Kombinatorisen genetiikan menetelmät korkealuokkaisten sääntelevien yhdistelmien löytämiseksi ja hermojen erilaistumisen geneettisten tekijöiden kehittämiseksi

Sukellus etsimään tehokkaita solujen erilaistumistekijöitä

Tutkijat pyrkivät edelleen löytämään parempia lääkkeitä neurologisten häiriöiden, kuten Parkinsonin taudin, Alzheimerin taudin ja Huntingtonin taudin, etenemisen palauttamiseksi tai hidastamiseksi. Nämä häiriöt ovat seurausta hermosolujen kuolemasta aivojen eri osissa. Potilaiden oireiden lievittämiseen käytettyjä lääkkeitä tai hoitoja ei ole vahvistettu.

Klikkaa nähdäksesi cistanche tubulosa -jauhe hermosolujen suojaamiseksi

Ne eivät palauta vaurioituneita hermokudoksia ja voivat aiheuttaa ei-toivottuja sivuvaikutuksia. Siksi yhä useammat tutkimukset pitävät kantasoluja lupaavana terapeuttisena aineena niiden itsensä uusiutumiskyvyn ja joustavuuden vuoksi erilaistumisen halutuiksi solulinjoiksi siirrettäväksi potilaaseen menetettyjen hermokudosten palauttamiseksi.

Ennen kuin kantasoluja voidaan käyttää kliinisesti neurologisten häiriöiden hoidossa, on kuitenkin vielä alueita, jotka vaativat parempaa ymmärrystä niiden täyden potentiaalin vapauttamiseksi. Kantasolut ovat regeneratiivisia ja muokattavia, ja niillä on taipumus muuttua mitä tahansa solutyyppiä, kun otetaan huomioon erilaistumista edistävien tekijöiden oikea yhdistelmä. Laaja tekijäverkosto on kuitenkin monimutkainen.

On tärkeää määrittää transkriptiotekijöiden (TF), pienten molekyylien ja/tai kasvutekijöiden yhdistelmät optimaalisen synergismin saavuttamiseksi erilaistuvat kantasolut mukaan lukien alkion kantasolut (ESC) ja indusoidut pluripotentit kantasolut nopeimmalla nopeudella, mikä johtaa hermosolujen puhtaimmassa populaatiossa. Voisi kuitenkin olla strateginen tapa seuloa nämä tekijät kustannustehokkaammin ja aikatehokkaammin.

Tämä auttaisi optimoimaan jo vakiintuneita protokollia, jotka ovat vielä työläitä, tai neuronaalisten alatyyppien, kuten keskipitkän piikkihermosolujen, sensoristen hermosolujen ja serotonergisten hermosolujen, karakterisointiin. Haasteena on edelleen profiloida hermosolujen kohtaloa aiheuttavat tekijät kattavasti ja määritellä, kuinka nämä elementit ovat vuorovaikutuksessa toistensa kanssa sääntelyverkostossa.

Muutamat ryhmät ovat käyttäneet uusia korkean suorituskyvyn seulontamenetelmiä selvittääkseen solun kohtalon säätelyverkostoa ja tarjonneet informatiivisia näkemyksiä tekijöistä, jotka ohjaavat hermosolujen muuntumista ja selviytymistä. Liu et ai. (2018) käyttivät CRISPR-aktivointia (CRISPRa) etsiäkseen TF:itä tai DNA:ta sitovia tekijöitä, jotka edistävät ESC:iden hermosolujen kohtaloa. Työ rajoittui kuitenkin yksittäisten tekijöiden tai pariyhdistelmien tutkimiseen.

Toisen systemaattisen seulonnan suorittivat Tsunemoto et ai. (2018), joka tutki TF:iden välistä suhdetta. Suurin osa heidän valitustaan ​​yksittäisestä TF:stä ei osoittanut vaikutuksia tutkimuksessa, mutta he tunnistivat 76 parittaista TF-yhdistelmää edistämään hiiren fibroblastien erilaistumista indusoiduiksi neuroneiksi.

Erityisesti niiden tuloksista puuttui jonkin verran johdonmukaisuutta aikaisempien tutkimusten kanssa, kuten dopamiiniaktiivista kuljettajaa Slc6a3 ei havaittu indusoiduissa neuroneissa, mahdollisesti johtuen lisätekijöiden puuttumisesta. Toisessa tutkimuksessa määritettiin keskeiset geenit neuronien eloonjäämisen ylläpitämiseksi tai parantamiseksi suorittamalla CRISPR-häiriöihin (CRISPRi) perustuva seulonta (Tian et al., 2019). Ja jälleen, ne rajoittuivat yksittäisten sgRNA:iden seulomiseen.

Lisätutkimuksia tarvitaan muiden geneettisten tekijöiden puolueettomaan seulomiseen ja tekijäyhdistelmien määrän lisäämiseen, koska on osoitettu, että eri yhteyksissä voidaan tarvita useamman kuin kahden tekijän cocktaileja, jotta erilaistumista ja uudelleenohjelmointia voidaan ohjata tehokkaasti.

Hyvä esimerkki on Oct4:n, Sox2:n, Klf4:n ja c-Mycin yhdistelmä, joka on välttämätön ESC:iden pluripotenssin kehityssignalointiverkon säätelemiseksi (Takahashi ja Yamanaka, 2006). Tällaisissa monimutkaisissa järjestelmissä on tarve karakterisoida kattavasti korkean asteen geneettisten yhdistelmien toimintoja suurella suorituskyvyllä, ja Combinatorial Genetics En Masse (CombiGEM) -menetelmä voi vain pystyä tekemään sen.

CombiGEM-menetelmä tehokkaaseen, korkealuokkaiseen ja systemaattiseen tekijäyhdistelmien näyttöön

CombiGEM tarjoaa paitsi systemaattisen tavan suorittaa suuren mittakaavan yhdistettyjä seuloja, vaan sillä on myös kyky skaalautuvaan koota korkealuokkaisia ​​kombinatorisia geneettisiä kirjastoja (Wong et al., 2015, 2016; Zhou et al., 2020). Yhden potin prosessi antaa käyttäjälle mahdollisuuden seuloa monia geneettisiä yhdistelmiä; 1-tapa, 2-tapa, 3-tapa ja teoriassa n-suuntaiset kirjastot.

Tämä tarjoaa nopean vaihtoehdon tavanomaiselle prosessille luoda ja testata yksittäisiä kiinnostavia yhdistelmiä. Vaikka useita muita kombinatorisia CRISPR-seulontastrategioita kehitettiin myös parimuotoisten geneettisten yhdistelmien tutkimiseen (Han et al., 2017; Shen et al., 2017; Najm et al., 2018; Truong et al., 2019; DeWeirdt et al., 2020 ), CombiGEM tarjoaa ainutlaatuisen mahdollisuuden arvioida kolmen tai useamman geneettisen yhdistelmän välisiä vuorovaikutuksia.

Jos käyttäjä esimerkiksi aikoo käyttää CRISPRa:ta tai CRISPRi:tä vastaavasti ehdokas-TF-yhdistelmien luettelon yli-ilmentämiseen tai repressoimiseen, voidaan seuloa viivakoodikirjasto TF-kohdennettuja sgRNA-yhdistelmiä käyttämällä CombiGEM-CRISPR v2:ta.0 ( Wong et al., 2016; Zhou et ai., 2020), kuten kuvassa 1 on esitetty.

Käyttämällä yhden astian ligaatiovaiheita sgRNA:iden kirjasto ja niitä vastaavat viivakoodit sisällytetään lentiviruksen kohdevektoriin, joka raportoi fluoresoivan proteiinin ilmentymisen hermosolutyyppispesifisen promoottorin, kuten tubuliini 1:n, aktivoituessa. sgRNA:ita ja erillinen lentivirusvektori, jossa on entsymaattisesti puutteellinen Cas9 joko fuusioituna transkription aktivaattorin tai repressorin kanssa, voidaan kuljettaa haluttuihin lähtösoluihin.

Ajan myötä, kun solut alkavat erilaistua, vain indusoidut neuronin kaltaiset solut ilmentävät fluoresenssia, ja nämä solut voidaan eristää käyttämällä fluoresenssiaktivoitua solulajittelua niiden sisältävien TF-yhdistelmien palauttamiseksi viivakoodisekvensoinnin avulla.

Jotta saataisiin parempi ymmärrys yhdistelmistä, jotka ohjaavat tiettyjä solulinjoja, näistä soluista voidaan myös tutkia tunnettuja solulinjan raportoijia tai markkereita käyttäjän tutkittavaksi valitsemien erilaistumisvaiheiden mieltymysten perusteella. Magneettisesti aktivoitua solulajittelua voitaisiin käyttää kiinnostavien solujen erottamiseen solun pinnan markkerien ilmentymien mukaan.

Yksisoluinen RNA-sekvensointi voitaisiin kytkeä kombinatoriseen CRISPR-seulontaan lukemana geenin ylös- tai alasäätelyn tyypin ja tasojen profiloimiseksi, ja kohdennettujen TF:iden yhdistelmä voidaan määrittää viivakoodilukien avulla (Replogle et al., 2020). Korkean sisällön kuvantamista voitaisiin käyttää solumorfologian muutosten seuraamiseen hermosolujen kehityksen alkuvaiheista myöhempään vaiheeseen.

Indusoitujen hermosolujen kaltaisten solujen fysiologinen merkitys tai toiminnallisuus voidaan määrittää hermosolujen kypsymiselle spesifisellä immunosytokemiallisella leimauksella, kuten NeuN, TUJ1 ja MAP2, ja sähköfysiologisilla mittareilla. Kuten aiemmin mainittiin, tutkimukset ovat yhdistäneet TF:n ja pienet molekyylit solujen kohtalon manipuloimiseksi.

CombiGEM:iä voidaan käyttää myös pienmolekyyliyhdistelmien tunnistamiseen, jotka voivat ylläpitää kantasolujen itsensä uusiutumista, indusoida solulinjan erilaistumista tai helpottaa uudelleenohjelmointia lisäämällä tehokkuutta ja mahdollisesti korvaamalla geneettisiä tekijöitä. CombiGEM:iä voidaan soveltaa myös määrittämällä ensin signalointireittien pienimolekyyliset kohteet, epigeneettiset tai soluprosessitekijät.

Suunnittelemalla sgRNA-kirjasto aktivoimaan tai inaktivoimaan lääkeainekohteita, voidaan sitten tunnistaa pienten molekyylien tehokkaat yhdistelmät erilaistumisen tai uudelleenohjelmoinnin tehostamiseksi. Tämä käsite heijastuu hyvin tutkimuksissa, joita olemme aiemmin suorittaneet löytääksemme lääkekohdeyhdistelmiä syöpää ja Parkinsonin tautia vastaan ​​(Zhou et al., 2020).

CombiGEM:n käyttö ei rajoitu vain CRISPR-pohjaisiin häiriöihin, vaan sitä voidaan soveltaa myös muihin DNA:ta tai RNA:ta sääteleviin tekijöihin tutkimaan RNA:n häiriöitä aiheuttavia toiminnan menetysseulontoja sekä toiminnan vahvistumista ilmentymisen yhteydessä. mikroRNA:iden (Wong et ai., 2015) ja sekvenssivarmennettujen ihmisen avoimien lukukehysten, kuten ihmisen TFome-kirjastossa raportoitujen (Ng et al., 2020).

CombiSEAL-menetelmä transkriptiotekijöiden korkean suorituskyvyn suunnitteluun

Luonnossa esiintyvien geneettisten tekijöiden ihanteellisen yhdistelmän löytäminen voi silti aiheuttaa haasteita, kuten rajoittuminen genomin karakterisoituihin TF:ihin, joilla on aiempaa tietoa niiden ilmentymisestä ja erilaistumisrooleista. Tutkimukset ovat osoittaneet, että TF:ien muokkaus tai keinotekoisten transkriptiotekijöiden tuottaminen avaa uusia vaihtoehtoja nopeuttaa erilaistumisnopeutta vaihtoehtoisten reittien kautta, ylittäen riippuvuuden muiden endogeenisten kofaktorien ilmentymisen edellytyksestä geenin säätelyverkostossa tai kokonaan korvaamalla. luonnolliset TF:t tehokkaampien kanssa (Jauch, 2018).

Näin tutkijat voivat räätälöidä tarvittavat tekijät kokeellisten tarpeidensa mukaan. Ehdotamme, että jos pyritään suorittamaan korkean suorituskyvyn mutageneesiä useissa paikoissa TF:lle, joka sisältää erilaisia ​​domeeneja, CombiSEAL voisi osoittautua hyödylliseksi alustaksi (Choi et al., 2019). CombiSEAL-menetelmä kokoaa aminohappoja koodaavia DNA-fragmentteja, jotka on merkitty kombinatorisesti viivakoodeilla (kuva 1).

Kuva 1 ｜ CombiGEM- ja CombiSEAL-menetelmät tehokkaiden erilaistumisen geneettisten tekijöiden seulomiseksi. Esimerkki CombiGEM-menetelmästä on useiden samasta konstruktista ilmennettyjen sgRNA:iden kokoonpano, ja sgRNA-yhdistelmiä edustavat niiden ketjutetut viivakoodit. CombiSEAL-menetelmä sisältää mutaatioita, jotka on lisätty proteiinin eri osiin, kuten transkriptiotekijöitä, jotka on merkitty P1:ksi, P2:ksi, P(n) ja P(n plus 1). Ja mutaatioiden yhdistelmät heijastavat niitä vastaavilla ketjutetuilla viivakoodeilla. Käyttäjä voi soveltaa asetelmia muihin DNA-kuljetusjärjestelmiin, ja tässä esityksessä käytetään lentivirusvektoreita. Seulontastrategiat voidaan suorittaa yhdistetyssä muodossa, ja tässä esimerkissä solupopulaatioiden tunnistaminen, jotka erilaistuvat tiettyyn neuronilinjaan, havaitaan aktivoimalla promoottori fluoresoivan proteiinin ilmentymistä varten, joka on merkitty kaaviossa X-fluoresenssiksi. Solupoolista peräisin olevien viivakoodien seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) tulkitsee DNA-kohteet tai transkription variantit. Eri hermosolutyyppien erilaistumista ohjaavien tekijöiden tiukka analyysi voisi käyttää taulukkopohjaisia ​​menetelmiä, kuten solujen tutkimista solulinjamarkkereilla ja sen jälkeen magneettisesti aktivoitua solulajittelua (MACS) monikuoppaisille levyille, joita voidaan seurata korkeasisältöinen kuvantaminen. Vaihtoehtoisesti yksisoluisen RNA-sekvensoinnin (RNA-Seq) avulla käyttäjä voi profiloida solujen geeniekspressiot, joilla on halutut fenotyypit, ja hän pystyy hakemaan viivakoodit sgRNA-yhdistelmien tai avainvarianttien mutaatioyhdistelmien tunnistamiseksi. FACS: Fluoresenssiaktivoitu solulajittelu.

CombiSEAL alkaa proteiinin ensimmäisistä leikkausosista, joissa mutageneesiä halutaan. Käyttäjä voi luoda jokaiselle osalle minkä tahansa määrän muunnelmia ja merkitä ne sitten viivakoodeilla mutaatioiden sijainnin ja yhdistelmän tunnistamiseksi. Jokainen osien pooli kootaan sitten peräkkäin insertoimalla ne kohdevektoriin, joka sisältää villityypin proteiinisekvenssin, joka on modifioitu reunustavan tyypin IIS-entsyymeillä aiotulla mutageneesialueella.

Tämä arpeutettu fuusiojärjestelmä, jossa proteiinin useita osia kytketään, on tärkeä, jotta vältetään ei-toivottujen aminohappojen lisääminen proteiiniin. CombiSEAL-menetelmä mahdollistaa valitun kiinnostuksen kohteena olevien varianttien poolin aminohapposekvenssien määrittämisen tehokkaammin ja kustannustehokkaammin, jolloin vältytään pitkiltä koko proteiinin kattavalta sekvensoinnilta mutaatiotyyppien ja niiden sijaintipaikan tunnistamiseksi koko proteiinissa. proteiinia.

Tämä menetelmällinen kokoonpano mahdollistaa helpomman analyysin suorittamalla lyhyiden ketjutettujen viivakoodien joukon korkean suorituskyvyn sekvensoinnin, joka päättelee aminohappomutaatioiden tyyppien ja sijainnin yhdistelmän tai muut halutut modifikaatiot, kuten domeenin vaihdon, insertion ja poiston. alun perin suunniteltu ja asennettu TF:ään

Johtopäätös

Verrattuna yrityksen ja erehdyksen menetelmiin, edistystä on saavutettu systemaattisempien lähestymistapojen käyttämisessä niiden olennaisten tekijöiden tai yhdistelmien määrittämiseksi, joita tarvitaan yhden solutyypin muuntamiseksi hermosoluiksi. Kyky tunnistaa korkeamman asteen yhdistelmiä on kuitenkin puuttunut, ja tässä ehdotamme, että CombiGEM-menetelmä voi pystyä käsittelemään tällaisia ​​rajoituksia.

CombiGEM käyttää viivakoodattua, yhden astian ligaatiojärjestelmää kokoamaan korkeamman asteen yhdistelmiä DNA:ta sitovista tekijöistä DNA:han kohdentamiseksi yhdellä kertaa, kiertäen useiden seulontakierrosten prosessin rajoittaakseen osumien määrän hallittavaan kokoon myöhempään validointiin. . Lisäksi vähemmän tehokkaat luonnolliset TF:t voidaan korvata keinotekoisilla tai muokatuilla TF:illä geeniekspression säätelemiseksi paremmin. Kuvaamme proteiinimutageneesimenetelmän, CombiSEALin, jonka avulla käyttäjät voivat luoda suuria ryhmiä transkriptiotekijävariantteja kokoamalla yksinkertaisesti useita viivakoodeilla merkittyjä paikkamutaatioita proteiiniin ja niiden eri domeeneihin.

Tämä nopeuttaa ja alentaa seulontamenettelyjen kustannuksia, jotta saadaan tietoa kiinnostavien muunnelmien mutaatiotyypeistä. Toivomme, että ehdotetut menetelmät voivat auttaa ymmärtämään ja laajentamaan mahdollisuuksia edistää hermoston regeneraatiota ja niitä voidaan soveltaa laajasti muillakin tutkimusalueilla.

Cistanchen neuroprotektiivisen vaikutuksen mekanismi

Cistanchella on osoitettu olevan hermostoa suojaavia vaikutuksia useiden mekanismien kautta:

1. Anti-inflammatoriset vaikutukset: Cistanche sisältää yhdisteitä, joiden on osoitettu estävän tulehdusta aivojen eri osissa, mikä voi auttaa suojaamaan hermosoluja vaurioilta.

2. Antioksidanttivaikutukset: Cistanche sisältää yhdisteitä, joilla on vahvoja antioksidanttisia ominaisuuksia. Antioksidantit auttavat suojaamaan hermosoluja vapaiden radikaalien ja oksidatiivisen stressin aiheuttamilta vaurioilta.

3. Välittäjäaineiden sääntely: Cistanchen on osoitettu säätelevän tiettyjä välittäjäaineita, kuten serotoniinia ja dopamiinia, jotka voivat auttaa suojaamaan hermosoluja ja parantamaan kognitiivista toimintaa.

4. Neurotrofisen tekijän stimulaatio: Cistanchen on osoitettu stimuloivan neurotrofisten tekijöiden, kuten aivoista peräisin olevan neurotrofisen tekijän (BDNF), tuotantoa, joka voi edistää hermosolujen kasvua ja selviytymistä.

Kaiken kaikkiaan nämä mekanismit toimivat yhdessä suojellakseen hermosoluja vaurioilta, edistääkseen niiden kasvua ja selviytymistä sekä parantaakseen kognitiivista toimintaa.

Viitteet

Choi GCG, Zhou P, Yuen CTL, Chan BKC, Xu F, Bao S, Chu HY, Thean D, Tan K, Wong KH, Zheng Z, Wong ASL (2019) Kombinatorinen mutageneesi massa optimoi SpCas9:n genomin muokkaustoiminnot. Nat Methods 16:722-730.

DeWeirdt PC, Sanson KR, Sangree AK, Hegde M, Hanna RE, Feeley MN, Griffith AL, Teng T, Borys SM, Strand C, Joung JK, Kleinstiver BP, Pan X, Huang A, Doench JG (2020) AsCas12a:n optimointi ihmisen solujen kombinatorisiin geneettisiin seuloihin. Nat Biotechnol 39:94-104.

Han K, Jeng EE, Hess GT, Morgens DW, Li A, Bassik MC (2017) Synergistiset lääkeyhdistelmät syöpää varten, jotka tunnistettiin CRISPR-seulonnassa parittaisille geneettisille vuorovaikutuksille. Nat Biotechnol 35:463- 474.

Jauch R (2018) Solun kohtalon uudelleenohjelmointi luontaisten transkriptiotekijöiden suunnittelun avulla. Curr Opin Genet Dev 52:109-116.

Najm FJ, Strand C, Donovan KF, Hegde M, Sanson KR, Vaimberg EW, Sullender ME, Hartenian E, Kalani Z, Fusi N, Listgarten J, Younger ST, Bernstein BE, Root DE, Doench JG (2018) Orthologous CRISPR- Cas9-entsyymit kombinatorisiin geneettisiin seuloihin. Nat Biotechnol 36:179-189.

Ng AHM, Khoshakhlagh P, Rojo Arias JE, Pasquini G, Wang K, Swiersy A, Shipman SL, Appleton E, Kiaee K, Kohman RE, Vernet A, Dysart M, Leeper K, Saylor W, Huang JY, Graveline A, Taipale J, Hill DE, Vidal M, Melero-Martin JM, et ai. (2020) Kattava kirjasto ihmisen transkriptiotekijöitä solujen kohtalosuunnittelua varten. Nat Biotechnol doi: 10,1038/s41587-020-0742-6.

Replogle JM, Norman TM, Xu A, Hussmann JA, Chen J, Cogan JZ, Meer EJ, Terry JM, Riordan DP, Srinivas N, Fiddes IT, Arthur JG, Alvarado LJ, Pfeiffer KA, Mikkelsen TS, Weissman JS, Adamson B (2020) Kombinatoriset yksisoluiset CRISPR-seulonnat suoralla ohjatulla RNA-sieppauksella ja kohdistetulla sekvensoinnilla. Nat Biotechnol 38:954- 961.

Shen JP, Zhao D, Sasik R, Luebeck J, Birmingham A, BojorquezGomez A, Licon K, Klepper K, Pekin D, Beckett AN, Sanchez KS, Thomas A, Kuo CC, Du D, Roguev A, Lewis NE, Chang AN , Kreisberg JF, Krogan N, Qi L, et ai. (2017) Kombinatoriset CRISPRCas9-seulonnat geneettisten vuorovaikutusten de novo -kartoittamiseksi. Nat Methods 14:573-576.

Takahashi K, Yamanaka S (2006) pluripotenttien kantasolujen induktio hiiren alkion ja aikuisten fibroblastiviljelmistä määritellyillä tekijöillä. Solu 126:663-676.

Tian R, Gachechiladze MA, Ludwig CH, Laurie MT, Hong JY, Nathaniel D, Prabhu AV, Fernandopulle MS, Patel R, Abshari M, Ward ME, Kampmann M (2019) CRISPR-häiriöpohjainen alusta multimodaalisille geneettisille seuloille ihmisen iPSC:ssä - peräisin olevat neuronit. Neuron 104:239-255.

Truong VA, Hsu MN, Kieu Nguyen NT, Lin MW, Shen CC, Lin CY, Hu YC (2019) CRISPRai samanaikaiseen geeniaktivointiin ja estoon kantasolujen kondrogeneesin ja kalvariaalisen luun regeneraation edistämiseksi. Nucleic Acids Res 47:e74. Wong AS, Choi GC, Cheng AA, Purcell O, Lu TK (2015) Massiivisesti rinnakkainen korkean asteen kombinatorinen genetiikka ihmissoluissa. Nat Biotechnol 33:952-961.

Wong AS, Choi GC, Cui CH, Pregernig G, Milani P, Adam M, Perli SD, Kazer SW, Gaillard A, Hermann M, Shalek AK, Fraenkel E, Lu TK (2016) Multipleksoitu viivakoodi CRISPR-Cas9-seulonta, jonka CombiGEM mahdollistaa . Proc Natl Acad Sci USA 113:2544-2549.

Zhou P, Chan BKC, Wan YK, Yuen CTL, Choi GCG, Li X, Tong CSW, Zhong SSW, Sun J, Bao Y, Mak SYL, Chow MZY, Khaw JV, Leung SY, Zheng Z, Cheung LWT, Tan K , Wong KH, Chan HYE, Wong ASL (2020) Kolmisuuntainen kombinatorinen CRISPR-näyttö lääkeainekohteiden välisten vuorovaikutusten analysoimiseen. Cell Rep 32:108020.

Dawn GL Thean, Alan SL Wong*