MiR-29b2/c:n poisto johtaa nopeutettuun ikääntymiseen ja neurosuojaukseen MPTP-indusoiduissa Parkinsonin taudin hiirissä

Abstrakti

Tutkimukset paljastavat yhteyden ikääntymiseen liittyvien miR{0}}-oireiden ja Parkinsonin taudin (PD) välillä. Tässä osoitamme, että seerumin miR-29-tasot 1-metyyli-4-fenyyli-1,2,3,6-tetrahydropyridiinin (MPTP) aiheuttamassa PD:ssä hiirillä oli dynaamisia muutoksia. MiR-29b2/c:n roolia ikääntymisessä ja PD:ssä tutkittiin käyttämällä miR-29b2/c-geenin poistohiiriä (miR-29b2/c KO). miR-29b2/c KO-hiirille oli ominaista huomattavasti kevyempi paino, kyfoosi, lihasheikkous ja epänormaali kävely verrattuna villityypin (WT) hiiriin. WT kehitti myös näennäisen dermiksen paksuuntumisen ja rasvakudoksen vähenemisen. Kuitenkin miR-29b2/c:n puute lievitti MPTP:n aiheuttamia dopaminergisen järjestelmän vaurioita ja gliaaktivaatiota nigrostriataalisessa reitissä ja paransi MPTP-käsiteltyjen KO-hiirten motorisia toimintoja. miR-29b2/c:n poistaminen esti tulehdustekijöiden ilmentymistä 1-metyyli-4-fenyylipyridinium (MPP plus ) -käsitellyissä primaariviljelmissä sekaglia-, primaaristen astrosyyttien tai LPS-käsitellyissä primaarinen mikroglia. Lisäksi miR-29b2/c-puutos lisäsi AMPK:n aktiivisuutta, mutta tukahdutti NF-κB p65-signaloinnin gliasoluissa. Tuloksemme osoittavat, että miR-29b2/c KO-hiirillä on progerian kaltainen fenotyyppi. Vähemmän aktivoituneet gliasolut ja tukahdutettu hermotulehdus voivat saada aikaan dopaminergisen hermosuojan miR- 29b2/c KO-hiirissä. Lopuksi voidaan todeta, että miR-29b2/c osallistuu ikääntymisen säätelyyn ja sillä on haitallinen rooli Parkinsonin taudissa.

Avainsanat

MiR-29b2/c; hermosolujen suojaus; MPTP:n aiheuttama Parkinsonin tauti;Cistanchen edut.

Napsauta tästä saadaksesimitkä ovat Cistanchen vaikutukset

Johdanto

Parkinsonin tauti (PD) on toiseksi yleisin hermostoa rappeuttava sairaus, jolle on ominaista dopaminergisten hermosolujen asteittainen häviäminen väliaivojen substantia nigra par compactassa (SNpc) sekä lisääntynyt gliaaktivaatio ja hermoston tulehdus [1–3]. MikroRNA:t ovat lyhyitä ei-koodaavia RNA-molekyylejä, jotka säätelevät geenien ilmentymistä transkription jälkeisellä tasolla [4, 5]. MikroRNA:t osallistuvat hermoston kehityksen, hermosolujen plastisuuden ja neurodegeneratiivisten sairauksien säätelyyn. MicroRNA29-perhe (miR- 29) koostuu kahdesta geeniklusterista: miR-29a/b1 ja miR-29b2/c, jotka sijaitsevat kromosomissa 6 ja kromosomissa 1, vastaavasti. hiiren genomi. miR-29a:lla ja miR-29c:llä on vain yksi nukleotidiero, kun taas miR-29b1 ja miR-29b2 ovat sekvenssiltään identtisiä [6]. miR{20}} osallistuvat useisiin biologisiin prosesseihin. Monet miR-29-kohdegeenit on varmistettu kokeellisesti, mukaan lukien Procellin selviytymisgeenit Bcl-2, Mcl-1, Cdc42 ja p85-; proapoptoottiset geenit Puma, Bim, Bak ja Bmf; ja proinflammatoriset sytokiinit IFN- ja IL-12. Ääreisjärjestelmässä tutkimukset ovat osoittaneet, että miR{28}}:t osallistuvat kudosfibroosiin [7–9], aineenvaihduntaan ja immuunisäätelyyn [10–13].

miR{0}}:t ilmentyvät laajalti keskushermostossa, ja niiden transkriptejä on sekä hermosoluissa että gliasoluissa [14, 15]. MiR-29n ja neurologisten sairauksien välinen yhteys on havainnollistettu yhä enemmän. miR-29:t osallistuvat -amyloidituotannon säätelyyn, ja ne ovat alasäädeltyjä AD-potilaiden aivoissa [16, 17]; miR-29-tasot laskevat myös Huntingtonin tautia (HD) sairastavilla potilailla ja HD-mallihiirillä [18, 19], kun taas ne lisääntyvät potilailla, joilla on amyotrofinen lateraaliskleroosi (ALS) ja ALS-hiirimalleissa [16, 20]. Sekä miR-29a/b-1--puutteellisilla hiirillä että miR-29:n alasäädellyillä hiirillä on ataksiaa muistuttava fenotyyppi [6, 21]. Mitä tulee miR-29:n ilmentymisen vaikutuksiin hermosolujen suojaukseen ja hermosolujen kuoleman edistämiseen iskeemisissä jyrsijämalleissa, raportoitiin vastakkaisia ​​tuloksia [22, 23]. Aiemmissa tutkimuksissa havaitsimme, että miR{24}s-tasot laskivat merkittävästi PD-potilaiden seerumissa, ja laskusuuntaus liittyi vakavampaan Parkinsonismiin [24]. Lisäksi miR{26}}-tasot korreloivat PD-potilaiden muistin suorituskykyyn [25]. Päätimme, että miR-29b2/c liittyy läheisesti PD:hen, mutta sen fysiologiset toiminnot ja patologiset mekanismit, jotka liittyvät PD:hen, ovat suurelta osin tuntemattomia.

Tässä tutkimuksessa hiiren seerumin miR{0}}-tasot vasteena MPTP-antoon mitattiin 120 päivää injektion jälkeen. MiR-29b2/c-puutteiden vaikutuksia perifeerisiin kudoksiin tutkittiin miR-29b2/c KO-hiirillä. Dopaminergistä neurotoksiinia MPTP:tä käytettiin edelleen indusoimaan PD:n hiirimalli. Sitten tutkittiin nigrostriataalisen dopaminergisen järjestelmän vaurioita, käyttäytymistä ja mahdollisia mekanismeja. Havaitsimme, että miR{7}}-tasot hiiren seerumissa osoittivat dynaamisia muutoksia MPTP:n antamisen jälkeen. miR- 29b2/c KO-hiirillä havaittiin nopeutunutta ikääntymistä, mikä osoitti kevyempää ruumiinpainoa, rasvakudoksen vähenemistä, kyfoosia, ihon paksuuntumista, lihasheikkoutta ja kävelyhäiriöitä. MiR-29b2/c:n puute johti kuitenkin lievittyneeseen dopaminergiseen vaurioon ja gliaaktivaatioon ja sen seurauksena parantuneeseen käyttäytymiseen PD:n kaltaisessa eläinmallissa.

Cistanche-pillerit

Tulos

1. Progerian kaltainen fenotyyppi miR-29b2/c KO-hiirissä

miR-29b2/c knockout-hiiret (miR-29b2/c KO) luotiin käyttämällä CRISPR-Cas9-tekniikkaa. Geenikohdistuksen ja mutanttihiiren genotyypityksen strategia esiteltiin täydentävässä kuvassa 1. Neljän ja 16- kuukauden ikäisten miR-29b2/c KO-hiirten ruumiinpainot olivat alentuneet (kuva 1A). Kolmen kuukauden iässä miR-29b2/c KO-hiirten ominaisuudet säilyivät muuttumattomina, mikä on osoitettu röntgenmikrotietokonetomografialla (mikro-CT) -skannauksella (lisäkuva 2A). MiR-29b2/c KO-hiirten ja niiden WT-hiirien välillä 13 kuukauden ikäisenä ei ollut eroja luun mineraalitiheydessä (BMD), trabeculien keskimääräisessä BMD:ssä, trabekulaarisen erotuksen, trabekulaarisen paksuuden ja rakennemalliindeksin (SMI) välillä. Täydentävä kuva 2B). Hematoksyliini- ja eosiinivärjäyksellä (H&E) havaitsimme, että 13-kuukauden ikäisillä miR-29b2/c KO-hiirillä oli paksuuntunut dermis ja lisääntyneet ja syventyneet rypyt (kuva 1B, 1C). Ja kyfoosi ilmeni 16-kuukauden ikäisillä miR-29b2/c KO-hiirillä (kuva 1C). miR-29b2/c KO-hiirillä nuorilla (3 kuukauden ikäisillä) oli normaalit rasvakudokset (lisäkuva 2C, 2D). Vatsan rasvakudos (ihonalainen rasva ja sisäelinten rasva yhdistettynä) ja ruskea rasvakudos kuitenkin vähenivät dramaattisesti miR-29b2/c KO-hiirillä verrattuna WT-hiiriin 16 kuukauden iässä (kuva 1D). Lisäksi analysoitiin vanhenemismarkkerien p21 ja p53 transkriptiotasot aivoissa. Ne lisääntyivät merkittävästi miR-29b2/c KO-hiirten hippokampuksessa, mutta eivät aivokuoressa kuuden kuukauden iässä. p53- ja p16-proteiinitasot miR-29b2/c-puutteellisessa hippokampuksessa eivät eronneet WT-kontrolleista. Lisäksi -galaktosidaasiaktiivisuus, joka on tunnettu solujen vanhenemisen ominaisuus, ei eronnut kolmen kuukauden ikäisten WT- ja miR{55}}b2/c KO -hiirten aivojen välillä.

Lihasheikkous ja kävelyhäiriö miR- 29b2/c KO -hiirillä

MiR-29b2/c-puutteellisten hiirten käyttäytyminen arvioitiin. Lihasvoimaa mitattiin Wire hanging ja Grid ripustustesteillä. MiR-29b2/c KO-hiiret saivat huonommat pisteet kuin kontrollihiiret Wire-ripustustestissä (kuva 2A). Ja putoamisviive oli dramaattisesti lyhyempi miR-29b2/c KO-hiirillä verrattuna villityypin vastineisiin Grid ripustustestissä (kuva 2B), mutta WT:n ja miR:n Rotarod-testin suorituskyky{10} }b2/c KO-hiiret eivät eronneet merkittävästi (kuvio 2C). Catwalk XT -analyysijärjestelmä havaitsi eläinten kävelyn. Yllättäen miR-29b2/c KO-hiirten sekä nopeus että askelpituus olivat korkeampia kuin vastaavilla, kun taas askeljakso, seisonta- ja heilahdusaika olivat lyhyempiä ja toimintajakso lyhyempi miR{ {15}} b2/c-puutteiset hiiret (kuva 2D).

Muutokset miR{0}}-arvoissa MPTP-indusoidussa PD-hiiren seerumissa

miR{0}}-tasot laskivat PD-potilaiden seerumissa terveisiin verrokkeihin verrattuna [24]. Tässä tutkimuksessa miR-29s-tasot PD-hiirten seerumissa määritettiin 3, 30 ja 120 päivää subakuutin MPTP-hoidon jälkeen. miR-29a- ja miR-29b-tasot laskivat 3 päivän kuluttua injektiosta ja palautuivat perusarvoihin 30 päivän kuluttua ja laskivat jälleen 120 päivän kuluttua. MiR-29c-taso ei kuitenkaan muuttunut merkittävästi (lisäkuva 5).

Cistanche-lisäaineet

miR-29b2/c-puutos lieventää MPTP:n aiheuttamia nigrostriataalivaurioita ja motorisia puutteita hiirillä

miR-29b2/c knockout-hiirille ja WT-pentueen kavereille injektoitiin MPTP:tä PD-mallin indusoimiseksi. p21:n, p53:n ja Pai1:n ilmentymistasot sekä miR-29b2/c KO-hiirten että WT-kontrollien striatumissa eivät muuttuneet MPTP:n antamisen jälkeen. MPTP-altistus aiheutti merkittävää vähenemistä TH-positiivisten dopaminergisten neuronien määrässä SNpc:ssä [F(1, 20)=5.441, P=0.0302] ja TH-positiivisissa hermopäätteissä, TH-proteiineissa [F(1, 20)=10.5, P=0.0041] ja dopamiinin, DOPAC:n ja HVA:n tasot striatumissa (kuvat 3A–3D). MPTP-käsiteltyjen miR-29b2/c KO-hiirten nigrostriataaliset vammat kuitenkin helpottivat dramaattisesti MPTP-käsiteltyihin WT-kontrolleihin verrattuna dopaminergisten hermosolujen lukumäärän, dopaminergisten hermopäätteiden tiheyden ja striatalin TH-proteiinitasojen ja dopamiinipitoisuus oli merkittävästi korkeampi; Lisäksi muutokset DOPAC:n ja DA:n sekä HVA:n ja DA:n suhteissa [F(1, 19)=12.64, P=0.0021] vähenivät huomattavasti (kuva 3A–3D). Normaaleilla suolaliuoksella injektoiduilla miR-29b2/c KO-hiirillä 5-HT:n ja sen metaboliitin 5-HIAA:n striataaliset pitoisuudet kasvoivat verrattuna WT-vastineisiin, ja NE-pitoisuudet olivat lähellä villityypin ja miR-29b2/c KO -hiiret (kuva 3D). Kasvatus- ja napatestejä käytettiin arvioimaan spontaania pystysuoraa aktiivisuutta [26, 27] ja hiirten lokomotorista aktiivisuutta [28]. Kaksi päivää viimeisen MPTP-injektion jälkeen kasvatustiheys laski WT-hiirillä viimeisen 2 minuutin aikana verrattuna normaaleihin suolaliuoksella käsiteltyihin WT-kontrolleihin. Samanlaiset kokeet eivät paljastaneet miR- 29b2/c-puutoksen vaikutusta MPTP:n aiheuttamiin muutoksiin kasvatustiheydessä (kuva 3E). Samoin Kääntymiseen ja kiipeämiseen käytetty kokonaisaika kasvoi WT-hiirillä MPTP:n antamisen jälkeen napatestissä, kun taas kokonaisaika oli lähellä normaaleja suolaliuoksella ja MPTP:llä käsiteltyjen miR-29b2/c KO-hiirten välillä (kuva 3F). .

miR-29b2/c-puutos heikentää MPTP:n aiheuttamaa gliaaktivaatiota hiirillä

Gliasolujen aktivaatio ja gliasoluvälitteinen hermotulehdus ovat osallisena PD-patologiassa [29]. Astrosyytit lisääntyivät huomattavasti WT-hiirten nigrostriataalisella reitillä, kun taas GFAP plus astrosyytit lisääntyivät striatumissa, mutta eivät miR:n SNpc:ssä [F(1, 8)=5.412, P=0.0484] -29b2/c KO-hiiret kolme päivää MPTP-injektion jälkeen. Erityisesti astrosyyttitiheydet eivät eronneet MPTP:llä käsiteltyjen WT- ja miR{10}}b2/c KO -hiirten kahdella alueella (kuvat 4A, 4B). Iba 1 plus mikroglia lisääntyi WT-hiirten musta-aineessa ja striatumissa [F(1, 8)=12.74, P=0.0073] sekä WT:ssä että miR{21}:ssa. }b2/c KO-hiiret MPTP-annon jälkeen. Lisäksi miR-29b2/c KO-hiirissä MPTP-injektio vähensi mikrogliatiheyksiä merkittävästi (kuvio 4C, 4D).

2. MiR-29b2/c-puutoksen vaikutukset primaarisesti viljellyissä astrosyyteissä

Raaputuskoetta käytettiin sen testaamiseen, vaikuttiko miR-29b2/c:n puute astrosyyttien lisääntymiseen ja migraatioon. Primaariset miR-29b2/c KO-astrosyytit eivät osoittaneet eroa lisääntymis- ja migraatiokyvyssä. Primaaristen WT- ja miR-29b2/c KO -astrosyyttien solujen elinkelpoisuudessa ei ilmennyt eroa lähtötasolla. MPP plus myrkytyksen jälkeen WT-astrosyyttien solujen elinkelpoisuus oli korkeampi verrattuna kontrolleihin, kun taas mutanttien astrosyyttien elinkelpoisuus ei muuttunut [F(1, 18)=5.727, P=0.0278 ]. Tehostunutta ROS-tuotetta ja glukoosin ottoa havaittiin MPP plus -käsitellyissä WT- ja miR-29b2/c KO -astrosyyteissä.

Cistanche tubulosa

Neurotrofisten tekijöiden, tulehdukseen liittyvien molekyylien, astrosyyttisten A1-tyypin ja A2-tyypin markkerigeenien ilmentymistasot mitattiin MPP plus -käsitellyissä astrosyyteissä. 12 tuntia altistuksen jälkeen BDNF:n ilmentyminen oli kohonnut WT- ja miR-29b2/c KO-astrosyyteissä (kuva 5A). TGF- 1:n ilmentymistaso nousi merkittävästi WT-astrosyyteissä MPP plus -altistuksen jälkeen, kun taas miR- 29b2/c KO-astrosyyteissä se aleni villityypin astrosyytteihin verrattuna sekä lähtötilanteessa että sen jälkeen. myrkytys (kuva 5B). TNF-transkriptin perustaso oli alhaisempi miR-29b2/c KO-astrosyyteissä verrattuna WT-astrosyytteihin. 12 tunnin hoidon jälkeen IL-1, IL-6 ja COX-2 ilmentymistasot lisääntyivät merkittävästi WT- ja miR-29b2/c-astrosyyteissä, kun taas TNF-transkripti oli kohonnut vain WT-astrosyyteissä, ja IL-1-, TNF- ja COX-2-transkriptit vähenivät miR-29b2/c KO -astrosyyttisoluissa verrattuna villityypin vastineisiin (kuva 5C) . A1-markkeri H2-T23 ja A2-merkkiaine CD14 olivat selvästi alhaisemmat PBS-käsitellyissä miR- 29b2/c KO-astrosyyteissä verrattuna WT-kontrolleihin. 12 tunnin käsittelyn jälkeen A1-markkerit H2-D1, Ggta1 ja C3 sekä A2-markkerit Clcf1 ja S100 10 lisääntyivät sekä WT- että miR-29b2/c KO -astrosyyteissä; H2-T23 lisääntyi vain WT-astrosyyteissä; Gbp2 ja CD14 eivät muuttuneet kahdessa astrosyyttigenotyypissä. Lisäksi H2-T23:n, H2-D1:n ja CD14:n transkriptit vähenivät miR-29b2/c KO-astrosyyteissä verrattuna WT-kontrolleihin (kuvio 5D, 5E). 12 tuntia ja 24 tuntia hoidon jälkeen AMPK-proteiinien ja fosforyloitujen AMPK-proteiinien tasot eivät muuttuneet WT-astrosyyteissä, kun taas 24 tuntia MPP plus -altistuksen jälkeen AMPK-proteiinitaso laski miR-29b2/:ssa c KO-astrosyytit, ja p-AMPK:n suhde AMPK:hen mutanttiastrosyyteissä kasvoi verrattuna WT-astrosyytteihin ja PBS-käsiteltyihin mutanttiastrosyytteihin samoin (kuvio 5F). Lisäksi PBS:llä tai LPS:llä käsiteltyjen BV2-solujen (lyhyesti CM ja LCM) käsiteltyä alustaa käytettiin stimuloimaan WT- ja miR-29b2/c KO-hiirten primaarisia astrosyyttejä. Vaikka p-AMPK-proteiinin ilmentyminen ei muuttunut 12 tunnin LCM-hoidon jälkeen, se oli merkittävästi korkeampi miR-29b2/c KO-astrosyyteissä verrattuna WT-astrosyytteihin. Havaitsimme, että pAMPK-proteiinit lisääntyivät molemmissa astrosyyttien genotyypeissä 24 LCM-käsittelyn jälkeen. LCM-stimulaatio lisäsi huomattavasti COX- 2-proteiinien ilmentymistä [F(2, 18)=10.29, P=0.0010], mutta COX-2-proteiinin tasoa miR-29b2/c KO:ssa astrosyytit vähenivät verrattuna WT-astrosyytteihin (kuva 5G). Nitriittipitoisuus LCM-käsitellyissä miR-29b2/c KO-astrosyyteissä oli myös merkittävästi alhaisempi verrattuna LCM-käsitellyihin WT-astrosyytteihin [F(2, 30)=17, P<0.0001] (Figure 5H). Further, the expression of senescence marker genes was evaluated. 12 h-treatment of MPP+ increased p53 transcript levels in both WT and miR- 29b2/c KO astrocytes. p19 and Pai1 transcripts were elevated only in WT astrocytes, and Pai1 expression levels in miR-29b2/c KO astrocytes were decreased compared to WT astrocytes after the treatment. Moreover, Bcl-2, Bax protein levels, and the ratio of Bcl-2 to Bax did not change in WT and miR-29b2/c KO astrocytes.

3. MiR-29b2/c-puutoksen vaikutukset primaarisesti viljellyssä mikrogliassa

LPS:ää käytettiin mittaamaan miR-29b2/c-puutteisen mikroglian vastetta tulehdusärsykkeisiin. BDNF-ilmentymistaso oli alhaisempi miR-29b2/c KO-mikrogliassa lähtötilanteessa. Neljä ja kahdeksan tuntia LPS-hoidon jälkeen IL-1-, IL-6-, TNF- ja COX-2-transkriptien määrä lisääntyi, kun taas IGF-1-ekspressio väheni WT:ssä. ja miR-29b2/c KO-mikrogliasoluissa, BDNF:n ilmentyminen väheni vain WT-mikrogliassa [F(2, 27)=41.5, P<0.0001]. IL-10 transcript increased in WT and miR-29b2/c KO microglia [F(2, 27) = 3.753, P=0.0365], and TGF-β1 transcript decreased in WT microglia at eight hours after the LPS challenge. BDNF and TGF-β1 transcripts were not changed in miR-29b2/c KO microglia. In addition, IL-6 transcripts were significantly reduced in miR-29b2/c KO microglia after the challenge compared to WT controls, IGF-1 and IL-10 transcripts were markedly higher in miR-29b2/c KO microglia after four and eight hours of intoxication, respectively (Figure 6A–6C). At baseline, the p-AMPK protein level and pAMPK to AMPK ratio were dramatically elevated in miR-29b2/c KO microglia when compared with WT microglia. 24 h after the treatment of LPS, p-AMPK level [F(1, 17) = 5.066, P=0.0379] and the ratio [F(1, 17) = 5.537, P=0.0309] were elevated only in WT microglia (Figure 6D). At one hour after the treatment, the phosphorylated-NF-κB p65 (p-p65) proteins and pp65 to p65 ratio, but not p65 proteins, increased in wildtype and miR-29b2/c KO microglial cells, yet the ratio decreased modestly in miR-29b2/c KO microglial cells when compared with WT microglia (p=0.071) (Figure 6E). The expression of COX-2 was enhanced in the two genotypes of microglial cells; whereas, the level of COX-2 in mutant microglia decreased when compared with WT controls after 24 h-treatment of LPS [F(1, 17) = 5.33, P=0.0338] (Figure 6D). Nitrite product was induced by the treatment of LPS in both genotypes of microglia, however, it was dramatically lower in miR- 29b2/c KO microglia at baseline and after the treatment of LPS [F(1, 20) = 14.03, P=0.0013] (Figure 6F).

Keskustelu

MiR-29-perheenjäsenten ilmentyminen lisääntyy useissa kudoksissa yksilöiden ikääntyessä [30–32]. Laboratoriomme ja muiden tutkimusten mukaan miR{3}}-taudin ja Parkinsonin taudin välillä on yhteys [33]. Tässä tutkimuksessa tutkittiin miR- 29b2/c:n roolia ikääntymisessä ja Parkinsonin taudissa. miR{7}}:illa on ikääntymistä edistäviä ja ikääntymistä estäviä vaikutuksia kudosten, lajien ja kehitysvaiheiden mukaan. Huomasimme, että 3-kuukauden ikäisillä miR-29b2/c KO-hiirillä oli normaali luuranko ja rasvakudos ja 4-kuukauden ikäisillä miR- 29b2/c KO-hiirillä heillä oli kevyempi paino verrattuna WT-vastineeseensa, mikä on samaa mieltä muiden tutkimusten kanssa [11, 34]. Lihasheikkous ja epävakaa kävely havaittiin 3-kuukauden ikäisillä miR- 29b2/c KO-hiirillä. Kolmetoista kuukauden ikäisillä miR-29b2/c KO-hiirillä dermis paksuuntui. Heillä oli kuitenkin normaali hieno reisiluun rakenne. Ruumiinpaino laski 16-kuukauden ikäisillä miR-29b2/c KO-hiirillä. Tässä iässä miR-29b2/c KO-hiirillä oli vähemmän vatsan rasvaa ja ruskeaa rasvaa, ja niillä ilmeni kyfoosia. miR-29:t osallistuvat p53-välitteiseen solusyklin pysähtymiseen [35, 36] ja p16/Rb-ohjautuvaan solun vanhenemiseen [37]. Solujen vanhenemista ei kuitenkaan havaittu miR-29b2/c KO -hiiren aivoissa. Siksi, vaikka miR-29b2/c myötävaikuttaa ikääntymisen säätelyyn, sen roolit ääreiskudoksissa ja aivoissa voivat olla erilaiset.

Seerumin miR{0}}-tasot alenivat PD-potilailla verrattuna terveisiin kontrolleihin [24]. Tässä havaitsimme, että miR-29:n ilmentyminen PD-hiiren seerumissa vaihteli 3–120 päivää MPTP:n annon jälkeen. miR-29:iä on runsaasti aivoissa [6, 30]. GEO-profiilin läpikäymisen kautta miR-29c:n ilmentymisen havaitaan olevan PD-potilaiden substantia nigrassa (p=0.0059, Mann-Whitney-testillä), ja lisäksi miR{{12 }}c:n ilmentyminen yläreunassa ei eronnut (p=0.47, Student-T-testillä) verrokkihenkilöihin verrattuna (täydentävä kuva 10). Täällä miR-29b2/c KO-hiiret altistettiin MPTP:llä PD:n kaltaisten vammojen aiheuttamiseksi. Mutanttihiirillä oli vähemmän vakavia vammoja nigrostriataaliseen dopaminergiseen järjestelmään ja lievempää gliaaktivaatiota ja myöhemmin jossain määrin käyttäytymisresistenssiä. Siten miR-29b2/c:llä on haitallinen rooli PD:n patologiassa. Havaitsimme, että MPTP-indusoidussa hiiren PD-mallissa p21-, p53- ja Pai1-transkriptien striatalitasot eivät muuttuneet, mikä viittaa siihen, että solujen vanhenemista ei ehkä tapahdu. Ikääntymisen katsotaan olevan suuri riskitekijä PD:n kehittymiselle [38], mutta ikääntymiseen liittyvät muutokset aivoissa, erityisesti dopaminergisessä järjestelmässä, voivat olla tärkeämpi tekijä.

WT- ja miR{0}}b2/c KO -hiirten primaarista gliaa viljeltiin taustalla olevien mekanismien tutkimiseksi. MPP plus -hoito lisäsi GDNF-ilmentymistä ja vähensi IL-1-ilmentymistä miR-29b2/c-puutteellisessa sekagliassa. MPP plus lisäsi myös proinflammatoristen geenien ilmentymistä WT-astrosyyteissä, mutta ei miR- 29b2/c-puutteellisissa astrosyyteissä. Samoin mutanttiastrosyytit tuottivat vähemmän NO:ta WT-astrosyyteihin verrattuna sen jälkeen, kun ne oli altistettu LPS:llä käsiteltyjen BV2-solujen vakioidulle alustalle. Primaarisessa mikrogliaviljelmässä verrattuna LPS-käsiteltyihin WT-kontrolleihin anti-inflammatorisen sytokiinin IL-10 ja neurotrofisen tekijän IGF-1 transkriptit olivat huomattavasti korkeammat ja tulehdusta edistävän sytokiinin IL{. {15}} väheni LPS-käsitellyssä miR-29b2/c KO-mikrogliassa. NO-tasot laskivat miR-29b2/c KO-mikrogliassa lähtötilanteessa ja LPS-myrkytyksen jälkeen. Tutkimukset ovat osoittaneet, että miR{20}} ja monet ennustetut kohdegeenit osallistuvat aineenvaihduntaprosesseihin [34, 39–41]. Olennaisena säätelijänä AMPK:n on osoitettu suojaavan PD:ssä aktivoituna [42]. AMPK:n aktivaatio stimuloi Sirtuin 1:tä ja estää NF-KB-aktivaatiota ja alavirran tulehduskohdegeenejä epäsuorasti [43]. Havaitsimme, että fosforyloidun AMPK-proteiinin taso ja p-AMPK:n ja AMPK:n suhde lisääntyivät LCM-käsitellyissä ja MPP plus -käsitellyissä miR- 29b2/c KO-astrosyyteissä, vastaavasti. COX-2-proteiinitaso oli alentunut LCM-käsitellyissä mutanttiastrosyyteissä verrattuna WT-astrosyytteihin. Lähtötilanteessa AMPK-aktiivisuus oli kohonnut miR-29b2/c KO-mikrogliassa. COX-2-proteiinin määrä väheni merkittävästi miR-29b2/c KO-mikrogliassa verrattuna WT-kontrolleihin LPS-hoidon jälkeen. LPS-hoidon aikana p-p65- ja p65-suhde oli hieman alentunut mutanttimikrogliassa, mikä merkitsi heikentynyttä NF-KB-signalointireittiä. Tuloksemme osoittavat, että lisääntynyt AMPK-aktiivisuus ja vähentynyt tulehdusvaste gliassa suojaavat nigrostriataalista reittiä miR-29b2/c KO-hiirissä (kuva 6G). Lopuksi miR-29b2/c:llä on tärkeä rooli ikääntymisessä ja nigrostriataalisen dopaminergisen järjestelmän vaurioissa.

Viitteet

1. Braak H, Del Tredici K. Kutsuttu artikkeli: Hermoston patologia satunnaisessa Parkinsonin taudissa. Neurologia. 2008; 70:1916–25.

2. Wang Q, Liu Y, Zhou J. Neuroinflammation in Parkinsonin tauti ja sen mahdollisuudet terapeuttisena kohteena. Transl Neurodegener. 2015; 4:19.

3. Wang Z, Dong H, Wang J, Huang Y, Zhang X, Tang Y, Li Q, Liu Z, Ma Y, Tong J, Huang L, Fei J, Yu M, et ai. NF-κB c-Rel:n selviytyminen ja tulehdusta ehkäisevät roolit Parkinsonin taudin malleissa. Redox Biol. 2020; 30:101427.

4. Zhu S, Wu H, Wu F, Nie D, Sheng S, Mo YY. MicroRNA- 21 kohdistuu kasvainsuppressorigeeneihin invaasiossa ja etäpesäkkeissä. Cell Res. 2008; 18.350–59.

5. Qiu L, Zhang W, Tan EK, Zeng L. MikroRNA:iden toiminnan ja säätelyn selvittäminen Alzheimerin taudissa ja Parkinsonin taudissa. ACS Chem Neurosci. 2014; 5:884–94.

6. Papadopoulou AS, Serneels L, Achsel T, Mandemakers W, Callaerts-Vegh Z, Dooley J, Lau P, Ayoubi T, Radaelli E, Spinazzi M, Neumann M, Hébert SS, Silahtaroglu A, et ai. MiR-29a/b-1-klusterin puute johtaa ataksisiin piirteisiin ja pikkuaivojen muutoksiin hiirillä. Neurobiol Dis. 2015; 73:275–88.

7. Hyun J, Choi SS, Diehl AM, Jung Y. Hedgehog-signaloinnin ja mikroRNA:n-29 mahdollinen rooli IKK-puutteisen hiiren maksafibroosissa. J Mol Histol. 2014; 45:103–12.

8. Qin W, Chung AC, Huang XR, Meng XM, Hui DS, Yu CM, Sung JJ, Lan HY. TGF-/Smad3-signalointi edistää munuaisfibroosia estämällä miR-29. J Am Soc Nephrol. 2011; 22:1462–74.

9. Xiao J, Meng XM, Huang XR, Chung AC, Feng YL, Hui DS, Yu CM, Sung JJ, Lan HY. miR-29 estää bleomysiinin aiheuttamaa keuhkofibroosia hiirillä. Mol Ther. 2012; 20:1251–60.

10. Steiner DF, Thomas MF, Hu JK, Yang Z, Babiarz JE, Allen CD, Matloubian M, Blelloch R, Ansel KM. MicroRNA-29 säätelee T-boxin transkriptiotekijöitä ja interferonin tuotantoa auttaja-T-soluissa. Immuniteetti. 2011; 35: 169-81.

11. Dooley J, Garcia-Perez JE, Sreenivasan J, Schlenner SM, Vangoitsenhoven R, Papadopoulou AS, Tian L, Schonefeldt S, Serneels L, Deroose C, Staats KA, Van der Schueren B, De Strooper B, et ai. MicroRNA-29-perhe sanelee tasapainon homeostaattisen ja patologisen glukoosinkäsittelyn välillä diabeteksessa ja liikalihavuudessa. Diabetes. 2016; 65:53–61.

12. Adoro S, Cubillos-Ruiz JR, Chen X, Deruaz M, Vrbanac VD, Song M, Park S, Murooka TT, Dudek TE, Luster AD, Tager AM, Streeck H, Bowman B, et ai. IL-21 indusoi antiviraalista mikroRNA:ta-29 CD4 T-soluissa HIV-1-infektion rajoittamiseksi. Nat Commun. 2015; 6:7562.

13. Ma F, Xu S, Liu X, Zhang Q, Xu X, Liu M, Hua M, Li N, Yao H, Cao X. MikroRNA miR-29 ohjaa synnynnäisiä ja adaptiivisia immuunivasteita solunsisäiselle bakteeri-infektiolle kohdistamalla interferoni-. Nat Immunol. 2011; 12:861–69.

14. Jovičić A, Roshan R, Moisoi N, Pradervand S, Moser R, Pillai B, Luthi-Carter R. Neuraalisolutyyppispesifisten miRNA:iden kattavat ekspressioanalyysit tunnistavat uusia hermosolujen fenotyyppien määrittelyn ja ylläpidon determinantteja. J Neurosci. 2013; 33:5127–37.

15. Ouyang YB, Xu L, Lu Y, Sun X, Yue S, Xiong XX, Giffard RG. Astrosyyteillä rikastettu miR-29a kohdistuu PUMA:han ja vähentää hermosolujen herkkyyttä etuaivojen iskemialle. Glia. 2013; 61:1784–94.

16. Shioya M, Obayashi S, Tabunoki H, Arima K, Saito Y, Ishida T, Satoh J. Poikkeava mikroRNA:n ilmentyminen hermostoa rappeutuvien sairauksien aivoissa: miR-29a vähentynyt Alzheimerin taudin aivoissa kohdistuu neuroninavigaattoriin 3. Neuropathol Appl Neurobiol. 2010; 36:320–30.

17. Hébert SS, Horré K, Nicolaï L, Papadopoulou AS, Mandemakers W, Silahtaroglu AN, Kauppinen S, Delacourte A, De Strooper B. MikroRNA-klusterin miR-29a/b-1 katoaminen satunnaisesti Alzheimerin tauti korreloi lisääntyneen BACE1/beeta-sekretaasin ilmentymisen kanssa. Proc Natl Acad Sci USA. 2008; 105:6415–20.

18. Johnson R, Zuccato C, Belyaev ND, vieraileva DJ, Cattaneo E, Buckley NJ. MikroRNA-pohjainen geenin säätelyhäiriöreitti Huntingtonin taudissa. Neurobiol Dis. 2008; 29:438–45.

19. Packer AN, Xing Y, Harper SQ, Jones L, Davidson BL. Bifunktionaalinen mikro-RNA miR-9/miR-9* säätelee REST- ja COREST-arvoja, ja sen säätely vähenee Huntingtonin taudissa. J Neurosci. 2008; 28:14341–46.

20. Nolan K, Mitchem MR, Jimenez-Mateos EM, Henshall DC, Concannon CG, Prehn JH. MikroRNA-29a:n lisääntynyt ilmentyminen ALS-hiirissä: sen eston toiminnallinen analyysi. J Mol Neurosci. 2014; 53:231–41.

21. Roshan R, Shridhar S, Sarangdhar MA, Banik A, Chawla M, Garg M, Singh VP, Pillai B. MiR-29:n aivospesifinen kaatuminen johtaa hermosolujen kuolemaan ja ataksiaan hiirillä. RNA. 2014; 20:1287–97.

22. Khanna S, Rink C, Ghoorkhanian R, Gnyawali S, Heigel M, Wijesinghe DS, Chalfant CE, Chan YC, Banerjee J, Huang Y, Roy S, Sen CK. MiR-29b:n menetys akuutin iskeemisen aivohalvauksen jälkeen edistää hermosolujen kuolemaa ja infarktin kokoa. J Cereb Blood Flow Metab. 2013; 33:1197–206.

23. Shi G, Liu Y, Liu T, Yan W, Liu X, Wang Y, Shi J, Jia L. Upregulated miR-29b edistää hermosolujen kuolemaa estämällä Bcl2L2:ta iskeemisen aivovaurion jälkeen. Exp Brain Res. 2012; 216:225–30.

24. Bai X, Tang Y, Yu M, Wu L, Liu F, Ni J, Wang Z, Wang J, Fei J, Wang W, Huang F, Wang J. Veriseerumin mikroRNA 29 -perheen väheneminen Parkinsonin tautia sairastavilla potilailla . Sci Rep. 2017; 7:5411.

25. Han L, Tang Y, Bai X, Liang X, Fan Y, Shen Y, Huang F, Wang J. Seerumi-mikroRNA-29-perheen ja Parkinsonin taudin kognitiivisten vaurioiden yhdistäminen. Ikääntyminen (Albany NY). 2020; 12:13518–28.

26. Chinta SJ, Woods G, Demaria M, Rane A, Zou Y, McQuade A, Rajagopalan S, Limbad C, Madden DT, Campisi J, Andersen JK. Solujen vanhenemista indusoi ympäristön neurotoksiini Paraquat ja se edistää Parkinsonin tautiin liittyvää neuropatologiaa. Cell Rep. 2018; 22:930–40.

27. Willard AM, Bouchard RS, Gittis AH. Motoristen puutteiden differentiaalinen hajoaminen dopamiinin asteittaisen ehtymisen aikana 6-hydroksidopamiinilla hiirillä. Neurotiede. 2015; 301:254–67.

28. Kam TI, Mao X, Park H, Chou SC, Karuppagounder SS, Umanah GE, Yun SP, Brahmachari S, Panicker N, Chen R, Andrabi SA, Qi C, Poirier GG, et ai. Poly(ADP-riboosi) ajaa patologista synukleiinin neurodegeneraatiota Parkinsonin taudissa. Tiede. 2018; 362:eaat8407.

29. Huang D, Xu J, Wang J, Tong J, Bai X, Li H, Wang Z, Huang Y, Wu Y, Yu M, Huang F. Dynamic Changes in the Nigrostriatal Pathway in the MPTP Mouse Model of Parkinson's Disease. Parkinsonin tauti. 2017; 2017: 9349487.

30. Ugalde AP, Ramsay AJ, de la Rosa J, Varela I, Mariño G, Cadiñanos J, Lu J, Freije JM, López-Otín C. Ikääntyminen ja krooninen DNA-vauriovaste aktivoivat säätelyreitin, johon liittyy miR{{2} } ja p53. EMBO J. 2011; 30:2219–32.

31. Hu Z, Klein JD, Mitch WE, Zhang L, Martinez I, Wang XH. MicroRNA-29 indusoi solujen vanhenemista ikääntyvässä lihaksessa useiden signalointireittien kautta. Ikääntyminen (Albany NY). 2014; 6:160–75.

32. Fenn AM, Smith KM, Lovett-Racke AE, Guerau-deArellano M, Whitacre CC, Godbout JP. Lisääntynyt mikroRNA 29b ikääntyneissä aivoissa korreloi insuliinin kaltaisen kasvutekijän-1 ja fraktalkiiniligandin vähenemisen kanssa. Neurobiol Aging. 2013; 34:2748–58.

33. Wang R, Yang Y, Wang H, He Y, Li C. MiR-29c suojaa tulehdukselta ja apoptoosilta Parkinsonin taudin mallissa in vivo ja in vitro kohdistamalla SP1:een. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2020; 47:372–82.

34. Caravia XM, Fanjul V, Oliver E, Roiz-Valle D, Morán-Álvarez A, Desdín-Micó G, Mittelbrunn M, Cabo R, Vega JA, Rodríguez F, Fueyo A, Gómez M, LoboGonzález M jne. MikroRNA-29/PGC1-säätelyakseli on kriittinen sydämen toiminnan metaboliselle säätelylle. PLoS Biol. 2018; 16:e2006247.

35. Varela I, Cadiñanos J, Pendás AM, Gutiérrez-Fernández A, Folgueras AR, Sánchez LM, Zhou Z, Rodríguez FJ, Stewart CL, Vega JA, Tryggvason K, Freije JM, LópezOtín C. Nopeutettu ikääntyminen in Zmpste2ficient in Zmpste2ficient proteaasi on kytketty p53-signalointiaktivaatioon. Luonto. 2005; 437:564–68.

36. Park SY, Lee JH, Ha M, Nam JW, Kim VN. miR-29 miRNA:t aktivoivat p53:n kohdistamalla p85 alfaan ja CDC42:een. Nat Struct Mol Biol. 2009; 16:23-29.

37. Martinez I, Cazalla D, Almstead LL, Steitz JA, DiMaio D. miR-29 ja miR-30 säätelevät B-Myb-ekspressiota solujen vanhenemisen aikana. Proc Natl Acad Sci USA. 2011; 108:522–27.

38. Collier TJ, Kanaan NM, Kordower JH. Ikääntyminen ja Parkinsonin tauti: saman kolikon eri puolet? Mov Disord. 2017; 32:983–90.

39. Massart J, Sjögren RJ, Lundell LS, Mudry JM, Franck N, O'Gorman DJ, Egan B, Zierath JR, Krook A. Muuttunut miR- 29 Ilmentyminen tyypin 2 diabeteksessa vaikuttaa glukoosi- ja rasva-aineenvaihduntaan luustossa Lihas. Diabetes. 2017; 66:1807–18.

40. Dooley J, Lagou V, Garcia-Perez JE, Himmelreich U, Liston A. miR-29a-puutos ei muuta hiiren haiman akinaarisyövän kulkua. Oncotarget. 2017; 8:26911–17.

41. Kwon JJ, Factora TD, Dey S, Kota J. Systematic Review of miR-29 in Cancer. Mol Ther Oncolytics. 2018; 12:173–94.

42. Lu M, Su C, Qiao C, Bian Y, Ding J, Hu G. Metformiini estää dopaminergisen neuronien kuoleman MPTP/PI:n aiheuttamassa Parkinsonin taudin hiirimallissa autofagian ja mitokondrioiden ROS-puhdistuman kautta. Int J Neuropsychopharmacol. 2016; 19:pyw047.

43. Salminen A, Hyttinen JM, Kaarniranta K. AMP-aktivoitu proteiinikinaasi estää NF-κB-signalointia ja tulehdusta: vaikutus terveyteen ja elinikään. J Mol Med (Berl). 2011; 89:667–76.

Xiaochen Bai 1% 2c2% 2c Xiaoshuang Zhang 1% 2c Rong Fang 1% 2c Jinghui Wang 1% 2c Zhaolin Liu 1% 2c Hongtian Dong 1% 2c Qing Li 1% 2c Jingyu Ge 1% 2c Mei Yu 1% 2c Jian Fei 3% 2c4% 2c Ruilin aurinko 4% 2c Fang Huang 1

1. Translational Neuroscience Department, Jing'an District Center Hospital of Shanghai, State Key Laboratory of Medical Neurobiology ja MOE Frontiers Center for Brain Science, Institutes of Brain Science, Fudan University, Shanghai 200032, Kiina

2. Kuntoutuslääketieteen laitos, Shanghai Jiao Tong -yliopiston Sixth People's Hospital, Shanghai 200233, Kiina

3. School of Life Science and Technology, Tongji University, Shanghai 200092, Kiina

4. Shanghai Engineering Research Center for Model Organisms, Shanghai Model Organisms Center, INC, Shanghai 201203, Kiina