Ekinakosidilla on kasvaimia estävä vaikutus maksasyövässä
Mar 31, 2022
Ottaa yhteyttä:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Wen Li*, Jing Zhou, Yajie Zhang, Jing Zhang, Xue Li, Qiao Yan, Jiabing Han ja Fangdi Hu*
Abstrakti
Tausta:Ekinakosidi (ECH) on Cistanches Herban tärkein vaikuttava aine, jolla tiedetään olevan terapeuttisia vaikutuksia metastaattisiin kasvaimiin. ECH:n vaikutukset maksasyöpään ovat kuitenkin edelleen epäselviä. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia ECH:n vaikutuksia maksasyövän solujen aggressioon.
Menetelmät:Kahta tyyppiä maksasyöpäsoluja Huh7 ja HepG2 käsiteltiin eri annoksilla ECH:ta eri aikoina ja gradienteina. MTT- ja pesäkkeiden muodostusmäärityksiä käytettiin määrittämään ECH:n vaikutukset Huh7- ja HepG2-solujen elinkykyyn. Transwell-määrityksiä ja virtaussytometriamäärityksiä käytettiin havaitsemaan ECH-hoidon vaikutukset Huh7- ja HepG2-solujen invaasioon, migraatioon, apoptoosiin ja solusykliin. Western blot -analyysiä käytettiin havaitsemaan ECH:n vaikutukset TGF- 1, smad3, smad7, apoptoosiin liittyvien proteiinien (kaspaasi-3, kaspaasi-8) ja syto C:n ilmentymistasoihin. maksasyövän soluissa. MiR-503-3p:n ja TGF- 1:n välinen suhde havaittiin bioinformatiikka-analyysillä ja lusiferaasireportterimäärityksellä.
Tulokset:Tulokset osoittivat, että ECH esti Huh7- ja HepG2-solujen proliferaatiota, invaasiota ja migraatiota annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. Lisäksi havaitsimme, että ECH aiheutti Huh7- ja HepG2-solujen apoptoosin estämällä soluja S-vaiheessa. Lisäksi miR-503-3p:n ilmentymisen havaittiin vähentyneen maksakasvainkudoksissa, mutta ECH-hoito lisäsi miR-503-3p:n ilmentymistä Huh7- ja HepG2-soluissa. Lisäksi havaitsimme, että TGF{10}} tunnistettiin miR-503-3p:n mahdolliseksi kohteeksi. ECH edisti TGF- 1/Smad-signalointireitin aktivoitumista ja lisäsi Bax/Bcl-2:n ilmentymistasoja. Lisäksi ECH voi laukaista mitokondrion syto C:n vapautumisen ja aiheuttaa reaktion kaspaasiluokan.
Johtopäätökset:Tämä tutkimus osoittaa, että ECH vaikuttaa kasvainten vastaiseen toimintaan miR-503-3p/TGF- 1/Smad-akselin kautta maksasyövässä ja tarjoaa turvallisen ja tehokkaan kasvainten vastaisen aineen maksasyövän hoidossa.
Avainsanat: Ekinakosidi, maksasyöpä, apoptoosi, MiR-503-3p, TGF- 1/smad
Cistanche on turvallinen ja tehokas kasvaimia estävä aine maksasyövän hoidossa.
Johdanto
Maksasyöpä on yksi yleisimmistä pahanlaatuisista kasvaimista, jonka ilmaantuvuus on korkea, ja maksasyövän ilmaantuvuus on kasvanut nopeasti [1]. Hepatektomia on paras tapa hoitaa maksasyöpää sen alkuvaiheessa oleville potilaille [2]. Useimmilla potilailla on kuitenkin uusiutumista ja etäpesäkkeitä leikkauksen jälkeen. 5-Vuosieloonjäämisaste on vain noin 3–5 prosenttia [2]. Siksi uusia terapeuttisia lähestymistapoja ja aineita tarvitaan kiireesti.
Viime vuosina syöpälääkkeiden kehittämisessä ja fytokemikaalien tutkimuksessa on alettu kiinnittää huomiota etnofarmakologiaan [3, 4]. Useat kliiniset ja kokeelliset tutkimukset ovat osoittaneet, että lääkemonomeerit voivat estää hepatosellulaaristen karsinoomasolujen proliferaatiota, metastasoitumista, indusoida apoptoosia ja syöpäsolujen erilaistumista [5]. Cistanches Herba on kasviperheeseen kuuluva kasvi, joka on perinteinen lääketiede Kiinassa ja tunnetaan nimellä "aavikon ginseng" [6]. Cistanches Herbassa on runsaasti kemiallisia komponentteja, ja tutkijat kotimaassa ja ulkomailla ovat eristäneet siitä yli sata yhdistettä, mukaan lukien fenyylietanoliglykosideja, lignaaneja, sykloalifaattisia terpeenejä, sokereita, aminohappoja jne. [7]. Ekinakosidi (ECH) on Cistanches Herban pääkomponentti, ja sitä pidetään yleisesti myös sen tärkeimpänä vaikuttavana aineena [6]. Viime vuosina tutkimukset ovat osoittaneet, että ECH voi olla uusi hoitovaihtoehto aggressiivisille tai laajalti metastaattisille kasvaimille [8]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että ECH voi estää haimasyöpää, leukemiaa, mahasyöpää, endometriumin syöpää ja monia muita kasvaimia [9]. ECH:n vaikutuksesta maksasyövän etenemiseen ei kuitenkaan ole raportoitu.
MiRNA:illa on keskeinen rooli geeniekspression jälkeisessä transkription säätelyssä (10). Laajat tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA:t liittyvät läheisesti maksasyöpään [11] ja multippeliskleroosiin. MiR-503-3p on äskettäin löydetty miRNA, joka osallistuu kasvainsolujen proliferaatioon, migraatioon ja invaasioon [12]. Kuitenkin sen toiminta maksasyövässä on epäselvä. Tällä hetkellä miRNA:n alavirran kohdegeenien tutkimus on suhteellisen kypsässä vaiheessa, mutta monet kohdegeenilokukset ovat vielä löytämättä. TGF- 1/Smad3-signaalin välitysreitti on erityisen tärkeä kasvaimen muodostumiselle ja kehitykselle [13]. Havaittiin, että TGF- 1/Smad3-reitti aktivoitui hepatoomamallissa, mikä viittaa siihen, että TGF- 1/Smad3-reitillä oli merkittävä rooli maksasyövän kehittymisessä [14]. TGF- 1/Smad3-reitin korkeaa ilmentymistä pidetään yhtenä tärkeimmistä syistä maksasyövän esiintymiseen [15]. MiRNA/TGF- 1/Smad3-reittiä tutkittiin tarkemmin taustalla olevan mekanismin tutkimiseksi, joka välitti ECH:n vaikutuksia maksasyöpään.
Tässä tutkimuksessa arvioimme ECH:n vaikutuksia maksasyövän solujen etenemiseen ja havaitsimme, että ECH:lla oli kasvaimia estävä vaikutus miR-503-3p/TGF- 1/Smad-akselin kautta maksasyövässä, ja tarjoaa turvallisen ja tehokkaan kasvaimia estävän aineen maksasyövän hoidossa.
cistanche tcmon syövän vastainen.
Menetelmät ja materiaalit
Materiaalit
Echinacoside (ECH) (purity>98 prosenttia, monohydraatti) saatiin Hetian Dichen sashing Pharmaceutical Development Co., Ltd:ltä (Xinjiang, Kiina). Rakennekaava on esitetty kuvassa 1.
Soluviljely ja transfektio
Ihmisen maksasyövän solulinjat Huh7 ja HepG2 ostettiin FENGHUISHENGWU:lta (Hunan, Kiina). Soluja viljeltiin DMEM-elatusaineessa, jota oli täydennetty 10 prosentilla naudan sikiön seerumilla (FBS, Gibco, USA) 37 asteessa 5 prosentin CO2-soluinkubaattorissa. MiR-503-3p mimic ja miR-NC hankittiin Shanghai Gene Pharmaceutical Co., Ltd.:ltä (Shanghai, Kiina). Kaikki transfektiot suoritettiin käyttämällä Lipofectamine 2000 -reagenssia (Invitrogen) noudattaen valmistajan ohjeita. Vielä 24–48 tunnin kuluttua transfektoidut solut kerättiin ja käsiteltiin jatkotutkimuksia varten.
Lusiferaasireportterimääritys
Kokonais-RNA:t uutettiin soluista ja TGF- monistettiin käyttämällä WT- ja MUT-alukkeita. TGF- 1-fragmentti lisättiin pGL3-Bashc-lusiferaasireportterivektoriin nimeltä TGF- -WT-Luc. 1:n ja miR-503-3p:n sitoutumisalue mutagenisoitiin mutanttiplasmidin muodostamiseksi, joka nimettiin nimellä TGF- 1-Mut-Luc. TGF 1-WT-Luc ja TGF- 1-Mut-Luc transfektoitiin soluihin yhdessä miR-503-3p-mimiikin ja pRLTK:n kanssa. Solut kerättiin 6 tuntia transfektion jälkeen. Dual-Luciferase Reporter Assay Kit (Promega, Madison, WI, USA) käytettiin lusiferaasiaktiivisuuden määrittämiseen.
Solukasvumääritys
Huh7- ja HepG2-solut (2 x 105) asetettiin 96-kuoppalevyille. Sitten soluja käsiteltiin ECH:lla 24, 36 ja 48 tuntia. Sen jälkeen kuhunkin kuoppaan lisättiin 10 ml MTT-liuosta ja soluja inkuboitiin 4 tuntia. Sen jälkeen kuoppiin lisättiin 150 µl DMSO:ta. Ja absorbanssi 570 nm:ssä mitattiin ELISA-lukijalla (Aoweiya, Peking, Kiina).
Pesäkkeiden muodostuminen
Yksisoluinen suspensio valmistettiin transfektoiduista soluista ja viljeltiin inkubaattorissa 7 päivää. Elatusaineen hylkäämisen jälkeen solut värjättiin Wrightin värjäyksellä 5 minuutin ajan ja värjättiin sitten Giemsa-väriliuoksella ja Sorensen-fosfomolybdaattipuskuriliuoksella (1:9) 10 minuutin ajan. Pesun jälkeen pesäkkeet laskettiin mikroskoopilla.
Transwell-määritys
Migraatio- ja tunkeutumismääritykset suoritettiin Transwell-kammioissa (Costar, Badhoevedorp, Te Nether lands), jotka oli päällystetty Maribelilla (BD Biosciences) tai ilman sitä {{0}}μm (huokoskoko) -kalvon yläpinnalla. Migraatiomääritystä varten transfektoidut Huh7- ja HepG2-solut suspendoitiin uudelleen 200 ul:aan seerumivapaata DMEM-elatusainetta ja ympättiin yläkammioihin. Invaasiomääritystä varten Matrigel (30 ug/kuoppa) esipäällystettiin ylempien kammioiden kalvoille ja muut vaiheet olivat samat kuin migraatiomääritys. 24 tunnin inkubaation jälkeen solut, jotka olivat siirtyneet tai tunkeutuneet kalvon läpi alapinnalle, kiinnitettiin etanolilla ja värjättiin 0,2-prosenttisella kristallivioletilla. Lopuksi soluja tarkkailtiin ja laskettiin viidessä satunnaisessa kentässä mikroskoopilla.
Solusyklianalyysi
Huh7- ja HepG2-solut kylvettiin 6-kuoppalevyille tiheydellä 1 × 105 solua/ml. Solut kerättiin sen jälkeen, kun niitä oli käsitelty ECH:lla 0, 24 ja 48 tuntia. Tesesoluihin lisättiin sitten 1 ml jäitä, joka oli esijäähdytetty 75-prosenttisella etanolilla, kiinnitettynä 20 asteeseen 2 tunnin ajan. Sen jälkeen soluihin lisättiin PI-värjäysliuosta ja inkuboitiin pimeässä 15 minuuttia. Sitten solusykli analysoitiin virtaussytometrialla.
Apoptoottisten solujen analyysi
Solut maljattiin 6-kuoppalevyille tiheydellä 5 × 105 solua/kuoppa. Keräyksen jälkeen solut sentrifugoitiin ja 195 µl Annexin V-FITC -sitoutumisliuosta lisättiin solujen uudelleensuspendoimiseksi. Seuraavaksi lisättiin 5 µl Annexin V-FITC:tä ja 10 µl propidiumjodidivärjäysliuosta. Soluja inkuboitiin pimeässä ja asetettiin sitten jäähauteeseen.
Cistanche suojaa maksaa.
Kvantitatiivinen käänteistranskriptio-PCR (qRT-PCR)
Kokonais-RNA:t uutettiin TRIzol-reagenssilla (Haigene, Haerbin, Kiina). QRT-PCR:ssä käytettiin Te viiA™ 7 -reaaliaikaista PCR-järjestelmää. RNA käänteistranskriptoitiin cDNA:ksi käyttämällä BeyoRT™ First Strand cDNA Synthesis Kit -sarjaa (Beyotime Institute of Biotechnology). U6:ta käytettiin endogeenisenä kontrollina [16]. Alukesekvenssit olivat seuraavat:
miR-503-3p: eteenpäin: 5′-CTGATGGTTAAGAGAATGT-3′,
miR-503-3p: käänteinen: 5′-GTCCTTGGACATCCGGGCCG-3′,
U6: eteenpäin: 5′-GACAGATTCGGTCTGTGGCAC-3′,
U6: käänteinen: 5′-GATTACCCGTCGGCCATCGATC-3′.
Western blot -analyysi
Transfektoidut solut kerättiin ja kokonaisproteiinit uutettiin. Proteiinipitoisuudet määritettiin käyttämällä BCA Protein Assay Kit -sarjaa. Proteiininäytteet erotettiin 10-prosenttisella SDS-PAGE:lla ja siirrettiin polyvinylideenifluoridikalvolle. Tämän jälkeen kalvoa inkuboitiin anti-TGF- 1 (1:1000, Shifeng, Shanghai, Kiina), SMAD3 (1:1000, Shifeng, Shanghai, Kiina), SMAD 7 (1:1000, Shifeng, Shanghai, Kiina), Bcl-2 (1:1000, Shifeng, Shanghai, Kiina), Bax (1:1000, Shifeng, Shanghai, Kiina), Cyto C (1:1000, Shifeng, Shanghai, Kiina), kaspaasi{ {19}} (1:1000, Shifeng, Shanghai, Kiina), kaspaasi-8 (1:1000, Shifeng, Shanghai, Kiina) ja anti- -aktiinivasta-aine (1:1000, Shifeng, Shanghai) , Kiina) yön yli. Kymmenen kertaa kalvoa inkuboitiin kanin vastaisen sekundaarisen vasta-aineen kanssa (1:1000, Shifeng, Shanghai, Kiina) [17].
Tilastolliset menetelmät
Tiedot esitettiin keskiarvona ± keskihajonta (SD). Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin SPSS 13.{1}} -ohjelmistolla. Vertailussa käytettiin opiskelijan t-testiä. p-arvo < 0,05="" katsottiin="">
Tulokset
ECH:n vaikutus ihmisen maksasyövän solujen aktiivisuuteen ja lisääntymiseen
ECH:n vaikutuksen tutkimiseksi ihmisen maksasyövän solujen toimintaan suoritettiin MTT-määritys, ja tulokset osoittivat, että HepG2:n (kuvio 2a) ja Huh7:n (kuvio 2b) solujen elinkelpoisuus väheni vähitellen annoksen ja ajan kasvaessa. ECH-hoito verrattuna kontrolliryhmään (p < 0.01).="" 48="" tunnin="" ech-altistuksen="" jälkeen="" solujen="" elinkelpoisuus="" oli="" alhaisin,="" joten="" 48="" tunnin="" ech-altistus="" valittiin="" jatkokokeeseen.="" pesäkkeiden="" muodostumismäärityksen="" tulokset="" osoittivat,="" että="" hepg2-="" (kuva="" 2c)="" ja="" huh7-solujen="" (kuvio="" 2d)="" pesäkkeiden="" lukumäärä="" väheni="" vähitellen="" ech:n="" käsittelyn="" ansiosta="" annoksesta="" riippuvaisella="" tavalla="" verrattuna="" kontrolliryhmään="" (p="">< 0="" .01,="" p="">< 0,001).="" nämä="" tulokset="" osoittavat,="" että="" ech:lla="" on="" tärkeä="" rooli="" hcc-solujen="" aktiivisuudessa="" ja="">
ECH:n vaikutukset ihmisen maksasyövän solujen migraatioon ja invaasioon
Jotta ECH:n vaikutusta ihmisen maksasyövän solujen toimintaan voitaisiin tutkia tarkemmin, havaittiin solujen migraatio ja tunkeutuminen. Kuten kuvioista 3a, b näkyy, verrattuna ryhmään, jossa ei ollut ECH-hoitoa, Huh7- ja HepG2-solujen migraatio ja invaasio väheni merkittävästi ECH-käsittelyn jälkeen annoksesta riippuvalla tavalla (p<0.01,><0.001), suggesting="" that="" ech="" inhibited="" the="" migration="" and="" invasion="" of="" huh7="" and="" hepg2="">
ECH sääteli ihmisen maksasyövän solujen jakautumista ja apoptoosia
Jotta voitaisiin tutkia ECH:n vaikutusta maksasyöpäsolujen apoptoosiin, suoritettiin virtaussytometria. Kuten kuvasta 4a näkyy, vertailuryhmään verrattuna Huh7- ja HepG2-solujen prosenttiosuus G0/G1-vaiheessa väheni merkittävästi ECH-hoidon jälkeen annoksesta riippuvalla tavalla (p<0.01), and="" the="" percentage="" of="" huh7="" and="" hepg2="" cells="" in="" the="" s="" phase="" was="" gradually="" increased="" after="" ech="" treatment="" in="" a="" dose-dependent="" manner=""><0.01), but="" there="" was="" no="" change="" of="" the="" percentage="" of="" huh7="" and="" hepg2="" cells="" in="" g2/m="" phase="" after="" ech="" treatment="" (p="">0.05), mikä osoittaa, että ECH aiheutti Huh7- ja HepG2-solujen S-vaiheen pysähtymisen. Lisäksi ECH-annoksen kasvaessa Huh7- ja HepG2-solujen apoptoosinopeus kasvoi asteittain kontrolliryhmään verrattuna (kuvio 4b, p).<0.01,><0.001). these="" results="" indicated="" that="" ech="" induced="" the="" apoptosis="" of="" huh7="" and="" hepg2="">
ECH:n vaikutukset TGF-1/Smad-reitille
Tiedetään, että TGF{0}}/Smad-signalointireitti liittyy hyvin solujen apoptoosiin. ECH-indusoidun apoptoosin mekanismin tutkimiseksi HepG2-soluissa. TGF- 1/Smad-signalointireitin ilmentyminen havaittiin. Verrattuna kontrolliryhmään havaitsimme, että ECH-käsittely vähensi merkittävästi TGF- 1:n ja Smad3:n ilmentymistasoja sekä mRNA:n (kuvio 5a) että proteiinin (kuvio 5b) tasoilla ja nosti merkittävästi proteiinin ilmentymistä. Smad7 annoksesta riippuvaisella tavalla sekä mRNA- että proteiinitasoilla (s<0.01,><0.001). these="" results="" indicated="" that="" ech="" inhibited="" the="" activation="" of="" the="" tgf-β1/smad="" signaling="">
TGF-1 oli miR-503-3p:n suora kohde
Lisäksi online-ennustetyökalu Starbase v2. osoitti, että TGF- 1 oli miR-503-3p:n mahdollinen kohde (kuva 6a). Lusiferaasireportterigeenimäärityksen tulokset osoittivat, että miR-503-3p-mimicilla ja TGF- 1-WT:llä yhteistransfektoitujen HepG2-solujen ja Huh7-solujen lusiferaasiaktiivisuus väheni merkittävästi, mutta ei miR{:lla yhteistransfektoitujen solujen lusiferaasiaktiivisuus. {10}}p mimic ja TGF- 1-MUT (kuva 6b, p<0.01). similarly,="" the="" luciferase="" activity="" of="" hepg2="" and="" huh7="" cells="" co-transfected="" with="" mir-503-3p="" inhibitor="" and="" tgf-β1-="" mut="" was="" signifcantly="" increased,="" but="" not="" the="" cells="" co-transfected="" with="" mir-503-3p="" inhibitor="" and="" tgf-β1-wt="" (fig.="" 6c,=""><0.01). furthermore,="" the="" expression="" levels="" of="" tgf-β1="" were="" signifcantly="" reduced="" in="" the="" mir-503-3p="" mimic="" group="" compared="" with="" that="" in="" the="" nc="" group="" (fig.="" 6d,=""><0.01), but="" signifcantly="" increased="" in="" the="" mir-503-3p="" inhibitor="" group="" (fig.="" 6d,=""><0.05). these="" results="" suggested="" that="" tgf-β1="" was="" a="" direct="" target="" of="" mir-503-3p.="" to="" further="" investigate="" whether="" mir-503-3p="" mediated="" the="" effect="" of="" ech="" on="" liver="" cancer,="" the="" expression="" of="" mir-503-3p="" was="" detected="" in="" liver="" cancer="" tissues="" and="" it="" showed="" that="" the="" expression="" levels="" of="" mir-503-3p="" were="" decreased="" in="" liver="" cancer="" tissues="" compared="" with="" that="" in="" normal="" liver="" tissues="" (fig.="" 6f,=""><0.01). moreover,="" the="" expression="" levels="" of="" mir503-3p="" were="" further="" decreased="" in="" metastasis="" liver="" cancer="" tissues="" than="" that="" in="" nonmetastatic="" liver="" cancer="" tissues="" (fig.="" 6g,=""><0.01). the="" expression="" levels="" of="" mir-503-3p="" in="" hepg2="" and="" huh7="" cells="" were="" gradually="" increased="" after="" ech="" exposure="" (fig.="" 6e,=""><0.05,><0.01). taken="" together,="" these="" results="" suggest="" that="" mir-503-3p/tgf-β1="" may="" mediate="" the="" effect="" of="" ech="" on="" liver="">
ECH:n vaikutus sytokromi C:n ja kaspaasien aktiivisuuteen
Kuten kuvassa 7a näkyy, vertailuryhmään verrattuna havaitsimme, että ECH-käsittely aiheutti merkittävän laskun Bcl-2:n ilmentymistasoissa annoksesta riippuvaisella tavalla (p<0.01,><0.001), while="" the="" expression="" levels="" of="" bax="" were="" signifcantly="" increased="" in="" a="" dose-dependent="" manner=""><0.01,><0.001). it="" was="" demonstrated="" that="" bcl-2="" and="" bax="" were="" involved="" in="" ech-induced="" apoptosis="" in="" hepg2="" and="" huh7="" cells.="" in="" addition,="" the="" expression="" levels="" of="" cyto="" c,="" caspase-8,="" and="" caspase-3="" were="" signifcantly="" increased="" in="" hepg2="" and="" huh7="" cells="" (fig.="" 7b,=""><0.01,><0.001), indicating="" that="" the="" release="" of="" cyto="" c="" and="" the="" activation="" of="" caspase-8="" and="" caspase-3="" were="" involved="" in="" ech-induced="" apoptosis="" in="" hepg2="" and="" huh7="">
Keskustelu
Kirurginen resektio on maksasyöpäpotilaiden tärkein hoitomenetelmä, ja uusiutumisen ja etäpesäkkeiden muodostumisaste maksan resektion jälkeen on korkea [18, 19]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että ECH:lla on tietty estovaikutus maksakasvaimiin ja se tarjoaa turvallisen ja tehokkaan kasvaimia estävän aineen maksasyövän hoidossa. Kliininen käytäntö on osoittanut, että perinteinen kiinalainen lääketiede voi tehokkaasti lievittää maksasyövän potilaiden kliinisiä oireita [20]. ECH:n osalta tutkimukset ovat osoittaneet, että ECH:lla on antioksidanttisia, masennuslääkkeitä, anti-inflammatorisia, antiviraalisia, kasvaimia estäviä ja antibakteerisia vaikutuksia [21, 22]. Kolorektaalisyövässä ECH voi indusoida kasvainsolujen apoptoosia säätelemällä kaspaasia-3 ja pilkkomalla DNA:n korjausentsyymejä DNA:n hapettumisen indusoimiseksi [23]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme ensimmäistä kertaa, että ECH vaikuttaa kasvainten vastaiseen toimintaan miR 503-3p/TGF- 1/Smad-akselin kautta maksasyövässä.
Eukaryoottisolujen solusyklin solujen välinen vaihe voidaan jakaa G1:een, S:ään ja G2:een. Solusyklin säätelypisteitä eri ajanjaksoina säätelevät erilaiset säätelytekijät [24]. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että Huh7- ja HepG2-solujen prosenttiosuus G0/G1- ja G2/M-vaiheessa pieneni ja S-vaiheen solujen prosenttiosuus kasvoi ECH:n jälkeen, mikä osoittaa, että ECH aiheutti S-vaiheen pysähtymisen. Huh7- ja HepG2-soluista. Apoptoosin epätasapaino on yksi ihmisen kasvainten päämekanismeista. On raportoitu, että kasvainten vastaiset kemoterapeuttiset lääkkeet yleensä indusoivat syöpäsolujen apoptoosia ja säätelevät syövän etenemistä. Tutkimuksessamme havaitsimme myös, että ECH voi indusoida maksasyövän solujen apoptoosia annoksesta riippuvaisella tavalla, mikä viittaa siihen, että syöpäsolujen apoptoosin indusoiminen voi olla yksi ECH:n taustalla olevista mekanismeista maksasyövän hoidossa.
MiRNA:illa on keskeinen rooli HCC-solujen lisääntymisen, syklin, apoptoosin ja migraation säätelyssä vuorovaikutusten kautta eri signaalireittien ja molekyylien kanssa [25, 26]. Esimerkiksi havaittiin, että miR-26a ekspressoituu voimakkaasti normaaleissa maksasoluissa, mutta se on merkittävästi heikentynyt maksasyöpäsoluissa ja estää proliferaatiota [27]. MiR-503-3p:n yli-ilmentyminen indusoi keuhkosyöpäsolujen apoptoosia ja estää solujen invaasiota ja migraatiota [28]. Lisäksi monet tutkimukset ovat osoittaneet, että TGF- 1/Smad-signalointireitillä on keskeinen rooli maksasyövän kehittymisessä [7]. Lisäksi kun maksasyövän eteneminen jatkuu, TGF{8}}:n ekspression on raportoitu lisääntyvän asteittain [29]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että ECH vähensi TGF- 1:a ja Smad3:a ja ylössääteli Smad7:ää, mikä osoittaa, että ECH esti TGF- 1/Smad-signalointireitin aktivoitumista. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että miR-503-3p:n ilmentymisen havaittiin vähentyneen maksakasvainkudoksissa, mutta ECH-hoito lisäsi miR-503-3p:n ilmentymistä Huh7- ja HepG2-soluissa. Lisäksi havaitsimme, että TGF- 1 tunnistettiin miR-503-3p:n mahdolliseksi kohteeksi. ECH edisti TGF- 1/Smad-signalointireitin aktivoitumista ja lisäsi Bax/Bcl-2:n ilmentymistasoja. Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-503-3p/TGF- 1/Smad-signalointireitti voi välittää ECH:n vaikutuksia maksasyöpään. On tiedetty, että lisääntynyt Bax/Bcl-2-suhde voi aiheuttaa mitokondrioiden syto-C:n vapautumisen sytoplasmaan. Cyto C on vuorovaikutuksessa kaspaasin-8 kanssa ja muodostaa apoptoottisen kehon, joka sitten värvää ja aktivoi kaspaasin-3, joka aiheuttaa kaspaasisarjan ja edistää solukuolemaa [30]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että ECH vähensi Bcl-2:n ilmentymistä ja lisäsi Baxin, Cyto C:n, kaspaasin-8 ja kaspaasin-3 ilmentymistä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että ECH voi korjata mitokondriovaurion jossain määrin.
Johtopäätös Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että ECH-hoito esti proliferaatiota, invaasiota ja migraatiota ja indusoi maksasyövän solujen apoptoosia. Maksasyöpäsolujen ECH-hoidon taustalla olevan mekanismin havaittiin liittyvän miR-503-3p/TGF- 1/Smad-signalointireittiin. Tämä tutkimus tarjoaa tietyn kokeellisen perustan kasvainten vastaisen ECH:n tutkimukselle. On syytä huomata, että tätä tutkimusta rajoittaa eläinkokeiden puute. Siksi tulevassa tutkimuksessamme tehdään eläinkokeita havaintojen vahvistamiseksi.
