Erot haloxylon-ammodendronin juurieritteissä eri metsien iässä ja Cistanche Deserticola -siementen itämisvasteessa

 

Abstrakti

Selvittääksesi, kuinka juuri erittyyHaloxylon ammodendron(saksaul) vaihtelevat metsien iän mukaan ja mitenCistanche deserticola(Cistanche) siementen itävyys vastaa näihin eroihin, tutkimme 1-, 3- ja 6-vuotiaita saxual-metsiköitä Alar-alueella, Xinjiangissa, Kiinassa. Juuren eritenäytteet kerättiin ja analysoitiin käyttämällä LC-MS-pohjaista kohdentamatonta metabolomiikkaa koostumuserojen karakterisoimiseksi. SamanaikaisestiCistanchesiemeniä käsiteltiin eri ikäryhmien juurinesteillä ja siementen itävyys määritettiin.

Tulokset osoittivat merkittäviä erojaCistanchehoitojen itävyysaste. 3-vuotinen metsikköeritekäsittely tuotti korkeimman itämisasteen, merkittävästi enemmän kuin käsittelyt, joissa käytettiin 1- ja 6-vuotiaiden metsien eritteitä, kun taas 1- ja 6-vuotiaiden käsittelyjen välillä ei havaittu merkittävää eroa. Aineenvaihdunta-analyysi osoitti, että saxual juurieritteiden yleiset aineenvaihduntaprofiilit olivat selvästi erotettavissa metsien iässä, ja suurin määrä erilaisia ​​metaboliitteja esiintyi 3- ja 1-vuotiaiden metsien välillä. Erilaiset metaboliitit rikastuivat pääasiassa sokereissa, B6-vitamiiniin liittyvissä molekyyleissä, flavonoideissa/fenoleissa ja lipideihin liittyvissä molekyyleissä. Tärkeimmät reittierot koskivat alfalinoleenihapon aineenvaihduntaa, B6-vitamiinin aineenvaihduntaa ja flavonoideihin liittyviä reittejä. Lisäseulonta integroimalla itämisfenotyyppejä osoitti, että edustavat eroavat piirteet, jotka ovat yhdenmukaisia ​​korkeamman itämisen kanssa, keskittyivät myös näihin metaboliittiluokkiin ja -reitteihin.

Nämä löydökset viittaavat selkeään kemialliseen erottumiseen saksijuurieritteissä metsien iässä ja viittaavat siihen, että 3-vuotiaille saksipuumetsikille voi kehittyä suotuisampi eritekemiallinen tausta.Cistanchesiementen itävyys. Tulokset antavat teoreettisen pohjan kehittämiselle ja optimoinnilleCistancherokotustekniikat.

Avainsanat: Haloxylon ammodendron; Cistanche deserticola; juurinesteet; metabolomiikka; stand-age gradientti

Johdanto

Kuivien aavikkoekosysteemien ennallistaminen riippuu usein tärkeimpien pensaiden muodostumisesta ja jatkuvasta kasvusta [1–2].Haloxylon ammodendronon tyypillinen hiekkaa kiinnittävä puulaji Luoteis-Kiinan autiomaa-alueilla ja sillä on erinomainen rooli tuulensuojassa ja hiekan kiinnittämisessä, pinnan stabiloinnissa ja kasvillisuuden rakenteen ylläpitämisessä [3–4]. Saksiviljelmien hoidon ja ekologisen toiminnan parantamisen ympärille on vähitellen muodostunut kattava polku "ekologinen ennallistaminen - metsänhoito - resurssien käyttö" [5–7]. Näiden lähestymistapojen joukossa rokottaminenCistanche deserticolasaxaul-viljelmien alla pidetään edustavana kehitysmallina, joka tasapainottaa ekologiset ja teolliset hyödyt [8–9].

 

Cistanchen viljelytukikohta Xinjiangissa, Kiinassa

 

Cistanche deserticolasillä on huomattava taloudellinen arvo ja se on lisännyt keinotekoisen viljelyn kysyntää [10–11]. Laajamittaisessa tuotannossa loisten rokotuksen onnistumisprosentti kuitenkin vaihtelee suuresti, mikä vaikuttaa tämän mallin vakauteen ja skaalautumiseen [12].

Saxaul–Cistanche-järjestelmässä siementen itävyys ja varhainen isännän tunnistaminen ovat kriittisiä vaiheita, jotka määrittävät, voidaanko loissuhde luoda [12–13].Cistanchesiemenet ovat erittäin pieniä, ja itämisen alkaminen riippuu voimakkaasti isäntäjuurieritteiden stimulaatiosta [14–15]. Itämisen jälkeen taimien on löydettävä isäntäjuuret lyhyessä ajassa ja päästävä haustorion muodostumisprosessiin [16]. Siksi isäntäsignaalien intensiteetti ja koostumus heijastuu suoraan itämistehokkuuteen ja myöhempien loisten onnistumisprosentteihin [16–17]. Pakollisille loiskasveille nämä signaalit voivat myös muodostaa aika-avaruus "olosuhteiden yhdistelmän", joka todennäköisemmin laukaisee itämisen, eli ns. itämisikkunan [18–19].

Saxaul juurinesteet sisältävät useita yhdisteluokkia, jotka voivat osallistua isännän tunnistus- ja induktioprosesseihin, kuten kinoneja, orgaanisia happoja ja hormoneihin liittyviä molekyylejä. Niiden koostumukseen vaikuttavat sekä kasvin kehitysvaihe että ympäristötausta [20–21]. Aiemmat tutkimukset viittaavat siihen, että juurieritteet vaihtelevat dynaamisesti vuodenaikojen tai kasvuvaiheiden välillä, mikä voi edelleen johtaa eroihinCistancheitävyys, haustorioiden muodostumisen tehokkuus ja loisten muodostuminen [22]. Puuviljelmien hoidon näkökulmasta kasvukauden gradientti vastaa usein isäntäjuurijärjestelmän kehittymistä, hiilen kerääntymistä ja risosfäärin mikroympäristön stabiloitumista. Tämän seurauksena eritteen kemiallista taustaa voidaan säätää systemaattisesti [23–26].

Todisteet ovat kuitenkin edelleen riittämättömiä siitä, kuinka iän erot muokkaavat saxaul juurieritteiden kemiallista spektriä ja voivatko tällaiset muutokset tuottaa kvantitatiivisia itämisvasteita. Tämä aukko rajoittaa myös suoria kvantitatiivisia ohjeita isäntätilan iän valitsemiseen ja avainten hallintajaksojen ajoittamiseen.

Metabolomiikka voi paljastaa muutoksia juuri-eritteen metaboliittiprofiileissa. Monimuuttujatilastollisia menetelmiä, kuten pääkomponenttianalyysiä (PCA) ja ortogonaalista osittaisten pienimmän neliösumman erotteluanalyysiä (OPLS-DA), voidaan käyttää ryhmien erottamiseen ja erilaisten metaboliittien tunnistamiseen [27–28]. Reitin lisämerkinnät ja rikastusanalyysit auttavat tulkitsemaan biokemiallisten muutosten suuntaa [29–30]. Vertaamalla synkronisesti metabolomiikan tuloksia funktionaalisiin fenotyyppeihin (esim. siementen itävyys), eritteiden kemialliset erot voidaan yhdistää mitattavissa oleviin tuloksiin - "edistetäänkö itävyyttä ja missä määrin" - mikä tarjoaa suorempaa tukea hallinta- ja sovelluspäätöksille [31–33].

Siksi tässä tutkimuksessa keskityttiin eri-ikäisiin saxaul-metsikoihin Alar-alueella Taklamakanin aavikon reunalla. Keräsimme juurieritteitä eri ikäisistä metsikköistä LC–MS-kohdistamatonta metabolomiikkaprofilointia varten ja suoritimmeCistanchesiementen itävyysmääritykset käyttämällä näitä eritteitä käsittelynä. Tutkimme iästä johtuvia muutoksia juuri-eritteen metaboliittiprofiileissa (yleinen erottuminen, erilainen metaboliittiseulonta ja reitin rikastuminen) ja sovitimme ne itämisnopeuden eroihin. Tutkimus tarjoaa kvantitatiivisia viitteitä parantamiseenCistancherokotus onnistuu ja tarjoaa empiiristä metabolomiikan näyttöä isäntä- ja loisten välisistä kemiallisista vuorovaikutuksista kuivilla alueilla.

 

1 Materiaalit ja menetelmät

1.1 Tutkimusalue

Tutkimusalue sijaitsee Alar Cityn autiomaa-keidas-siirtymävyöhykkeellä Taklamakanin aavikon pohjoisreunalla, Xinjiangissa, Kiinassa. Alueella on tyypillinen lämmin lauhkea, äärimmäisen kuiva ilmasto, jossa on voimakasta tuuli-hiekkatoimintaa, niukkaa sademäärää ja voimakasta haihdutusta. Vuotuinen keskimääräinen sademäärä on 40,1–82,5 mm ja keskimääräinen haihdunta 1876,6–2558,9 mm. Valo- ja lämpöresurssit ovat runsaat, ja vuorokausilämpötilaerot ovat suuria. Pintakasvillisuutta hallitsevat aavikon pensaat ja harvat yrtit. Saxaul on tärkein rakentava laji, jota käytetään paikallisissa tuulensuoja- ja hiekankiinnitysvyöhykkeissä, ja alue on myös tärkeä saxaul-inokuloinnin tuotantoalue.Cistanche.

1.2 Näytteenotto ja käsittely

Näytteenotto tehtiin huhtikuussa 2025 (keväällä) Alarin alueella. Juuren eritteet ja synkroniset maanäytteet kerättiin 1-, 3- ja 6-vuotiaista saxaul-metsikoista.Cistanchesiementen itämiskokeet suoritettiin näytteenoton jälkeen.

1-, 3- ja 6-vuotiset stand-age-hoidot nimettiin AO:ksi, AT:ksi ja AS:ksi. Kukin hoito sisälsi kolme biologista replikaattia, jotka oli merkitty AO1–AO3, AT1–AT3 ja AS1–AS3. Yhden vuoden osastot edustavat varhaista perustamisvaihetta; 3-vuotiset metsikköt edustavat voimakasta kasvuvaihetta, jossa on aktiivisia juurakkosfääriprosesseja; ja 6-vuotiset metsit edustavat suhteellisen vakaata vaihetta. Perustuen eroihin isännän kehitysvaiheissa, vertailimme juuri-eritteen kemiallista vaihtelua metsiköiden iässä ja sen suhdettaCistanchesiementen itävyys.

1.2.1 Juurinesteen kerääminen

Juuren eritteet kerättiin käyttämällä in situ -kenttäuuttomenetelmää. Jokaiselta kasvualustalta valittiin saxaul-yksilöitä, joilla oli samanlainen kasvutila eikä ilmeisiä tuholaisia ​​tai sairauksia. Kolmesta kasvista otettiin näytteitä per metsikkö ikä biologisina rinnakkaisina. Juuret kaivettiin huolellisesti kasvipohjan ympäriltä, ​​mikä minimoi mekaaniset vauriot. Tarttuva maaperä poistettiin varovasti; juuret huuhdeltiin deionisoidulla vedellä; sitten juuret pussitettiin ja haudattiin uudelleen in situ 24 tunnin esikäsittelyä varten.

Esikäsittelyn jälkeen juuret poistettiin ja huuhdeltiin uudelleen varovasti deionisoidulla vedellä. Juurisegmentit käärittiin kostutetulla suodatinpaperilla kosteuden ylläpitämiseksi, asetettiin 50 ml:n sentrifugiputkiin, suljettiin parafilmillä ja haudattiin uudelleen in situ. 24 tunnin kuluttua suodatinpaperilla käärityt juurisegmentit kerättiin, pidettiin jäissä ja kuljetettiin laboratorioon.

Laboratoriossa lisättiin 100 ml deionisoitua vettä ja näytteitä ravisteltiin 30 minuuttia uuttamista varten. Uute tyhjösuodatettiin, konsentroitiin alennetussa paineessa ja säilytettiin -80 asteessa myöhempiä LC-MS-kohduttamattomia metabolomiikkaanalyysejä varten. Samoja uutteita käytettiin myös siementen käsittelymäärityksiin.

1.2.2 Maaperänäytteiden otto ja maaperän fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien määrittäminen

Maanäytteet kerättiin samanaikaisesti juurieritteiden kanssa. Näytteet ilmakuivattiin luonnollisesti, epäpuhtaudet poistettiin ja kuljetettiin 2 mm:n seulan läpi fysikaalis-kemiallisia mittauksia varten, mukaan lukien pH, kokonaistyppi (TN), kokonaisfosfori (TP), kokonaiskalium (TK), alkalihydrolysoituva typpi (AN), käytettävissä oleva fosfori (AP), käytettävissä oleva kalium (AKS) ja maaperä. Yksityiskohtaiset menetelmät on esitetty taulukossa 1.

Taulukko 1. Maaperän fysikaalis-kemialliset indikaattorit ja analyysimenetelmät

Ilmaisin	Lyhenne	Analyyttinen menetelmä
pH	-	Potentiometrinen menetelmä
Kokonaistyppi	TN	Kjeldahlin menetelmä
Kokonaisfosfori	TP	NaOH-fuusio – molybdeeniantimonikolorimetria (spektrofotometria)
Yhteensä kalium	TK	NaOH-fuusiomenetelmä
Alkalihydrolysoituva typpi	AN	Alkalinen diffuusiomenetelmä
Käytettävissä oleva fosfori	AP	Spektrofotometrinen menetelmä
Saatavilla kaliumia	AK	Ammoniumasetaattiuuttomenetelmä
Maaperän orgaaninen aines	SOM	Kaliumdikromaattihapetusmenetelmä

1.3 LC–MS:n kohdentamaton aineenvaihdunta ja tietojen esikäsittely

Juuren eritenäytteet analysoitiin käyttämällä ultra-korkean suorituskyvyn nestekromatografia-korkean resoluution massaspektrometriaa (UHPLC-HRMS) sekä positiivisissa että negatiivisissa sähkösumutusionisaatiomuodoissa. Raakadatalle suoritettiin piikin uutto, retentioajan korjaus, huippujen kohdistus, puuttuvien arvojen käsittely ja normalisointi ennen alavirran analyysejä.

Laadunvalvontanäytteitä ja nollakontrolleja käytettiin poistamaan taustahäiriöhuippuja ja ominaisuuksia, joiden toistettavuus oli huono tietojen vakauden ja vertailukelpoisuuden parantamiseksi. Metaboliitin tunnistaminen ja annotointi perustuivat pääasiassa tarkkoihin massaan, retentioaikaan ja MS/MS-fragmentointikuvioihin, jotka sovitettiin HMDB:hen, METLINiin, MassBankiin ja kartoitettiin KEGG:hen reittianalyysiä varten. Annotaatiotulokset suodatettiin täsmäytysluottamuksella ja suoritettiin kemiallisten luokan luokittelu ja reittitason yhteenveto.

1.4 CistancheSiementen itämiskoe

1.4.1 Siementen esikäsittely

KerättyCistanchesiemenet asetettiin 30 asteeseen vakiolämpötilassa olevaan inkubaattoriin 1 tunniksi. Siemenkuoret poistettiin ja siemenet pintasteriloitiin 2-prosenttisessa natriumhypokloriitissa 15 minuutin ajan, huuhdeltiin kolme kertaa steriilillä tislatulla vedellä ja kuivattiin steriilillä suodatinpaperilla.

1.4.2 Esikoe ja itämisen edistämisen perusolosuhteiden määrittäminen

Eri ikäisten metsien eritteillä tehtyjen hoitojen vertailukelpoisuuden varmistamiseksi suoritettiin esikoe gibberelliinin ja fluridonin lisäysolosuhteiden seulomiseksi. Testiä edeltävien tulosten perusteella itämistä edistäväksi perusedellytykseksi valittiin yhdistelmä, jolla oli parempi itävyys ja vakaa toistettavuus: 1 ml 1 g·L−1^{-1}−1 gibberelliiniä ja 1 ml 10 mg·L−1^{-1}−1 fluridonia.

1.4.3 Hoidot eri ikäisillä juurieritteillä

Yhdistetyssä perusitämistä edistävässä ehdossa vertailua varten lisättiin yhtä suuret määrät juurieritteenäytteitä 1-, 3- ja 6-vuotiaista saxaul-metsikoista.Cistanchesiementen itämisvasteet. Tässä tutkimuksessa keskityttiin eri metsien eritteiden hoitovaikutuksiin, eikä se sisältänyt eksudaattipitoisuusgradienttia.

Jokaista käsittelyä varten 50 esikäsiteltyä siementä laitettiin petrimaljoille suodatinpaperimenetelmällä ja inkuboitiin 25 asteessa pimeässä. Itämisnopeus kirjattiin 10 päivän kuluttua. Itämiskriteerinä käytettiin sädettä (alkioputki), jonka pituus oli > 1 mm. Jokaisella hoidolla oli kolme toistoa.

1.5 Tilastollinen analyysi

Esikäsittelyn ja normalisoinnin jälkeen metabolomiikkatiedot analysoitiin käyttämällä hierarkkista klusterianalyysiä, PCA:ta ja OPLS-DA:ta metsien iän välisten yleisten erojen arvioimiseksi. Erilaiset metaboliitit seulottiin käyttämällä VIP > 1 ja P < 0,05. Venn-kaavioita, tulivuorikaavioita, klusteroituja lämpökarttoja ja KEGG-reitin rikastusanalyysejä käytettiin tärkeimpien aineenvaihdunnan ominaisuuksien tulkinnassa.

Cistanchesiementen itämisnopeudet analysoitiin yksisuuntaisella ANOVAlla; post hoc -vertailut suoritettiin käyttäen Tukeyn testiä. Merkitystasoksi asetettiin =0.05\\alpha=0.05 =0.05.

 

2 Tulokset ja analyysi

2.1 Maaperän fysikaalis-kemialliset ominaisuudet

Maaperän fysikaalis-kemialliset indikaattorit osoittivat jonkin verran vaihtelua eri metsiköiden iässä, mutta muutoksen kokonaissuuruus oli rajallinen (taulukko 2). Maaperät olivat emäksisiä kaikilla palstoilla, pH vaihteli välillä 8,35-8,83. Kokonaistypen, kokonaisfosforin, kokonaiskaliumin ja orgaanisen aineksen pitoisuudet olivat yleensä alhaisia. Kolmen vuoden osastoilla oli suhteellisen korkeampi TN, TK, SOM ja AK; 6 vuoden osastoilla oli hieman korkeampi TP ja AP; ja 1 vuoden metsikköillä oli suhteellisesti korkeampi AN. Kaiken kaikkiaan maaperän taustat vaihtelivat jonkin verran metsiköiden iässä ilman johdonmukaista suuntausta. Siksi myöhemmät analyysit keskittyivät pääasiassa juuri-eritteen eroihin ja niiden vastaavuuteenCistanchesiementen itämisvasteet.

Taulukko 2. Maaperän fysikaalis-kemialliset ominaisuudet

Hoito	pH	TN (g·kg⁻¹)	TP (g·kg⁻¹)	TK (g·kg⁻¹)	AN (mg·kg⁻¹)	AP (mg·kg⁻¹)	AK (mg·kg⁻¹)	SOM (g·kg⁻¹)
AO	8.83	0.129	0.591	6.76	11.672	7.171	159.783	2.660
AT	8.35	0.165	0.604	10.69	9.114	7.381	377.900	3.186
AS	8.82	0.101	0.649	7.08	10.697	8.086	185.962	2.547

Huomautuksia:AO=1-vuoden kanta; AT=3-vuoden taso; AS=6-vuoden taso.

 

2.2 Eri metsien ikäisten juurieritteiden vaikutuksetCistancheSiementen itävyys

Cistanchesiementen itämisasteet erosivat merkittävästi eri ikäisten juurten eritteiden käsittelyjen välillä (kuva 1). Kolmen vuoden metsikkönesteen käsittely (AT) tuotti korkeimman itämisasteen, 84,66 % ± 1,15 %. Yhden vuoden (AO) ja 6 vuoden (AS) hoidot tuottivat vastaavasti 80,89 % ± 2,04 % ja 80,67 % ± 0,67 %. Yksisuuntainen ANOVA osoitti merkittävän eron hoitojen välillä (P=0.022). Tukeyn post hoc -testi osoitti, että AT oli merkittävästi korkeampi kuin AO (P=0.038) ja AS (P=0.030), kun taas AO ja AS eivät eronneet merkittävästi (P ​​= 0.980).

Kuva. 1 Erot Cistanche deserticola -siementen itämisnopeudessa eri-ikäisten Haloxylon ammodendron -metsiköiden juurieristekäsittelyssä

 

Nämä tulokset viittaavat siihen, että kevätikkunan aikana eri ikäisten metsien juurinesteet vastaavat selkeitä erojaCistanchesiementen itämisvasteet ja 3-vuotiaiden metsien eritteet osoittavat vahvempaa itävyyttä edistävää potentiaalia. Selvittääksemme edelleen näitä eroja, analysoimme seuraavaksi yleistä metaboliitti-profiilin erottelua ja erilaisia ​​metabolisia ominaisuuksia.

2.3 Yleiset erot juurieritteissä eri ikävuosien välillä

2.3.1 Juuren eritteen aineenvaihduntaprofiilien yleinen erottelu

Juurieritteiden aineenvaihduntaprofiilit erottuivat selvästi puuston iän mukaan. Globaali lämpökartta (kuva 2) osoitti, että useimmat saman metsikön iän näytteet ryhmittyivät samalle oksalle, mikä osoittaa hyvää ryhmän sisäistä yhtenäisyyttä. Näytteet eri ikäisistä metsikköistä osoittivat suhteellisen selkeitä ryhmittelymalleja, mikä viittaa siihen, että eritteen koostumus järjestettiin uudelleen metsikön iän mukaan.

PCA-tulokset (kuvio 3) osoittivat, että kaksi ensimmäistä pääkomponenttia selittivät 46,5 % kokonaisvarianssista; PC1 ja PC2 selittivät vastaavasti 32,1 % ja 14,4 %. Näytteet eri ikäisistä metsikköistä osoittivat erottuvat jakaumat ordinaatiotilassa. Erityisesti yhden vuoden näytteet osoittivat yleistä jakautumistrendiä, joka poikkesi 3- ja 6-vuotiaista näytteistä, mikä osoitti rakenteellista eroa eritekoostumuksessa puuston iän mukaan. Vaikka jonkin verran ryhmän sisäistä vaihtelua säilyi, puusto-ikäsidonnainen erotrendi oli selvä.

 

2.3.2 Ryhmien välinen syrjintä

Puuston iän välisten erojen vertailemiseksi edelleen parittaiset vertailut (AO vs. AT, AO vs. AS, AT vs. AS) suoritettiin negatiivisen ionimoodin tietojen perusteella (kuva 4). Kaikki kolme vertailua osoittivat selkeän eron ja hyvän biologisten replikaattien klusteroitumisen, mikä osoitti vakaat metaboliset erot metsien iässä.

Kaikilla OPLS-DA-malleilla oli hyvä istuvuus ja ennakoiva suorituskyky, R2Y=0.998–1,000 ja Q2=0.663–0,873, mikä osoitti juuren eritenäytteiden voimakasta erottelua puuston iän välillä. Erotus oli selkein AS:n ja AO:n välillä, mikä viittaa suurimman kokonaiskoostumuseron 1 ja 6 vuoden metsien eritteiden välillä. AT osoitti myös vakaata erotusta AO:sta ja AS:sta, mikä osoitti, että 3 vuoden eritteillä on jo selkeät vaihekohtaiset ominaisuudet. Kaiken kaikkiaan juuri-eritteen metaboliittiprofiilit olivat erittäin erotettavissa metsien iässä, mikä tuki erilaisten metaboliittien ja niiden yhteyttä itävyyseroihin alavirran analyysejä.

Kuva. 3 Pääkomponenttianalyysi

Kuva. 4 eri-ikäisten Haloxylon-ammodendronin juurieritteiden OPLS-DA-pisteiden parillinen vertailu

 

2.4 Saxaul Root -eritteiden tärkeimmät eroavat metaboliset ominaisuudet

2.4.1 Erilaisten aineenvaihduntatuotteiden ja yhteisten ominaisuuksien määrä

Jokainen parikohtainen vertailu metsien iän välillä sisälsi tietyn määrän erilaisia ​​metaboliitteja (kuva 5). Suurin määrä esiintyi AT vs. AO:ssa, 31 erilaista metaboliittia. AS vs. AO ja AS vs. AT olivat 24 ja 18 erilaista metaboliittia, vastaavasti, mikä osoittaa, että erot 3 vuoden ja 1 vuoden eritteiden välillä olivat selkeimpiä.

Seitsemän erilaista metaboliittia jaettiin kaikissa kolmessa vertailussa, mikä osoitti suhteellisen vakaan metaboliittisarjan, joka reagoi seisoma-iän muutoksiin. Samaan aikaan jokaisessa vertailussa säilyi joitain ainutlaatuisia erilaisia ​​metaboliitteja, mikä heijastaa selkeitä vaihekohtaisia ​​​​piirteitä eksudaattimuutoksissa. Kaiken kaikkiaan iän erot eivät ilmaistu vain metaboliittien määrässä, vaan myös rakenteessa, jossa yhteiset ja vaihekohtaiset erilaiset metaboliitit esiintyivät rinnakkain.

 

Kuva. 5 Venn-kaavio Haloxylon ammodendronin juurieritteiden erilaistetuista metaboliiteista metsikköiän välillä

 

2.4.2 Differentiaalisten aineenvaihduntatuotteiden muutosmallit

Tulivuoripiirrokset ja klusteroidut lämpökartat osoittivat modulaarisia muutoksia juurieritteissä metsikön iässä. Kaikissa kolmessa vertailussa (kuva 6) merkittävät aineenvaihduntatuotteet jakautuivat tulivuoren molemmille puolille, mikä osoittaa sekä ylös- että alas-säädeltyjä metaboliitteja metsien iässä. Monet merkittävät piirteet osoittivat suuria kertamuutoksia ja voimakasta merkitystä, mikä viittaa siihen, että ryhmäerottelua ohjasivat yhdessä joukko keskittyneitä metabolisia siirtymiä hajautettujen yksittäisten variaatioiden sijaan.

Metaboliitin annotaatioiden perusteella tärkeimmät eroluokat keskittyivät sokereihin, B6-vitamiiniin liittyviin molekyyleihin, flavonoideihin/fenoleihin ja lipideihin liittyviin molekyyleihin. Edustavia erilaisia ​​metaboliitteja olivat sakkaroosi, isopyridoksaali, linolenaatti (18:3), PA 40:7, metyyligibberelliini A9 ja sekologaniini.

AT vs. AO sisälsi suurimman määrän erilaisia ​​metaboliitteja, mikä viittaa voimakkaampaan kemiallisen tuotannon siirtymiseen 1-vuotiaista 3-vuotisiin. Erot AT:n ja AS:n välillä olivat myös vakaita, mikä osoittaa, että 3-vuotisvaihe ei ole vain lineaarinen siirtymä 1- ja 6-vuotiaiden metsien välillä, vaan sillä on selkeitä vaihekohtaisia ​​piirteitä. Kaiken kaikkiaan metsien iän väliset erot johtuivat pääasiassa koordinoiduista muutoksista yllä olevien metaboliittiluokkien välillä eikä yksittäisten metaboliittien yksittäisistä vaihteluista.

 

Kuva. 6 Haloxylon-ammodendronin juurieritteissä olevien erilaisten metaboliittien tulivuoren kaaviot metsiköiden eri aikoina

 

Edustavien erilaisten metaboliittien lämpökartta (kuva 7) osoitti lisäksi hyvää biologisten replikaattien ryhmittymistä ja selkeää erottelua metsien iän välillä, mikä osoitti, että metsien ikäerot heijastuivat suoraan differentiaalisten metaboliittien profiileihin. Kolmen vuoden ryhmä (AT) osoitti osittaisia ​​yhtäläisyyksiä AO:n tai AS:n kanssa eri metaboliittimoduuleissa, mutta säilytti omat erityispiirteensä. Jotkut metaboliitit saavuttivat huippunsa AT:ssa, mutta pysyivät alhaisempana AO:ssa ja AS:ssa; toiset olivat alhaisempia AT:ssa, mutta korkeampia AO:ssa tai AS:ssa. Näin ollen 3-vuotisvaihe ei noudattanut yksinkertaista monotonista nousu/laskumallia, vaan selkeä vaihekohtainen uudelleenjärjestely. Erityisesti B6-vitamiiniin liittyvät molekyylit (esim. isopyridoksaali, pyridoksaatti), flavonoidit/fenolit (esim. kversetiini, isokersitriini, skopoliini) ja lipideihin liittyvät molekyylit (esim. linolenaatti 18:3, PA 40:7, FA 18:1) osoittivat yhteneväisiä ikämoduuleita, FA 18:1; analyysit.

Kuva. 7 edustavien erilaisten metaboliittien hierarkkinen klusterilämpökartta

 

2.4.3 Pääasialliset aineenvaihduntareitit

KEGG-reittianalyysi osoitti, että ikään liittyvät erot saksaulanjuuren eritteissä liittyivät ensisijaisesti lipidiaineenvaihduntaan, vitamiini/kofaktori-aineenvaihduntaan ja flavonoideihin liittyvään sekundaariseen aineenvaihduntaan (kuva 8). Alfa-linoleenihapon aineenvaihdunta ilmaantui suhteellisen korkealla reitti-vaikutustekijällä, mikä edustaa näkyvää lipideihin liittyvää reittiä seisoma-ikäeroissa. B6-vitamiinin aineenvaihdunta osoitti myös suurta merkitystä, mikä viittaa merkittäviin muutoksiin kofaktoreihin liittyvissä ja redox-homeostaasiin liittyvissä pienissä molekyyleissä.

Toissijaisessa aineenvaihdunnassa flavonoidien biosynteesi, flavonin ja flavonolien biosynteesi ja flavonoidien hajoaminen rikastuivat, mikä osoittaa, että fenoli-flavonoidimoduuli on pääasiallinen suunta iän vaihtelulle. Lisäksi aromaattisten yhdisteiden reitit, kuten bentsoaatin hajoaminen, osoittivat tiettyjä vasteita. Kaiken kaikkiaan iästä johtuvat erot saksaulanjuuren eritteissä rakentuivat pääasiassa lipidiaineenvaihdunnan, B6-vitamiinin aineenvaihdunnan ja flavonoidi-/fenoliaineenvaihdunnan ympärille.

2.5 Itämisfenotyyppien perusteella seulotut edustavat differentiaaliset aineenvaihduntatuotteet

Selvittääksemme edelleen yhteyksiä eritteiden erojen jaCistancheitämisfenotyypit, erilaiset metaboliitit integroitiin itämisnopeusmalleihin. Itämismääritykset osoittivat, että AT-käsittelyllä oli korkein itävyys, kun taas AO ja AS olivat alhaisempia eivätkä eronneet merkittävästi. Tämä kuvio viittaa siihen, että 3-vuotiaat saxaul-eritteet voivat sisältää kemiallisia komponentteja, jotka ovat edullisempia edistämiselleCistanchesiementen itävyys.

Tämän fenotyypin perusteella asetimme etusijalle metaboliitit, jotka (i) esiintyivät sekä AT vs. AO että AT vs. AS -vertailuissa ja (ii) osoittivat muutostrendejä, jotka olivat yhdenmukaisia ​​korkeamman itämisen kanssa (taulukko 3). Nämä ehdokkaat eroavat ominaisuudet keskittyivät pääasiassa sokereihin, lipideihin liittyviin molekyyleihin, B6-vitamiiniin liittyviin molekyyleihin ja flavonoideihin/fenoleihin, ja ne liittyivät alfalinoleenihapon aineenvaihduntaan, B6-vitamiinin aineenvaihduntaan ja flavonoideihin liittyviin reitteihin. Nämä tulokset osoittavat selkeän kategorioiden ryhmittymisen ehdokkaiden metabolisten ominaisuuksien joukossa, jotka ovat yhdenmukaisia ​​korkeamman itämisen kanssa, mikä viittaa siihen, että nämä metaboliitit tai niihin liittyvät reitit voivat myötävaikuttaa itämisfenotyyppiin.

Kuva. 8 Kuplakaavio aineenvaihduntareittiin vaikuttavista tekijöistä

 

 

Välilehti. 3 Eri-ikäisten Haloxylon ammodendron -kasvien juurieritteiden ja Cistanche deserticolan siementen itävyyden välinen vastaavuus

Vertailuryhmä	Itämisvasteen tyyppi	Tärkeimmät eroluokat	Eroominaisuudet	Edustavia erilaisia ​​metaboliitteja
AT vs AO	Itävyys sisäänAT korkeammallakuinAO	Sokerit, B6-vitamiiniin liittyvät, flavonoidit/fenolihapot, lipidit	Merkittävä modulaarinen uudelleenjärjestelyeritteissä klo3 vuottaseistä ikää	sakkaroosi; isopyridoksaali; pyridoksaatti; kvertsetiini; isokersitriini; Linolenaatti (18:3)
AS vs AT	Itävyys sisäänAS alempanakuinAT	Sokerit, flavonoidit, gibberelliinit	Erottelu välillä6 vuottaja3 vuottaseisoo osoitteessasignalointijasekundaarinen aineenvaihduntatasot	sakkaroosi; isokersitriini; Metyyligibberelliini A9
AS vs AO	Itämisnopeuden eroei merkittävää	B6-vitamiiniin liittyvät, lipidit	Suuret metaboliset erotvälillä1 vuosija6 vuottaseisoo, muttaei merkittävää itävyyseroa	Isopyridoksaali jne.

3 Keskustelu

3.1 Stand-age edistää saxaul-juurieritteiden kemiallista erilaistumista

Kasvien juurinesteet eivät ole staattisia; ne mukautuvat dynaamisesti kehitysvaiheen, resurssien allokoinnin ja risosfäärin ympäristömuutosten mukaan. McLaughlin et ai. [22] osoitti, että juurieritteet vaihtelevat huomattavasti kasvilajin ja aikaskaalan välillä, mikä osoittaa vahvaa spatiotemporaalista dynamiikkaa. Chen et ai. [23] raportoi lisäksi, että sekä puiden ikä että vuodenaika muuttavat merkittävästi juurien erittymisstrategioita ja aineenvaihduntatuotteiden koostumusta kiinalaisilla kuusiviljelmillä, mikä osoittaa selkeitä ikävaiheen eroja aineenvaihdunnan tuloksissa. Nämä tutkimukset tukevat fysiologista ja ekologista perustaa juuri-eritteen kemian kehitysvaiheohjautuneelle erilaistumiselle.

Tässä tutkimuksessa saxaul juurieritteet osoittivat selvää eroa metsien iän välillä yleisellä metaboliittiprofiilitasolla. Lämpökartan klusterointi, PCA ja OPLS-DA osoittivat vakaan erottelun metsien iän välillä, mikä osoittaa, että metsikköikä voi ohjata saxaul juurieritteiden vaihekohtaista kemiallista uudelleenjärjestelyä. Tämä on samaa mieltä olemassa olevan tiedon kanssa, että kasvin kasvuvaihe vaikuttaa eritteen koostumukseen, ja viittaa siihen, että Saxaul–Cistanche-isäntäjärjestelmässä kasvukauden vaihtelu voi olla tärkeä ekologinen tekijä, joka muokkaa juuriperäisten signaalien taustaa.

Lisäksi kasvukauden muutokset eivät vastaa vain isännän kehitysvaihetta vaan myös risosfäärin ympäristötaustan muutoksia. Maaperän ravinnetasot, pH, orgaaninen aines ja suolaisuusolosuhteet voivat vaikuttaa kasvien ravinteiden hankintaan, hiilen jakautumismalleihin ja juurakoiden vakauteen, mikä edelleen säätelee juurieritteiden koostumusta ja vapautumisprosesseja.

3.2 Eritteet 3-vuotiaasta Saxaulista vastaavat korkeampaaCistancheSiementen itävyysaste

Parasiittisten kasvien siementen itävyys riippuu suuresti isännästä peräisin olevista kemiallisista signaaleista. Nelson [16] totesi, että Orobanchaceae-lajin juuriloiskasvit luottavat tyypillisesti isäntäjuuren vapauttamiin signaalimolekyyleihin havaitakseen isännän läsnäolon ja käynnistääkseen itämisen; tällainen "isäntä-indusoitu itävyys" on keskeinen mukautuva mekanismi.

Tässä tutkimuksessaCistanchesiementen itävyys oli korkein 3-vuotisessa saxaul-eritekäsittelyssä, merkittävästi korkeampi kuin 1- ja 6-vuotisilla eritteillä tehdyissä hoidoissa, kun taas yhden vuoden ja 6 vuoden hoitojen välillä ei havaittu merkittävää eroa. Tämä osoittaa, että eri seisoma-isännät eivät todennäköisesti tarjoa pelkästään eri määriä eritteitä, vaan kemiallisesti erilaisia ​​itävyyttä edistäviä taustoja. Se tosiasia, että AT:lla ja AO:lla oli eniten erilaisia ​​metaboliitteja, viittaa siihen, että kemiallinen uudelleenjärjestely 1-vuotiaista 3-vuotiaisiin metsikoihin oli suurin, mikä vastaa korkeamman itämisen suuntaa.

Tämä malli voi liittyä kasvuvaiheen eroihin saxaulissa ja vastaavissa resurssien allokointistrategioissa. Yksivuotinen saxaul on varhaisessa perustamisvaiheessa, jolloin kasvit eivät ole täysin vakiintuneet, juurijärjestelmät ja resurssien hankinta ovat suhteellisen rajallisia ja aineenvaihduntatuotos voi keskittyä enemmän itsensä kasvun ylläpitämiseen. Kuuden vuoden saxaul on suhteellisen kypsässä vaiheessa, jolloin resurssien kohdentaminen voi siirtyä kohti ylläpitoa, rakenteellista vakautta ja ympäristöön sopeutumista, mikä johtaa vakaampiin erittymisstrategioihin. Sitä vastoin 3-vuotias saxaul on yleensä voimakkaassa kasvuvaiheessa, ja juurien laajeneminen, ravinteiden otto ja maanalainen aineenvaihdunta ovat aktiivisempia, mikä tekee siitä todennäköisemmin rikkaamman ja vaihtelevamman juuren eriteprofiilin. Tämän perusteella selvä metaboliitin uudelleenorganisaatio ja korkeampi itävyys 3-vuotisen hoidon aikana voivat heijastaa suotuisampaa risosfäärin signaaliympäristöäCistanchesiementen itävyys kevätikkunan aikana.

3.3 Tärkeimmät eroavat aineenvaihduntaominaisuudet, jotka ovat yhdenmukaisia ​​itämisreaktioiden kanssa

Metabolomiikka paljastaa tehokkaasti metaboliittiprofiilin muutokset monimutkaisissa näytteissä. Kun se on integroitu reitin rikastusanalyysiin, se mahdollistaa suurten muutossuuntien tunnistamisen järjestelmätasolla. Aiemmat tutkimukset [31–33] viittaavat siihen, että metabolomiikan tulosten yhdistäminen funktionaalisiin fenotyyppeihin, kuten siementen itämiseen, auttaa kohdistamaan ehdokasmetaboliitteja tai reittejä, jotka ovat yhdenmukaisia ​​fenotyyppimuutosten kanssa. Juuren eritteiden osalta "fenotyypin ensimmäinen, aineenvaihduntatuotteiden jäljitys" -strategia on erityisen hyödyllinen spesifisiin biologisiin vaikutuksiin liittyvien ehdokkaiden metabolisten piirteiden tunnistamisessa.

Tässä tutkimuksessa fenotyyppiohjattu seulonta osoitti, että edustavat eroavat piirteet, jotka vastaavat 3-vuotisen hoidon korkeampaa itämisnopeutta, keskittyivät pääasiassa sokereihin, B6-vitamiiniin liittyviin molekyyleihin, flavonoideihin/fenoleihin ja lipideihin liittyviin molekyyleihin, jotka käsittivät alfalinoleenihapon aineenvaihduntaa, B6-vitamiinin aineenvaihduntaa ja flavonoideihin liittyviä polkuja. Mekaanisesti sokerit voivat heijastaa muutoksia risosfäärin hiilen tarjonnassa ja allokaatiossa; lipideihin liittyvät molekyylit voivat liittyä kalvon lipidien uudelleenmuodostukseen ja stressisignaalien säätelyyn; flavonoidit/fenolit voivat osallistua isäntä-loisen tunnistamiseen ja risosfäärisignaalien siirtoon; ja B6-vitamiiniin liittyvät molekyylit voivat olla yhteydessä metaboliseen homeostaasiin ja stressin puskurointiin. Nämä metaboliset luokat osoittivat koordinoituja muutoksia AT-ryhmässä.

Cistanche-tutkimukset osoittavat, että isännästä peräisin olevat fenolihapot voivat vaikuttaa induktioprosesseihin, ja fenoliset/aromaattiset sekundaariset aineenvaihduntatuotteet isäntäjuurissa voivat vaikuttaa loisvasteisiin [14]. Vaikka tämä tutkimus ei voi suoraan todistaa, että yksittäinen metaboliitti on ratkaiseva tekijä, joka lisää itävyyden lisääntymistä, 3-vuotiaiden ryhmässä havaitut luokkaryhmittäiset muutokset viittaavat siihen, että itävyyttä edistävä etu johtuu todennäköisemmin useiden metaboliittiluokkien koordinoidusta uudelleenjärjestelystä, jotka muodostavat yhdistetyn kemiallisen taustan, eikä yhden molekyylin vahingossa tapahtuvasta lisääntymisestä.

3.4 Käytännön vaikutukset ja tutkimuksen rajoitukset

Tuotantokäytännön näkökulmasta tulokset viittaavat siihen, että kevätikkunan aikana 3-vuotiaalla saxaulilla voi olla paremmat mahdollisuudetCistancherokotus, joka tarjoaa referenssin isäntäkasvuston valintaan metsän allaCistancheviljely ja mahdolliset tekniset kehityssuunnat rokotuksen onnistumisen parantamiseksi.

Tämä tutkimus perustuu kuitenkin yhteen kevään otokseen, ja päätelmät heijastavat pääasiassa kevätikkunan aikaisia ​​suhteita; suoraa ekstrapolointia koko vuodelle ei vielä tueta. Lisäksi maaperän taustan rooli eritteen aineenvaihduntatuotteiden ominaisuuksien muovaamisessa on edelleen suurelta osin pääteltävissä, ja se olisi edelleen validoitava korrelaatioanalyyseillä, kontrolloiduilla kokeilla tai multi-omiikkamenetelmillä. Kohdistamattomalla metabolomiikalla on myös rajoituksia, kuten isomeerien häiriöt ja joidenkin metaboliittien rajallinen tunnistamisvarmuus. Siksi lipideihin liittyviä, B6-vitamiiniin liittyviä ja flavonoidi-/fenolimolekyylejä tulisi harkita ehdokassuunnilla eikä täysin vahvistettuina keskeisinä induktiotekijöinä. Lopuksi käytännön rokotustuloksiin vaikuttavat monet tekijät, kuten loisten muodostuminen, haustorioiden muodostuminen, myöhempi kasvu, pellon vesi-suolaolosuhteet ja hoitokäytännöt. Lisätyötä, jossa yhdistetään kenttärokotuskokeet, loistutkimukset ja keskeisten ehdokkaiden metaboliittien kohdennettu validointi, tarvitaan, jotta voidaan vahvistaa siirtymistä todelliseen tuotantoon.

 

4 Johtopäätökset

Saxaul-juuri-eritteen koostumuksen kemiallinen uudelleenjärjestely metsikön iässä vastasi selvästi erojaCistanchesiementen itämisvasteet korostaen isännän kehitysvaiheen merkitystä loissiementen itämisfenotyyppien säätelyssä. Huhtikuussa juurieritteen aineenvaihduntaprofiilit erosivat merkittävästi metsiköiden iästä. 3 vuoden saksaulien eritteet osoittivat selkeimpiä eroja ja vastasivat korkeimpiaCistanchesiementen itävyysaste. Edustavia eroavia piirteitä, jotka ovat yhdenmukaisia ​​korkeamman itävyyden kanssa, keskittyivät pääasiassa sokereihin, B6-vitamiiniin liittyviin molekyyleihin, flavonoideihin/fenoleihin ja lipideihin liittyviin molekyyleihin, jotka käsittivät alfalinoleenihapon aineenvaihduntaa, B6-vitamiinin aineenvaihduntaa ja flavonoideihin liittyviä reittejä. Pysyvyys-eritteen ja itämisen välinen suhde ei seurannut yksinkertaista lineaarista vahvistumista; keskitasoinen metsien ikä muodosti todennäköisemmin kemiallisen taustan, joka oli yhdenmukainen korkeamman itämisvasteen kanssa.

 

Tekijän panokset

Zhao Zhen: käsitteellistäminen, metodologia, tutkimus, tietojen kuratointi, data-analyysi, luonnos, visualisointi.
Fan Jinglong: metodologia, tarkistus ja editointi, visualisointi, valvonta, projektinhallinta, rahoituksen hankinta.
Dong Weikang: tutkimus, tietojen kuratointi.
Zhou Zhibin: resurssit, valvonta, rahoituksen hankinta.
Li Bingwen, Wang Shijie: metodologia, resurssit, valvonta, rahoituksen hankinta.