Selkeät tietullin kaltaiset reseptorit Geenien ilmentyminen ja gliavaste luonnollisen scrapien eri aivoalueilla Osa 3

Tutkimme mahdollisia korrelaatioita prionisairauksien neuropatologisten tunnusmerkkien ja TLR-geenin ilmentymisen välillä neljällä eri aivoalueella luonnostaan ​​scrapie-tartunnan saaneiden lampaiden välillä. Kaikilla neljällä aivoalueella havaitsimme merkittäviä eroja PrPSc-saostumisessa, spongioosissa, astroglioosissa ja mikroglioosissa luonnollisesti tartunnan saaneilla verrattuna kontrollilampaisiin.

Prionitauti, joka tunnetaan myös nimellä temppelisairaus, vahansyöntitauti jne., on prionien aiheuttama akuutti virusinfektio. Tauti tarttuu pääasiassa syömällä prioneja sisältävää kypsentämätöntä ruokaa. Kun se on saanut prionitartunnan, se voi aiheuttaa aivotulehdusta ja hermostovaurioita, ja oireita, kuten päänsärkyä, oksentelua ja kuumetta, voi esiintyä.

Tällaiseen tilanteeseen joutuessamme emme kuitenkaan voi menettää luottamusta muistiomme prionisairauden olemassaolon vuoksi. Useimmat tartunnan saaneet voivat toipua ja palauttaa muistinsa hoidon jälkeen.

Ennaltaehkäisevästi voimme tietysti yrittää syödä enemmän kypsennettyä ruokaa välttääksemme prioniinfektion. Samanaikaisesti, jos sinulla on oireita, sinun tulee myös hakeutua lääkäriin mahdollisimman pian, jotta sairaus ei pahene.

Päivittäisessä elämässä voimme kokeilla yksinkertaisia ​​muistiharjoituksia, kuten lukemista, listojen laatimista, tapahtumien ja tietojen järjestämistä jne. muistimme parantamiseksi. Nämä harjoitukset eivät vaadi paljon aikaa ja energiaa, mutta ne ovat erittäin tärkeitä terveiden aivojen ja tehokkaan muistitoiminnan ylläpitämiseksi.

Lyhyesti sanottuna, kun kohtaamme sairauksia, kuten prionisairauksia, meidän tulee suhtautua siihen myönteisesti, hakeutua ammattimaiseen hoitoon ja ennaltaehkäiseviin toimenpiteisiin sekä kiinnittää huomiota päivittäisiin muistiharjoituksiin fyysisen terveytemme ja tehokkaan työskentelyn varmistamiseksi. Voidaan nähdä, että meidän on parannettava muistia, ja Cistanche voi parantaa muistia merkittävästi, koska se voi myös säädellä välittäjäaineiden tasapainoa, kuten nostaa asetyylikoliinin ja kasvutekijöiden tasoa, jotka ovat erittäin tärkeitä muistille ja oppimiselle. Lisäksi Cistanche voi myös parantaa verenkiertoa ja edistää hapen toimitusta, mikä voi varmistaa, että aivot saavat riittävästi ravintoa ja energiaa, mikä parantaa aivojen elinvoimaa ja kestävyyttä.

Napsauta tietää tapoja parantaa aivojen toimintaa

Nämä erot olivat ilmeisimpiä medulla oblongatassa, kaikkein caudalareassa. Sitä vastoin lievimmät vauriot havaittiin etukuoressa, eniten rostralareassa. Tämä peräkkäinen kuvio on sopusoinnussa prionien neuroinvaasion ja leviämisen reitin kanssa kaikkialla keskushermostossa, alkaen selkäytimen sisääntulokohdista ja ulokkeista ja saavuttaen lopulta etukuoren [1,5,51].

Kun otetaan huomioon niiden anatominen läheisyys, havaitsimme yllättäen PrPSc:n kertymisen ja vakuolisoitumisen jyrkän laskun sekä astroglioosin merkittävän vähenemisen, kun siirryimme talamuksesta aivotursoon, eikä patologian asteittaista caudo-rostralista etenemistä seurannut.

Spesifinen mikrogliamorfologia, joka tunnetaan sauvamikrogliana, havaittiin pyramidaalisten soluneuronien läheisyydessä CA3:ssa, mutta se puuttui kaikilta muilta tutkituilta neuroanatomisilta alueilta.

Tietojemme mukaan tätä mikrogliaprofiilia ei ole tähän mennessä liitetty prionien laukaisemaan hermotulehdukseen, vaikka äskettäinen tutkimus raportoi sauvan muotoisen mikroglian esiintymisestä CJD-potilaiden pikkuaivoissa [52].

Vaikka sitä on vähän tutkittu ensimmäisten kuvausten jälkeen 1900-luvulla, sauvamikrogliaa on äskettäin raportoitu neurologisissa häiriöissä, kuten epilepsia, Lewyn kehon dementia, Huntingtonin tauti ja AD, erityisesti aivokuoren ja hippokampuksen kohtalaisesti vaurioituneilla alueilla [40, 41, 53]. Sauvan mikroglian fenotyyppinen ilmentyminen ja toiminnot eivät ole vielä selviä.

Kuitenkin se tosiasia, että tämä morfologinen piirre tyypillisesti osuu vaurioituneiden tai vaurioitumisalttiiden hermosolujen esiintymiseen, viittaa hermoja suojaavaan rooliin [42,54,55].

Tankomikroglian ei uskota liittyvän vakaviin vaurioihin, koska näissä olosuhteissa odotetaan etenemistä kohti ameboidista morfologiaa [56]. Rodmikroglian esiintyminen scrapie-tartunnan saaneiden lampaiden hippokampuksessa, mutta ei muilla aivojen alueilla, voi olla osoitus hermostoa suojaavasta ympäristöstä, mikä on hyvin sopusoinnussa tällä alueella havaitun rajoitetun hermosolujen menetyksen kanssa.

Analyysimme TLR-ilmentymisestä paljastaa suoran korrelaation vaurion vakavuuden ja TLR-geenin yli-ilmentymisen välillä, joka on sama kuin edellä mainitun prionien neuropatologian caudo-rostral-eteneminen.

Sitä vastoin TLR4 oli samalla tavalla yli-ilmentynyt kaikilla alueilla leesion vakavuudesta riippumatta. TLR4:n yli-ilmentyminen lievempien hermosoluvaurioiden alueilla (eli hippokampuksessa ja etukuoressa) voi heijastaa hermosoluja suojaavaa roolia, kuten aiemmin on kuvattu fagosyyttisoluille, kuten makrofageille ja mikroglioille [23,57]. TLR7:n voimistuminen on raportoitu aiemmin hiirimalleissa priondisairaus ja ihmispotilaat [22,26,31].

Havaitsimme vain TLR7:n noususäätelyn pitkittäisydinosassa, vaurioituneimmalla alueella, jolla havaittiin korkeimmat spongioosi- ja PrPSc-kertymät.

Apoptoosin aiheuttama neuronaalinen kuolema on aiemmin liitetty TLR7-stimulaatioon [58, 59], ja sen yli-ilmentyminen pitkittäisydin voi liittyä tähän mekanismiin [60]. Vaikka TLR1:n rooli neurodegeneratiivisissa sairauksissa ei ole vielä selvä, TLR2:n osallistuminen mikrogliaaktivaatioon on osoitettu yhä enemmän amyotrofisessa lateraaliskleroosissa, MS:ssä ja AD:ssa [61,62].

Vaikka TLR2:n roolia prionisairauksissa ei täysin ymmärretä, hyödyllisiä vaikutuksia on ehdotettu: eloonjäämisaika lyhenee hiirillä, jotka eivät ilmennä TLR2:ta aivojensisäisen scrapie-rokotteen jälkeen [22].

TLR2:n ja MyD88:n yli-ilmentyminen voi myös olla osoitus proinflammatorisesta mikrogliafenotyypistä, mikä voisi selittää TNF- ja IL-6-pitoisuuden lisääntymisen, jonka havaitsimme talamuksessa [8,63].

Mielenkiintoista on, että kokeet, joissa käytettiin EOC 13.31 -soluja, immortalisoitua mikroglian kaltaista hiirisolulinjaa, ovat osoittaneet tulehduksellisen vastereitin säätelyhäiriön vasteena TLR2-aktivaatiolle ja ehdottaneet yhteyttä TLR2:n ilmentymisen ja mikroglian kertymisen välillä tilassa, joka ei ole optimaalinen fagosytoosiin [26]. .

Siksi TLR2:n yli-ilmentyminen pitkittäisytimen ja talamuksessa, vaurioituimmilla alueilla, joilla havaittiin myös liiallisia määriä fagosyyttisiä mikrogliaa, viittaa siihen, että PrPSc:n toimintahäiriöinen puhdistuma voi johtaa PrPSc:n jatkuvaan kertymiseen ja hermosolujen vaurioitumiseen [9,17].

Löydökseemme scrapie-tartunnan saaneiden lampaiden hippokampuksesta paljastavat päinvastaisen kuvion verrattuna muihin analysoituihin aivoalueisiin, joissa TLR1, TLR2 ja MyD88 ovat heikentyneet eikä sytokiinimuutoksia.

Tämä voi viitata siihen, että mikrogliat reagoivat eri tavalla aivotursossa; on todellakin osoitettu, että TLR2-puutos primaarisissa mikrogliasoluviljelmissä, jotka ovat peräisin vastasyntyneistä hiiristä (0–3 päivää vanhoista) ja joita on stimuloitu neurotoksisella peptidillä PrP106-126, siirtää mikroglian aktivaation neurotoksisesta hermostoa suojaavaan fenotyyppiin [63 ].

PrP106-126-peptidin merkitys prionipatologiassa on kuitenkin kyseenalaistettu [64]. CD36 on erityyppinen muodontunnistusreseptori, joka pystyy tunnistamaan endogeenisesti johdettuja ligandeja, kuten amyloidia muodostavia peptidejä, joilla on vakiintunut rooli näiden komponenttien endosyyttisessä sisäänotossa [65, 66]. Tämä reseptori on liitetty proinflammatoriseen mikrogliastatukseen [67].

In vitro BV-2-solujen, eräänlaisen immortalisoituneen mikrogliasolun, stimulointi PrP106-126:lla johtaa CD36:n lisääntymiseen, mikä lisää tulehdusta edistäviä sytokiinejä sekä iNOS- ja NO-tuotantoa [68,69].

Lisäksi CD36:n -amyloidipeptidin tunnistaminen laukaisee uuden heterotrimeerisen kompleksin CD36-TLR4-TLR6:n, joka aktivoi synnynnäisen immuunivasteen [70,71].

Tutkimuksessamme kaikki alueet osoittivat CD36:n merkittävää noususäätelyä aivotursoa lukuun ottamatta. CD36:n, TLR4:n ja TLR6:n voimistuminen vaurioituimmilla alueilla, pitkittäisytimessä ja obexissa, viittaa tämän kolmikon osallisuuteen pro-inflammatorisen mikroglia-statusiinin laukaisemisessa prioniinfektiolle.

Sitä vastoin CD36:n ja TLR6:n yli-ilmentymisen puuttuminen hippokampuksessa viittaa siihen, että tätä heterotrimeeriä ei muodostu, mikä on jälleen osoitus aivoa suojaavasta ympäristöstä tällä aivoalueella.

On vielä selvitettävä, miksi mikroglia reagoi eri tavalla tällä aivoalueella. Vaikka prionikanta-spesifinen solutropismi voi määrittää mikroglioosin ja astroglioosin mallin, viimeaikaiset havainnot viittaavat siihen, että molempiin reaktioihin vaikuttaa pääasiassa aivoalue [18,72].

Mikroglia ja astroglia eivät reagoi tasaisesti keskushermostossa, ja tämä aluespesifinen vaste voi johtaa joidenkin aivoalueiden valikoivaan haavoittuvuuteen prionisairauksissa [16,18].

Tässä suhteessa on oletettu, että mikroglian tulehdusvastetta prioniinfektiolle säätelee PrPSc:n sialylaatio [14,73–75] ja että PrPSc:n sialylaatio on aivoalueriippuvaista [18]. Tarkemmin sanottuna PrPSc:n korkeampi sialylaatiotaso löytyy aivotursosta ja aivokuoresta kuin talamuksessa ja aivorungossa, mikä viittaa mahdolliseen rooliin näiden aivoalueiden selektiivisessä haavoittuvuudessa [18, 73, 75].

Korkea PrPSc-sialylaation taso hippokampuksessa voi liittyä hidastunut prionien replikaation, mikä johtaa erottuvaan prionien aiheuttamaan mikrogliaaktivaatioon tällä alueella, mikä on yhdenmukainen tämän alueen vähentyneen herkkyyden kanssa, jonka havainnot viittaavat.

Mielenkiintoista on, että aiemmat löydökset viittaavat siihen, että aivoturso voidaan suojata prionien neurotoksisuudelta luonnollisessa CJD-infektiossa [76,77], ja CJD-tapausten yksityiskohtaiset neuropatologiset tutkimukset ovat raportoineet lievempiä vaurioita hippokampuksessa kuin muilla aivoalueilla [76].

Tarkemmin sanottuna arkkikorteksi, joka käsittää pääasiassa hippokampuksen, näyttää olevan suhteellisen säästäväinen verrattuna muihin aivokuoren alueisiin CJD:ssä [77]. Tämä luonnollisessa CJD:ssä kuvattu lievä hippokampuksen osallisuus on yhtäpitävä nykyisten löydösten kanssa lampailla, jotka ovat luonnostaan ​​saaneet scrapien.

Mielenkiintoista on, että tämä osittainen suojaus ainakin kahta luonnollista prionisairautta vastaan ​​esiintyy hippokampuksessa, joka on fylogeneettisesti aivokuoren vanhin alue ja koostuu aivokuoren peruskudoksesta.

Tämän korrelaation merkityksen selvittämiseksi tarvitaan lisätutkimuksia. Yhteenvetona voidaan todeta, että tuloksemme paljastavat erityisen lievän neuropatologian luonnollisten scrapie-tartunnan saaneiden lampaiden hippokampuksessa, jolle on ominaista spongioosin, PrPSc-kertymän ja astroglioosin taso odotettua alhaisempi, kun otetaan huomioon kaudaali-to. -skrapieleesioiden rostaalinen leviäminen.

Lisäksi hippokampuksen eksklusiivinen mikrogliamorfologia, sauvamikroglia, jolla voi olla hermoja suojaava rooli [54], yhdessä erillisen kuviontunnistusreseptorin (TLR-geenit ja CD36) geeniekspressioprofiilin kanssa erottavat tämän aivoalueen entisestään muista neuroanatomisista sairauksista. luonnollisilla scrapie-tartunnan saaneilla lampailla.

Nämä löydökset viittaavat tiettyyn hermosuojausasteeseen aivotursoa vastaan ​​luonnollista prioniinfektiota vastaan, mikä ansaitsee lisätutkimuksia. Proteiinien laskostumisen aiheuttamat neurodegeneratiiviset sairaudet sisältävät tulehduksen noidankehän, joka koostuu väärin laskostuneiden proteiinien kertymisestä, glia-aktivaatiosta ja gliatulehduksen välittäjien vapautumisesta, mikä pahentaa proteiinien kertymistä ja hermoston tulehdus.

Tämän noidankehän keskeyttäminen kohdistamalla mikroglia-aktivaatioon käyttämällä spesifisiä TLR-inhibiittoreita tietyssä sairausvaiheessa voi olla lupaava lähestymistapa hermoston tulehduksen rajoittamiseen. Tuloksemme korostavat TLR2:n alasäätelyä mahdollisena kohteena tällaiselle lähestymistavalle, koska tämä voi indusoida mikroglian siirtymisen neurotoksisesta aneuroprotektiiviseen fenotyyppiin [63].

Lopuksi, vaikka glialfenotyyppien monimuotoisuuden karakterisoinnissa on saavutettu suurta edistystä hermostoa rappeutuvien sairauksien hiirimallien avulla, heijastavatko hiirimallit uskollisesti prionisairauksien keskeisiä näkökohtia, on jonkin verran keskustelua [78, 79].

Tuloksemme tg338-siirtogeenisestä mallista toistivat prioniinfektion yleiset patologiset merkit, mukaan lukien merkittävä PrPSc-kertymä, neuropilin spongioosi, astroglioosi ja mikroglioosi.

Kuitenkin infektoituneet hiiret osoittivat merkittävää TLR1:n ja TLR2:n yli-ilmentymistä ja taipumusta TLR7:n yli-ilmentymiseen. Vaikka näiden geenien noususäätelyä on aiemmin kuvattu muissa scrapie-tartunnan saaneissa hiirimalleissa [22,26], tämä kuvio on ristiriidassa lampaiden aivoissa tehtyjen löydöstemme kanssa. On huomattava, että hiiren aivoissa emme havainneet muutoksia TLR4:n ilmentymisessä, geenissä, jonka ilmentymisessä havaittiin suurimmat muutokset lammasnäytteissä.

Nämä ristiriitaiset havainnot voivat johtua erilaisista infektioreiteistä ja/tai prioniproteiinin ilmentymistasoista tg338-hiirissä [80,81]. Siitä huolimatta tuloksemme osoittavat viime kädessä, että scrapien intraserebralinokulaatio ylikokoisissa tg338-hiirissä ei toista luonnollisessa scrapie-infektiossa havaittua immuunivastetta.

4. Materiaalit ja menetelmät

4.1. Scrapie-tartunnan saaneet ja kontrollilampaat

Tässä tutkimuksessa oli mukana 21 naaraspuolista Rasa Aragonesa -lammasta (ikä 2–6 vuotta). Kaikki genotyypitettiin PRNP-polymorfismien varalta, kuten aiemmin on raportoitu [82], ja niillä havaittiin olevan ARQ/ARQ-genotyyppi. Kontrollieläimet (n=8) valittiin parvesta, jossa ei ollut raportoitu scrapie-tapauksia.

Scrapie-tartunnan saaneet eläimet (n=13) saatiin scrapie-tartunnan saaneista parvista, ja ne oli diagnosoitu peräsuolen limakalvobiopsioiden immunohistokemialla (IHC). Infektio varmistettiin PrPSc:n post mortem -immunoditektiolla obexissa julkaistujen kriteerien mukaisesti [83].

Eläimet lopetettiin suonensisäisellä barbituraattien yliannostuksella ja verensuonilla.

Eutanasian aikaan kaikilla scrapie-tartunnan saaneilla lampailla oli erilaisia ​​vaikeusasteisia kliinisiä oireita: joillakin eläimillä ilmeni alkavia oireita, kuten selän ja kylkien kutinaa digitaalisen stimulaation ja lievän kehon kunnon heikkenemisen jälkeen, kun taas toisilla eläimillä oli kehittyneitä kliinisiä oireita, kuten spontaani raapiminen. hännänjuuri, lannealue ja raajat, neurologiset oireet, mukaan lukien ataksia ja pään vapina, ja hampaiden narskuttelu, villan menetys ja voimakas painonpudotus [84].

4.2. Tg338-hiiren infektio

TLR-geenin ilmentymisen arvioimiseksi scrapien hiirimallin aivoissa kymmenen viikon ikäiset tg338-hiiret (n=8) (yli-ilmentävät lampaan VRQ/VRQ PrPC 8- 10-kertaistumaan [ 85]) inokuloitiin aivopoolilla, joka oli peräisin luonnollisesta scrapie-tartunnan saaneesta Rasa Aragonesa -lampasta, joka oli lopetettu kliinisessä vaiheessa.

Hiiret siirrostettiin 20 ul:lla scrapie-siirrostetta (laimennettuna 2 % w/v PBS:ssä) oikeaan aivopuoliskoon isofluraanipuudutuksessa. Aivoinsisäiset injektiot suoritettiin käyttämällä 50 ul:n ruiskua ja 25G neulaa. Inokulaation jälkeen hiirille annettiin subkutaaninen injektio buprenorfiinia (0,3 mg/kg) kivunlievityksen indusoimiseksi.

Kontrollina tg338-hiiriä (n=8) siirrostettiin scrapie-negatiivisen lampaan aivohomogenaatilla noudattaen samaa edellä kuvattua menettelyä. Hiiriä tarkkailtiin kliinisten oireiden kehittymisen varalta ja lopetettiin kohdunkaulan dislokaatiolla, kun taudin merkkejä, kuten vakavaa ataksiaa ja kyvyttömyyttä ruokkia, ilmaantui.

Scrapie-positiivisella siirrosteella infektoituneiden hiirten keskimääräinen eloonjäämisaika oli 187 ± 26 dpi.

4.3. Kudoskokoelma

Näytteet keskushermostosta kerättiin ja jaettiin sagittaalisesti kahteen puolikkaaseen; toinen kiinnitettiin 10 % neutraalilla puskuroidulla formaliinilla histopatologista ja immunohistokemiallista analyysiä varten, ja toinen jäädytettiin suoraan ja pidettiin -80 ◦C:ssa proteiinianalyysiä varten tai stabiloitiin RNAlaterTM-liuoksessa (InvitrogenTM, Waltham, MA, USA) RNA:n uuttamista varten ja sitten jäädytettiin ja säilytettiin -80 ◦C:ssa.

4.4 PRNP-sekvensointi

DNA uutettiin verinäytteistä Speedtools Tissue DNA Extraction kit -sarjalla (Biotools, Madrid, Espanja) valmistajan ohjeiden mukaisesti. PCR-monistaminen ja sekvensointi suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla [82].

4.5. Immunohistokemia

Formaliinilla kiinnitetyt kudokset käsiteltiin tavanomaisten histopatologisten menetelmien mukaisesti. Kudosleikkeet upotettiin parafiiniin, leikattiin 4 um:n paksuisiksi osiksi ja värjättiin hematoksyliinieosiinilla (HE) vakuolaation ja neuropilispongioosin arvioimiseksi.

IHC PrPSc:n havaitsemiseen suoritettiin käyttämällä hiiren monoklonaalista primääristä vasta-ainetta L42 lampailla (1:500 laimennus huoneenlämpötilassa 30 minuuttia) (R-Biopharm, Darmstadt, Saksa) ja kanin polyklonaalista vasta-ainetta R486 hiirillä (1: 8000 laimennus, yön yli 4 ◦C:ssa (R. Jackman, julkaisematon), kuten aiemmin on kuvattu [86,87].

Leikkeet altistettiin myös tavanomaiselle immunovärjäykselle astrosyyttimarkkerille glial fibrillary hapan proteiini (GFAP) (1:500; Dako, Glostrup, Tanska) ja mikrogliamarkkerilla ionisoitu kalsiumia sitova sovitinmolekyyli 1 (Iba1) (1:1000; Wako, Richmond). , VA, USA), julkaistujen pöytäkirjojen [88] mukaisesti. Kaikki histologiset ja IHC-arvioinnit suoritti kaksi eläinlääketieteellistä patologia, jotka olivat sokeutuneet kliinisille tiedoille.

Spongioosin ja PrPSc-värjäytymisen intensiteetin arvioinnit suoritettiin semikvantitatiivisesti ja mukautettiin aikaisemmissa tutkimuksissa kuvattujen kriteerien mukaisesti: neuropilin ja perikaryan vakuolaatio pisteytettiin arvosta 0 (poissa) 5:een (erittäin lukuisia ja konfluentteja) [51], PrPSc-signaali kvantifioitiin perustuen immunovärjäytymisasteeseen 0 (ei leimaamista) 5:een (intensiivinen yhtenäinen leimaus), kuten aiemmin on raportoitu [89], ja GFAP- ja Iba1-immunoleimauksen laajuus pisteytettiin asteikolla, joka vaihtelee välillä {{ 8}} - 5 (0=heikko värjäys; 5=merkittävä immunoleimaus koko alueella) kuvatulla tavalla [88]. Arvioitiin neljä aivoaluetta: etukuoren (Fc) talamus (Th), hippokampuksen muodostuminen (Hc) ja pitkittäisydin (Mo), ja jokainen alue analysoitiin globaalisti pisteytyksen suhteen ja esitettiin graafisesti keskiarvona ± standardivirhe.

4.6. Western Blot

100 mg aivokudosta jokaiselta aivoalueelta (Fc, Th, Hc ja Mo) 13:sta scrapie-infektoituneesta lampaasta, joista 8:lla oli pitkälle edenneet kliiniset oireet ja 5:llä, joilla oli alkavia kliinisiä oireita, homogenisoitiin 1 ml:ssa lyysipuskuria.

8 infektoidun ja 8 kontrollihiiren hemiencefalonit homogenisoitiin 10 %:ssa (w/v) lyysipuskurissa. Kudosnäytteet homogenisoitiin jauhamisputkissa (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) käyttämällä TeSeEPrecess 48 TM -homogenisaattoria (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), ja proteiinipitoisuus mitattiin käyttämällä PierceTM BCA Protein Assay -kittiä (ThermoScientificTM, Waltham, MA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

PrPres-analyysiä varten yhtä suuria proteiinimääriä kudoshomogenaateista inkuboitiin 10 minuuttia 37 ◦C:ssa proteinaasi K -liuoksen kanssa, kuten aiemmin on kuvattu [90].

Tuloksena saaduille näytteille suoritettiin elektroforeesi 12 % CriterionTM XT Bis-Tris Protein Gel -geelissä (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ja siirrettiin PVDF-kalvoille, joita estettiin 1 tunnin ajan 2 % rasvattomalla maidolla TBST:ssä (Tris- puskuroitu suolaliuos, jossa on 0,1 % Tween20).

Immunoblottausta varten kalvoja inkuboitiin yön yli 4 ◦C:ssa Sha31-primaarisen vasta-aineen (SPI-Bio, Montigny-le-Bretonneux, Ranska) kanssa pitoisuudella 1 µg/ml, minkä jälkeen inkuboitiin 1 h huoneenlämpötilassa (RT) piparjuuriperoksidaasin kanssa. konjugoitu anti-hiiri-IgG-sekundaarinen vasta-aine (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA).

Immunoreaktiivisuus havaittiin käyttämällä kemiluminesoivaa substraattia ImmobilonCrescendo Western HRP (Merck, Darmstadt, Saksa). TLR4-proteiinin ilmentyminen analysoitiin kudoshomogenaateista, jotka oli sekoitettu 2 x Laemmli-näytepuskuriin (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. .

40 mikrogrammaa kokonaisproteiinia ladattiin kuoppaa kohti, ajettiin 7,5 %CriterionTM TGXTM Precast Midi Protein Gel -geelissä (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ja siirrettiin PVDF-kalvoille, jotka sitten estettiin 2 tunnin ajan 4-prosenttisella naudan seerumialbumiinilla. (BSA) (Merck, Darmstadt, Saksa) TBST:ssä RT:ssä. Kalvoja inkuboitiin yön yli 4 ◦C:ssa kanin polyklonaalisen anti-TLR4-vasta-aineen kanssa (Novus Biological, Minneapolis, MN, USA) pitoisuudessa 0,5 µg/ml, minkä jälkeen ne pestiin ja inkuboitiin vuohen anti-kanin IgG:llä ( H + L) HRP-sekundaarinen vasta-aine (ThermoScientificTM, Waltham, MA, USA) klo 1:20, 000 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa.

Blotit visualisoitiin edellä kuvatulla tavalla. Seuraavaksi kalvot irrotettiin RestoreTM Western Blot Stripping -puskurilla (ThermoScientificTM, Waltham, MA, USA) 15 minuutin ajan 37 ◦C:ssa, pestiin ja suljettiin uudelleen.

Sitten kalvoja inkuboitiin yön yli 4 ◦C:ssa hiiren monoklonaalisen aktiinin primaarisen vasta-aineen kanssa (Santa CruzBiotechnology, Dallas, TX, USA) 1:1000, pestiin ja inkuboitiin anti-hiiri-m-IgGkBP-HRP sekundaarisen vasta-aineen kanssa (Santa Cruz). Biotechnology, Dallas, TX, USA) 1 tunnin ajan. Pesun jälkeen blotit kehitettiin edellä kuvatulla tavalla.

Densitometria suoritettiin ImageJ-ohjelmistolla ja arvot normalisoitiin käyttämällä -aktiinia. Normalisoidut arvot esitettiin GraphPad Prism 6:lla.0 (SanDiego, CA, USA).

Tilastolliset analyysit tartunnan saaneiden ja kontrolliryhmien vertaamiseksi suoritettiin Studentin t-testillä, ja varianssien yhtäläisyys määritettiin Levene'stestillä käyttämällä SPSS-ohjelmistoa (SPSS Statistics for Windows, versio 17.0, Chicago, IL, USA). Ryhmien välisiä eroja pidettiin tilastollisesti merkittävinä kohdassa * p<0.05.

4.7. RNA:n uuttaminen, cDNA-synteesi ja geeniekspressio

Lampaan kokonais-RNA uutettiin 90 mg:sta kudosnäytteitä otsakuoresta, talamuksesta, hippokampuksesta ja ydin pitkittäisestä. Hiiren aivot jaettiin keskiviivalla ja kokonais-RNA uutettiin<90 mg obtained from the thalamic area. 

Kudokset homogenisoitiin käyttämällä TeSeEPrecess 48TM -homogenisaattoria (Bio-Rad) ja RNeasy LipidTissue Mini Kit -pakkausta (Qiagen, Hilden, Saksa) yhdistettynä TURBO DNaasiin (Invitrogen TM, Waltham, MA, USA) mahdollisen genomisen DNA-kontaminaation poistamiseksi. RNA-pitoisuus määritettiin spektrofotometrisesti NanoDrop-spektrofotometrillä (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA), ja jokaiselle näytteelle analysoitiin suhteet 260/280 ja 260/230 näytteen puhtauden varmistamiseksi.

Yksi mikrogramma komplementaarista DNA:ta (cDNA) syntetisoitiin käyttämällä qScriptTM cDNA SuperMixiä (Quantabio BiosciencesTM, Beverly, MA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lisäksi DNaasi-hoidon tehokkuus arvioitiin RT-negatiivisissa näytteissä. Käänteistranskription jälkeen sama erä laimennettua cDNA:ta altistettiin qPCR:lle TLR:ien monistamiseksi.

Kaksi yleisesti käytettyä taloudenhoitogeeniä (HK) valittiin normalisoimaan kohdegeenien ilmentymistä: glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) ja aktiini-beeta (ACT) [91]. Tämän HK-geenin stabiilius varmistettiin koe-olosuhteissamme. Lähetti-RNA:n (mRNA) ilmentyminen määritettiin qPCR:llä 1-10 lampaan TLR-geenille, 1-9 hiiren TLR-geenille ja MyD88-geenille molemmille lajeille.

Kaksi tulehdusta edistävää (TNF- ja IL-6) ja kahta anti-inflammatorista (IL-10 ja TGF-) sytokiiniä tutkittiin myös lampaan talamuksessa ja aivotursossa. Alukesekvenssit ja tehot oli julkaistu aiemmin tai ne on suunniteltu Primer3Plus-työkalulla [92] (taulukko 2).

Vahvistimme kunkin standardikäyrän muodostavan geenin tehokkuuden monistamalla kontrolli-cDNA:n 1:2-sarjalaimennoksia ja tarkistamalla sitten lineaarisuuden alkuperäisen templaattikonsentraation ja syklin kynnysarvojen (Ct) välillä. Kaikki geenit osoittivat korrelaatiokerrointa välillä 0.9 ja 0.99, standardikäyrien kulmakertoimen ollessa -3,2 - -3,5 ja qPCR-tehokkuuden ollessa 90-110 %.

QPCR-reaktiot ajettiin käyttämällä Applied BiosystemsTM QuantStudioTM 5 RealTime PCR System -järjestelmää, 96-kuoppa yleisissä monistusolosuhteissa: alkuaktivointi- ja cDNA-denaturaatiovaihe 10 minuuttia 95 ◦C:ssa, jota seurasi 40 3 sekunnin sykliä 95 ◦C:ssa. ja 30 la 60 ◦C.

Epäspesifisten PCR-amplikonien tai korkeiden alukedimeerien läsnäolon tunnistamiseksi suoritimme dissosiaatiokäyräprotokollan jokaisen qPCR-reaktion jälkeen. Jokainen näyte analysoitiin kolmena rinnakkaisena 10 µl:n kokonaisreaktiotilavuudessa, joka koostui 15 ng:sta cDNA:ta, 5 µl:sta Fast SYBR Green Master Mix (2X) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) ja tarvittavasta määrästä eteenpäin ja taaksepäin. alukkeet (taulukko 2).

Nukleaasivapaata vettä lisättiin lopulliseen tilavuuteen 10 ui. Geeniekspression tasot määritettiin käyttämällä vertailevaa Ct-menetelmää. Tulokset esitettiin kertamuutoksina ja geeniekspressioerot suhteessa vertailuryhmän keskimääräiseen tasoon skaalattiin 1:een.

4.8. Tietojen analyysi ja tilastot

Kaikki kerätyt kvantitatiiviset tiedot testattiin normaaliuden suhteen Shapiro-Wilk Wtestillä. Histologiset ja immunohistokemialliset erot tartunnan saaneiden ja kontrolliryhmien välillä arvioitiin Studentin t-testillä tai Mann-Whitney U -testillä riippuen parametrisesta tai ei-parametrisesta datajakaumasta.

Tilastolliset erot neljän eri aivoalueen välillä scrapie-tartunnan saaneilla lampailla määritettiin käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA), jota seurasi Bonferroni post hoc -testi tai Kruskal-Wallis -testi parametrisen tai ei-parametrisen datajakauman mukaan. QPCR-tietojen tilastolliset analyysit suoritettiin kunkin geenin keskimääräisistä ∆Ct-arvoista.

Infektoituneiden ja kontrolliryhmien tilastollista vertailua varten suoritettiin Studentin t-testi tai Mann-Whitney U -testi kunkin geenin normaalijakaumasta riippuen ja varianssien yhtäläisyys määritettiin Levene-testillä. Ilmaisuerojen katsottiin olevan merkittäviä, kun p < 0.05.

Seuraavia merkintöjä käytettiin p-arvojen merkitsemiseen kuvissa: * p < 0.05; ** p Pienempi tai yhtä suuri kuin 0.01; # p < 0.1. Tilastollisiin analyyseihin käytettiin SPSS-ohjelmistoa (SPSS Statistics for Windows, versio 17.0, Chicago, IL, USA). Kaaviot luotiin GraphPad Prism 6.0:lla (San Diego, CA, USA) ja kuvissa esitetyt tiedot edustavat keskiarvon keskiarvoa ja keskivirhettä (keskiarvo ± SEM).

5. Johtopäätökset

Tietojemme mukaan tämä tutkimus on ensimmäinen, joka kuvaa TLRgeenien ilmentymistasoja luonnollisten scrapie-tartunnan saaneiden lampaiden ja kokeellisesti scrapie-tartunnan saaneiden ylikokoisten tg338-hiirten eri aivoalueilla.

Tutkimuksemme osoittaa selvästi, että TLR:t ja erityisesti TLR4 lampailla ja TLR1 ja TLR2 hiirillä ovat mukana scrapien patogeneesissä. Lisäksi, toisin kuin kaikilla muilla tutkituilla alueilla, TLR-geenin ilmentymisen erottuva profiili sekä ainutlaatuinen mikrogliamorfologia ja hippokampuksessa havaittu lievä neuropatologia viittaa aivoaluespesifiseen immuunivasteeseen naturalscrapie-infektiossa.

Lisätutkimukset ovat kuitenkin tarpeen TLR-ilmentymisen karakterisoimiseksi mikrogliassa, astrogliassa ja hermosoluissa scrapie-infektiossa, jotta voidaan ymmärtää kunkin solutyypin tarkka vaikutus hermotulehdukseen. Lisäksi on vielä määritettävä, onko TLR-aktivaatio suora vaste prionitoksisuuteen vai tapahtuuko se toissijaisesti muiden tulehdusmekanismien vuoksi.

TLR:t ovat lupaava kohde toprionisairauksien terapeuttisille lähestymistavoille, ja siksi tarvitaan parempaa ymmärrystä TLR-säädellyistä hermotulehdusreaktioista, jotta voidaan varmistaa edistyminen tällä alalla.

Lisämateriaalit: Seuraavat ovat saatavilla verkossa osoitteessahttps://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms23073579/s1.

Tekijän panokset: Käsitteellisyys, tutkimus ja tietojen kuratointi, MCG ja LMC; kirjoitus-alkuperäisen luonnoksen valmistelu, MG-M., MCG ja LMC; kokeellinen metodologia, MG-M.; kirjoitus-arviointi ja editointi, MG-M., MCG, LMC ja AO; in vivo -metodologia, MB; rahoituksen hankinta, RB ja JJB; molekulaarinen metodologia, BS-P.; valvonta, MCG ja JJB Kaikki kirjoittajat ovat lukeneet käsikirjoituksen julkaistun version ja hyväksyneet sen.

Rahoitus: Tätä tutkimusta rahoitti "Departamento de Ciencia, Universidad y Sociedad delConocimiento" (Aragonin hallitus) projektin "A05_20R: Enfermedades Priónicas, Vectoriales y Zoonosis Emergentes" kautta.

Institutionaalisen arviointilautakunnan lausunto: Kaikki eläimiä koskevat menettelyt noudattavat Espanjan eläinsuojelulakiin RD53/2013 ja Euroopan unionin direktiiviin 2010/63 kokeellisiin tarkoituksiin käytettävien eläinten suojelusta sisältyviä ohjeita. Zaragozan yliopiston eläinkokeiden etiikkakomitea hyväksyi pöytäkirjan (lupanumero: PI38/159 lokakuuta 2015 ja PI19/14 11 huhtikuuta 2014).

Ilmoitettu suostumus: Ei sovelleta.

Tietojen saatavuusilmoitus: Tässä tutkimuksessa esitetyt tiedot ovat saatavilla artikkelitekstin, kuvien ja lisämateriaalin sisällä.

Kiitokset: Kiitämme Olivier Andreolettia (UMR INRAEENVT 1225-IHAP) ja VincentBeringuea (UMR VirologieImmunologieMoleculaires (VIM-UR892), INRAE, Universite Paris-Saclay) näissä kokeissa käytetyistä tg338-hiiristä.

Eturistiriidat: Kirjoittajat ilmoittavat, että ne eivät ole eturistiriitoja. Rahoittajalla ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelussa; tietojen keräämisessä, analysoinnissa tai tulkinnassa; käsikirjoituksen kirjoittamisessa tai tulosten julkaisupäätöksessä. Tämän käsikirjoituksen kuvat ja luvut ovat alkuperäisiä tietoja.

Viitteet

1. Andreoletti, O.; Berthon, P.; Marc, D.; Sarradin, P.; Grosclaude, J.; van Keulen, L.; Schelcher, F.; Elsen, JM; Lantier, F. PrP(Sc):n varhainen kertyminen suolistoon liittyviin imusolmukkeisiin ja hermokudoksiin herkkien lampaiden Romanovin parvesta, jolla on naturalscrapie. J. Gen. Virol. 2000, 81 Pt 12, 3115–3126. [CrossRef] [PubMed]

2. Prusiner, SB Prionitaudit ja BSE-kriisi. Science 1997, 278, 245–251. [CrossRef] [PubMed]

3. McBride, PA; Schulz-Schaeffer, WJ; Donaldson, M.; Bruce, M.; Diringer, H.; Kretzschmar, HA; Beekes, M. Scrapien varhainen leviäminen maha-suolikanavasta keskushermostoon käsittää splanchni- ja vagushermojen autonomiset kuidut.J. Virol. 2001, 75, 9320–9327. [CrossRef]

4. Mabbott, NA; MacPherson, GG Prionit ja heidän tappava matkansa aivoihin. Nat. Rev. Microbiol. 2006, 4, 201–211. [CrossRef]

5. Wemheuer, WM; Benestad, SL; Wrede, A.; Wemheuer, WE; Brenig, B.; Bratberg, B.; Schulz-Schaeffer, WJ PrPSc:n leviämiskuviot lampaiden aivoissa, jotka liittyvät eri prionityyppeihin. Vet. Res. 2011, 42, 32. [CrossRef]

6. Betmouni, S.; Perry, VH; Gordon, JL Todisteet varhaisesta tulehdusvasteesta hiirten keskushermostossa, joilla on scrapie. Neuroscience 1996, 74, 1-5. [CrossRef]

7. Sandberg, MK; Al-Doujaily, H.; Sharps, B.; De Oliveira, MW; Schmidt, C.; Richard-Londt, A.; Lyall, S.; Linehan, JM; Brandner, S.; Wadsworth, JD; et ai. Prionien neuropatologia seuraa vaihtoehtoisten prioniproteiinien isoformien kertymistä sen jälkeen, kun infektoiva tiitteri on saavuttanut huippunsa. Nat. Commun. 2014, 5, 4347. [CrossRef]

8. Vincenti, JE; Murphy, L.; Grabert, K.; McColl, BW; Cancellotti, E.; Freeman, TC; Manson, JC Mikroglian määritteleminen kroonisen neurodegeneraation ajan kuluessa. J. Virol. 2015, 90, 3003–3017. [CrossRef]

9. Aguzzi, A.; Zhu, C. Microglia prionisairauksissa. J. Clin. Tutki. 2017, 127, 3230–3239. [CrossRef]

10. Obst, J.; Simon, E.; Mancuso, R.; Gomez-Nicola, D. Mikroglian rooli prionisairauksissa: toiminnallisen monimuotoisuuden paradigma. Front. Ikääntyminen Neurosci. 2017, 9, 207. [CrossRef]

11. Lawson, LJ; Perry, VH; Dri, P.; Gordon, S. Heterogeenisuus mikroglian jakautumisessa ja morfologiassa normaalissa aikuisen hiiren aivoissa. Neuroscience 1990, 39, 151-170. [CrossRef]

12. Matyash, V.; Kettenmann, H. Heterogeenisuus astrosyyttien morfologiassa ja fysiologiassa. Brain Res. Rev. 2010, 63, 2–10. [CrossRef][PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com