Cistanche-polysakkaridien apoptoottinen vaikutus leukemiaan

Tekijä:

LI Yan,Zhang Jin,Zhang Jing-Nan,et ai.

Sisä-Mongolia, Kiina

Tutkiakseen apoptoottista vaikutustaCistanche-polysakkaridit( CDP) ihmisen päälläakuutti leukemiasolulinja Jurkat solut.menetelmätMTT-määritystä käytettiin CDP:n vaikutuksen havaitsemiseksi solujen lisääntymiseen, Western blot -menetelmää käytettiin kaspaasin-9 ja kaspaasin-3 aktivoitumisen havaitsemiseen., ja apoptoottiset signaalimolekyylit testattiin myös.tuloksiaT-solujen proliferaatiota esti 1 mg/ml ja 2 mg/ml CDP, T-solujen apoptoosi indusoitiin 5 mg/ml CDP:llä, japro-kaspaasin-9 ja pro-kaspaasin-3 ilmentyminen väheni merkittävästi. Solun pintareseptorien CD45 ja CD71 ilmentymistä esti merkittävästi 5 mg/ml CDP:tä, EＲK-fosforylaatio indusoitiin, ja JNK:n fosforylaatio estyi.

Johtopäätökset

【Avainsanat】Cistanche-polysakkaridit; Apoptoosi; Ｒreseptori; kaspaasi-9; kaspaasi-3

Akuutti lymfoblastinen leukemia (ALL) on pahanlaatuinen imusolmukkeiden klooninen sairaus, jolla on suuri immunofenotyypin heterogeenisyys. , helppo uusiutua ja niin edelleen. Tällä hetkellä yleisesti käytettyjä hoitomenetelmiä ovat luuytimensiirto, induktiohoito, immunoterapia, yhdistetty kemoterapia jne. Koska useimmat kemoterapialääkkeet eivät pysty kohdistamaan ja tappamaan kasvaimia, ne voivat aiheuttaa vakavia vaurioita ruoansulatuskanavalle, verijärjestelmälle, sydän- ja aivoverisuonit jne. Hoidon aikana siihen liittyy usein suuria haittavaikutuksia, joista osa on jopa kuolemaan johtavia. Kemoterapian edetessä keholla on taipumus kehittää sietokykyä kemoterapialääkkeitä kohtaan, mikä lisää taudin uusiutumisen riskiä.

Siksi erittäin tehokkaan, alhaisen toksisuuden ja tarkasti kohdistetun leukemiahoidon tai adjuvanttihoidon etsimisestä on tullut tämän hetken huomion keskipiste.CistancheMongoliaksi kutsutaan Chagangaoyaksi. Se kuuluu Ledangaceae-heimoon ja Cistanche-sukuun. Se loistaa aavikon puiden juurissa ja sillä on "aavikon ginsengin" maine.

Cistanchen tärkeimpiä vaikuttavia ainesosia ovat fenyylietanoidiglykosidit, lignaanit, betaiinit, sterolit, aminohapot ja polysakkaridit. Anti-inflammatoriset, antiviraaliset, antioksidantit, immuunisäätely ja muut vaikutukset.

Tutkimukset ovat löytäneet senCistanche-polysakkaridi (CDP),yhtenä sen tärkeimmistä aktiivisista komponenteista,sillä on kasvaimia estäviä ja immunomoduloivia vaikutuksia.Tutkijat havaitsivat, että CDP:llä on merkittävä tappava vaikutus leukemiasoluihin K562 ja THP-1, ja ehdottivat, että CDP:llä on tietty roolileukemian ehkäisy tai hoito. Lisäksi perinteisen kiinalaisen lääketieteen yhdiste, cistanche, akuutin hoitoonleukemia, Cistancheon myös yksi tärkeimmistä komponenteista. Kuitenkin erityinen toimintamekanismiCistancheei tiedetä. Tässä artikkelissa eristäminen ja puhdistusCistanche CDPtutkittiin ja CDP:n tappavaa vaikutusta ja siihen liittyvää mekanismia ihmisen akuutin leukemiasolulinjassa Jurkat tutkittiin.

1.1 Tärkeimmät reagenssit ja instrumentit

Cistanche-jauhe ostettiin Sichuanista WecistancheGroup Co, Ltd., ihmisen akuutti leukemiasolulinja Jurkat ostettiin Shanghai Institute of Cell Biologyn solupankista, tiatsolisininen (MTT) ja natriumdodekyylisulfaatti (SDS) ostettiin Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd.:ltä, sikiön naudan seerumi (FBS) ostettiin Hangzhou Sijiqing Bioengineering Materials Co., Ltd.:ltä, kysteiiniä sisältävä kaspaasi-3, kaspaasi-9, CD71, CD45, fosforyloitu c-Jun-aminoterminaalinen kinaasi (p) -JNK) ja fosforyloidut solunulkoiset signaalisäädellyt kinaasi (p-ERK) vasta-aineet ostettiin Cell Signaling Technologylta, USA, ja aktiinivasta-aineet ostettiin Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd:ltä. Sähkökemiallinen Luminesenssi (ECL) substraatti ostettiin Thermolta Scientific Company of the United States ja muut reagenssit olivat kotimaista analyyttistä laatua. Gel-View 6000 plus älykäs kuvatyöasema (Guangzhou Boluteng Biotechnology Co., Ltd.:n tuote), Revolve FL ylösalaisin fluoresenssimikroskooppi (Echo Laboratoriesin tuote, USA), EPOCH-mikrolevylukija (Beijing Bo Teng Instrument Co., tuote, Oy.).

1.2 CDP:n erottaminen ja puhdistaminen Ota 500 gCistanche-uutejauhe, liota sitä 95-prosenttisessa etanolissa yön yli, suodata sideharsolla, kerää suodattimen jäännökset, keitä kuumalla vedellä 60 asteessa 2 h/kerta, yhteensä 3 kertaa. Lopun jälkeen suodokset yhdistettiin kolme kertaa, konsentroitiin alennetussa paineessa 2/3:aan alkuperäisestä tilavuudesta, lisättiin 3 kertaa tilavuus 95-prosenttista etanolia ja annettiin seistä 4 asteessa yön yli. Sentrifugoi seuraavana päivänä nopeudella 4 000 r/min 10 minuuttia, kerää sakka, poista proteiini Sevag-menetelmällä, saosta absoluuttisella etanolilla, pakastekuivaa CDP:n saamiseksi.

1.3 Soluviljely Ihmisen akuutti leukemiasolulinja säilytettiin nestetypessä Jurkat-laboratoriossa. Käytettäessä solut otettiin nopeasti talteen 37-asteisessa vesihauteessa ja viljeltiin RPMI1640-elatusaineessa (joka sisälsi 100 U/ml penisilliiniä ja 100 U/ml streptomysiiniä) 10 prosentin FBS:n kanssa. Soluja viljeltiin 37-asteisessa, 5-prosenttisessa CO2-soluinkubaattorissa, siirrostettiin 2-3 päivän välein, ja kokeet suoritettiin, kun solut tulivat logaritmiseen kasvuvaiheeseen.

1.4 MTT-koe Jurkat-solut logaritmisessa kasvuvaiheessa otettiin, sentrifugoitiin solupelletin saamiseksi ja laskettiin 5 x 105 solua/ml. Ota 96-kuoppasoluviljelylevy, inokuloi 100 ul solua jokaiseen kuoppaan ja lisää sitten 100 ul RP-MI1640 täydellistä elatusainetta kontrolliryhmäksi; koeryhmä jaettiin 3 ryhmään, käyttäen ensin RPMI1640-elatusainetta CDP:n eri konsentraatioiden valmistamiseksi ja sitten lisäämällä 100 ui RP-MI1640-elatusainetta kuhunkin kuoppaan. ul Jurkat-soluja ja 100 ul CDP-liuosta käytettiin CDP:n lopullisen konsentraatioon 1, 2 ja 5 mg/ml, vastaavasti. Jokaiseen ryhmään asetettiin 5 kaksoiskuoppaa ja niitä inkuboitiin 37 asteen soluinkubaattorissa 48 tuntia. Lisää inkubaation jälkeen 20 ul MTT:tä (kantaliuoksen pitoisuus 5 mg/ml) jokaiseen kuoppaan, laita se takaisin soluinkubaattoriin ja jatka inkubointia 4 tuntia ja lisää lopuksi 100 ul 20-prosenttista liuosta. SDS formazaanin liuottamiseen 37 asteessa yön yli ja käytä sitä seuraavana päivänä. Kunkin ryhmän absorbanssi aallonpituudella 570 nm havaittiin mikrolevylukijalla, ja CDP:n eri konsentraatioiden estonopeus Jurkat-solujen lisääntymiselle laskettiin kaavalla.

1.5 Western blotting Jurkat-solut logaritmisessa kasvuvaiheessa otettiin ja kylvettiin 6-kuoppalevylle tiheydellä 2 × 105 solua/ml, 500 ul/kuoppa ja 500 ul täydellistä RPMI1640-elatusainetta lisättiin kontrolliin. ryhmä. Perusta 3 koeryhmää, 1, 2 ja 5 mg/ml polysakkaridikäsittelyryhmät, CDP

Liuotettiin etukäteen RPMI164{48}} täydelliseen alustaan, 500 ul soluja ja 500 ul CDP-liuoksia eri pitoisuuksilla lisättiin 6-kuoppalevylle ja inkuboitiin 37 asteessa 48 tuntia. Viljelyn jälkeen kunkin ryhmän solususpensiot kerättiin, sentrifugoitiin nopeudella 1 500 r/min 5 minuuttia solupellettien saamiseksi ja pestiin kahdesti esijäähdytetyllä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS). Pesun jälkeen kuhunkin ryhmään lisättiin 20 ul solulyysipuskuria ja soluja lyysattiin jäissä 30 minuuttia. Kokonaisproteiini uutettiin ja solukonsentraatio säädettiin käyttämällä Bradfordin menetelmää. Kustakin ryhmästä otettiin 20 ug proteiinia SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesia (PAGE) varten ja proteiini siirrettiin polyvinylideenifluoridikalvolle (PVDF) elektroporaatiolla. Estetty rasvattomalla maitojauheella huoneenlämmössä 1 tunnin ajan, lisätty kanin anti-ihmiskaspaasin-3 ja kaspaasin-9 vasta-aineita laimennussuhteella 1:1 000, inkuboitu huoneenlämmössä 1 tunnin ajan. h, huuhdellaan 3 kertaa fosfaatti-Tween-puskurin (PBST) ravistelijalla (10 min/kerta), lisää piparjuuriperoksidaasilla (HRP) leimattu sekundaarinen vasta-aine (1:1 000), inkuboi 1 h huoneenlämmössä, huuhtele 3 kertaa PBST:llä, huuhtele 1 kerta PBS:llä, lisää ECL-substraattia ja käytä Kuvaamiseen käytettiin älykästä kuvatyöasemaa ja kunkin ryhmän vyöhykkeiden muutoksia verrattiin CDP:n aiheuttaman Jurkat-solujen apoptoosin tutkimiseen. Apoptoosireittiin liittyvien proteiinien havaitsemiseksi soluviljely- ja CDP-käsittelyolosuhteet olivat samat kuin edellä. Reaktion jälkeen solut hajotettiin proteiinin kvantifiointia varten. Proteiini siirrettiin PVDF-kalvolle SDS-PAGE:lla ja elektroporaatiolla. Rasvattomalla maitojauheella 1 tunnin eston jälkeen lisättiin anti-CD71-, CD45-, p-JNK- ja p-ERK-vasta-aineita (1:1 000) ja inkuboitiin huoneenlämmössä 1 tunti. HRP-leimattua sekundaarista vasta-ainetta (1:1 000) inkuboitiin 1 tunti, ja lopuksi älykästä kuvantamistyöasemaa käytettiin kuvantamiseen CDP-indusoidun Jurkat-soluapoptoosin vastaavien signaalimolekyylien tutkimiseen. Tuloksena saadut kokeelliset juovat harmaasävytettiin Image J:llä (1.8.0).

Napsauta tästä saadaksesi tietoa Cistanchen vaikutuksesta kasvainten vastaiseen ja syövänvastaiseen vaikutukseen

1.6 Tilastollinen analyysi SPSS21.0 -ohjelmistoa käytettiin t-testiin ja varianssianalyysiin

2 tulosta Cistanche-toiminnosta päälläleukemia

2.1 Solujen lisääntymistaso

CDP eristettiin onnistuneesti, ja sen sokeripitoisuus oli yli 9{{20}} prosenttia ja proteiinipitoisuus alle 5 prosenttia. Solujen lisääntymisen estonopeus 1 mg/ml CDP-ryhmässä oli (19,1 ± 2,1) prosenttia, kun taas 2 mg/ml ja 5 mg/ml CDP-ryhmissä (44,2 ± 5,2) ) ) prosenttia ja (47,8 ± 4,4) prosenttia, mikä osoittaa, että CDP voi merkittävästi estää Jurkat-solujen proliferaatiota annoksesta riippuvalla tavalla. 2.2 Verrokkiryhmään verrattuna (0,62±0.04, 0,56±{{40}}.{{49) }}7), apoptoosin taso Jurkat-soluissa, joita oli käsitelty 5 mg/ml CDP:llä, johti kaspaasin-9 ja kaspaasin{{30}} entsyymeihin. Pro-form pro-kaspaasi-9 ( 0. 09 ± 0. 02) ja pro-kaspaasi-3 ( {{ 63}}. 12 ± 0. 01) väheni merkittävästi, ja 1 mg/ml ja 2 mg/ml CDP-ryhmät olivat merkittävästi vähemmän tehokkaita prokaspaasille-3 soluissa. Kaspaasi-9 (0,58±0,04, 0,51±0,01) ja pro-kaspaasi-3-pitoisuudella (0,48±0,04, 0,44±0,05) ei ollut merkittävää vaikutusta, eli alhainen. CDP-pitoisuus ei indusoinut Jurkat-solujen apoptoosia, mutta pääasiassa esti solujen lisääntymistä, kuten kuvassa 1 on esitetty.

1-4: viiteryhmä,

1 mg/ml CDP-ryhmä, 2 mg/ml CDP-ryhmä, 5 mg/ml CDP-ryhmä; sama kuin seuraavassa kuvassa

Kuva 1 CDP:n vaikutus kaspaasiin-9 ja kaspaasiin-3 Jurkat-soluissa

Cistanche-polysakkaridien vaikutus Vaikutus leukemiaan

2.3 CD71:n ja CD45:n suhteelliset ekspressiotasot apoptoosireseptorikontrolliryhmässä olivat 1.00±0.04, {{10}},54±54± 0.{{20}}2. 5 mg/ml CDP-ryhmä voi merkittävästi estää CD71:tä (0.05±0.02). 01) ja CD45 (0. 13 ± {{40}}. 03); 1 mg/ml ja 2 mg/ml CDP-ryhmät saattoivat estää CD71:n (0,52 ± 0,06, 0,43 ± 0,07) ilmentymisen tietyssä määrin. CD45:n ilmentymiseen ei ollut merkittävää vaikutusta (0,51). ±0,01, 0,48±0,02). Katso kuva 2.

Kuvio 2 CDP:n vaikutus reseptorien ilmentymiseen solukalvon pinnalla

2.4 Apoptoosiin liittyvät reitit

P-JNK:n ja p-ERK:n suhteelliset ekspressiotasot vertailuryhmässä olivat 1,20±0.08 ja 0,21±0 .03. 5 mg/ml CDP-ryhmä indusoi apoptoosia ja alensi merkittävästi JNK:n fosforylaatiotasoa. (0. 32 ± 0. 04) , lisäsi merkittävästi ERK:n fosforylaatiotasoa (1,13 ± 0. 05); 1 mg/ml, 2 mg/ml CDP nosti JNK:n fosforylaatiotasoa (1,12 ± 0. 06 , 1.06 ± 0,06) ei vaikuttanut merkittävästi, mutta nosti silti ERK:n fosforylaatiotasoa (0, 54 ± 0, 04, 0, 63 ± 0, 02). Katso kuva 3.

Kuva 3 CDP:n vaikutus JNK:n ja ERK:n fosforylaatioon

3 Keskustelu

Viime vuosina tutkimukset ovat osoittaneet, että CDP:llä on tietty estovaikutus leukemiasolulinjoihin, mutta spesifistä vaikutusmekanismia ei vielä tunneta.

Apoptoosiprosessissa kaspaasi-9 on yksi ylävirran signaalimolekyyleistä kaspaasista riippuvaisessa apoptoosiprosessissa. Signaalistimulaation jälkeen prokaspaasi-9 hydrolysoituu massiivisesti, jolloin muodostuu aktivoitunut pilkkoutuneen kaspaasin muoto-9, joka jatkaa apoptoottisten signaalien lähettämistä alaspäin edistääkseen apoptoosia. Kaspaasi-3 on efektorityyppinen kaspaasimolekyyli ja avainsignalointimolekyyli solukaspaasista riippuvaisen apoptoosin prosessissa. Se esiintyy normaaleissa olosuhteissa myös proentsyymin (pro-kaspaasin-3) muodossa. Kun se on aktivoitu hydrolyysillä, muodostuu suuri määrä pilkkoutunutta kaspaasia. -3, se hajottaa useita tärkeitä proteiinimolekyylejä soluissa ja lopulta indusoi apoptoosia. CDP kuuluu biologisten makromolekyylien aktiivisiin polysakkarideihin, eikä se pääse vapaasti soluihin solukalvon läpi. Siksi CDP indusoi apoptoosia vaikuttamalla reseptorien ilmentymiseen ja jakautumiseen Jurkat-solukalvojen pinnalla, välittäen siten signaaleja solujen sisäpuolelle ja lopulta aktivoimalla kaspaasiperheen. proteiinia, mikä johtaa solujen apoptoosiin. Tämä tutkimus osoittaa, että CDP:n alhainen pitoisuus ei indusoi Jurkat-solujen apoptoosia, vaan estää pääasiassa solujen lisääntymistä. CD71, joka tunnetaan myös nimellä transferriinireseptori, on tyypin II transmembraaninen glykoproteiinireseptori, joka osallistuu raudan imeytymiseen ja solujen kasvun ja kehityksen säätelyyn. CD71 ekspressoituu voimakkaasti potilailla, joilla on akuutti leukemia, ja se liittyy ensisijaiseen lääkeresistenssiin, toisin sanoen CD71:n ilmentymiseen. Mitä suurempi arvo, sitä huonompi ensimmäisen kemoterapian vaikutus. Siksi CD71 on yksi apudiagnoosin markkereista. CD45 ekspressoituu kaikentyyppisten leukosyyttien pinnalla, joka tunnetaan myös leukosyyttien yhteisenä antigeeninä. Se kuuluu tyypin I transmembraaniseen glykoproteiiniin ja liittyy läheisesti T-solujen kehitykseen ja erilaistumiseen. CD45:llä on erilaiset ilmentymistasot ja allosteeriset tyypit erityyppisissä leukemioissa, joten sitä voidaan käyttää yhtenä markkerina leukemian erotusdiagnoosissa ja immunofenotyypin määrittämisessä. Monoklonaalista CD45-vasta-ainetta on käytetty laajalti leukemian, erityisesti lääkeresistentin leukemian, hoidossa. Friesen et ai. havaitsi, että radionuklideja

Merkitty CD45-mAb voi indusoida apoptoosia lääkeresistenteissä leukemiasolulinjoissa aktivoimalla kaspaasiperheen proteiineja (mukaan lukien kaspaasi-3, kaspaasi-8 ja kaspaasi-9). CDP indusoi Jurkat-solujen apoptoosia, ensinnäkin vaikuttamalla solukalvon pintareseptoreihin CD45 ja CD71, vaikuttamalla näiden kahden ilmentymiseen ja jakautumiseen, välittämällä apoptoosisignaaleja soluihin ja lopulta aktivoimalla kaspaasin-9 ja kaspaasin{{8 }}, laukaisee apoptoosin. Sekä kaspaasi-9 että kaspaasi-3 sijaitsevat kuitenkin alavirtaan apoptoottisesta reitistä, ja ylävirran signalointimolekyylejä on tutkittava lisää. Tässä tutkimuksessa CDP pitoisuudessa 5 mg/ml indusoi Jurkat-solujen apoptoosia samalla kun se inhiboi CD45:n ilmentymistä, joka oli samanlainen kuin edellä kuvatun monoklonaalisen CD45-vasta-aineen ilmentyminen. Siksi apoptoosiin liittyvien reseptorien CD45 ja CD71 näkökulmasta,Cistanchesillä on tietty potentiaali leukemian hoitoon tai adjuvanttihoitoon.Mitogeenilla aktivoidut proteiinikinaasijärjestelmät (MAPK:t) ilmentyvät kaikissa eukaryoottisoluissa.

Cistanche-tabletit leukemian hoidon immuunijärjestelmän parantamiseen

Se on erittäin tärkeä tiedonvälitysreitti, joka suorittaa solunulkoisen stimulaatiosignaalin transduktion solunsisäiseen ja koostuu seriini/treoniiniproteiinikinaaseista, mukaan lukien ERK, JNK ja p38MAPK. Sen fosforylaatio ja defosforylaatio ovat solujen elämän toimintojen kytkimiä ja ovat mukana Ja säätelevät solujen kasvu-, proliferaatio-, erilaistumis-, aktivaatio- ja apoptoosin prosessia. Tämä tutkimus viittaa siihen, että JNK-defosforylaatio liittyy CDP:n aiheuttamaan T-soluapoptoosiin, kun taas ERK-fosforylaatio osallistuu näihin kahteen prosessiin, koska CDP estää solujen lisääntymistä ja indusoi apoptoosia.

Tiivistettynä,Cistanche CDPsillä on sytotoksinen vaikutus T-lymfosyyttisen leukemiasolulinjaan Jurkat, mikä osoittaa, että pienet pitoisuudet (alle 2 mg/ml) estävät solujen lisääntymistä, kun taas suuret pitoisuudet (5 mg/ml) indusoivat apoptoosia.Cistanche CDPindusoi apoptoosia Jurkat-soluissa pääasiassa vaikuttamalla ja muuttamalla soluja.

Apoptoosiin liittyvien reseptorien CD71 ja CD45 ilmentyminen kalvon pinnalla välittää signaaleja solujen sisälle aiheuttaen edelleen ERK-fosforylaatiota ja JNK-defosforylaatiota ja lopulta kaspaasin -9 aktivoitumista, mikä puolestaan ​​aktivoi kaspaasin{{4} } apoptoosin indusoimiseksi.