Pistacia atlantica subsp. mutica-uutteet hiiren B16F10-melanoomasoluilla

Ota yhteyttä: ali.ma@wecistanche.com

Samira Eghbali-Feriz1, Akram Taleghani2, Hadi Al-Najjar3, Seyed Ahmad Emami1, Homa Rahimi4, Javad Asili1, Samira Hasanzadeh1 ja Zahra Tayarani-Najaran5,*

Abstrakti:Pistacia atlantica (P. atlantica) subsp. muticaa on käytetty perinteisessä lääketieteessä ja se on kuuluisa lääkinnällisistä ominaisuuksistaan. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida metanolin (MeOH), n-heksaanin, dikloorimetaanin (CH2Cl2), n-butanolin (BuOH), etyyliasetaatin (EtOAc), vesiuutteiden ja P. atlantica subsp. mutica melaniinin synteesiin ja oksidatiiviseen stressiin B16F10-melanoomasolulinjassa. B16F10-solujen elinkelpoisuus kasvien eri uutteiden kasvavilla pitoisuuksilla (02-200 µg/ml) käsittelyn jälkeen mitattiin käyttämällä resatsuriinia. Eteeristen öljyjen koostumus tunnistettiin kaasukromatografia-massaspektrometria (GC-MS) -analyysillä ja melaniinin, sienten synteesiä estävällä vaikutuksellatyrosinaasiaktiivisuus, solutyrosinaasi ja oksidatiivinen stressi arvioitiin kolorimetrisillä ja fluorometrisilla menetelmillä. Tiedot osoittivat uutteita pitoisuuksilla 0.2-200 µg/ml, eivät osoittaneet merkittävää toksisuutta melanoomasoluille, mutta eteerisen öljyn pitoisuuksilla 200 µg/ml oli sytotoksinen vaikutus. Pistacia atlantica subsp. mutica voisi estää sienentyrosinaasitoiminta. Myös melaniinin määrä B16F10-soluissa laski. Lisäksi P. atlantica subsp. mutica-uutteet reaktiivisten happilajien määrän vähentämisessä melanoomasoluissa paljastivat merkittäviäantioksidanttitoiminta. Lisäksi kaikilla eteeristen öljyjen pitoisuuksilla ei ollut merkittävää vaikutusta tässä tutkimuksessa. Themelanogeneesiestävä jaantioksidanttiP. atlantica subsp. mutica B16F10-soluilla voi viitata kasvin mahdolliseen valkaisuun käytettäväksi dermatologisissa ihonhoitotuotteissa ja ihon ikääntymisen ehkäisyssä kosmetiikkateollisuudessa.Avainsanat:Anti-tyrosinaasi; Melanogeneesi; P. atlantica subsp. mutica.

NapsautaCistanchen edut antioksidanttina

JOHDANTO

Melaniini on ihon pigmentti, joka syntetisoituu melanosomeissa ja siirtyy keratinosyytteihin koko fysiologisen prosessin, ns.melanogeneesi. Melaniinilla on tärkeä rooli suojaamisessa UV-vaurioilta ja se määrittää ihon, hiusten ja silmien värin. Melaniinin liiallinen tuotanto johtuu melanoomasta ja ihon epänormaalista pigmentaatiosta (1-3). Melaniinin biosynteesin avainentsyymi on tyrosinaasi, joka katalysoi kahta erillistä reaktiota, 3,4-dihydroksifenyylialaniinin (DOPA) hapettumista dopakinoniksi ja L-tyrosiinin hydroksylaatiota DOPA:ksi (4).Tyrosinaasitai polyfenolioksidaasi on kuparia sisältävä sekatoimintoinen entsyymi, jota löytyy mikro-organismeista, eläimistä ja kasveista (5). Tyrosinaasi on eniten vaikuttanut tekijä hedelmien ja vihannesten ruskistumiseen. Melaniinin ylituotanto ja kertyminen voi aiheuttaa monia ihosairauksia, kuten melasmaa, pisamia, auringon melanoosia ja ikäpisteitä (6). Siksi,tyrosinaasiinhibiittorit ovat herättäneet suurta kiinnostusta elintarvike- ja kosmetiikkateollisuudessa. Monissa elävissä organismeissa hapettuminen on välttämätöntä energian tuottamiseksi biologisten prosessien ruokkimiseksi.

Vetyperoksidi (H2O2) ja muut -reaktiiviset happilajit (ROS) - aiheuttavat kuitenkin solukuolemaa ja kudosvaurioita monissa fysiologisissa ja patologisissa ilmiöissä, mukaan lukien ROS:n lisääntyminen UV-säteilyn seurauksena melanogeneesiprosessin aikana. Lisäksi tiedetään hyvin, että UV-indusoitu ROS:n tuotanto on osallisena useiden ihosairauksien, kuten ikääntymisen, ryppyjen, valoherkkyyden ja pahanlaatuisuuden, patogeneesissä (7). Siten löytää luonnollisia lähteitäantioksidanttejaanti-tyrosinaasiaktiivisuus auttaa muokkaamaan liiallisuuteen liittyviä ihovaurioitamelanogeneesi (4).

Pistacia-suku kuuluu Anacardiaceae-perheeseen, johon kuuluu noin 9 lajia, ja sitä esiintyy enimmäkseen Välimeren alueella, Euroopassa ja joissakin osissa Aasiaa (8,9). Pistacia atlantica (P. atlantica)Desf. sillä on 3 alalajia, nimittäin: P. atlanticasubsp. kurdica (Zohary) Rech. f., P. atlanticasubsp. mutica (Fischer & CA Meyer) Rech. f. ja P. atlantica subsp. cabulica (Osakkeet) Rech. f. Kolme mainittua P. atlantica, P. khinjuk Stocks ja P. vera L. alalajia kasvatetaan Iranissa (10). P. atlanticasubsp. mutica eli Baneh on pyöreä tai soikea, halkaisijaltaan 0.5-0,7 cm. P. atlantican rungon antioksidanttinen ja syöpää ehkäisevä vaikutus on liitetty kasvin korkeaan kokonaisfenolipitoisuuteen. P. atlanticaa on perinteisesti käytetty lievittämään ylävatsan epämukavuutta ja kipua, dyspepsiaa ja peptistä haavaumaa (11-13). P. atlantica subsp.:n melanogeneesiä estävästä aktiivisuudesta ei kuitenkaan ole tehty tutkimuksia. mutica. Joten tässä projektissa valitsemme B16F10-melanoomasolut tutkimaan P. atlantica subsp. mutica-uutteet. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää metanolin (MeOH), n-heksaanin, dikloorimetaanin (CH2Cl2), n-butanolin (BuOH), etyyliasetaatin (EtOAc), vesiuutteiden (H2O) ja P.:n eteerisen öljyn estovaikutusta. atlanticasubsp. mutica hedelmät päällämelanogeneesija arvioimaan potentiaaliaantioksidanttikasvin kapasiteettia B16F10-melanoomasoluissa.

MATERIAALIT JA MENETELMÄT

Kemikaalit

SienityrosinaasiAgaricus bisporuksesta, kojiinihappo, resatsuriini, L-3, 4-dihydroksifenyylialaniini (L-DOPA), diklooridihydrofluoreseiinidiasetaatti (DCFH-DA), egtatsiinihappo (EGTA), dimetyylisulfoksidi (DMSO) ), fenyylimetyylisulfonyylifluoridi, glyserofosfaatti, -merkaptoetanoli, fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS), natriumortovanadaatti, tris-puskuroitu suolaliuos tween 20 (TBST), ostettu Sigmalta (USA). Naudan sikiön seerumi (FBS), penisilliini, streptomysiini ja trypsiini-EDTA saatiin GibcoBRL:ltä (Grand Island, USA). Melanoomasolulinja (B16F10, luettelonro C540) ostettiin Pasteur Institute of Iranilta (Tehran, IR Iran). Kaikki muut kemikaalit ja liuottimet olivat Merckiltä (Saksa).

Uutteiden valmistus

P. atlantica subsp. mutica kerättiin toukokuussa 2014 Bardaskan-vuorilta, Khorasan Razavin maakunnasta, Iranista koilliseen, ja sen tunnisti rouva M. Souzani. Lahjakorttinäyte (nro: 13069) talletettiin Mashhadin lääketieteellisten tieteiden yliopiston farmasian korkeakoulun herbaarioon, Mashhad, Iran. P. atlantica subsp. mutica (200 g) jauhettiin sekoittimella (Toos chekan Co, IR Iran) ja perkoloitiin sitten MeOH:lla huoneenlämpötilassa 24 tunnin ajan aiemmin raportoidun protokollan mukaisesti (14). Uuton jälkeen liuotin haihdutettiin käyttämällä pyöröhaihdutinta ja sitten pakastekuivattiin. Metanoliuute (94 g) fraktioitiin edelleen liuotin-liuotin-osituksella, jolloin saatiin viisi erilaista fraktiota, mukaan lukien MeOH, n-heksaani, CH2Cl2, BuOH, EtOAc ja H20.

Eteerisen öljyn eristäminen

P. atlantica subsp.mutican kypsymättömät hedelmät (150 g) alistettiin hydrotislaukseen Clevenger-tyyppisellä laitteella 3 tunnin ajan. Väritön öljy saatiin 0,8 %:n (tilavuus/paino) saannolla. Saatu eteerinen öljy kuivattiin vedettömällä natriumsulfaatilla ja säilytettiin 4 asteessa pimeässä lisätestaukseen saakka.

Kaasukromatografia ja kaasukromatografia-massaspektrometria

Kaasukromatografia-analyysi (GC) suoritettiin käyttämällä Varian CP{{0}} -laitetta, joka oli varustettu FID-detektorilla ja liitettynä sulatettuun piidioksidikolonniin (CP-Sil 8CB, 50 m × 0,25). mm, kalvon paksuus 0,12 µm) seuraavissa olosuhteissa: uunin lämpötila 50-250 astetta nopeudella 3 astetta/min; injektorilämpötila 260 astetta, jakosuhde 1:5, kantokaasulla, N2-virtausnopeus 2 ml/min; ilmaisimen lämpötila 280 astetta.

Kaasukromatografia-massaanalyysit (GC-MS) suoritettiin käyttämällä Agilent 5975 -laitetta, joka oli varustettu HP-5 MS -kolonnilla (30 m × 0,25 mm id, {{ 14}},25 µm kalvonpaksuudet) yhdistetty nelinkertaiseen massaanturiin ja tietokoneeseen, joka on varustettu Wiley 7n.L -kirjastolla. Uunin lämpötila 50-250 astetta nopeudella 3 astetta/min, injektorilämpötila 250 astetta, ruiskutustilavuus: 0,1 µL, jaettu ruiskutus jakosuhteella 1:50, kantokaasun (helium) virtausnopeus 1 ml/ min, ionilähde: 70 eV, ionisaatiovirta: 150 µA ja skannausalue: 35-465. Eteerisen öljyn ainesosien tunnistaminen perustui retentiokaasukromatografiaan, joka saatiin HP-5MS-kolonnin n-alkaanisarjan (C6-C20) perusteella, niiden massaspektrien ja fragmentaatiokuvioiden vertailuun. kirjallisuudessa ja tietokonesovitus Wiley 7n.L -kirjaston kanssa (15). Kypsän hedelmän yksittäisten komponenttien suhteellinen määrä määritettiin pinta-alaprosenttimenetelmällä ottamatta huomioon kalibrointikerrointa.

Soluviljely

Melanoomasolulinja, B16F10, pidettiin 37 asteessa kosteassa ilmakehässä (90 prosenttia), joka sisälsi 5 prosenttia CO2:ta. Soluja viljeltiin RPMI-1640:ssa (Bioidea, Iran), jossa oli 10 % (tilavuus/tilavuus) FBS:ää, 100 IU/ml penisilliiniä ja 100 ug/ml streptomysiiniä. P. atlantica subsp. mutica valmistettiin pitoisuudella 50 µg/ml DMSO:ssa ja pidettiin -40 asteessa. Kojihappoa (2 ja 4 mM) käytettiin positiivisena kontrollina kaikissa kokeissa. Soluja viljeltiin 96-kuoppalevyillä tiheydellä 105 solua/ml. Uutteen aktiivisuus kussakin kokeessa laskettiin käyttämällä seuraavaa yhtälöä:  toiminto

ggaktiivisuusprosentti{0}}näytteen absorbanssi/Kontrollin absorbanssi*100

Solujen elinkelpoisuusmääritys

Resatsuriini on solun terveyden indikaattori, joka käyttää elävien solujen pelkistysvoimaa ja muuttuu resorufiiniksi. Resatsuriini on sininen, myrkytön, ei-fluoresoiva ja soluja läpäisevä yhdiste, joka muuttuu väriltään punaiseksi ja erittäin fluoresoivaksi resorufiiniksi elävissä soluissa (16). Noin 104 B16F10-melanoomasolua kylvettiin 96-mikrokuoppalevyn kuhunkin kuoppaan ja käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla P. atlantica subsp. mutica (0.2-200 µg/ml). 4 tunnin inkubaation jälkeen resatsuriinin ja resorufiinin absorbanssi mitattiin aallonpituudella 570 nm ja 600 nm käyttämällä H4 Hybrid Multi-Mode -mikrolevylukijaa (BioTek, Winooski, USA). Jokainen koe tehtiin kolmena kappaleena. Puolet maksimaalisesta estävästä konsentraatiosta (IC50) laskettiin käyttämällä GraphPad-ohjelmistoa pitoisuus-vaikutuskäyrästä: log-pitoisuus vs. vaste.

Sienityrosinaasin aktiivisuusmääritys

Sienten toimintatyrosinaasiL-DOPA:n hapettumisessa mitattiin spektrofotometrisesti, kuten aiemmin on kuvattu (17), joillain muutoksilla. Lyhyesti, 160 µl 5 mM L-DOPA:a (100 mM natriumfosfaattipuskurissa pH 6,8) ja 20 µl samaa puskuria P. atlanticasubsp.:n kanssa ja ilman. mutica-uutteet ja eteerinen öljy (10-1000 µg/ml) sekoitettiin 20 µl:aan sienityrosinaasia (200 yksikköä/ml) ja inkuboitiin sitten 37 asteessa 30 minuuttia. Absorbanssi mitattiin 475 nm:ssä Synergy H4 Hybrid Multi-Mode -mikrolevylukijalla (BioTek, Winooski, USA).

Melaniinipitoisuuden määritys melanoomasoluissa

Melanoomasoluja, B16F10, kylvettiin tiheydellä 105 solua per kuoppa 96-kuoppaviljelylevyille ja inkuboitiin 24 tuntia. Sitten niitä inkuboitiin P. atlantica subsp. mutica-uutteet ja eteerinen öljy 24 tunnin ajan. Melaniinipitoisuus mitattiin aiemmin kuvatulla tavalla (18). Käsittelyn jälkeen solut kerättiin käyttämällä trypsiiniä. Ne pestiin PBS:llä. Solupelletit liuotettiin 50 ul:aan natriumhydroksidiliuosta (2 M) 60 minuutin ajan 60 °C:ssa. Melaniinipitoisuus mitattiin mittaamalla absorbanssi 405 nm:ssä Synergy H4 Hybrid Multi-Mode -mikrolevylukijalla (BioTek, Winooski, USA).

Solujen tyrosinaasin aktiivisuusmääritys

DOPA:n hapettuminen DOPA-kromiksi analysoitiin spektrofotometrialla indikaattorina.tyrosinaasitoiminta (18). 106 B16F10-melanoomasolua maljattiin 96-kuoppalevyn jokaiseen kuoppaan yön yli. Kun solua on käsitelty eri pitoisuuksilla (0.{6}} µg/ml) P. atlantica subsp. mutica-uutteet ja eteerinen öljy 24 tunnin ajan. Solut irrotettiin käyttämällä trypsiiniä; pestiin PBS:llä ja hajotettiin 50 ul:lla natriumfosfaattipuskuria (pH 6,8, 100 mM), joka sisälsi 1 % triton X-100 ja 0,1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia. Lysaatteja sentrifugoitiin 10, 000 rpm 20 minuuttia 4 asteessa. 100 µl kutakin lysaattia (joista jokainen sisältää 100 mg proteiinia) sekoitettiin 30 µl:n kanssa 5 mM DOPA:ta 96-kuoppaisella levyllä ja inkuboitiin 37 asteessa 2 tuntia, absorbanssi mitattiin 475 nm:ssä Synergy H4 Hybrid Multi-Mode -mikrolevylukijalla. (BioTek, Winooski, USA).

Solujen reaktiivisten happilajien tason määritys

Reaktiivisten happiyhdisteiden taso mitattiin aiemmin kuvatulla tavalla pienin muutoksin (19). Melanoomasoluja, B16F10, (2 × 104) kylvettiin 96-kuoppalevyille yön yli ja sitten niitä käsiteltiin eri pitoisuuksilla (0.{7}} µg/ml) P. atlantica subsp. . mutica-uutteet ja eteerinen öljy 24 tunnin ajan. Sitten soluja inkuboitiin 50 ul:n kanssa H202:ta (24 mM) 37 asteessa 30 minuuttia. Sitten soluihin lisättiin 50 ui DCFH-DA:ta ja DCF:n fluoresenssin intensiteetti mitattiin 504 nm:n emissiolla ja 524 nm:n virityksellä käyttämällä Synergy H4 -mikrolevylukijaa (BioTek, USA).

Western blot -analyysi

Melanoomasoluja, B16F10, viljeltiin 75 cm3:n pulloissa metanoliuutteen (0.5-100 µg/ml) kanssa ja ilman sitä 24 tuntia. Sitten solut hajotettiin puskurissa (50 mM tris-HCl, pH 7,4, 2 mM EGTA, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 10 mM glyserofosfaattia, 10 mM -merkaptoetanolia, 1 mM natriumortovanadaattia, 1-prosenttista koalihappodeoksihappoa). natriumsuola). Sama määrä proteiineja (50 ug) ladattiin 12-prosenttiseen natriumdodekyylisulfaatti (SDS)-polyakryyliamidigeelielektroforeesiin ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridikalvoille. Kalvot estettiin 2 tunnin ajan 10-prosenttisessa rasvattomassa maidossa TBST-puskurissa (20 mM tris-HCl pH 7,4, 100 mM NaCl ja 0,1 % Tween 20) huoneenlämpötilassa. TBST-puskurilla pesun jälkeen kalvoa inkuboitiin yön yli primaarisen vasta-aineen kanssa: 1:300 (kanin anti-tyrosinaasivasta-aine (Santa Cruz Biotechnology, CA)). Sen jälkeen kun kalvoja oli huuhdeltu 3 kertaa TBST-puskurilla, kalvoja inkuboitiin sitten 2 tuntia kanin vastaisen IgG:n (1:2000) kanssa sekundaarisena vasta-aineena (solusignalointi). Huuhtelu 3 kertaa TBST-puskurilla toistettiin ja proteiinivyöhykkeet havaittiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssia (ECL) prime Western blot -detektiojärjestelmää (BioRaD, USA) (20). Latauskontrollina käytettiin anti- -aktiinivasta-ainetta.

Tilastollinen analyysi

Kokeiden suhteelliset tulokset esitettiin kolmen riippumattoman mittauksen keskiarvona ± SD. Varianssianalyysi ja IC5{2}}-laskenta suoritettiin GraphPad Prism 6:lla.0 käyttämällä yksisuuntaista ANOVA-testiä ja keskiarvoja verrattiin Dunnett-testeillä. P < 0,05="" tarkoittaa="" tilastollisesti="" merkitsevää="" eroa="" uutteella="" käsiteltyjen="" solujen="" ja="" kontrollin="" välillä.="" kaksisuuntaista="" anova-testiä="" ja="" bonferronivertailun="" jälkitestiä="" käytettiin="" vertaamaan="" eri="" uutteiden="" vaikutusta="" kussakin="">

TULOKSET

Eteeristen öljyjen koostumus

Kaasukromatografiaa on käytetty kvantifiointiin ja Gc-massaa yhdisteiden tunnistamiseen. Sekä GC- että GC-MS-analyysin tulokset on esitetty yhdisteiden kvantitatiivisessa ja kvalitatiivisessa tunnistustaulukossa. P. atlanticasubsp. mutica, eteerisestä öljystä tunnistettiin 68 ainesosaa ja niiden osuus öljyn kokonaiskoostumuksesta oli 99,8 prosenttia (taulukko 1). Eteerisen öljyn ryhmitellyt yhdisteet määritettiin monoterpeenihiilivedyiksi 86,5 prosenttia, happipitoisiksi monoterpeeneiksi 3,7 prosenttia, seskviterpeenihiilivedyiksi 8,7 prosenttia, hapetetuiksi seskviterpeeneiksi 0,1 prosenttia ja sekalaiset 0 .8 prosenttia . Eteerisen öljyn tärkeimmät aineosat olivat -E-ocimene 29,7 prosenttia, myrseen 17,1 prosenttia, -Z-ocimene 170 prosenttia, -pineeni 10,2 prosenttia ja E-karyofyleeni 7,1 prosenttia.

Uutteiden vaikutus solujen eloonjäämiseen

Solujen elinkelpoisuutta seurattiin resatsuriinilla. Melanoomasolut, B16F10, kylvettiin 96-kuoppalevylle. 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla (0.2-200 µg/ml) P. atlantica subsp. mutica-uutteet, tulokset osoittivat, että uutteilla ei ollut merkittävää sytotoksista vaikutusta B16F10-soluihin tässä tutkimuksessa käytetyillä pitoisuuksilla (kuvio 1). Doksorubisiini positiivisena kontrollina indusoi merkittävästi solukuolemaa (P <>

Uutteiden vaikutus sienten tyrosinaasiaktiivisuuteen

P. atlantican vaikutus sienityrosinaasin estämiseen L-DOPA:n hapetuksessa arvioitiin. Tulokset osoittivat, että sienityrosinaasiKaikki eri uutteet estivät aktiivisuutta, mutta n-heksaaniuutteen konsentraatiolla 1000 µg/ml ei ollut merkittävää vaikutusta tässä kokeessa. Kojihappoa (2 ja 4 mM) käytettiin positiivisena kontrollina (P < 0,05)="" (kuvio="">

Uutteiden ja eteeristen öljyjen vaikutus melaniinin synteesiin

Tutkia P. atlantica subsp.:n eri uutteiden ja eteeristen öljyjen vaikutusta. mutica melaniinin synteesiin, uutteella käsiteltyjen B16F10-melanoomasolujen melaniinipitoisuus arvioitiin. Kojihappoa (2 ja 4 mM) käytettiin positiivisena kontrollina.

Tulokset osoittivat, että MeOH-, CH2Cl2- ja EtOAc-uutteet (0.2-200 µg/ml), n-heksaani (2-200 µg/ml) ja H2O-uutteet (2{{9) }} ja 200 ug/ml) oli estävä vaikutus melaniinin synteesiin (P < 0,05)="" (kuvio="" 3).="" kaikilla="" eteerisen="" öljyn="" ja="" buoh-uutteen="" pitoisuuksilla="" ei="" kuitenkaan="" ollut="" merkittävää="" melaniinin="" synteesiä="" estävää="" vaikutusta.="" eteeristen="" öljyjen="" tuloksia="" ei="" näytetä="">

Uutteiden vaikutus solujen tyrosinaasiaktiivisuuteen

Arvioidakseen P. atlantica subsp. mutica-uute päällämelanogeneesierityisesti arvioimme solunsisäistätyrosinaasiaktiivisuus B16F10-melanoomasoluissa. Tulokset osoittivat, että MeOH-, EtOAc- ja BuOH-uutteet (0.2-200 µg/ml), n-heksaani (0.2 µg/ml) ja CH2Cl2 (20 ja 200 µg/ml) µg/ml) uutteet P. atlantica subsp. mutica saattoi merkittävästi inhiboida solujen tyrosinaasiaktiivisuutta (P < 0,05)="" (kuvio="" 4),="" mutta="" vesiuutteella="" ei="" ollut="" estävää="" vaikutusta="" solujen="">

Uutteiden vaikutus solujen reaktiivisten happilajien tasoon

Solunsisäinen ROS-taso osoittaaantioksidanttiP. atlantica subsp.mutican kapasiteetti mitattiin soluista, joita oli käsitelty pelkällä 24 mM H202:lla tai eri uutteilla B16F10-melanoomasoluissa. Tulokset osoittivat, että kaikki uutteiden pitoisuudet P. atlanticasubsp. mutica paitsi 0,2 µg/ml CH2Cl2-uutetta voisi merkittävästi tukahduttaa H2O2:n aiheuttamaa oksidatiivista stressiä (P < 0,05)="" (kuva="">

Uutteiden vaikutus solujen tyrosinaasiproteiinitasoon

P. atlanticasubsp.:n solunsisäinen vaikutus. mutica melanogeenisille sukulaisproteiineille, kuten tyrosinaasille, indikaattorinamelanogeneesiarvioitiin Western blot -menetelmällä. Kuten kuvassa 6,tyrosinaasiP. atlantica subsp. mutica-uutekäsittely pitoisuuksilla {{0}},5 ja 10 µg/ml (P < 0,05).="" -sisäisenä="" kontrollina="" käytettiin="">

Eteeristen öljyjen vaikutukset eri parametreihin

Eteerinen öljy arvolla 0.2-200 µg/ml ei paljastanut merkittävää vaikutusta kaikkiin edellä mainittuihin parametreihin lukuun ottamatta pitoisuutta 200 µg/ml, jolla oli sytotoksista vaikutusta melanoomasoluihin. Tästä syystä eteeristen öljyjen tulokset eivät sisälly tulososaan, koska estäviä vaikutuksia ei havaittu.

KESKUSTELU

Kaupalliset virastot mainostavat laajasti luonnonkosmetiikkatuotteita niiden turvallisuuden ja monikäyttöisen toiminnan vuoksi. Uusien melanogeenisten aineiden löytäminenantioksidanttiluonnollisista lähteistä peräisin oleva aktiivisuus on yksi kiinnostuksen kohteista hyperpigmentaatiohäiriöiden hoitoon käytettävien tuotteiden formulaatiossa. Lääke- ja kosmetiikkatuotteissa, joita käytetään ihon valkaisuaineina, melaniinin muodostumisen estoon, vapaiden radikaalien poistamiseen ja ihontyrosinaasitoimintaa, joka on tärkeä asiaan liittyvien ihosairauksien hoidossa (21).

Tässä tutkimuksessa P. atlantica subsp. mutica arvioitiin ja niiden vaikutukset tyrosinaasiaktiivisuuteen ja melaniinin synteesiin analysoitiin. P.:n MeOH- ja EtOAc-uutteet. atlantica subsp. mutica osoitti merkittävääantioksidanttiaktiivisuus pitoisuuksilla 2, 20 µg/ml ja 20 200 µg/ml, mikä voidaan johtua kasveissa yleisesti esiintyvistä polyfenoleista ja flavonoideista. Tulokset osoittivat, että kaikki uutteet, erityisesti MeOH-, EtOAc- ja H2O-uutteet, voivat merkittävästi estää siententyrosinaasitoiminta. Myös MeOH-, EtOAc- ja BuOH-uutteet kykenivät vähentämään solujen tyrosianaasiaktiivisuutta, mikä oli sopusoinnussa solujen melaniinituotannon vähenemisen kanssa. Tässä tutkimuksessa kaikilla eteeristen öljyjen pitoisuuksilla ei ollut merkittävää estävää vaikutusta solujen tyrosianasia, melaniinin synteesiä jaantioksidanttitoiminta. Koska MeOH-uutteella on enemmän aktiivisuutta eri kokeissa verrattuna muihin uutteisiin, olemme valinneet mainitun uutteen Western blot -analyysiin. Yhteenvetona voidaan todeta, että tämän uutteen anti-melanogeeninen vaikutus vahvistettiin kaikissa B16F10-soluissa tehdyissä määrityksissä, ja se on verrattavissa positiiviseen kontrolliin kojiinihappoon (taulukko 2).

MeOH-, CH2Cl2- ja EtOAc-uutteilla on vähentynyt solujen määrätyrosinaasiaktiivisuus, melaniinipitoisuus ja ROS. Semipolaariset luonnonfraktiot voivat uuttaa fytokemikaaleja, jotka ovat vastuussa antimelanogeenisestä aktiivisuudesta, kuten polyfenoleja ja flavonoideja. N-heksaanifraktio ja eteerinen öljy olivat vähemmän aktiivisia, mikä osoittaa, että kasvien fytokemikaaleilla, joilla on ei-polaarinen ja haihtuva luonne, ei ole merkittävää vaikutustamelanogeneesiprosessi (22,23).

Polyfenolit ja flavonoidit toimivat ROS-tuotannon estäjinä ja voivat olla vastuussa kasviuutteiden melanogeenisistä ominaisuuksista (24-27). Tärkeimmät yhdisteet P. atlantica subsp. mutica ovat kvertsetiini, luteoliini, isokersetiini, rutiini, luteoliini7-laktaatti ja fenoliyhdisteet, kuten p-kumariinihappo, kofeiinihappo ja gallushappo, jotka ovat vastuussaantioksidanttitoiminta (28). Rutiinin on raportoitu estävän tyrosinaasin aktiivisuutta ja se on tehokas pigmenttiä estävä aine hydroksyyliryhmien läsnäolon vuoksi (29). Mielenkiintoista on, että kversetiinillä, luteoliinilla ja isokersetiinillä on myös monia hydroksyyliryhmiä rakenteessa, mikä tekee niistä sopivia vuorovaikutukseen tyrosinaasin kanssa, mikä johtaa antityrosinaasiaktiivisuuteen (21,30). Äskettäin on osoitettu, että flavonoidien, kuten luteoliinin ja kversetiinin, vaikutukset välittyvät pääasiassa transkriptiotekijän modulaation kautta.melanogeneesi-assosioitunut transkriptiotekijä (MITF) ja/tai melanogeneesientsyymittyrosinaasi, DCT tai tyrosinaasiin liittyvä proteiini 1 (TYRP-1) (31). P-kumaarihappo ja kofeiinihappo estivät sienten tyrosinaasin aktiivisuutta ja olivat 10- ja 3- kertaa tehokkaampia kuin kojiinihappo (32).

Galliahapolla on tyrosinaasia estävää aktiivisuutta ja se pelkistää dopakinonin takaisin L-DOPA:ksi redox-syklin kautta, kuten askorbiinihappo (33). Vastaavasti tässä tutkimuksessa P. atlantica subsp. mutica alensi tyrosinaasiproteiinin tasoa soluissa, mikä korreloi vahvasti kversetiinin, luteoliinin, isokersetiinin, rutiinin ja muiden polyfenolien läsnäolon kanssa kasvissa.

On monia raportteja kasveista, joilla on anti-melanogeeninen ja antioksidanttivaikutus, joka vähentää oksidatiivista stressiä, mikä voi olla suuri potentiaali ihosairauksien hoidossa. Esimerkiksi P. atlantican ilmaosien erilaiset uutteet vähensivät oksidatiivista stressiä, mikä voidaan johtua kasvista laajalti esiintyvistä polyfenoleista, flavonoideista ja antosyaniinista (34). Eräässä toisessa tutkimuksessa P. veran MeOH-uute vähensi melaniinin eritystä, mikä johtui joistakinantioksidanttiyhdisteitä tässä kasvissa. Tämä tutkimus osoitti, että kojiinihappo positiivisena kontrollina osoitti IC50-arvon 0,05 mg/ml ja suurempia pitoisuuksia P. veraa voidaan käyttää tehokkaana aineena ihosairauksien, kuten melanooman syövän hoidossa (35). ). Gourine et ai. osoitti, että P. atlantican ilmaosilla on voimakkaita antioksidanttisia ominaisuuksia (36). Myös Nepeta satureioidesin MeOH- ja CH2Cl2-fraktiot osoittivat mahdollisia vaikutuksia melaniinin tuotantoon B16F10-melanoomasoluissa ja voivat edistää ihonhoitotuotteiden kosmeettisia formulaatioita (37). Kojihapon johdannaisilla oli estävää vaikutustatyrosinaasi. Näyttää siltä, ​​että vapaan hydroksyyliryhmän ja metyylisubstituutin läsnäolo tässä yhdisteessä vahvisti estävän aktiivisuuden. Tässä tutkimuksessa kojiinihappo (positiivinen kontrolli) osoitti IC50-arvon 0,28 mM (38). Fenyylipropanoidiglykosidit ja flavonoidit, jotka on eristetty Teucrium polium L. var. gnaphalodes osoitti antioksidantti- ja tyrosinaasia estäviä aktiivisuuksia. Kirjoittajat osoittivat, että jaranolilla oli suurin tyrosinaasia estävä aktiivisuus (IC50 0,041 mM) ja poliumosidi oli paras antioksidantti testatuista yhdisteistä. Kojihapon IC50-arvo oli 0,02 mM (39).

Proteiinitason laskutyrosinaasiP. atlantica subsp. mutica jaantioksidanttiominaisuudet ja vähentynyt ROS ovat vahvistaneet tämän aineen käytön melanogeneesiä estävänä aineena. Tämä tutkimus on ensimmäistä kertaa määrittänyt P. atlanticasubsp:n estävän vaikutuksen. mutica päällämelanogeneesiB16F10-melanoomasoluissa. Melaniinin kertymisen ja ylituotannon estämiseksi ihoon estetääntyrosinaasion tärkeä rooli. Näin ollen, mitä tulee P. atlantica subsp.mutican raportoituun antioksidanttivaikutukseen, flavonoidi- ja fenoliyhdisteet ovat tärkeitä komponentteja kasvissa, jotka vastaavat P. atlantica subsp. mutica. P. atlantica subsp. mutica voi tarjota sopivan aineen ihoa valkaisuihin formulaatioihin, ja se voitaisiin sisällyttää ihonhoitovalmisteiden kosmeettisiin tuotteisiin.

PÄÄTELMÄ

Yhteenvetona voidaan todeta, että tämä tutkimus osoitti ensimmäistä kertaa, että P. atlantica subsp. muticalla on vahvatyrosinaasiinhiboiva vaikutus, joka on sopusoinnussa melaniinin vähentämisen kanssa. Lisäksi P. atlanticasubsp. mutica osoitti myös suurta puhdistusaktiivisuutta jaantioksidanttiominaisuudet, mikä johtuu pääasiassa sen korkeasta flavonoidien ja kokonaispolyfenolien määrästä. Tulokset viittaavat siihen, että P. atlanticasubsp. mutica, joka vähentää melaniinin tuotantoa, voi korreloida solujen ROS:n ehtymiseen ja sen estävään vaikutukseen signaalireitin säätelyyn.tyrosinaasitoiminta. Koska semipolaarisessa uutteessa oli merkittävää antityrosinaasia ja anti-melanogeeninenSiksi päättelemme, että näistä vaikutuksista vastaavat yhdisteet kerääntyvät uutteeseen, eivät eteerisiin öljyihin.