % tilavuus/tilavuus, Soul, Korea). Folin-Ciocalteu-reagenssi, gallushappo (97 prosenttia) ja kversetiini ostettiin Merckiltä (Kenilworth, NJ, USA). 2,2-difenyyli-1-pikryylihydratsyyli (DPPH), askorbiinihappo ja 3,4-dihydroksi-L-fenyylialaniini (L-DOPA) ostettiin Sigma-Aldrichilta (St. Louis, MO, USA). Kaikki muut tässä kokeessa käytetyt kemikaalit olivat analyyttistä laatua ja ostettu Sigma-Aldrichilta. Kaikki varastoliuokset valmistettiin puhdistetulla deionisoidulla vedellä käyttäen aMilli-Q-puhdistusjärjestelmää (Millipore, Burlington, VT, USA).

3.2. Ultraääniavusteinen uutto ja Soxhlet-uutto

Jauhettu maapähkinäkuori (1 g) laitettiin uuttoastiaan, jokaisessa oli 10 ml liuotinta, ja sekoitettiin pyörresekoittimella (VM-10, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Korea) 1 minuutti. Uutto suoritettiin kierrättämällä vettä ultraääniuuttimessa (250 W, SD-D250H, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Korea) käyttämällä ulkoista jäähdytettyä kylpykiertolaitetta (CDRC8, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Korea) ) digitaalisella ajastimella ja lämpötilansäätimellä. Uutto tehtiin digitaalisella ajastimella ja lämpötilansäätimellä varustetulla ultraäänilaitteella. Näytettä sonikoitiin eri kokeen kestojen ja lämpötilojen ajan 40 kHz:n toimintataajuudella. Sitten uute sentrifugoitiin nopeudella 10, 000 rpm 10 minuuttia (236R, Labogene, Soul, Korea). Sentrifugoinnin jälkeen näytetilavuudet lisättiin 5 ml:ksi ja suodatettiin 0,2 um:n kalvosuodattimen läpi ennen analyysiä. Soxhlet-uuttoa varten jauhettua maapähkinän kuorta (5 g) uutettiin jatkuvasti 100 ml:lla käyttäen 99,5-prosenttista etanolia 4 tunnin ajan (8 sykliä) maksimilämpötilassa 70 °C Soxhlet-laitteessa. Ultraääniavusteisen uuttotekniikan osoitettiin olevan erittäin tehokas öljyn uuttamisessa rypäleen siemenistä. Ultraäänen etu verrattuna tavanomaisiin sekä öljyn että polyfenolien uuttomenetelmiin oli samanlainen, koska öljyn/polyfenolien saanto saatiin pienemmällä liuottimen kulutuksella ja lyhyemmällä käyttöajalla. uuttoaika.

3.3. Kokeellinen suunnittelu

Kokeellinen suunnittelu suoritettiin käyttämällä CCD:tä, eräänlaista RSM:ää koeajojen minimoimiseksi ja tekijöiden välisen vuorovaikutuksen tutkimiseksi. Design-Expert®-ohjelmistoa 8.0 (State-Ease, City, MN, USA) käytettiin kokeiden suunnitteluun, tietojen analysointiin ja uutto-olosuhteiden optimointiin antioksidantteja sisältävien bioaktiivisten yhdisteiden uuttamisen maksimoimiseksi,ihon valkaisuunja ryppyjä estäviä vaikutuksia maapähkinän kuoresta. Kokeet suunniteltiin CCD:n mukaan, kolmen esitetyn riippumattoman muuttujan etäisyys- ja keskipistearvot perustuivat alustavien kokeiden tuloksiin (taulukko 1). CCD:tä käytettiin ennustamaan optimaaliset UAE-olosuhteet vasteiden maksimoimiseksi, mukaan lukien RSA, TAI ja CAI maapähkinän kuorista. Riippumattomiksi muuttujiksi valitut kolme muuttujaa olivat uuttoaika (X1), uuttolämpötila (X2) ja etanolipitoisuus (X3). Yhteensä 17 koeajoa luotiin kolmella toistolla keskipisteissä toistettavuuden arvioimiseksi. Kvadraattista regressiomallia käytettiin sovittamaan kokeelliset tiedot ja sovellettiin vastemuuttujien ennustamiseen, kuten yhtälössä (1) esitetään:

Y= 0 plus 1X1 plus 2X2 plus 3X3 plus 11X12 plus 22X22 plus 33X32 plus 12X1X2 plus 13X1X3 plus 23X2X3 (1)

jossa Y on ennustettu vaste; 0 on vakio (leikkaus); 1, 2 ja 3 ovat lineaaristen vaikutustermien regressiokertoimet; 11, 22 ja 33 ovat neliövaikutteisia termejä; ja 12, 13 ja 23 ovat vuorovaikutusvaikutustermejä, vastaavasti. Regressiokertoimien ja mallitermien tilastollisen merkitsevyyden määrittämiseksi ja kokeellisen [38] matemaattisten mallien sovittamiseksi käytettiin vastepinta-analyysiä ja ANOVAa.

3.4. DPPH radikaalinpoistotoiminta (RSA)

Maapähkinänkuoriuutteen RSA oli Pereira-Caron et ai. [39]. Valmistettiin 0.01 mM DPPH:n liuos metanolissa (95 prosenttia) ja 1,25 ml lisättiin 0,25 ml:aan laimennettua uutetta. RSA määritettiin mittaamaan absorbanssi aallonpituudella 517 nm käyttämällä UV-visspektrofotometriä (UV1650PC, Shimadzu, Kioto, Japani) 20 minuutin inkubaation jälkeen. Aihio valmistettiin käyttämällä tislattua vettä ja RSA laskettiin alla olevan mukaisesti. (Yhtälö (2)):

RSA (prosentti)={1 −Abs (näyte) /Abs (kontrolli) }× 100 (2)

3.5. Tyrosinaasiaktiivisuuden esto (TAI)

TAI suoritettiin modifioidun menetelmän mukaisesti käyttämällä L-DOPA:ta substraattina Jo et ai. [40]. Näytteet sekoitettiin 200 µl:aan L-DOPAa ja 200 µl:aan kaliumfosfaattipuskuria (pH 6,8) ja 200 µl:aantyrosinaasi(125 U/ml) lisättiin koeputkeen ja inkuboitiin 37 °C:ssa 20 minuuttia. Näytteen absorbanssi mitattiin 475 nm:ssä UV-Vis-spektrofotometrillä ja tuloksia verrattiin kontrolliin. Kullekin pitoisuudelle entsyymiaktiivisuus laskettiin prosentteina verrattuna analyysiin puskuria ilman inhibiittoria käyttäen, ja TAI laskettiin seuraavan kaavan perusteella. (Yhtälö (3)):

TAI (prosentti)={1 −Abs (kontrolli) − Abs (näyte) /Abs (kontrolli)}× 100 (3)

jossa Abs (kontrolli) on puskurin ja kollagenaasin absorbanssi; Abs (näyte) on puskurin plus kollagenaasi plus näyte/standardi absorbanssi.

3.6. Kollagenaasiaktiivisuuden esto (CAI)

Uutteiden CAI:n mittaus suoritettiin modifioimalla Wünschin ja Heindrichin [41] menetelmiä. Substraatti, 4-fenyyliatsobetsyylioksikarbonyyli-Pro-Leu-Gly Pro-Arg (FALGPA), liuotettiin 10 ml:aan puskuria pitoisuuteen 1,2 mg/ml ja sitten lisättiin 125 µl liuosta ja inkuboitiin 60 minuuttia. 37 ◦C:ssa. Kollagenaasi liuotettiin puskuriin pitoisuuteen 0,4 mg/ml ja puskuriliuokseen lisättiin 75 ui entsyymiliuosta. Entsyymi-substraattiseosta inkuboitiin vesihauteessa 37 °C:ssa 30 minuuttia ja reaktio pysäytettiin lisäämällä 75 ui 20-prosenttista sitruunahappoa (w/v). Kun oli lisätty 1,5 ml etyyliasetaattia, etyyliasetaattikerros erotettiin ja absorbanssi mitattiin aallonpituudella 320 nm. Inhibitioprosentti laskettiin seuraavan kaavan mukaan.

CAI (prosentti)={1 − [Abs (kontrolli) − Abs (näyte)] /Abs (kontrolli)}× 100 (4)

jossa Abs (kontrolli) on puskurin ja kollagenaasin absorbanssi; Abs (näyte) on puskurin ja kollagenaasin sekä näytteen/standardin absorbanssi.

3.7. Solulinjojen ylläpito ja viljely

Melaniinia tuottava B16-F0-melanoomasolu saatiin Korea Cell Line Bankista (KCLB, Chongno, Soul, Korea) ja sitä viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle's-elatusaineessa (DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) täydennettynä naudan sikiön seerumilla (FBS, 10 prosenttia, Welgene, Gyeongsan, Korea) ja penisilliini-streptomysiinin antibioottiliuoksella (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Trypsiini-EDTA:ta (Gibco, Grand Island, NY, USA) käytettiin solujen trypsinisointiin. Kaikki käytetyt materiaalit olivat soluviljelylaatua.

3.8. Käänteistranskriptiopolymeraasiketjureaktio (RT-PCR)

RT-PCR suoritettiin mittaamaan muutoksia MMP-3- ja TRP-1-geenin ilmentymistasoissa, jotka liittyvätvalkaisuja ryppyjä ehkäiseviä vaikutuksia, B16-F0-soluja viljeltiin kuoppalevyllä, joka oli käsitelty eri pitoisuuksilla maapähkinänkuoriuutetta seerumittomassa DMEM:ssä, ja inkuboitiin 24 tuntia. Käsittelemätön solukontrolli pidettiin samoissa olosuhteissa kuin testattu ryhmä kokeen aikana. RNA:n eristäminen soluista suoritettiin käyttämällä AccuPrep® Universal RNA Extraction Kit -sarjaa (Bioneer, Daejeon, Korea). Täydentävä DNA syntetisoitiin käyttämällä AmfiRiert Platinum cDNA synthesis MasterMixiä (GenDEPOT, Barker, TX, USA). RT-PCR-analyysi suoritettiin käyttämällä CFX 96 touch PCR System -järjestelmää (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) mRNA-tasojen määrittämiseksi. Käytetyt alukkeet olivat seuraavat: MMP-3 sense, {{10}}AGTTTGGTGTCGCGGAGCAC-30 ja antisense, 50-TACATGAGCGCTTCCGGCAC-30; ja TRP-1 sense, 50-GCTGCAGGAGCCTTCTTTCTC 30 ja antisense, 50-AAGACGCTGCACTGCTGGTCT-30. Sopivaa edellä mainittua alukesarjaa käytettiin vastaavien geenien monistamiseen seuraavilla kiertoolosuhteilla: 94 ◦C 5 minuutin ajan, jota seurasi 25 sykliä 95 ◦C:ssa 5 s, 60 ◦C 30 s (MMP:lle-3). , ja 60 ◦C 30 s (TRP-1) ja 72 ◦C 30 s jatkettaessa. PCR-tuotteet elektroforeesittiin 1-prosenttisella agaroosigeelillä, värjättiin etidiumbromidilla ja visualisoitiin käyttämällä Gel Doc TM XR plus System- ja Quantity One -ohjelmistoa 2.0 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Kotitalousproteiinia, -aktiinia, käytettiin kuormituskontrollina olettaen, että näiden proteiinien ilmentymistasot pysyvät vakioina.

4. Johtopäätökset

Tässä tutkimuksessa täydentävää lähestymistapaa käytettiin bioaktiivisten aineiden talteenotossa ja käytössä maapähkinän kuoren maatalouden sivutuotteista, jotta kehitettiin lisäarvoa tuottavia ainesosia, joilla on useita käyttötarkoituksia. Ensinnäkin yritimme lisätä bioaktiivisten yhdisteiden uuttotehoa antioksidanttisilla, ihoa valkaisevilla ja ryppyjä ehkäisevillä vaikutuksilla optimoimalla Arabiemiirikuntien prosessia. Siksi tässä tutkimuksessa käytettiin Yhdistyneet arabiemiirikunnat bioaktiivisten yhdisteiden tehokkaaseen tuotantoonihon valkaisuunja ryppyjä ehkäiseviä vaikutuksia maapähkinäkuorista ja sovellettiin tilastolliseen optimointiin RSA:n, TAI:n ja CAI:n maksimoimiseksi samanaikaisesti. Yhdistyneiden arabiemiirikuntien olosuhteet optimoitiin CCD:n avulla ja vahvistettiin, että liuottimen ja pitoisuuden valinta tulee ottaa huomioon bioaktiivisten yhdisteiden uuttamisessa maapähkinän kuorista. Päällekkäin vastepinnat, kolmen riippuvan muuttujan käyrät, uuttoaika 31,2 minuuttia, uuttolämpötila 36,6 ◦C ja etanolipitoisuus 93,2 prosenttia määritettiin Arabiemiirikuntien optimaalisiksi olosuhteiksi. On vahvistettu, että maapähkinän kuoriuutteiden RSA on erittäin korkea ja sen voidaan odottaa lisääntyvän TAI:ssa ja CAI:ssa, jotka ovat osoittimiaihon valkaisuunja ryppyjä ehkäiseviä vaikutuksia. Arabiemiirikuntien olosuhteiden optimointi vahvisti maapähkinänkuoren bioaktiivisten aineiden tuotannon lisääntymisen sekä maapähkinänkuoriuutteen valkaisevan ja ryppyjä ehkäisevän vaikutuksentyrosinaasija kollagenaasitoiminnan alasäätelyt. Tämän perusteella arvioitiin maapähkinän kuorien vaikutusta MMP:n ja TRP:n ilmentymistasoihin ja arvioitiin, onko niillä valkaisu- ja ryppyjä ehkäiseviä vaikutuksia geenien ilmentymistasolla. mRNA-ilmentymiä sekä MMP-3- ja TRP-1-proteiinin ilmentymisen estoa. Siksi maapähkinän kuoriuutteen on osoitettu olevan tehokasvalkaisuja ryppyjen paraneminen proteiinien ilmentymisessä ja geenitasoissa. Arabiemiirikuntien maapähkinänkuoriuutteella on korkea antioksidanttiaktiivisuus ja erinomaiset ihoa valkaisevat ja ryppyjä ehkäisevät vaikutukset, mikä antaa maapähkinänkuorelle suuren potentiaalin luonnonkosmetiikka- ja elintarvikeainesosana. Lisäksi uskotaan, että bioaktiivisten yhdisteiden tuotantoa Arabiemiirikuntien avulla voidaan soveltaa kaupallistamisprosessiin kosmetiikan, elintarvikkeiden ja farmaseuttisten materiaalien valmistuksessa, kun otetaan huomioon suurempi tuotantosaanto ja pienemmät prosessointikustannukset verrattuna tavanomaisiin prosesseihin.