Koe 4 Cistanche Deserticola Fenyylietanoliglykosidin vaikutus hiiren perimenopausaalisen oireyhtymän masennusmalliin materiaaleihin ja menetelmiin 1 koemateriaalit

1.1 Koeeläimet

SPF-luokan hiiret, Kunming-rotu, naaras, 18–22 g, tarjoaa Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd., tämän erän hiirten sertifikaattinumero: 0016003; laboratoriotodistus numero SYXK (Yu) 2010-001. 1.2 Koelääkkeet

Cistanche-fenyylietanoliglykosidivalmistettiin kokeen 1 menetelmän mukaisesti ja pitoisuus saavutti 66,47 %. Gengnian'an-kapseli, ainesosat: Rehmannia glutinosa, Rehmannia glutinosa, Alisma, Ophiopogon japonicus, Scrophulariaceae, pionin kuori, Poria cocos, helmiäinen, curculigo, Schisandra chinensis, magnetiitti, Polygonum multicaraum, polygonum multicarat . Toiminnot ja indikaatiot:Ravitse yiniä ja hillitse yangia, helpottaa vaivojajarauhoittaa mieltä. Käytetään vaihdevuosien kuumien aaltojen ja hikoilun, huimauksen, tinnituksen, ärtyneisyyden ja unettomuuden hoitoon. Tekniset tiedot: 0,3 g per kapseli. Käyttö ja annostus: Suun kautta, 3 kapselia kerrallaan, 3 kertaa päivässä. Valmistaja: Shanxi Tianxing Pharmaceutical Co., Ltd. Tuotantoerän numero: 121104. Hyväksyntänumero: National Drug Approval No. Z14021848.

KUINKA KAUVAN KESTÄÄ, ETTÄ CISTANCHE TOIMII?

Soijaisoflavonit ja E-vitamiini pehmeät kapselit, ainesosaluettelo: soijaisoflavonijauhe, E-vitamiini, auringonkukkaöljy, gelatiini, glyseriini, vesi, tartratsiini, titaanidioksidi. Ikoniset ainesosat ja sisältö: Jokainen 100g sisältää 55,2 mg soija-isoflavoneja (genisteiininä laskettuna) ja 608,5 mg E-vitamiinia. Terveystoiminnot: Lisää luun tiheyttä. Ohjeet ja annostus: Ota 1 kapseli 2 kertaa päivässä lämpimän veden kera. Tekniset tiedot: 500mg × 100 kapselia. Valmistaja: Weihai Ziguang Biotechnology Development Co., Ltd. Tuotantoerän numero: 13070302. Hyväksyntänumero: Guoshijianzi G20080032. 1.3 Kokeelliset reagenssit

Natriumkarboksimetyyliselluloosa, Tianjin Hengxing Chemical Reagent Manufacturing Co., Ltd., eränumero: 20120418; penisilliininatrium injektiota varten, North China Pharmaceutical Co., Ltd., erittely: 4 miljoonaa yksikköä, tuotantoerän numero: c1206807; formaldehydiliuos (analyyttinen laatu), Yantai City Shuangshuang Chemical Co., Ltd., tuotantoerän numero: 20130902; 0,9 % natriumkloridi-injektio, Chenxin Pharmaceutical Co., Ltd.; erittely: 250ml, tuotantoerän numero: 1301265303;

Kloorihydraatti, Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute, eränumero 20120827; hiiren E2 ELISA -tunnistussarja, R&D Company, eränumero: 20140101A; hiiren T ELISA -tunnistussarja, R&D Company, eränumero: 20140101A; hiiren LH ELISA -tunnistussarja, R&D Company, eränumero: 20140101A; Hiiren FSH ELISA -tunnistussarja, R&D Company, eränumero: 20140101A;

Mouse DA ELISA -tunnistussarja, R&D Company, eränumero: 20140101A; Hiiri 5-HT ELISA -tunnistussarja, R&D Company, eränumero: 20140101A. 1.4 Koevälineet

Elektroninen vaaka, Shanghai Minqiao Medical Instrument Co, Ltd, malli: JY601; elektroninen analyyttinen vaaka, Ohaus (Shanghai) Company, malli: AR1140/C; nopea pöytäsentrifugi, Shanghai Anting Scientific Instrument Factory, malli: TGL-168 ; Sähkötermostaattinen vesihaude, Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co, Ltd, malli: HWS12; Hiiren autonominen aktiivisuuden testaaja, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., malli: ZZ-6; Hiiren pimeyden välttämismittari, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., malli: BA-200; hännän jousituksen testaaja, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., malli: TS-200; nopea jäähdytetty sentrifugi, HKUST Innovation Co., Ltd.:n Zhongjia Branch, malli: KDC-160HR; säädettävä pipetointi väline, Shanghai Leibo Analytical Instrument Co, Ltd;

Mikrolevylukija, American BIO-RAD Company, malli: 680;

Sähkömikroskooppi, Japani OLYMPUS Company, malli: BX61.

2 Kokeellinen menetelmä

2.1 Mallintaminen ja lääkkeiden anto

Valittiin 90 naaraspuolista Kunming-hiirtä, joiden ruumiinpaino oli 23-25g, ja 10 valittiin satunnaisesti tyhjäksi ryhmäksi, joille tehtiin näennäisleikkaus, ja loput hiiret käytettiin luomiseen. perimenopausaaliset mallit. Punnituksen jälkeen hiiret nukutettiin vatsaontelonsisäisellä injektiolla 10 % kloraalihydraattia (0,03 ml/10 g) ja vatsan asento kiinnitettiin. Sitten hiukset leikattiin hiiren takaosasta viimeisen kylkiluun alta, keskikainalaisen linjan leikkauskohdasta ja noin 1 cm selkärangan ulkopuolelta, ja leikattiin sitten desinfioinnin jälkeen. Ihon ja selän lihakset ovat noin 0.{9}}cm leveät. Viiltokentässä näkyy maidonvalkoinen kiiltävä rasvamassa, johon munasarja on upotettu. Tartu pienillä pinseteillä varovasti rasvamassaan ja vedä se ulos viillosta, erota rasvamassa, niin näet ryhmän ohuita, epäsäännöllisiä, kelta-punaisia ​​munasarjoja. Leikkauksen aikana sido munasarjat (mukaan lukien rasva) ensin ohuilla langoilla ja poista sitten munasarjat. Leikkauksen jälkeen kohdun sarvet laitetaan takaisin vatsaonteloon, lihakset ja iho ommellaan ja molemmat munasarjat poistetaan samalla tavalla. Leikkauksen jälkeen eläimet nostettiin varovasti ja penisilliiniä 200,{12}} u/kg (0,1 ml kukin) injektoitiin lihakseen infektion estämiseksi 3 peräkkäisenä päivänä kerran päivässä. 5 päivää leikkauksen jälkeen jokaiselle hiirelle tehtiin emättimen sivelytutkimus yksitellen kerran päivässä 5 peräkkäisen päivän ajan sen määrittämiseksi, olivatko munasarjat kokonaan poistettu. Hiiret, jotka osoittivat kiimareaktion sivelyssä, hylättiin, ja 60 täysin kastroitua hiirtä jaettiin satunnaisesti ja tasaisesti 6 ryhmään kokeellisia tarkoituksia varten, nimittäin malliryhmä, Mengnianan-ryhmä, soija-isoflavoniryhmä, suuri, keskikokoinen jaPieniannoksinen Cistanche-fenyylietanoliglykosidiryhmä. Jokaisen ryhmän eläimille annettiin vastaavat lääkkeet 10. päivänä leikkauksen jälkeen. Kuuden päivän annon jälkeen nollakoeryhmän hiiret kasvatettiin 5:ssä per häkki normaalin ruoan ja veden kanssa ilman stimulaatiota. Kaikki 6 malliryhmää kasvatettiin 1 hiiri per häkki, ja niille annettiin erilaisia ​​stimulaatioita satunnaisesti joka päivä. Seitsemää stressitekijää käytettiin satunnaisesti 18 päivän sisällä: kostea kuivike (1 g kuivike / 1 ml vettä); uinti jäävedessä (4 astetta, 5 min); lämpöstressi (45 astetta, 5 min); yövalaistus (24h); hännän kiinnitys (1 min); veden puute (24 h); paasto (24h). Ärsyke annettiin satunnaisesti joka päivä, ja jokainen ärsyke ei voinut ilmaantua yhtäjaksoisesti 18 päivään.

Valmistusmenetelmä: 0,5 % CMC Valmistusmenetelmä: Punnitse 4 g karboksimetyyliselluloosanatriumia ja sekoita se tislattuun veteen 800 ml:ksi.

Cistanchen fenyylietanoliglykosidiryhmän suurten, keskisuurten ja pienten annosten annokset olivat 200mg/kg, 10{{20}}mg/kg ja 50mg/kg (antotilavuus 0,1 ml/10 g). Valmistusmenetelmä: Punnitse 2000mg, 1000mg ja 500mg Cistanche-fenyylietanoidiglykosidia, liuottamalla ne pieneen määrään 0,5 % CMC:tä, säädä sitten tilavuus 100 ml:ksi, sekoita hyvin, ja siinä kaikki. Gengniangan-kapselit (675 mg/kg, sekoitettuna tislattuun veteen pitoisuuteen 67,5 mg/ml, 0,1 ml/10 g, mikä vastaa 15 kertaa kliinistä annosta); valmistusmenetelmä: ota 9 Gengniangan-kapselia, käytä ensin pieni määrä 0,5 % CMC Dissolve -liuosta, säädä sitten tilavuus 40 ml:ksi ja sekoita hyvin saadaksesi Gengnianan-kapselisuspension annoksen (675 mg/kg). Soijapapu Isoflavone E-vitamiini pehmeä kapseli (250 mg/kg, käytä tislattua vettä saadaksesi 25 mg/ml, 0,1 ml/10 g, mikä vastaa 15 kertaa kliinistä annosta); Valmistusmenetelmä: Ota 2 soijapavun isoflavoni-E-vitamiinipehmeää kapselia, käytä se ensin Liuota pieni määrä 0,5 % CMC:tä, säädä sitten tilavuus 40 ml:ksi ja sekoita hyvin saadaksesi soija-isoflavoni-E-vitamiinikapselisuspension (250 mg/kg) ). Säilytystapa: jäähdytä, pidä lämpimänä käytön aikana.

Antomenetelmä: Jokaisen ryhmän eläimille annettiin vastaavia lääkkeitä 10. päivänä leikkauksen jälkeen. Gengnian'an-ryhmälle annettiin suun kautta Gengnian'an-kapselisuspensiota 675 mg·kg-1, soija-isoflavoniryhmälle annettiin suun kautta 250 mg·kg-1 soija-isoflavoni-E-vitamiinikapselisuspensiota ja suuria, keskikokoinen japieniä annoksia Cistancheafenyylietanoli. Glykosidiryhmälle annettiin suun kautta suuria, keskikokoisia ja pieniä annoksia Cistanche-fenyylietanoliglykosidia 200mg·kg-1, 10mg·kg-1, 50mg·kg{{ 5}}, 0,1 ml/10 g. Nollaryhmälle ja malliryhmälle annettiin letku samalla tilavuudella 0,5 % CMC-liuosta kerran päivässä 30 peräkkäisen päivän ajan.

2.2 Havaintokohteet ja havaitsemismenetelmät

Pakkouinti: Ensimmäisenä päivänä kroonisen stressistimulaation päättymisen jälkeen kunkin ryhmän hiirten liikkumattomuusaikaa mitattiin 6 minuutin sisällä 2-6 minuuttia. (Laita kunkin ryhmän hiiret 2000 ml:n dekantterilasiin. Veden lämpötila on 25 astetta. Kellumisen ylläpitämiseen vaadittavan vähimmäisliikkeen lisäksi eläinten raajat pysähtyvät ja ne kirjataan liikkumattomiksi. Kirjaa koko liikkumattomuusaika alkaen 2. 6 minuuttiin 6 minuutin sisällä) Vapaaehtoinen aktiivisuustesti: Toisena päivänä kroonisen stressistimulaation päättymisen jälkeen mitattiin hiirten spontaanien aktiivisuuksien lukumäärä kussakin ryhmässä 5 minuutin sisällä.

Pimeyden välttämismenetelmä: Kolmantena päivänä kroonisen stressistimulaation päättymisen jälkeen laita hiiren häntä mittalaatikkoon pieneen pimeän aukkoon päin ja harjoittele. Mittaa uudelleen 24 tunnin kuluttua ensimmäisen kerran pimiöön saapuvan hiiren latenssi ja aika, joka kuluu pimiöön siirtymiseen 5 minuutin sisällä. Sähköiskujen määrä.

Häntäripustustesti: 5. päivänä kroonisen stressistimulaation päättymisen jälkeen hiirten liikkumattomuusaikaa kussakin ryhmässä 6 minuutin sisällä mitattiin 2-6 minuuttia.

2 tuntia viimeisen annoksen jälkeen (12 tuntia ilman ruokaa tai vettä) hiiret punnittiin, silmämunat poistettiin, veri kerättiin, seerumi erotettiin ja seerumin E2-, T-, LH- ja FSH-pitoisuudet. mitattu; hiiret tapettiin sitten kaulanikamien dislokaatiolla, ja hiiret leikattiin. , poista kateenkorva, perna ja kohdun kudos, punnitse niiden märkäpaino ja laske elinindeksi (elinindeksi=elimen märkäpaino mg/hiiren paino g), poista sitten aivot, leikkaa puolet ja valmistele aivot kudoshomogenaatti. Entsyymi-immunomääritystä käytettiin monoamiinin välittäjäaineiden 5-HT ja DA pitoisuuksien määrittämiseen aivokudoshomogenaatissa. Kateenkorva, perna, kohtu ja aivokudokset kiinnitettiin 10-prosenttisessa formaldehydiliuoksessa, upotettiin parafiiniin, leikattiin ja värjättiin HE:llä. Kunkin ryhmän morfologiset muutokset havaittiin valomikroskoopilla. 2.3 Kitin määritysmenetelmä

Ota seeruminäytteitä: Käytä koeputkia, joissa ei ole pyrogeenejä ja endotoksiineja. Vältä solustimulaatiota leikkauksen aikana. Kun veri on kerätty, sentrifugoi sitä nopeudella 3000 rpm 10 minuuttia seerumin ja punasolujen erottamiseksi nopeasti ja huolellisesti. Ota kudoshomogenaattinäytteitä: Lisää kudokseen sopiva määrä fysiologista suolaliuosta ja soseuta se. Sentrifugoi nopeudella 3000 rpm 10 minuuttia ja ota supernatantti.

Hiiren (Hiiri)estradioli (E2) ELISA-sarjan määritysmenetelmä on sama kuin kokeessa 2. Standardituotteiden (S0-55) pitoisuudet ovat: 0, 4, 8, 16, 32 ja 64 pmol/l.

Hiiren testosteronin (T) ELISA-sarjan määritysmenetelmä on sama kuin estradiolin (E2) määritysmenetelmä. Standardituotteiden (S0-55) pitoisuudet ovat: 0, 50, 100, 200, 400, 800 pg/ml.

Hiiren follikkelia stimuloivan hormonin (FSH) ELISA-sarjan määritysmenetelmä on sama kuin estradiolin (E2) määritysmenetelmä. Vakiotuotteiden (S0-55) pitoisuudet ovat: 0, 5, 10, 20, 40 ja 8{{30} }mIU/ml. Hiiren (Hiiri) luteinisoivan hormonin (LH) ELISA-sarjan määritysmenetelmä on sama kuin estradiolin (E2) määritysmenetelmä. Standardin (S0-55) pitoisuudet ovat: 0, 0,5, 1, 2, 4 ja 8 mIU/ml. Hiiren 5-hydroksitryptamiinin (5-HT) ELISA-sarjan määritysmenetelmä on sama kuin estradiolin (E2) määritysmenetelmä. Standardituotteiden (S0-55) pitoisuudet ovat: 0, 15, 30, 60, 120, 240 ng/ml. Hiiren (Mouse) dopamiinin (DA) ELISA-tunnistussarjan määritysmenetelmä on sama kuin estradiolin (E2) määritysmenetelmä. Standardituotteiden (S0-55) pitoisuudet ovat: 0, 7,5, 15, 30, 60 ja 120 pg/ml.

Taulukosta 21 ja kuvasta 25 voidaan nähdä, että nollaryhmään verrattuna malliryhmän hiirten liikkumattomuusaika lisääntyi merkittävästi pakkouinti- ja hännänripustuskokeissa (P<0.01), indicating that perimenopausal model mice with depression Increased levels of despair about adverse circumstances. Compared with the model group, the forced swimming immobility time and tail suspension immobility time of mice in each drug group were significantly reduced (P<0.01).

2 Vaikutukset autonomisiin aktiviteetteihin perimenopausaalisilla masennusmallihiirillä

Kunkin koeryhmän hiirten autonomisen aktiivisuustestin tulokset on esitetty taulukossa 22 ja kuvassa 26.

Taulukosta 23 ja kuvista 27 ja 28 voidaan nähdä, että verrattuna tyhjään ryhmään hiirten latenssiaika malliryhmässä pieneni merkittävästi ja sähköiskujen määrä lisääntyi merkittävästi (P<0.01), reflecting the decline in memory of the perimenopausal depression model mice. . Compared with the model group, the number of electric shocks received by mice in each administration group was significantly reduced (P<0.01), and the latency of mice in the high-dose Cistanche phenylethanol glycoside group, Mengnianan group, and soybean isoflavones group was significantly reduced (P<0.01). extension (P<0.01). The latent period of mice in the medium and small doses of Cistanche phenylethanoid glycoside group was significantly prolonged (P<0.05).

4 Vaikutukset elinindeksiin perimenopausaalisilla masennusmallihiirillä

Taulukosta 24 ja kuvasta 29 voidaan nähdä, että malliryhmän kateenkorvaindeksi, pernaindeksi ja kohtuindeksi alenivat merkittävästi nollaryhmään verrattuna (P<0.01), indicating that the perimenopausal depression mouse model had thymus, spleen, and uterus index. Shrinkage of the organization. Compared with the model group, the thymus index, spleen index, and uterine index of mice in the high-dose Cistanche phenylethanol glycoside group, Gengnianan group, and soybean isoflavone group could be significantly increased (P<0.01). The medium-dose Cistanche-fenyylietanoliglykosidiryhmä Hiirten kateenkorvaindeksiä ja kohtuindeksiä voidaan nostaa merkittävästi (P<0.01), and the spleen index can be significantly increased (P<0.05).