Graham{0}}Oppiminen saa aikaan ainutlaatuisen transkription

Abstrakti:
Oppiminen voi indusoida neurofysiologista plastisuutta kuulokuoressa useaan aikaan. Kestävät muutokset kuulokortikaalisessa toiminnassa, jotka jatkuvat päivien, viikkojen tai jopa eliniän ajan, vaativat oppimisen aiheuttamaa geeniekspressiota. Itse asiassa de novo -transkriptio on molekulaarinen determinantti sille, muuttuvatko ohimenevät kokemukset pitkäaikaisiksi muistoiksi, joilla on pysyvä vaikutus käyttäytymiseen.

Tieteen ja tekniikan jatkuvan kehityksen myötä ihmisen elämässä on ilmaantunut monia maagisia elämänilmiöitä, joista tutkimukselle arvokkain on muisti. Muisti on tärkeä osa ihmisen kehittynyttä hermotoimintaa, ja se on myös erilaisten ihmisten evoluution jälkeen tapahtuneiden tapahtumien tallentaminen ja kerääminen. Joten onko geenien ilmentymisen ja muistin välillä yhteyttä? Vastaus on kyllä.

Ensinnäkin geenien vaikutus muistiin on ilmeinen. Se voi säädellä useiden muistiin liittyvien molekyylien ja proteiinien ilmentymistä yksittäisten nukleotidien polymorfismien (SNP) ja muiden menetelmien avulla. Tämä voi vaikuttaa neuronien väliseen kommunikaatiotehokkuuteen ja siten vaikuttaa henkilön kognitiivisiin, käsitteellisiin, emotionaalisiin ja muihin ominaisuuksiin, jotka osoittavat muistin laatua.

Toiseksi muistilla voi myös olla tietty vaikutus geenien ilmentymiseen. Oppimisemme, muistimme ja ajattelumme prosessissa ei ole kyse vain aivojen hermotoiminnan muutoksista, vaan myös monien geenien ja molekyylien säätelystä ja interventiosta. Näiden geenien ja molekyylien säätely tallentaa jälkiä, jotka vastaavat pitkäaikaismuistissamme olevia tunteita ja kokemuksia, ja ne tallentuvat lopulta geeneihin.

Lopuksi, positiivisen asenteen ja pitkän aikavälin muistikyvyn välillä on keskinäinen riippuvuus. Iloinen mieliala voi auttaa meitä keskittymään enemmän ja keskittymään oppimis- ja ajatteluprosessin aikana, mikä auttaa parantamaan muistikykyä. Pitkäaikainen tietoinen muisti voi myös edistää uusien hermoyhteyksien ja -rakenteiden muodostumista aivoissa, mikä on myös erittäin hyödyllistä tulevaisuuden oppimisen ja muistin kannalta.

Siksi voimme päätellä, että geeniekspression ja muistin välillä on korrelaatio. Voimme edistää ja parantaa muistikykyämme tietoisen muistin, optimismin ja positiivisen ajattelun avulla, mikä voi myös auttaa saavuttamaan parempaa fyysistä ja henkistä terveyttä. Vain tällä tavalla voimme palvella paremmin yhteiskuntaa ja inhimillistä kehitystä. Voidaan nähdä, että meidän on parannettava muistia, ja Cistanche deserticola voi parantaa muistia merkittävästi, koska Cistanche deserticola on perinteinen kiinalainen lääkeaine, jolla on monia ainutlaatuisia vaikutuksia, joista yksi on parantaa muistia. Jauhetun lihan teho perustuu sen sisältämiin erilaisiin vaikuttaviin ainesosiin, mukaan lukien happo, polysakkaridit, flavonoidit jne. Nämä ainesosat voivat edistää aivojen terveyttä monin tavoin.

Napsauta tietää lisäravinteita parantaaksesi muistia

Kuulokortikaaliset geenit, jotka tukevat kuulooppimista, muistia ja hankittua äänispesifistä käyttäytymistä, ovat kuitenkin suurelta osin tuntemattomia. Tämä raportti on ensimmäinen, joka tunnistaa genominlaajuiset muutokset oppimisen aiheuttamassa geeniekspressiossa kuulokuoressa, joiden uskotaan olevan kuulomuistin muodostumisen taustalla. RNA-sekvensoinnin geenirikastumisprofiilien bioinformaattiset analyysit tunnistivat biologisia reittejä, joihin kuuluvat kolinergiset synapsit ja neuroaktiivisten reseptorien vuorovaikutukset.

Löydökset kuvaavat keskeisiä ehdokkaita, jotka ovat taustalla aivokuoren toiminnassa tapahtuvia muutoksia, jotka tukevat pitkäaikaisen kuulomuistin muodostumista aikuisten aivoissa. Tunnistetut molekyylit ja mekanismit ovat mahdollisia terapeuttisia kohteita helpottamaan pitkäkestoisia ja äänispesifisiä muutoksia kuulotoiminnassa aikuisiässä, ja ne ovat nyt ensisijaisia ​​tulevia geenikohdistettuja tutkimuksia varten.

Käsikirjoitus:

Oppimisen ja muistin alalla hyvin hyväksytty käsite on, että muistot tallennetaan sinne, missä niitä käsitellään (Nadel & Hardt, 2011). Biologiset tapahtumat, jotka tunnetaan nimellä muistin konsolidoituminen, voivat vakauttaa aistikokemuksen herättämiä ohimeneviä hermorepresentaatioita (Lechner, Squire, & Byrne, 1999; McGaugh, 2000; Dudai, 2012). Perus- ja evoluutionaalisesti konservoituneita mekanismeja, jotka käynnistävät muistin konsolidaation, ovat transkriptio ja translaatio, jotka määritellään geenien ja niiden myöhempien proteiinituotteiden aktiiviseksi ilmentymiseksi (Alberini &Kandel, 2014; Costa-Mattioli et al., 2009).

Oletimme, että äänen erottelun oppiminen indusoi de novo -geenin ilmentymistä kuulokuoressa. Äänimerkkien erittäin spesifiset esitykset voivat kestää kokemuksen ohimenevyyden (sekunnit ja minuutit) konsolidoitumalla pitkäaikaiseen muistiin (tuneista päiviin), joka myöhemmin ohjaa äänivihjeistä käyttäytymistä. Vaikka erottuvien alueellisten transkriptomisten profiilien uskotaan olevan vastuussa muistin lujittamisesta (Katzman, et al., 2021), oppimisen aiheuttamia transkriptiotapahtumia, jotka tukevat muistin muodostumista keskusaudiojärjestelmässä, alikuvataan vakavasti.

Sitä vastoin kuulokuorta on kuvattu poikkeuksellisen hyvin kuulooppimisen ja muistin tutkimuksissa neurofysiologisten muutosten tasolla erityisesti reseptiivisten kenttien ja tonotooppisten karttojen tasolla (Schreiner & Polley, 2014; Weinberger NM, 2015; Pienkowski & Eggermont, 2011), cortico- aivokuoren ja cortico-fugal-yhteydet (Souffi et al., 2021; Lesicko & Geffen, 2022; Schreiner & Polley, 2014; Liu et al., 2011; Xiong, Znamenskiy ja Zador, 2015), myös useilla aikaskaaloilla (F Martinsroemke) , 2011; Froemke & Schreiner, 2015; Fritz, Elhilali, David ja Shamma, 2007; Tchernichovski & Margoliash, 2013). Lisäksi neurofysiologiset muutokset liittyvät käyttäytymiseen, esim. vihjailevaan toimintaan (Letzkus, Wolff ja Lüthi, 2015), huomioimiseen (Fritz et al., 2007; Elhilali et al., 2007) ja äänisignaalien muistiin (Bieszczad & Lüthi, 2015). Weinberger 2010; Grosso et al., 2015; Aschauer & Rumpel, 2016; Concina, Renna, Grosso ja Sacchetti, 2019; Letzkus, Wolff, & Lüthi, 2015; Ghosh & Zador, 2021).

Vuosikymmeniä saatu näyttö oppimisen aiheuttamasta neurofysiologisesta plastisuudesta kuulokuoressa on osoittanut kuulomuistin yhteisiä käyttäytymisominaisuuksia (Weinberger 2007a; 2007b), mikä tekee siitä parhaan ehdokasalueen kuulomuistin lujittamisessa. Tutkimalla kuulokuorta bioinformaattisesti hyödynnämme myös puolueetonta mahdollisuutta paljastaa aivojen laajuisia yhteisiä tai erillisiä biologisia portinvartijoita adaptiivisen kuulotoiminnan taustalla olevalle neuroplastisuudelle. Laajemmasta näkökulmasta katsottuna aluetranskriptominen profilointi voi johtaa täydellisempään ymmärrykseen siitä, kuinka aistijärjestelmää muokattu kokemus palvelee muistia.

Kuulokuoressa tunnistettu oppimisen aiheuttama transkriptominen profiili voi validoida, laajentaa tai johtaa uusiin prosessien biologisiin malleihin, jotka tukevat tai heikentävät adaptiivista kuulokäsittelyä. Kuulomuistin lujittaminen on todennäköisesti seurausta kokemuksesta riippuvista muutoksista geenin ilmentymisessä, jotka vaikuttavat kuulokuoren solutoimintoihin, mikä puolestaan ​​edistää kestäviä muutoksia äänen aiheuttamassa neurofysiologisessa vasteessa, joka muuttaa äänikäyttäytymistä.

Oppimisen aiheuttamien transkriptien tunnistamiseksi suoritettiin ilmentymisprofilointianalyysi RNA-sekvenssiä (RNAseq) käyttäen anatomisesti määritellyn kuulokuoren näytteille (Bregma -3,10 mm, Interaural 6,90 mm; Paxinos & Watson, 2007). ) vesirajoitteisista aikuisista, jotka on koulutettu painamaan baaripuristinta puhtaisiin sävyihin vesipalkinnon saamiseksi. Reaktiot puhtaaseen tavoitetaajuuteen (5,0 kHz; 65 dB SPL) johtivat palkkioon, kun taas vastaukset ei-tavoitetaajuuteen (11,5 kHz; 65 dB SPL) jäivät palkitsemattomiksi ja aloittivat aikakatkaisujakson, joka pidensi aikaa seuraavaan kokeiluun.

Tämä kaksisävyinen syrjintätehtävä (2TD) ei ole havainnollisesti vaikea; akustiset taajuudet ovat yli oktaavin päässä toisistaan ​​ja jyrsijät erottavat ne helposti (Talwar & Gerstein, 1998). Pikemminkin käyttäytymishaaste oli assosiatiivinen: 2TD-suorituskyky vaatii muistia, jonka sävy liittyy palkkioon (vs. ei palkkiota). Koulutetut rotat (N=8) lopetettiin kolmen peräkkäisen päivittäisen 45-minuutin 2TD-harjoittelun jälkeen ja niitä verrattiin ääni-naiivien rottien ryhmään (N=4). Tämä on aikapiste koulutuksessa, jolloin eläimet ovat vielä suorittamassa 2TD-tehtävää. Varhainen tehtävien hankinta kohdistettiin oppimisen aiheuttamien transkriptiotapahtumien vangitsemiseen, jotka loivat pohjan myöhemmille 2TD-suorituskyvyn kasvulle, joka havaittiin viikkojen harjoittelun aikana.

Esimerkiksi keskimääräinen suorituskyky oli yli sattuman, mutta vain 66 ± 7,81 % 3 päivän jälkeen verrattuna vähintään 90 prosenttiin pidennetyn harjoittelun jälkeen (Shang, Bylipudi, & Bieszczad, 2019). Hyödyntääksemme mahdollisuutta tunnistaa onnistuneen äänispesifisen assosiatiivisen muistin kannalta merkityksellisten geenien ilmentymä, hyödynsimme HDAC-estäjää, joka kohdistuu aktiivisuudesta riippuvaisen geeniekspression seepigeneettiseen säätelyyn oppimisessa ja muistin muodostumisessa (McQuown, et al., 2011; Kwapis, et al. al., 2017; Malvaez, et ai., 2012). Tärkeää on, että vuosikymmenen työ on osoittanut, että HDAC:n esto voi helpottaa oppimisen aiheuttamaa neurofysiologista plastisuutta äänen aiheuttamissa kortikaalivasteissa (suhteessa ajoneuvoon) ja tehostaa kuuloon perustuvaa syrjivää käyttäytymistä (Bieszczad et al., 2015; Phan et al., 2017; Shang, Bylipudi, &Bieszczad, 2019; Rotondo & Bieszczad, 2020; Rotondo & Bieszczad, 2021a; 2021b), mukaan lukien epäinhimilliset (Gervain, et al., 2013).

Puolet koulutetuista eläimistä hoidettiin HDAC-estäjillä RGFP966 (N=4; 10 mg/kg, ApexBio, cat#A8803; sub. cu. injektio) , kun taas toinen puolisko oli samalla tavalla koulutettua, mutta annettiin vehikkeliliuosta (N=4; sovitettu tilavuus, sub. cu. injektio; kuva 1a). 2TD-suorituskyvyssä ei ollut eroja ryhmien välillä aivokeräyksen aikaan (RGFP966: 61±5,0 % vs. ajoneuvo: 71±7,0 %; t(5,9166)=-1.21, p=0.272 Welchin t-testi). Aivot kerättiin nopeasti ja pakastettiin ajankohdassa, joka oli yhdenmukainen inhibiittorin huippupitoisuuden kanssa kuulokuoressa, tunnin kuluttua joko HDAC-estäjän tai vehikkelin istunnon jälkeisestä injektiosta (Bieszczad et al., 2015).

Tässä esitetyt havainnot ovat ensimmäiset, jotka tunnistavat assosiatiivisen oppimisen transkriptomisen profiilin kuulokuoressa. Oppiminen kaksisävyisessä syrjintätehtävässä aiheutti muutoksia satojen geenien transkriptiotasoissa (verrattuna äänettömään) (kuva 1b). Hierarkkinen klusterointialgoritmi osoitti, että geenit ovat yksilöllisesti ylös- tai alasäädeltyjä, paljastaen monimutkaisen verkoston aivokuoren geenin ilmentymistapahtumia, joita kuulooppiminen indusoi (kuvio 2a).

Rikastusanalyysit (iPathwayGuideTM; Impact Analysis -menetelmä) identifioivat kolinergisynapsin (differentiaalisesti ilmentyvät geenit (DEG) / kaikki geenit (ALL): 22/101; p=0.004, Bonferronicorrection) tärkeimmäksi biologiseksi reitiksi (taulukko 1) . Tämä tulos on yhdenmukainen 1990-luvulta lähtien tehtyjen tutkimusten kanssa, joissa korostetaan kuulokuoren kolinergisen signaalin riittävyyttä neurofysiologisen plastisuuden ja siihen liittyvän kuulokäyttäytymisen vuoksi (Froemke & Martins, 2011; Weinberger, 2003; Bakin & Weinberger, 1996; Kilgard & Merzenich, 1998). HDAC-inhibitiolla tapahtuvan oppimisen indusoimat transkriptitasot joko vahvistuivat samaan suuntaan (yksityisten geenitranskriptitasojen lisäysten tai lisäysten seurauksena) (kuvio 2b) tai tylsisivät verrattuna yksinoppimiseen (kuvio 2c). Yksi tärkeimmistä biologisista reiteistä näissä olosuhteissa oli neuroaktiivinen ligandi-reseptori -vuorovaikutus (DEG/ALL: 30/194; p=0.016; Taulukko 1), joka sisälsi hermoaktivaatiolle ratkaisevia efektoreita.

Toinen huippureitti oli ekstrasellulaarisen matriisireseptorin (ECM-reseptori) vuorovaikutus (DEG/ALL: 14/69; p=0.04; Taulukko 1). ECM:n komponentit ovat kriittisiä aivokuoren plastisuuden ja muistin lujittumisen kannalta (Happel, et al., 2014; Banerjee, et al., 2017; El-Tabbal, et al., 2021; Sonntag, et al., 2015). Nämä reitit tarjoavat potentiaalisia vaihtoehtoja, kenties täydentäviä, kolinergiselle signaloinnille, jotka voivat helpottaa kestäviä kokemuksesta riippuvia muutoksia kuulotoiminnassa (Ji, Gao ja Suga, 2001; Luo & Yan, 2013; Metherate, 2011). Muut geenit, joiden ilmentyminen muuttui kuulooppimisen myötä, mutta ei edelleenkään HDAC:n eston seurauksena, liittyivät todennäköisesti tehtävän proseduuriolosuhteisiin eikä äänispesifiseen assosiatiiviseen muistiin. Esimerkiksi apeliinin signalointireitti tunnistettiin (DEG/ALL: 20/116; p=0.0005), joka on tärkeä aivoissa vedenoton homeostaattisessa säätelyssä (Hu, et al., 2021). Transkriptitasojen suora vertailu kahden koulutettujen rottien ryhmän välillä (oppiminen HDAC-inhibitiolla tai ilman sitä) osoitti hyvin vähän ainutlaatuisesti differentiaalisesti ekspressoituneita geenejä (DEG).

Todennäköisimpien DEG:ien tunnistamiseen käytetty kynnys (p =0.05) havaitsi, että vain Adamts13, U6, Rexo4 ja Cabin1 ilmentyivät eri tavalla (kuva 2d). Näin ollen HDAC-estämisen tärkein vaikutus näyttää olevan moduloida kuulooppimisen indusoimien geenien ilmentymistä normaaleissa olosuhteissa sen sijaan, että hankittaisiin äskettäin ainutlaatuisia geenejä, jotka säilyttävät äänispesifisen muistin. Yhdessä nämä havainnot osoittavat laajamittaisia ​​transkriptiomuutoksia kuulokuoressa varhaisessa harjoitteluvaiheessa, kun aikuiset eläimet oppivat erottamaan äänimerkkien väliset assosiatiiviset suhteet. Yhdessä vakiintuneiden neurofysiologisten ja käyttäytymiseen liittyvien raporttien kanssa HDAC:n estämisestä kuulotoiminnan edistämiseksi, nämä havainnot tukevat taktiikkaa käyttää HDAC-estäjää erottamaan geenit, joiden ilmentyminen määrää kuulomuistin muodostumisen onnistumisen.

Useita kiinnostavia geenejä (GOI) valittiin rikastusanalyyseistä inbiologisista reiteistä genominlaajuisen sekvensoinnin validoimiseksi geenikohdistetulla lähestymistavalla. Näytteet kerättiin erillisistä kohortteista, jotka replikoivat kahta koulutettujen ja hoidettujen eläinten ryhmää samalla varhaisessa vaiheessa. harjoitusaikapiste (eli tunti kolmannen 2TD-harjoitusistunnon jälkeen) käytettäväksi geeniekspressioanalyysissä käyttäen kvantitatiivista reaaliaikaista polymeraasiketjureaktiota (qRT-PCR). 2TD:n suorituskyvyssä ei ollut eroja replikoituneissa kohorteissa (RGFP9661: 61±5.0% vs. RGFP9662: 67±6.0%; t(8.441)=-0.834, p {{20}}.4274 ja Ajoneuvo1:71±6.0% vs. Ajoneuvo 2: 74±3,0 %; t(4.0809)=-0.444, p {{ 34}}.6796; Welchin t-testi).

Ensimmäinen GOI oli Egr1, hyvin tutkittu, aktiivisuudesta riippuvainen "välittömän varhaisen geenin" tiedetään saavuttavan huippunsa ensimmäisten oppimistuntien aikana ja kriittinen muistin muodostukselle (Duclot & Kabbaj, 2017). Se oli topplearning-indusoitu geeni, jonka ilmentyminen oli vahvistettua ja jota myös vahvistettiin HDAC-inhibitiolla erillisessä eläinryhmässä geenikohdistetussa tutkimuksessa (kuvio 3). Sama koski Per2:ta, geeniä, joka osallistuu vuorokausirytmien ja serotoninergisten reittien säätelyyn aivoissa (Bae, et al., 2001; Albrecht, et al., 2001; Cuesta, et al., 2009; Reh, et al. ,2020). Per2 on osa "kellogeeni"-perhettä, joka on liitetty HDAC-modulaatioon muilla aivojen alueilla (Kwapis, et al., 2018), ja sillä voi olla rooli myös kuulotoiminnassa (Reh et al., 2020). Sitä vastoin jotkin genomin laajuisesti tunnistetut GOI:t vahvistettiin vain osittain.

Chrna7 koodaa dynaamisen nikotiiniasetyylikoliinireseptorin (nAChR) alayksikköä, jonka havaittiin alentuneen kuulooppimisen myötä, mikä on yhdenmukainen neurofysiologisen näytön kanssa (Takesian, etal., 2018; Kuchibhotla, et al., 2017). Näin ollen odotimme, että geenikohdennettu tutkimus vahvistaa Chrna7:n alasäätelyn kaikissa 2TD-koulutetuissa eläimissä, mutta alasäätely oli ilmeistä vain vehikkelillä hoidetuilla eläimillä, jotka oppivat 2TD:n ilman HDAC-estoa. Muut valitut GOI-geenit olivat Nr4a-orponukleaaristen reseptorien perheestä Nr4a1 ja Nr4a2, jotka ovat välittömästi varhaisia ​​geenejä, joiden kerrottiin olevan välttämättömiä RGFP966:n selektiivisen HDAC-kohteen myötävirtavaikutusten levittämiseksi muilla aivoalueilla (McQuown et al., 2011; Kwapis et al. ., 2019).

Aiempien raporttien mukaisesti tehtävästä riippuvaisista alueellisista eroista Nr4a-perheen geeniekspressiossa (McNulty, et al., 2012), Nr4a1, mutta ei Nr4a2, säädettiin kuulokuoressa kuulooppimisen jälkeen. Muita DEG:itä, Htr1a tai Adamts13, ei vahvistettu geenikohdistetulla tutkimuksella todennäköisesti johtuen eroista tunnetuissa transkriptiovarianteissa, joita räätälöidyt geenikohdistetuilla koettimillamme ei havaittu, tai tyypin I virheestä tai hienovaraisista käyttäytymiseroista koulutettujen eläinryhmien välillä. jäi havaitsematta 2TD-suorituskykymittareissa. Tutkimme myös Lynx1:tä, geeniä, jolla on pitkä toimintahistoria "kriittisen ajanjakson" kaltaisen plastisuuden avaamiseksi uudelleen sensorisessa aivokuoressa (Morishita et al., 2010), todennäköisesti sen vaikutuksesta kolinergiseen ja serotonergiseen modulaatioon (Takesian et al. , 2018). Vaikka se olisikin johdonmukaista aikaisempien genomin laajuisten raporttien kanssa, joiden havaitseminen epäonnistui (Kalish, et al., 2020), sitä ei havaittu RNAseq-tietojoukostamme eikä geenikohdistetussa tutkimuksessa.

Vaikka on edelleen haasteellista määrittää, voidaanko erot selittää todellisella biologisella tai yksilöllisellä vaihtelulla eläinten välillä tai teknisellä vaihtelulla alhaisen runsauden tai solutyyppispesifisten ilmentävien transkriptien vuoksi, raportoimme poikkeuksellisen johdonmukaisia ​​tuloksia joillekin GOI:ille. Koska Chrna7:n, Egr1:n ja Per2:n oppimisen aiheuttama ilmentyminen on johdonmukaista geenikohdennettujen ja genominlaajuisten lähestymistapojen ja koulutettujen eläinten eri kohorttien välillä, on selvää, että nämä geenit voivat olla keskeisimpiä toimijoita kestävien muutosten kannalta. kuulotoiminto ja muisti, ja ne ovat nyt ensisijaisia ​​tulevaa tutkimusta varten.

Yhdessä tarkasteltuna löydökset paljastavat dynaamisen transkription maiseman aikuisen kuulokuoressa, joka voisi tukea syntyvää kuulotoimintaa neurofysiologiassa ja käyttäytymisessä. Koska aistijärjestelmän toiminnan epigeneettiset kontrollit ovat lisääntyneet (vrt. Shang & Bieszczad, 2022), on jännittävää pohtia. kuinka epigeneettiset mekanismit vaikuttavat tasapainottamiseen kuulokortikaalisten piirien kokemuksesta riippuvaisen plastisuuden kanssa. Esimerkiksi nykyinen genominlaajuinen tietoaineisto tunnisti myös oppimisen aiheuttaman vähentymisen arepressiivisen histonideasetylaasin, Hdac9:n, ilmentymisessä, joka puuttui HDAC-estämisen yhteydessä.

On houkuttelevaa verrata vähentyneen HDAC9-ekspression vaikutusta farmakologisesti inhiboivien HDAC:ien vaikutukseen oppimisen aiheuttaman transkription edistämiseksi. Toinen tärkeä epigeneettisten säätelyaineiden luokka muuttaa DNA:ta histoneiden sijaan. Esimerkkejä ovat Tet1 ja Gadd45b, jotka molemmat vaikuttavat DNA:n metylaatioon (Bayraktar & Kreutz, 2018) ja joiden havaittiin olevan alas- ja ylöspäin säädelty oppimisen kanssa HDAC-estämisen alaisena. Lisäksi mikroRNA:iden luokka esiintyi tärkeimpänä biologisena reittinä, joka oli indusoitu HDAC-estämisen avulla (katso taulukko 1), jotka ovat saavuttaneet vetovoiman kentällä hermoston transkription säätelyn tärkeimpinä epigeneettisinä säätelijöinä (Saab & Mansuy, 2014). Korkeamman asteen molekulaariset vuorovaikutukset epigeneettisten toimijoiden ja ekspressoituneiden geenien proteiinituotteiden välillä ovat myös todennäköisiä. Esimerkiksi tunnistettu ylöspäin säädelty Egr1 voi rekrytoida Tet1:n poistamaan repressiivisiä metylaatiomerkkejä aktivoidakseen alavirran geenejä (Sun et al., 2019). Lisää molekyylitutkimuksia tarvitaan, jotta voidaan analysoida kuulojärjestelmän epigeneettisten säätelijöiden välisten vuorovaikutusten merkitystä oppimisen aikana. Lisäksi tämä raportti tarjoaa välittömän mahdollisuuden luoda yhteyksiä valittujen kuulokuoren geenien ja niiden alavirran efektorien välille.

Näiden geenien ja molekyylien välisen kuilun kurominen umpeen niiden vaikutuksiin äänen aiheuttamiin neurofysiologisiin tapahtumiin on olennaista, jotta ymmärrettäisiin, kuinka aikuisen kuulojärjestelmä mukautuu kokemukseen muuttamaan käyttäytymistä. Itse asiassa de novo -transkription translaatiota tarvitaan käyttäytymistoimintojen pitkäaikaisiin muutoksiin, koska ne tuottavat pysyviä muutoksia solun toimintaan. Esimerkiksi oppimisen aiheuttamien transkriptioprosessien tärkeimmät kohdeefektorit voivat muuttaa kanavien tai reseptorien saatavuutta (Metherate, Intskirveli ja Kawai, 2012; Brown & Kaczmarek, 2011; Henton, Zhao ja Tzounopoulos, 2023) äänen määräävissä piireissä. herätetty kynnys, reagointikyky ja vastaanottava kenttäarkkitehtuuri kuulojärjestelmässä. On perusteltua olettaa, että erilaiset kuulotehtävät rekrytoisivat ainutlaatuisia geeniverkkoja tiettyjen solutoimintojen kannalta oleellisille biologisille reiteille, jotka tukisivat tehtävään liittyvän ääniominaisuuden tai tehtävärakenteen oppimista.

Kaiken kaikkiaan tämä raportti toimii lähtökohtana, jotta RNAseq-tietojoukot saataisiin saataville oppimis-, aikuis- ja kuulokuoresta (katso Data Repository). Pyrkimys kaventaa tietokuilua, jota pahentaa aikuisen kuulokuoren molekyyligeneettisiin prosesseihin keskittyvien tutkimusten vakava puute, on nyt tervetullut. Kannustamme tutkimaan bulkki-RNA-sekvensoinnin spatio-temporallimitaatioita, joiden herkkyyttä rajoittaa teknisesti myös lukusyvyys (Li& Wang, 2021), varsinkin kun modernit Omics-tekniikat kehittyvät ja paranevat nopeasti.

Vaikka kuulokuoren tutkimukset ovat edistyneet molekyyligenetiikassa, jotka ovat tunnistaneet olennaiset molekyylikaskadit (Schicknick et al., 2008), sallivat IEG-profiilit (Mello, Velho ja Pinaud, 2006; de Hoz, et al., 2018). Peter, et al., 2011) ja jopa kromatindynamiikasta (Peter et al., 2021), kuuloalueella on ennakkotapaus, jossa transkriptiodynamiikkaa tutkitaan kauniisti (Kwan, 2016; Barta, et al., 2018; Li, et al. al., 2020; Ebeid, et ai., 2017). Olemassa olevat molekyylityökalut, kuten yksisoluinen RNA-sekvensointi (RNA-Seq) ja pienimolekyylinen fluoresoiva in situ -hybridisaatio (smFISH), ovat hyödyllisiä antamaan näkemyksiä kokemuksesta riippuvaisesta solujen välisestä vaihtelusta ja molekyylien vuorovaikutuksista kuulokortikaalisoluissa ja -piireissä. Toisin kuin bulkki-RNAseq, nämä menetelmät kunnioittavat syvää solujen monimuotoisuutta ja korkeamman järjestyksen organisaatiota kuulokuoressa, kuten sen kerroskohtaista mikropiiriä ja lemniskaalista topografiaa.
Älykkäät lähestymistavat merkki- ja sekvenssitranskripteihin vain äskettäin aktiivisista kuulokuoren soluista (Cho, Huang ja Gray, 2016) voivat lisätä herkkyyttä riittävän lujasti saadakseen toiminnallisesti merkityksellisimmät geenisarjat toiminnallisesti merkityksellisimmistä solutyypeistä ja -populaatioista. Samanlaisia ​​lähestymistapoja voitaisiin käyttää myös aivokuoren alapuolella aivokuoren aktiivisuudesta riippuvaisten alueellisten transkriptomisten profiilien kaappaamiseen ja kontrastointiin, jotka kunnioittavat aivokuoren uskomatonta integraatiota kuulojärjestelmän subkortikaaliseen toimintaan erilaisissa kuunteluolosuhteissa tai käyttäytymisvaatimuksissa. Aikuisten aivojen kuulooppimisen taustalla olevien geneettisten ja molekyylimekanismien solujen ja alueellisten erojen täydellinen karakterisointi on ensiarvoisen tärkeää kehitettäessä paikkaselektiivisiä ja molekyyliin kohdistettuja tarkkuusterapioita, jotka mahdollistavat voimakkaita ja pysyviä toiminnallisia muutoksia tukemaan tiettyjä kuulo- ja kuuntelukykyjä koko elinkaaren ajan.

menetelmät

Koehenkilöt: Yhteensä 24 aikuista Sprague-Dawley-urosrottaa (250-300 g saapuessaan; Charles RiverLaboratories, Wilmington, MA) käytettiin käyttäytymis- ja molekyylikokeissa. Kaikki eläimet sijoitettiin yksitellen lämpötilasäädeltyyn (24 ˚C) yhdyskuntahuoneeseen 12-tunnin valo/pimeysjaksolla. Koehenkilöillä oli ad libitum mahdollisuus saada ruokaa ja vettä ennen käyttäytymiskoulutusta. Kaikki menettelyt hyväksyttiin ja suoritettiin Institutional AnimalCare and Use -komitean (IACUC) ohjeiden mukaisesti Rutgersissa, New Jerseyn osavaltion yliopistossa (protokollanro: 999900026 (KMB)).

Käyttäytymislaitteisto ja ääniärsykkeet: Kaikki käyttäytymisistunnot suoritettiin kahdessa identtisessä instrumentaalisessa ehdollistamiskammiossa (H{{0}}TC-NSF; Coulbourn Instruments, Holliston, MA) äänenvaimennuslaatikossa. Päivittäiset harjoitukset tasapainotettiin molemmille kammioille yhtäläisen altistuksen varmistamiseksi. Jokainen kammio (12" L x 10" S x 12" K; metalliverkkolattia oli varustettu vastevivulla (H21-03R), talon valolla (K11-01R), kaiuttimella (K{) {8}}R) ja vedenjakelujärjestelmä (H14-05R). Koulutusvaiheiden aikana eläimet saattoivat painaa vastevipua ("barpress"), mikä laukaisi vesikupin (~0,02cc) palkintoportissa (1,25"L x 1,625" K). Käsikytkintä (K21-01) käytettiin varhaisen istunnon aikana eläimen tangon painalluksen reaktion muotoiluun laukaistakseen vesikupin, joka mahdollisti pääsyn Käyttäytymisvasteet tallennettiin Graphic State 4 -ohjelmistolla (CoulbournInstruments, Holliston MA) offline-analyysiä varten.

Kaikki kuuloärsykkeet luotiin käyttämällä Tucker-Davis Technologies (TDT, Alachua, FL) ja RPvdsEx-ohjelmistoa, ja ne esitettiin operanttikammion seinään asennetun kaiuttimen kautta. Valkokohinaa (proseduurikoulutuksen aikana; kuva 1a) esitettiin 7 tai 9 sekuntia (75 dB SPL). Puhtaita ääniä (kaksisävyisen erottelukoulutuksen aikana; kuva 1a) esitettiin aina 8 s (70 dB SPL). Äänitasot kalibroitiin päivittäin digitaalisella äänimittarilla (Larson DavisSoundTrack LxT1).

Käyttäytymisharjoittelu ja HDAC3:n farmakologinen esto: Yhden päivän vivariumiin sopeutumisen jälkeen rottia käsiteltiin päivittäin vähintään 3 päivän ajan. Ennen käyttäytymisharjoittelun aloittamista rotat asetettiin rajoitetun veden annosteluohjelmaan, kunnes ne saavuttivat 85 % ikäisten vertailueläinten rajoittamattomasta painosta. Vesirajoitetut rotat muotoiltiin sitten äänivaimennettujen kammioiden sisään, jotta ne pystyisivät puristamaan vesipalkkioita (kuvio la). Barpressin muotoilu ja myöhempi ääniharjoittelu tehtiin aiemmin kuvatulla tavalla (Shang, Bylipudi & Bieszczad, 2019). Lyhyesti sanottuna kaikki eläimet muotoiltiin barpressoimaan 5 päivän ajan ja koulutettiin sitten prosessitehtävässä oppia painamaan ääntä, mikä tässä vaiheessa oli laajakaistainen Gaussin kohinaärsyke (1-12,5 kHz kaistanpäästösuodatettu valkoinen kohina; 75 dB SPL) vesipalkinnon saamiseksi. Kaikki eläimet oppivat yhdistämään tämän äänen palkkioon ennen kuin he jatkoivat harjoituksen seuraavaan vaiheeseen. Proseduurikoulutus osoitti yksilöllistä vaihtelua siinä, kuinka nopeasti eläimet kykenivät oppimaan tehtävän korkealle suoritustasolle. Siitä huolimatta kaikki eläimet pystyivät saavuttamaan suoritustason, joka oli suurempi tai yhtä suuri kuin 90 % kahtena peräkkäisenä päivänä (keskiarvo=92,85 %, sem =0,01 %) keskimäärin 12,67 päivän jälkeen ( sd=2.85 päivää). Suorituskyky on laskettu käyttämällä 100 %.

Koulutuksen seuraava vaihe oli kaksiäänisen erottelun (2TD) tehtävä (kuva 1a), jossa rottia koulutettiin erottamaan kaksi spektrisesti erilaista äänitaajuutta. S+-sävyyn (50 kHz; 70 dB SPL) kohdistuvat lyönnit johtaisivat vesipalkkion esittämiseen, kun taas tangon painallukset kiveen (11,5 kHz; 70 dB SPL) johtivat virhesignaaliin (vilkkuva talo). valo) ja "aikakatkaisu" (6 sekuntia lisää odottamaan seuraavan kokeilun alkua). S+- ja S-S-kokeet satunnaistettiin ja kestivät 8 s. Kokeiden väliset intervallit (ITI:t) olivat keskimäärin 15 sekuntia (väli: 5-25 s, satunnaistettu). Barpressit äänettömän ITI:n aikana olivat merkityksettömiä (ei aikakatkaisua, ei virhesignaalia tai vesipalkkiota). Päivittäiset istunnot kestivät 45 minuuttia. Kaikki eläimet suorittivat 2TD-tehtävän yhteensä kolmena peräkkäisenä päivänä. Koulutettu tarkkailija laittoi rotat pariksi niin, että eläimille, joilla oli samanlainen prosessitehtävän suorittamisnopeus, määritettiin erilaiset hoitoolosuhteet 2TD-vaiheessa. Suorituskykyä vastaavat parit saivat systeemisiä injektioita joko farmakologisen luokan I HDAC3-estäjää RGFP966 (Abcam Inc., ab144819; 10 mg/kg;sc; N=12) tai vehikkeliliuosta (N=9) välittömästi jokaisen jälkeen. 2TD istunto. 2TD-tehtävän suorituskyky laskettiin aiemmin kuvatulla tavalla: 100 % (Shang, Bylipudi & Bieszczad, 20).

).Kudosten kerääminen ja RNA:n eristäminen: Tunti sen jälkeen, kun eläimet olivat saaneet kolmannen ja viimeisen RGFP966-injektion kolmannen 2TD-istunnon jälkeen, aivot leikattiin nopeasti ja pakastettiin 2-metyylibutaanin dekantterilasiin, joka asetettiin kuivajäälle. Pikapakastetut aivot säilytettiin sitten lämpötilassa -80˚ C tulevaa käsittelyä varten. Aivojen valmistelemiseksi kryosektiota varten aivot suojattiin epäoptimaalisen leikkauslämpötilan yhdisteellä (OCT) ja niitä säilytettiin -20˚ C:ssa 12-24 tuntia sen varmistamiseksi, että aivokudos saavuttaisi -20˚ C leikkaamista varten. OCT:hen koteloidut aivot leikattaisiin sitten vaakatasossa kryostaatissa (Leica CM 3050S) 250 µm:n paksuudella. Käyttämällä 1 mm:n pyöreän kudoksen mikrolävistystä otettiin 2 mm3 kuulokuoren kudosta kustakin pallonpuoliskosta (yhdistettynä yhdeksi näytteeksi yhteensä 4 mm3 aivoaluetta kohti) RNA:n uuttamista varten. Kuulokortekslokaatio tunnistettiin käyttämällä Paxinoksen ja Watsonin The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates -julkaisua (6. painos) vertailuna (noin A/P=-3,6 - -5,8 mm, M/L {{20} } ±6,4 mm D/V=-4,2 - -5,8 mm ja hippokampuksen käyttö maamerkkinä

Kokonais-RNA kustakin näytteestä eristettiin käyttämällä PureLinkTM RNA Mini Kit -sarjaa (ThermoFisher) käyttäen valmistajan protokollaa. RNA-näytteet puhdistettiin sitten RNA Clean andConcentratorTM -25 Kit -sarjalla (Zymo Research).

Gene expression analysis, Gene Ontology (GO) biological process analysis, and gene set enrichment analysis (GSEA): RNA-seq analysis was conducted by the Iowa Institute of Human Genetics (IIHG; Iowa City, IA, USA). Briefly, using 500 ng total RNA (all RIN values >8), luotiin sekvensointikirjastot käyttämällä Illumina TruSeq® Stranded mRNA Library Prepkit -pakkausta valmistajan suosittelemien protokollien mukaisesti. Kirjastot yhdistettiin ja sekvensointi suoritettiin Illumina NovaSeq 6000 -laitteella, joka käytti 100 bp:n paritetun pään SBS-kemiaa. Lukemat käsiteltiin "bcbio-nextgen.py" avoimen lähdekoodin tietotekniikan putkilinjalla, joka on kehitetty ensisijaisesti Harvard Chan Bioinformaticsissa (v.1.2.4), joka toimii Argon HPCresourcella Iowan yliopistossa. Tämä putki sisältää "parhaiden käytäntöjen" lähestymistapoja lukulaadun hallintaan, lukujen kohdistukseen ja kvantitointiin. "bcbio-nextgen.py"-liukulinja ajettiin "RNA-seq"-tilassa "rn6"-avaimella valittuna genomin koontiversiona (sisäisesti viitaten Ensembl-kokoonpanoon ja genebuildiin "Rnor_6.0"). Kohdistettu liukuhihna lukee Rnor_6.0-genomiin käyttämällä liitostietoista, erittäin nopeaa hisat2-kohdistajaa (2.2.1) ja samanaikaisesti kvantifioitua lukemista transkriptomiin käyttämällä "lohi" (1.4.0) -kohdistajaa. Qualimap (2.2.2), laskentatyökalu, joka tutkii hisat2 BAM -kohdistustiedostoja, käytettiin luettujen tietojen tutkimiseen laadunvalvontaa varten. Sekvenssien laatupisteet läpäisivät perustarkastukset ja sekvenssien kopiointinopeudet olivat hyväksyttävien parametrien sisällä. Kaikki näytteet läpäisivät QC:n lukujen kohdistusta varten eksonisille alueille. Lohista johdetut transkriptien kvantifikaatiot (TPM tai "transkriptit per miljoonaa") tuotiin ja niistä tehtiin yhteenveto arvioituihin lukemiin geenitasolla käyttämällä Rstudion tximport-ohjelmaa (1.12.3), kuten on kuvattu parhaissa harjoittelee DESeq2 vinjettiä(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/DESeq2/inst/doc/DESeq2.html).

Geenit, joiden arvioitu määrä oli alle 5 kaikissa näytteissä, esisuodatettiin alavirran analyysistä suositellun menettelyn mukaisesti. Differentiaalinen geeniekspressioanalyysi suoritettiin DESeq2:lla (v.1.24.0) arvioiduilla geenitasomäärillä. FDR 5 % ja X< abs(logFC) < 10 was set as a cutoff for differential expression (DEGs). Heatmaps, line graphs, and volcano plots were generated using clusterProfiler packages in R/Bioconductor. Gene level, pathway, and DEG analyses were generated using iPathwayGuide (Advaita Bioinformatics, https://www.advaitabio.com/ipathwayguide; last accessed November 15, 2022). iPathwayGuide scores pathways using the Impact Analysis method (Draghici et al., 2007); Tarca et al., 2009, Khatri et al., 2007). The underlying pathway topologies, comprised of genes and their directional interactions, are obtained from the KEGG database (Kanehisa et al., 2000; Kanehisa et al., 2010; Kanehisa et al., 2012; Kanehisa et al., 2014).

RNA-seq-tietojen validointi qRT-PCR:llä: RNA-seq-tiedot validoitiin qRT-PCR:llä mRNA:sta, joka oli erotettu eri rottaryhmistä. Viisi transkriptiota valittiin luettelosta uusista DEG:istä, jotka löydettiin kullakin alueella lähtötasolla. Kolme geeneistä perustui hypoteeseihin perustuen kuulokortikaaliseen fysiologiseen ja käyttäytymiseen liittyvään kirjallisuuteen, kun taas kolme muuta geeniä olivat uusia geenejä, jotka tunnistettiin geenitasolla ja DEG-analyyseillä lääke- ja vehikkeliryhmien vertailussa. Kaikki alukesekvenssit valittiin joko rottien aivokudosta koskevasta aikaisemmasta kirjallisuudesta (sekvenssit alla olevassa taulukossa) tai ne suunniteltiin käyttämällä NCBI Primer Blastia ja validoitiin kohdespesifisyys arvioimalla sulamiskäyriä ja PCR-amplikonituotteen sekvensointia. qRT-PCR-analyysit suoritettiin QuantStudio 3:ssa (Applied Biosystems) SsoAdvancedTMUniversal SYBR Green Supermixillä (Bio-Rad). Jokaista näytettä kohden 500 ng cDNA:ta monistettiin käyttämällä iScriptTM cDNA Synthesis Kit -sarjaa (Bio-Rad).

Kiitokset

Kirjoittajat haluavat kiittää tohtori Andrea Shangia, Sean Tsauria ja Sooraz Bylipudia heidän avustaan ​​käyttäytymismenetelmissä ja analyyseissa; Dr. Mimi L. Phan avustamisestaan ​​RNA:n erottamisessa ja näytteenottoprotokollassa; Tri Troy A. Roepke, Ali Yasrebi ja ChristopherO'Brien avustamisestaan ​​RNA-näytteen puhdistusanalyysissä; ja Alisa Ray teknisestä avusta. Haluamme kiittää kaikkia nykyisiä ja entisiä CLEF Labin työntekijöitä avusta ja tuesta.

Tätä työtä tukivat National Institutes of Health, National Institute of Defness and Communication Disorders [R{0}}DC014753 to KMB]; Rutgersin yliopiston taiteiden ja tieteiden korkeakoulu; Rutgersin yliopiston Aresty-säätiö, jolla on pieni apurahoitus perustutkintotutkimukseen; ja Project SUPER -ohjelma Rutgersin yliopistossa pienellä apurahalla perustutkintotutkimukseen.

Viitteet:

Alberini, CM ja Kandel, ER (2014). Transkription sääntely muistin konsolidoinnissa. ColdSpring Harbor Perspectives in Biology, 7(1), a021741.doi:https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021741

Albrecht, U., Zheng, B., Larkin, D., Sun, Z., & Lee, C. (2001). MPer1 ja mper2 ovat välttämättömiä vuorokausikellon normaalille nollaukselle. J Biol Rhythms, 16, 100-104. doi: 10.1177/074873001129001791.

Aschauer, D. ja Rumpel, S. (2016). Sensorinen neokortex ja assosiatiivinen muisti. BehavioralNeuroscience of Learning and Memory, 37, 177-211.doi:https://doi.org/10.1007/7854_2016_453

Bae, K., Jin, X., Maywood, ES, Hastings, MH, Reppert, SM ja Weaver, DR (2001). mPer1:n, mPer2:n ja mPer3:n differentiaalifunktiot SCN-vuorokausikellossa. Neuron, 30, 525-536.doi:10.1016/S0896-6273(01)00302-6.

Bakin, JS ja Weinberger, NM (1996). Fysiologisen muistin induktio aivokuoressa stimuloimalla nucleus basalis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States, 93(20), 11219-11224. doi:https://doi.org/10.1073/pnas.93.20.11219

Banerjee, SB, Gutzeit, VA, Baman, J., Aoued, HS, Doshi, NK, Liu, RC, & Ressler, KJ (2017). Perineuronaaliset verkot aikuisen sensorisessa aivokuoressa ovat välttämättömiä pelon oppimiseen. Neuron, 95(1), 169-179. doi:10.1016/j.neuron.2017.06.007

Barta, CL, Liu, H., Chen, L., Giffen, KP, Li, Y., Kramer, KL, . . . Hän, DZ (2018). Aikuisten seeprakalan sisäkorvan karvasolujen RNA-seq-transkriptomianalyysi. Scientific Data, 5, 180005.doi:https://doi.org/10.1038/sdata.2018.5

Bayraktar, G., & Kreutz, MR (2018). Aktiivisuudesta riippuvan DNA:n demetylaation rooli aikuisen aivoissa ja neurologisissa häiriöissä. Frontiers in Molecular Neuroscience, 11, 169.doi:10.3389/fnmol.2018.00169

Bieszczad, KM, Bechay, K., Rusche, JR, Jacques, V., Kudugunti, S., Miao, W., . . . Wood, MA (2015). Histonin deasetylaasi-inhibitio RGFP966:n kautta vapauttaa aistinvaraisen aivokuoren plastisuuden ja muistin muodostumisen spesifisyyden. J Neurosci, 35(38), 13124-13132.doi:https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.{2}}.2015

Brown, MR ja Kaczmarek, LK (2011). Kaliumkanavan modulaatio ja kuulokäsittely. Kuulotutkimus, 279(1-2), 32-42. doi:https://doi.org/10.1016/j.heares.2011.03.004

Bychkov, ML, Vasilyeva, NA, Shulepko, MA, Balaban, PM, Kirpichnikov, MP, & Lyukmanova, EN(2018). Lynx1 estää A-1-42- ja JNK-aktivoinnin aiheuttaman neuromodulaattorin ilmentymisen pitkäaikaisen estämisen ja vähentämisen. Acta Naturae, 10(3), 57-61.

Reference:1950477648n@gmail.com