Sairauden mallinnus munuaisorganoideilla Ⅱ

4. Strategiat munuaisten organoidialustojen parantamiseksi

Nykyiset munuaisten organoidit ovat esillämunuaisten kannalta merkitykselliset rakenteetmutta eivät muistutatoimivat aikuisen munuaiset. Näin ollen kohdassa kuvatut protokollat2.2 synnyttää munuaisten organoideja, joilta puuttuu in vivo -kaltainen biofyysinen ympäristö, mukaan lukien nesteen virtaus kudosten läpi. Viimeaikaiset tutkimukset ovat parantaneet organoidin samankaltaisuutta aikuisen munuaisen kanssa käyttämällä tekniikoita, kuten transplantaatiota ja yhdistämällä erilaisia ​​organoidityyppejä korkeamman asteen munuaisrakenteiden saavuttamiseksi. Näitä tekniikoita voidaan yhdistää biotekniikan lähestymistapoihin organoidien kypsymisen tutkimiseksi ja parantamiseksi. Alla korostamme näitä strategioita ja keskustelemme uusista näkökohdista seuraavan sukupolven luomiseenmunuaisten organoidijärjestelmät. 

NAPSAUTTAMALLA TÄTÄ SAATTAA CISTANCHE CKD-HOITOON

4.1. Esittelyssä gradientit

Tiedämme, että normaalin embryogeneesin aikana mesonefros, metanefros ja UB lähettävät signaaleja toisilleen kuvioimaan kehittyvän munuaisen [6]. Lisäksi varhaisessa alkiossa muodostuneet biokemialliset gradientit ovat välttämättömiä oikean munuaisten kuvioinnin ja kehityksen ohjaamiseksi [47]. Merkittävä ongelma nykyisissä munuaisten organoidikehitysprotokollassamme on niiden eristäminen muista kehon kudoksista kehityksen aikana ja siten biokemiallisten gradienttien puute, joka muodostuu vuorovaikutuksista muiden alkion yhdessä kehittyvien kudosjärjestelmien kanssa. Siksi nämä vuorovaikutukset kannattaa sisällyttää organoidikehitykseen. Taguchi ja Nishinakamura (2017) sekä Tsujimoto et al. (2020) ovat pitäneet joitakin näistä vuorovaikutuksista helpottavan organoidin kypsymistä [17,24]. Strategioissaan he käyttivät ensin PIM- ja AIM-spesifisiä tekijöitä itsenäisten organoidien kehittämiseen, minkä jälkeen he siirsivät yhteisviljeltyjä MM- ja UB-organoideja hiiriin [17,24]. Tällä tavalla kehitetyissä munuaisen organoideissa oli korkeamman asteen rakenteita, mutta ne eivät kyenneet toistamaan laajoja in vivo -kaltaisia ​​UB-haaroja. Vaikka nämä tutkimukset korostavat viereisten kudosten yhteisviljelyn merkitystä, ne vaativat organoidin parantamista vakiintuneiden gradienttien kautta, jotka sisältyvät organoidikehityksen alkamisesta.

Koska on lähes mahdotonta sisällyttää kaikki kehittyvän alkion kudokset ja optimoida sen olosuhteita, ehdotamme simulointia ympäristöstä, jossa solut kokevat naapurikudoksen vaikutukset. Tämä voidaan saavuttaa muokkaamalla biokemiallista gradienttia solujen kasvattamiseksi, jolloin gradientti voi jäljitellä viereisten kudosten läsnäoloa. Gradientti voi sitten ohjata sekä AIM- että PIM-linjoja samassa solususpensiossa ja siten indusoida UB:n ja MM:n muodostumista samanaikaisesti. Voisimme esimerkiksi luoda GDNF-gradientin ja edistää UB:n haarautumista MM:ssä indusoidaksemme aikuisen munuaisen monimutkaisen keräyskanavajärjestelmän muodostumisen.

Vaikka näitä gradienttipohjaisia ​​lähestymistapoja ei ole tutkittu munuaisorganoidien luomiseksi, niitä on käytetty parantamaan muiden organoidien kypsymistä. Esimerkiksi Ben-Reuven ja Reiner et ai. (2020) upotettiin morfogeeniä vapauttavia helmiä hydrogeeliin auttamaan aivojen organoidien etu- ja taka-akselin mallintamiseksi [48]. Toisessa tutkimuksessa Kamperman et ai. (2019) perustivat solusubstraatin biotinyloiduilla morfogeeneillä [49]. Näiden staattisten lähestymistapojen lisäksi tutkijat ovat kehittäneet myös mikrofluidisia siruja, joissa on muiden ohjaama morfogeeni. Esimerkiksi Cui et ai. (2020) käyttivät kammiota, jossa oli kemotaksiskammiot morfogeenien jakeluun ja kammioita, joissa kantasoluja voidaan viljellä hydrogeeleissä [50]. Siten tutkijat voivat soveltaa samanlaisia ​​järjestelmiä munuaisten organoidikehityksen ohjelmointiin käyttämällä tiettyjä tekijöitä, joita ohjataan tilallisesti niiden vaikutusten välittämiseksi. Tämä luo gradientin ja jäljittelee luonnossa esiintyviä morfogeenien jakaumia, jotka ovat tärkeitä alkion munuaisten kehitykselle. Esimerkiksi helmiä, joissa on AIM- ja PIM-erilaistumiselle spesifisiä tekijöitä, voidaan kylvää hydrogeelin vastakkaisille puolille luonnollisten AIM-PIM-gradienttien jäljittelemiseksi. Vaihtoehtoisesti hiPSC:n erilaistumisen kontrolloimiseksi soluja tai organoideja voidaan kylvää mikrofluidilaitteisiin siten, että eri sukupolvien solut/organoidit ovat vastakkaisilla puolilla (katso kuva 5A). Hydrogeeleihin upotettuja HiPSC:itä voidaan viljellä näiden kahden rakenteen välissä, mikä voi toimia morfogeenisten tekijöiden lähteinä. Tätä lähestymistapaa voidaan käyttää jäljittelemään mesonefroksen ja metanefroksen välisiä vuorovaikutuksia, joita nykyisistä munuaisorganoidiprotokollasta puuttuu niiden kokoonpanossa (katso kuva 5A). Siten tulevassa työssä tulisi pyrkiä jäljittelemään biokemiallisia vihjeitä useista kudostyypeistä, jotka ovat olennaisia ​​munuaisten kehitykselle, mukaan lukien UB:n ja MM:n väliset sekä kehittyvän munuaisen ja verisuoniston väliset. Aiheeseen liittyvä järjestelmäsuunnittelu voi tutkia vaihtoehtoja gradienttien luomiseksi näiden vuorovaikutusten jäljittelemiseksi.

4.2. Organoidien perfusointi mikrofluidiaineilla

Nesteen virtaus on elintärkeäämunuaisten fysiologiakoska se käynnistää solunsisäisten tapahtumien sarjan vasteena mekanisoitumiselle ja helpottaa kuljetusta kudosten välillä [51]. Siksi, jos haluamme tuottaa toimivia munuaisorganoideja ja ylläpitää niitä pitkiä aikoja, meidän on integroitava vakaat ja perfusoitavat verisuoniverkostot organoidimallijärjestelmiimme. Nestevirtausta on tuotu munuaisten organoideihin kahdella päätavalla, mikrofluidiikalla ja transplantaatiolla. Homan et ai. (2019) sisälsi biofysikaalisia vihjeitä 3D-biopainetussa sirussa, jossa organoideja viljeltiin kammiossa, jossa oli dynaaminen nestevirtaus [52]. Tämä järjestely simuloi mikrofluidista kaveria ja edisti verisuoniverkoston muodostumista, mutta se ei koonnut yhteen perfuusiota verisuoni- ja tubulusrakenteiden kautta munuaisten fysiologian toistamiseksi. Tästä huolimatta tämä tutkimus korosti biofysikaalisen ympäristön merkitystä organoidien kypsymisessä.

Kuva 5. Ehdotetut parannukset munuaisten organoidialustalle. (A) Lähestymistavat gradienttien luomiseksi, joissa hiPSC:itä voidaan viljellä kehittyäkseen munuaisorganoideiksi. Vasemmalta oikealle: iPSC-klusteri hydrogeelissä, jota reunustavat morfogeeneja emittoivat helmet, hiPSC-klusteri hydrogeelissä, jota reunustavat morfogeeneja emittoivat organoidit, monikammioinen sirujärjestelmä, jossa hiPSC-klusteri on viljelty hydrogeelissä ja altistettu molemmin puolin NP- ja UB-linjan morfogeeneille nesteessä. (B) Ehdotettu sirujärjestelmä munuaisen organoidin viljelemiseksi haarautuvan endoteelikanavan viereen, ja sen läpivienti tapahtuu hydrogeelissä (esim. kollageenimatriisissa). (C) Ehdotetut rakennustelineet, joissa munuaisorganoideja voidaan kasvattaa ja myöhemmin siirtää. Vasemmalta oikealle: huokoinen tukirakenne, jossa on haarautuvia endoteelikanavia (punainen), kylvettyjä munuaisen organoideja ja kylvettyjä morfogeenihelmiä (punaiset ja siniset pallot); huokoinen teline, jossa NP-organoidit ympäröivät UB-organoideja

Uskomme, että organoideja voidaan kehittää kanavoituun mikrofluidiseen organ-on-chip-alustaan ​​mallintamaan ihmisen munuaista, kuten on tehty muissa pallomaisissa järjestelmissä. Esimerkiksi toisin kuin Homan et ai. (2019), joka laittoi organoidin nesteen kumppanikammioon, Nashimoto et al. (2017) viljelivät ihmisen keuhkojen fibroblastien sferoideja solunulkoisessa matriisissa (ECM) kahden endoteelikanavan välissä [52,53]. Kanavat synnyttivät perfusoitavan verisuoniverkoston, joka muodostui angiogeneesin kautta. Käyttämällä jokseenkin samanlaista lähestymistapaa kuin Nashimoto et al. (2017), ehdotamme hiPSC-klusterin sijoittamista perfusoitavan endoteelisuonen viereen, joka voidaan rakentaa sirulle, kuten kuvassa 5B [53]. Kun myöhemmin lisätään itäviä munuaisorganoidikohtaisia ​​signaaleja, verisuonikanava voidaan ohjata haarautumaan ja tunkeutumaan organoidiin, kun se alkaa erilaistua. Tämä konfiguraatio toistaisi munuaisten kehityksen varhaiset vaiheet [54]. Munuaisten kehitykseen tarvittavien morfogeneettisten signaalien jatkuvalla perfuusiolla munuaisten organoidien pitäisi pystyä paremmin toistamaan todellisia ihmisen munuaisten muodostumisprosesseja. On myös tärkeää, että järjestelmän parametrit, kuten nestemäisen sikiön jännitys, ECM:n koostumus ja konfiguraatio sekä organoidivaihe, harkitaan huolellisesti ja optimoidaan. Lisäksi koska Schumacher et ai. (2021) ovat osoittaneet, että hypoksia johtaa lisääntyneeseen angiogeneesiin munuaisten organoideissa. Sellaista ex vivo -järjestelmää voidaan viljellä vähentyneen hapen läsnä ollessa verisuonten muodostumisen indusoimiseksi tehokkaammin [55]. Viime kädessä näiden strategioiden pitäisi helpottaa organoidin kypsymistä, koota yhteen verisuoni- ja tubulusperfuusio ja suorittaa fysiologisia toimintoja, kun ne tapahtuvat in vivo.

4.3. Organoidin kypsymisen edistäminen transplantaation kautta

Tutkimukset ovat osoittaneet, että munuaisten organoidien siirtäminen isäntään, kuten hiireen, kananmunaan tai rottaan, voi tarjota käyttökelpoisen reitin verisuonittumiselle [16, 33, 56]. Siirretyt organoidit osoittavat kuitenkin rajallista menestystä toiminnallisina rakenteina. Suurin este tässä strategiassa on laajan UB-haaroittamisen yhteenveto siirrettyjen organoidien MM:ssä. Lisäksi organoideissa olevilta nefronisegmenteiltä puuttuu oikea suuntaus kohti keräyskanavaa. Nämä ominaisuudet ovat välttämättömiä, jotta siirretyt organoidit voivat suorittaa aikuisen ihmisen munuaisen toiminnan. Lisäksi transplantaation jälkeiset organoidit integroituvat isäntään, mikä vaikeuttaa organoidin ja isäntäkudoksen välisten rajojen erottamista ja siten rajoittaa organoidikohtaista analyysiä.

Kudostekniikan strategiat tarjoavat laajan valikoiman työkalujaparantaa munuaisten organoidin kehitystäkypsymisen ja toiminnallisen integraation kannalta. Tyypillisesti kudostekniikan lähestymistavat käyttävät telineitä (esim. silkkifibroiinirunkoa) eri kokoonpanoissa, kuten kalvoina, matoina, hydrogeeleinä ja sieninä, tukemaan solujen järjestelyä ja toistamaan haluttujen ongelmien erilaiset biofysikaaliset vihjeet. Esimerkiksi yhdessä tutkimuksessa Gupta et ai. (2019) käyttivät huokoisia silkkitelineitä organoidien kasvattamiseen, mitä seurasi transplantaatio [31]. Tässä lähestymistavassa rakennustelineiden biomateriaali ja konfiguraatio tarjosivat puitteet, jotka tukevat organoidikehitystä ja antavat vakautta siirron yhteydessä. Tästä järjestelmästä puuttui kuitenkin toiminnallisia vihjeitä organoidin kypsymisen tukemiseksi, kuten verisuonten yhteiskehittäminen muiden kehittyvien rakenteiden läheisyydessä.

Tulevat tutkimukset voivat kehittää samanlaisia ​​strategioita ja sisältää toiminnallisia vihjeitä organoidin kypsymisen tukemiseen. Esimerkiksi, kuten kuviossa 5C on pääpiirteittäin esitetty, huokoinen tukirakenne voidaan konfiguroida perfusoitavilla kanavilla ja ladata morfogeenisillä tekijöillä relevantin organoidikehitysjärjestelmän kehittämiseksi transplantaation avulla. Esikylvö endoteelisoluilla voi tukea suunnattua suonen kehitystä, kun taas avoin huokoinen rakenne voidaan kylvää hiPSC:illä ja ohjelmoida morfogeneettisten tekijöiden avulla organoidikehitykseen. Vaihtoehtoisesti munuaiskudoksista erittynyt solunulkoinen matriisi (ECM) voi itsessään toimia tukimateriaalina munuaisorganoidin kudosmuokkauksessa. Esimerkiksi soluista poistettuja munuaisia ​​on käytetty tukemaan organoidin kypsymistä. Näitä matriiseja voitaisiin käyttää organoidien viljelemiseen ja siirtämiseen tai kudostekniikan tukirakenteiden johtamiseen näistä biomateriaaleista.

Lisäksi telineet tarjoavat käyttämättömän mahdollisuuden upottaa useita organoidilinjoja yhteen valittuihin paikkoihin. Esimerkiksi Taguchi ja Nishinakamura (2017) ja Tsujimoto et al. (2020) siirsi sekä UB- että NP-organoideja, mikä mahdollisti niiden vaskularisoitumisen [17,24]; heiltä puuttui kuitenkin solunulkoinen tukirakenne monilinjaisten organoidien suuntaamiseksi. Telineitä käyttämällä voisimme jäljitellä nefronien muodostumista yhden keräysrakenteen ympärillä suuntaamalla UB-organoidit telineen keskelle ja pohjalle. Samanaikaisesti voimme kylvää NP-organoideja ulkopinnalle (katso kuva 5C). Samanlaisia ​​kudostekniikan lähestymistapoja voidaan kehittää organoidien kypsymisen edistämiseksi. Suunniteltaessa kudosteknologiaan perustuvaa lähestymistapaa organoidien siirtämiseen, parametrit, kuten biomateriaalien konfiguraatio ja yhteensopivuus, tulee kuitenkin valita huolellisesti munuaisten tarpeiden mukaan.

5. Johtopäätökset

Kehitysmunuaisten organoidion suuri läpimurto in vitromunuaissairauksien mallinnus. Munuaisten organoiditmahdollistaa yksilöllisen opiskelungeneettiset munuaissairaudetja huumeiden seulonta ihmisperäisellä alustalla. Vaikka munuaisten organoidit ovat erittäin lupaavia, ne ovat epäkypsiä ja eristettyjä nykyisessä muodossaan. Todella mallintaaihmisen munuainenja niihin liittyvät sairaudet, meidän on kypsytettävä ne kokoamalla yhteen kehittyvät munuaisvuorovaikutukset. Erityisesti meidän on edistettävä UB:n ja MM:n välisiä vuorovaikutuksia in vitro ja esitettävä ihmisperäinen verisuonisto munuaisten organoideihin. Meidän on myös harkittava gradienttipohjaisia ​​morfogeenilähestymistapoja rinnakkaiseen in vivo ihmisen alkionkehitykseen. Munuaisten organoideilla on suuri potentiaali aikuisten jasikiön munuaissairausja huumeiden seulonta. Niiden eteneminen voi johtaa hengenpelastuksen kehittymiseenmunuaissairaushoitoja nopeammalla ja tarkemmalla tavalla kuin koskaan ennen.

Viitteet

1. Bannier-Hélaouët, M.; Post, Y.; Korving, J.; Trani Bustos, M.; Gehart, H.; Begthel, H.; Bar-Ephraim, YE; van der Vaart, J.; Kalmann, R.; Imhoff, SM; et ai. Ihmisen kyynelrauhasen tutkiminen organoideilla ja yksisolusekvensoinnilla.Solujen kantasolu2021, 28, 1221–1232.e7. [CrossRef] [PubMed]

2. Lee, J.; Rabbani, CC; Gao, H.; Steinhart, MR; Woodruff, BM; Pflflum, ZE; Kim, A.; Heller, S.; Liu, Y.; Shipchandler, TZ; et ai. Hiuksia kantava ihmisen iho syntyy kokonaan pluripotenteista kantasoluista.Luonto2020, 582, 399–404. [CrossRef] [PubMed]

3. Takahashi, K.; Yamanaka, S. Pluripotenttien kantasolujen induktio hiiren alkion ja aikuisen fibroblastiviljelmistä määritellyillä tekijöillä.Cell2006, 126, 663–676. [CrossRef] [PubMed] 

4. Maailmanlaajuiset tosiasiat: munuaistaudit. Saatavilla verkossa:https://www.kidney.org/kidneydisease/global-facts-about-kidney disease#:~{}:text=10%25%20of%20the%20population%20worldwide,have%20access%20to%20ffordable %20 hoitoa(käytetty 6. heinäkuuta 2022).

5. Rehman, S.; Ahmed, D.Embryologia, munuaiset, virtsarakko ja virtsajohdin; StatPearls: Treasure Island, FL, USA, 2022.

6. Reidy, KJ; Rosenblum, ND Solut ja munuaisten kehityksen molekyylibiologia.Semin. Nephrol.2009, 29, 321–337. [CrossRef] [PubMed] 

7. Ryan, D.; Sutherland, M.; Flores, TJ; Kent, AL; Dahlstrom, J.; Puelles, V.; Bertram, J.; McMahon, AP; Little, MH; Moore, L.; et ai. Ihmisen sikiön munuaisten kehittyminen raskauden puolivälistä myöhään uros- ja naispuolisilla imeväisillä.eBioLääketiede2017, 27, 275–283. [CrossRef] 

8. Al-Awqati, Q.; Oliver, JA Kantasolut munuaisissa.Kidney Int.2002, 61, 387–395. [CrossRef] 

9. Tran, F.; Klein, C.; Arlt, A.; Imm, S.; Knappe, E.; Simmons, A.; Rosenstiel, P.; Seibler, P. Kantasolut ja organoiditeknologia tarkkuuslääketieteessä tulehduksissa: olemmeko jo perillä?Edessä. Immunol.2020, 11, 573562. [CrossRef]

10. Drost, J.; Clevers, H. Aikuisten kantasoluista peräisin olevien organoidien translaatiosovellukset.Kehitys2017, 144, 968–975. [CrossRef] 

11. Hishikawa, K.; Takase, O.; Yoshikawa, M.; Tsujimura, T.; Nangaku, M.; Takato, T. Aikuisten kantamaiset solut munuaisessa.World J. Stem Cells2015, 7, 490–494. [CrossRef]