Karvediloli, adrenerginen salpaaja, estää melaniinin synteesiä estämällä CAMP/CREB-signalointireittiä ihmisen melanosyyteissä ja ex vivo -ihokulttuurissa

Ottaa yhteyttä:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Myoung Eun Choi 1,†, Hanju Yoo 1,2,†, Ha-Ri Lee 2,3, Ik Joon Moon 1, Woo Jin Lee 1, Youngsup Song 3,*,‡ ja Sung Eun Chang 1

Abstrakti:Katekolamiinit toimivat G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien kautta, mikä laukaisee solunsisäisen 30:n 50-syklisen adenosiinimonofosfaatin (cAMP) tason nousun eri soluissa. Katekoliamiinibiosynteesi ja -adrenerginen reseptori ovat olemassamelanosyytit; näin ollen katekoliamiineilla voi olla ratkaiseva rooli ihon pigmentaatiossa. Niiden toimintaa ja epäinhimillisen ihon melanogeneesiä välittäviä mekanismeja ei kuitenkaan ole vielä tutkittu. Siksi tutkimme karvedilolin, ei-selektiivisen salpaajan, jolla on heikko 1-salpaaja, mahdollista anti-melanogeneettistä vaikutusta. Karvediloli vähensi melaniinipitoisuutta ja solujen tyrosinaasiaktiivisuutta vaarantamatta solujen elinkelpoisuutta normaalilla ihmisellämelanosyytitsamoin kuin Mel-Ab:ssä immortalisoiduissa hiiren melanosyyteissä. Karvediloli-alassäädelty mikroftalmiaan liittyvä transkriptiotekijä (MITF), tyrosinaasi, tyrosinaasiin liittyvä proteiini (TRP)-1 ja TRP-2. Karvedilolihoito johti fosfori-cAMP-response elementti-siding protein (CREB) -säätelyn vähenemiseen. Lisäksi cAMP-tasojen kohoaminen forskoliinilla hoidettaessa käänsi karvedilolin anti-melanogeenisen vaikutuksen. Lisäksi karvediloli alensi huomattavasti melaniiniindeksiä ultraviolettisäteilytetyissä ihmisen ihoviljelmissä. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että karvediloli estää tehokkaasti melanogeneesiä ihmisellämelanosyytitja ex vivo ihmisen ihoa inhiboimalla cAMP/proteiinikinaasi A/CREB-signalointia. Karvedilolin melanogeenisillä vaikutuksilla voi olla merkitystä ihollevalkaisuagentit.

Avainsanat:karvediloli; adrenerginen salpaaja;melaniinin synteesi; cAMP/CREB-signalointi

Cistanchepystyy estämään melaniinin synteesiä

1. Esittely

Monilla pigmentaarisilla ihosairauksilla on merkittävä psykologinen ja sosiaalinen vaikutus potilaisiin. Erilaisia ​​hoitomenetelmiä, mukaan lukien systeemiset ja paikalliset aineet sekä laserhoito, on kehitetty [1–3]. Tulokset ovat kuitenkin usein epätyydyttäviä ja hoitoon liittyvät haittavaikutukset, kuten tulehdusten jälkeinen hyperpigmentaatio (PIH) ja hypopigmentaatio, ovat yleisiä. Lisäksi hoito on kallista ja aikaa vievää [4–6].

Katekolamiinit, joihin kuuluvat dopamiini, epinefriini ja norepinefriini, ovat signaalimolekyylejä, jotka toimivat välittäjäaineina ja endokriinisinä hormoneina. Ihossa katekoliamiinien biosynteesi ja hajoaminen tapahtuu ihmisen keratinosyyteissä, mutta katekoliamiinisynteesi melanosyyteissä on hieman erilaista [7–9]. Katekolamiinit toimivat G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien (GPCR) kautta. Katekoliamiinien sitoutuminen GPCR:iin laukaisee solunsisäisen adenylaattisyklaasin aktivoitumisen, joka syntetisoi 30, 50- syklistä adenosiinimonofosfaattia (cAMP) ATP:stä [10]. Toinen lähetti-cAMP käyttää aktiivisuuttaan sitomalla proteiinikinaasi A:n (PKA) R-alayksikköä, mikä johtaa cAMP-vasteelementtiä sitovan proteiinin (CREB) fosforylaatioon. GPCR:itä aktivoivat amiinit ja peptidit, mukaan lukien glukagoni, lisäkilpirauhashormoni, sekretiini ja kalsitoniini [10].

Adrenergisten reseptorin antagonisteja ovat -reseptori- ja -reseptoriantagonistit. -Reseptorantagonistit on jaettu ei-selektiivisiin, 1-selektiivisiin ja 2-selektiivisiin aineisiin, kun taas -reseptoriantagonistit on luokiteltu ei-selektiivisiksi, 1-selektiivisiksi ja 2-selektiivisiksi aineiksi. tekijöiden valikoivan estotoiminnan perusteella. Toisin kuin ensimmäisen sukupolven ei-selektiiviset reseptoriantagonistit, kuten propranololi, timololi ja nadololi, karvediloli on kolmannen sukupolven ei-selektiivinen salpaaja, joka näyttää verisuonia laajentavia vaikutuksia estämällä 1-adrenoreseptorit (1-AR:t). [11]. Siksi karvediloli on anonselektiivinen salpaaja, jolla on heikko 1-estoaktiivisuus [12]. Sitä käytetään pääasiassa suun kautta otettavana lääkkeenä korkean verenpaineen ja kongestiivisen sydänsairauden hallintaan, kuten muutkin salpaajat [12]. Kolmannen sukupolven salpaajilla on kuitenkin angiogeenisiä, antioksidanttisia, antiproliferatiivisia, antihypertrofisia ja apoptoottisia vaikutuksia, jotka vaativat lisäselvitystä [11]. Dermatologiassa karvedilolia käytetään antioksidanttisten ja tulehdusta ehkäisevien vaikutustensa vuoksi usein oraalisissa formulaatioissa erythematotelangiektaattisen ruusufinnien hoitoon [13,14]. Lisäksi karvedilolin antioksidanttinen aktiivisuus estää ultraviolettisäteilyn (UV) aiheuttaman ihokarsinogeneesin, mikä tekee siitä houkuttelevan aineen UV-säteilyyn liittyvien ihosairauksien hoidossa [15–18]. Karvedilolaren kemopreventiiviset vaikutukset eivät kuitenkaan välity suoraan haitallisten reaktioiden kautta. [19] Vaikka tarkka mekanismi on suhteellisen tuntematon, cAMP/PKA- ja PKC-δ-signalointireitti voi liittyä karvedilolin ominaisuuksiin ihon etäpesäkkeitä vastaan ​​[20].

Pigmentaatiotutkimuksen alkuvaiheessa ihminenmelanosyytithavaittiin ilmentävän -1-AR-signalointia solunulkoisen induktion jälkeen norepinefriinillä. -AR:ita ei kuitenkaan löydetty stimulaation jälkeen adrenergisellä signaloinnillamelanosyytit[8]. Sitä vastoin Cillbro et ai. myöhemmin osoitti, että ihmisen melanosyyteissä on spesifinen toiminnallinen 2-AR-signaali ja että 2-AR-stimulaatio johtaa pigmentaatioon 2-AR/cAMP-reitin kautta [7]. Siksi ehdotettiin katekoliamiinien roolia pigmentaation säätelyssä, ja cAMP:tä pidetään pääakselina melanogeneesin katekoliamiinin säätelyssä.

Melanogeneesi on monimutkainen prosessi, joka sisältää useita reittejä. Tyrosinaasi, tyrosinaasiin liittyvä proteiini 1 (TRP-1) ja TRP-2, jota kutsutaan myös dopakromitautomeraasiksi (DCT), ovat kolme tärkeintä melanosyyttispesifistä entsyymiä, jotka osallistuvatmelaniinin synteesi[21]. Melanogeneesiä indusoivat tai estävät monet tekijät, mukaan lukien hormonit, sytokiinit, välittäjäaineet, kasvutekijät ja mikromolekyylit [21–23].

Tärkein positiivinen säätelijä on melanokortiini-1-reseptori ja sen ligandit, melanokortiini ja adrenokortikotrooppinen hormoni [23]. Melanogeneesiin osallistuvia tekijöitä ovat kuitenkin -endorfiini, estrogeenit, androgeenit, D3-vitamiini ja katekoliamiinit [23]. Kumulatiiviset todisteet ovat osoittaneet, että L-tyrosiini ja L-DOPA, jotka ovat melanogeneesin substraatteja ja välituotteita, vaikuttavat melanogeenisen reitin indusoijina ja positiivisina säätelijöinä muiden solutoimintojen säätelijöiden lisäksi [24]. Lisäksi Jeff Howe et ai. ehdotti, että L-tyrosiinin melanogeneesin induktio ja säätely välittyvät L-tyrosiinin adrenergisten reseptorien suoran aktivoinnin kautta, eikä sen aineenvaihduntatuotteiden, kuten katekoliamiinien, aiheuttamia [25]. Heidän tutkimuksissaan norepinefriini ja epinefriini stimuloivat tyrosinaasiaktiivisuutta, mutta niiden induktiivinen vaikutusmelaniinin synteesioli suhteellisen alempi kuin L-tyrosiini [25].

Katekoliamiinit voivat näytellä tärkeitä tehtäviä ihon pigmenttijärjestelmässä; niiden vaikutuksia melanogeneesiin kolmannen sukupolven ei-selektiivisten salpaajien vaikutuksesta ei kuitenkaan ole vielä tutkittu. Siksi tässä tutkimuksessa pyrimme tutkimaan, vaikuttaako karvediloli melanogeneesiin ja tutkimme sen vaikutusmekanismeja ihmisellä.melanosyytitja ex vivo ihmisen iho ja sen mahdollinen käyttö avalkaisutuote.

estää melaniinin muodostumistayrttisäiliöt

2. Tulokset

2.1. Karvediloli estää melanogeneesiä

Karvedilolin sytotoksisuus normaalia ihmistä vastaanmelanosyytit(NHMs) ja Mel-ab-solut arvioitiin WST-soluproliferaatiomäärityksellä. 10 uM:n karvedilolikonsentraatio alkoi osoittaa sytotoksisuutta sekä NHM- että Mel-ab-soluja vastaan ​​(kuvio 1A, B). Siksi lisäarvioinneissa käytimme 8 µM karvedilolia, joka ei ole sytotoksinen NHM:ille.

Käsittely karvedilolilla vähensi melaniinipitoisuutta annoksesta riippuvalla tavalla vaikuttamatta NHM:iden elinkelpoisuuteen (kuvio 1C). Melaniinipitoisuus laski 28,36 prosenttia 96 hofin 8 µM karvedilolikäsittelyn jälkeen (kuva 1C). 100 mg/ml arbutiinin lisääminen vähensi melaniinipitoisuutta vähemmän kuin karvediloli (kuvio 1C). 4 päivän karvedilolihoidon jälkeen melaniinipitoisuus laski ajasta riippuvaisella tavalla (kuvio 1D). Forskoliinihoito (FSK) 4 päivän ajan karvedilolilla suoritetun esikäsittelyn jälkeen aiheutti kuitenkin melaniinipitoisuuden nousun (kuva 1E). FSK lisää MITF:n transkriptiota suurimmassa määrin 2 tunnin kuluttua NHM:issä ja sen uskotaan toimivan cAMP:n kautta. /PKA/CREB-reitti (kuva 1F).

2.2. Karvediloli estää MITF:n ja sen kohdegeenien ilmentymistä ja alentaa fosfo-CREB-tasoja NHM:issä

Koska karvediloli vähensi melaniinin kertymistä, tutkimme solujen tyrosinaasin aktiivisuutta. Hoito karvedilolilla vähensi solujen tyrosinaasin aktiivisuutta annoksesta riippuvalla tavalla NHM:issä (kuvio 2A). Tyrosinaasiaktiivisuus laski 28,48 prosenttia 96 tunnin 8 uM karvedilolikäsittelyn jälkeen (kuvio 2A). Seuraavaksi määritimme, vaikuttaako karvediloli MITF:n ekspressioon, jolla on ratkaiseva rooli tyrosinaasin ja alavirran melanogeenisten geenien säätelyssä. FSK-hoito nosti solunsisäisiä cAMP-tasoja ja kumosi karvedilolin melanogeenisia vaikutuksia. Karvediloli alensi merkittävästi MITF:n, melanogeneesin keskeisen transkriptiotekijän, proteiinitasoja 72 tunnin kohdalla (kuvio 2B). Lisäksi sen kohdegeenien, kuten tyrosinaasin ja TRP{10}}, ilmentyminen väheni karvedilolihoidon jälkeen (kuva 2B). Nämä tulokset osoittavat, että karvediloli estää melanogeneesiä vähentämällä MITF-signalointia.

Seuraavaksi tutkimme melanogeneesin solunsisäisiä signalointireittejä, jotka säätelevät MITF-transkriptiota mittaamalla fosfo-CREB:n ja fosfo-ERK:n ilmentymistasoja. Fosfo-ERK-tasot eivät muuttuneet ajan kuluessa karvedilolihoidon jälkeen; fosfo-CREB-tasot kuitenkin laskivat (kuvio 2B). Aiempien havaintojen mukaisesti tulokset paljastivat, että karvedilolini estää melanogeneesiä estämällä cAMP/PKA/CREB-signalointireittiä. Lisäksi FSK-hoito kumosi karvedilolin anti-melanogeenisen vaikutuksen nostamalla cAMP-tasoja.

2.3. Melaniiniindeksi ja immunohistokemiallinen värjäys ihmisen ihokulttuurissa ex vivo

Orvaskeden melanosyyttitiheys ja melaniiniindeksi ex vivo ihmisen ihoviljelykudosleikkeissä havaittiin Melan-A:lla ja vastaavasti Fontana-Massonin värjäyksellä. Karvediloli ei vaikuttanut Melan-A:n määrään (plus)melanosyytitkarvedilolilla plus UV-säteilyllä (UVR) käsitellyssä näytteessä verrattuna pelkällä UVR:llä käsitellyyn näytteeseen (kuva 3A). HMB45(plus)melanosyytit voivat viitata siihen, että melanosyyttinen aktiivisuus lisääntyi UVR-käsittelyn aikana ja että se käänteisesti väheni karvedilolihoidon jälkeen (kuvio 3B). Melaniinipitoisuus pieneni kuitenkin merkittävästi karvedilolilla ja UVR:llä käsitellyissä näytteissä verrattuna pelkällä UVR-käsitellyillä näytteillä (kuva 3C). Melaniiniindeksin laskemista varten laskettiin ja verrattiin Fontana–Massonin värjäytymisalueen osuus UVR-säteilylle altistetun näytteen ja karvedilolille plus UVR:lle altistetun näytteen välisestä kokonaisalueesta ja sitä verrattiin (kuva 3D). Kunkin näytteen solulysaatit analysoitiin Western blotassay -määrityksellä, joka paljasti, että tyrosinaasia, TRP1:tä ja DCT:tä lisäsi UVR ja alensi karvedilolikäsittely (kuvio 3E). Tämän seurauksena karvediloli alensi huomattavasti melaniiniindeksiä ja melanogeneesiin liittyviä proteiineja, mikä osoittaa sen anti-melanogeenisen vaikutuksen UVR-käsitellyllä ihmisen iholla.

3. Keskustelu

Melaniini on pigmentti, joka vastaa ihon ja hiusten väristä, ja se syntetisoituu melanosomeissamelanosyytit. Vaikka orvaskeden melaniinilla on tärkeä suojaava rooli UV-säteilyä vastaan, melaniinin ylituotanto ja kerääntyminen ihoon aiheuttaa hankalia ihon hyperpigmentaarisia häiriöitä, kuten PIH:ta, valon ikääntymiseen liittyvää dyspigmentaatiota, melasmaa ja auringon lentigiiniä [18, 26]. Siksi melanogeneesin estäminen on ollut ihon kauneutta ja terveyttä edistävien lääke- ja kosmeettisten hoitojen painopiste. Huomattavia ponnisteluja on tehty uusien ja tehokkaiden pigmentaatiota ehkäisevien aineiden löytämiseksi. Spesifisten aineiden melanogeneesin vastaiset mekanismit ovat kuitenkin tällä hetkellä epävarmoja, ja niitä on yleisesti arvioitu hiiren soluissa, mikä tuottaa tuloksia, jotka eivät aina ole yhdenmukaisia ​​ihmisen ihokokeiden kanssa [27, 28]. Lisäksi, koska melanosyyttien melanogeneesiä säätelevät tiukasti keratinosyytit ja muut naapurisolut, yhteisviljellyt ihmissolut tai ex vivo ihmisen iho ovat luotettavampia kokeellisia asetuksia tehokkaiden menetelmien tutkimiseen.valkaisuagentit [29]. Useimmat ihoa valkaisevat aineet, olivatpa ne luonnollisesti tai kemiallisesti johdettuja, voivat aiheuttaa ihotoksisuutta tai ärsytystä, mikä voidaan jossain määrin ennustaa käyttämällä solujen elinkelpoisuustestejä in vitro melanosyyteillä. Tutkimuksessamme karvediloli ei osoittanut sytotoksisuutta, kun sitä käytettiin kohtalaisina annoksina.

cistanche bienfaits

Paikallisesti käytettävät hydrokinonivoiteet voivat aiheuttaa ei-toivottuja hypopigmentaatiohäiriöitä ja ihotoksisuutta [30–32]. Lisäksi jotkutvalkaisukosmetiikalla on tuhoisia seurauksia, koska ne aiheuttavat hypopigmentaatiota tyrosinaasiproteiinien hajoamisen kautta [33–35]. Valkaisuaineita voidaan käyttää suurempina annoksina käyttäjästä riippuen hyperpigmentaaristen leesioiden valkaisujen maksimoimiseksi. Siksi turvallisia ja terveitä ihonvalkaisuaineita tutkitaan jatkuvasti.

Siksi tämä tutkimus suunniteltiin suoritettavaksi normaaleissa ihmissoluissa ja ex vivo ihmisen ihossa. Lisäksi katekoliamiinien vakiintuneen G-signaloinnin toimintamekanismin perusteella, joka lisää solun cAMP-tasoa, uskoimme, että adrenerginen salpaaja voisi vähentää cAMP-tasoja ja estää UVR/cAMP/CREB-signalointireittiä, joka on päämekanismi UV-indusoidussa ihon hyperpigmentaatiossa. [36,37]. Siksi oletimme, että cAMP-tasoja alentavat adrenergiset salpaajat vähentävätmelaniinin synteesi.

Lisäksi kehittää turvallisiavalkaisuluotettavia ja toistettavia antimelanogeneesin mekanismeja olisi pyrittävä rinnakkain. Fysiologisesti merkittävin ärsyke on UV ja orvaskeden UV-signaalien joukossamelanosyytitCREB-akseli on vakiintunein reitti melanogeneesin säätelyyn ihmisen epidermiksessä [29]. Altistuminen UV:lle aktivoi peräkkäin cAMP-tuotannon, PKA:n ja transkriptiotekijän CREB:n, mikä puolestaan ​​indusoi MITF:n ja alavirran kohdemelanogeenisten geenien ilmentymistä [38,39]. PKA:lla tapahtuvan CREB-fosforylaation lisäksi viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että CREB-säädellyn transkription koaktivaattorin (CRTC) 3 värvääminen CREB-transkriptiokompleksiin edellyttää myös cAMP-stimuloitua MITF:ää. MITFsuorittaa keskeisimmän roolin säätelyssämelaniinin synteesija tuloksena oleva melanogeenisten entsyymien transkriptio [26,40,41]. Tämän solunsisäisen signalointiprosessin aikana melanogeneesiä säätelevät avainentsyymi, tyrosinaasi ja muut entsymaattiset proteiinit, kuten TRP-1 ja DCT [1–4]. Tässä tutkimuksessa karvediloli vähensi tehokkaasti CREB:n fosforylaatiota, mikä osoittaa, että se vähensi MITF- ja tyrosinaasiproteiineja inhiboimalla MITF-transkriptiota (kuvio 4). Ottaen huomioon, että MITF-mRNA-geenin säätelyä säätelevät ja pelastavat muut solunsisäiset signaalimolekyylit ja koaktivaattorit, MITF:n transkription tason säätely on lupaava strategia terveiden ihon valkaisuaineiden tutkimiseen, koska MITF:n eloonjäämistoiminto säilyy ja pelastuu [1,38,40]. Todellakin, kun tutkimme FSK-indusoitua MITF-transkriptiota, MITF-mRNA:lla havaittiin oma huippuvastekäyränsä melanogeneesille ja solujen eloonjäämiselle solujen homeostaasille. Biologiset toiminnotmelanosyytitnäytti olevan luonnostaan ​​muiden ihmisten melanosyyttien palautesignaalien säätelemä. Lisäksi karvedilolilla on pienempi hypopigmentaation haittatapahtumien riski, koska se heikentää solujen tyrosinaasin aktiivisuutta ajan myötä eikä äkillisesti.

Katekolamiineja ovat dopamiini, epinefriini ja norepinefriini, ja ne syntetisoidaan ravinnon tyrosiinista entsyymien vaikutuksesta [42]. Katekoliamiinien biosynteesi ja hajoaminen tapahtuu monissa soluissa, mukaan lukien sympaattisten hermojen ja aivojen hermosolut, adrenomedullaarisolut, endoteelisolut, neutrofiilit ja mononukleaariset solut [43–45]. Ihmisen ihossa katekoliamiinisynteesi tapahtuu keratinosyyteissä. Sitä vastoin melanosyytit ilmentävät myös mRNA:ta ja entsyymejä noradrenaliinin, mutta eivät epinefriinin, autokriiniseen synteesiin [7,42]. Ihmisessämelanosyytit, -1-AR voi olla tärkeä reaktiossa norepinefriinille, muttamelaniinin synteesisiihen vaikuttaa myös toiminnallinen 2-ARsignaling [7,8]. Mielenkiintoista on, että vitiligopotilaiden 2-AR-tiheys keratinosyyteissä on lisääntynyt [46]. Norepinefriinipitoisuudet ovat lisääntyneet virtsassa ja plasmassa potilailla, joilla on ei-segmentaalinen vitiligo, mikä viittaa siihen, että katekoliamiiniaineenvaihdunta saattaa liittyä vitiligon kehittymiseen ja etenemiseen. [47]. Lisäksi klassisten stressin välittäjäaineiden lisäksi melanosyytit tuottavat neuropeptidejä ja hormoneja, kuten kortikotropiinia vapauttavaa tekijää ja proopiomelanokortiinia. UVR ja muut aineet, jotka vaikuttavat ihon neuroendokriinisyyteen [48], stimuloivat tätä tuotantoa. Siksi katekoliamiinien toiminta ja melanosyyttinen toiminta liittyvät läheisesti toisiinsa monissa monimutkaisissa reiteissä. Lisäksi karvediloli saattaa häiritä melanogeenisen reitin kemiallisia reaktioita, ja tätä mahdollisuutta tulisi tutkia edelleen. Karvedilolilla voi olla etuja, koska sillä on samanaikaisesti anti-inflammatorisia vaikutuksia, koska useimmat hyperpigmentaariset häiriöt ovat tummaihoisilla potilailla kliinisesti tai subkliinisesti PIH:ta. Koska karvedilolin läpäisyä ihon läpi on tutkittu sekä in vitro että ex vivo, karvedilolia voidaan kehittää paikallisenavalkaisuagentti tulevaisuudessa [49–51].

Systeeminen karvedilolin anto voi aiheuttaa bradykardiaa, huimausta, hypotensiota, päänsärkyä ja huimausta. Karvedilolin paikallinen käyttö ei yleensä aiheuta systeemisiä oireita; meidän tulee kuitenkin kiinnittää erityistä huomiota näihin oireisiin, kun sitä käytetään potilaille, joilla on viallinen ihosuoja, kuten atooppinen ihottuma. Lisäksi ekseemaa, kutinaa ja jäkälätulehduksia on raportoitu harvoissa tapauksissa karvedilolin käytön yhteydessä. Nämä dermatologiset sivuvaikutukset sekä kontaktidermatiitti tulee myös ottaa huomioon käytettäessä karvedilolia paikallisenavalkaisuagentti.

Lopuksi osoitimme, että karvediloli vähensi tehokkaasti melanogeneesiä ihmisellämelanosyytitja ex vivo ihmisen ihoa estämällä cAMP/CREB/MITF-reittiä, mikä viittaa sen mahdolliseen käyttöön tehokkaana valkaisuaineena. Karvedilolin adrenergireseptorin toiminnallista osallistumista ihmisen melanosyyteissä on tutkittava tarkemmin.

4. Materiaalit ja menetelmät

4.1. Materiaalit

Karvediloli, 3,4-dihydroksi-L-fenyylialaniini (L-DOPA), koleratoksiini (CT) ja 12-otetradekanoilforboli-13-asetaatti (TPA) ostettiin Sigma-Aldrich Co.:lta. (St. Louis, MO, USA). Dulbeccon modifioitu Eagle's Medium (DMEM) ja Dulbeccon fosfaattipuskuroitu suolaliuos ostettiin WelGENE:ltä (Daegu, Korea). Naudan sikiön seerumi (FBS), antibiootti-antimykootti ja trypsiini-EDTA ostettiin Gibcolta (Grand Island, NY, USA). Elatusaine 254 (CascadeBiologics, Portland, OR, USA) ja FSK ([3R-(3 ,4a ,5 ,6 ,6a ,10 ,10a ,10b )]-5-(asetyylioksi)-3-etenyylidodekahydro{ {24}},10,10b-trihydroksi-3,4a,7,7,10a-pentametyyli-1H-nafto[2,1-b]pyraani-1-oni )ostettiin Tocris Bioscienceltä (Bristol, UK).

4.2. Solulinjat ja soluviljelmä

Invitrogenilta (Carlsbad, CA, USA) saatuja primäärisiä NHM:itä pidettiin elatusaineessa 254 (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA), jota oli täydennetty ihmisen melanosyyttien kasvulisällä (Thermo Fisher). Mel-ab-solut, hiirestä johdettu spontaanisti immortalisoitu melanosyyttisolulinja, saatiin Korean Cell Line Bankista (KCLB, Soul, Korea) ja niitä ylläpidettiin DMEM:ssä, jota oli täydennetty 10 prosentilla FBS:llä, penisilliini-streptomysiinillä, 100 nM TPA:lla ja 1 nM:llä. CT. Kaikki solut pidettiin rutiininomaisesti 37 ◦C:ssa kosteassa ympäristössä, jonka hiilidioksidipitoisuus oli 5 prosenttia.

4.3. Vasta-aineet ja Western Blots

Solut pestiin kerran kylmällä PBS:llä ja hajotettiin proteiinin lyysipuskurissa (1 % SDS 10 mMTris:ssä ja 5 mM EDTA, pH 7,4), minkä jälkeen inkuboitiin 98 ◦C:ssa 10 minuuttia. Proteiininäytteet erotettiin 8-prosenttisella SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla, blotattiin nitroselluloosakalvoille (GE Healthcare Life Sciences, Chicago, IL, USA) ja suojattiin sitten Tris-puskuroidulla suolaliuoksella, joka sisälsi 0,5 prosenttia Tween 20:tä ja 5 prosenttia BSA:ta, ja altistettiin immunoblottaukselle. Tyrosinaasi- ja TRP{14}}-vasta-aineet ostettiin Santa Cruz Biotechnologylta (Dallas, TX, USA) ja MITF ostettiin Abcamilta (Cambridge, UK). -tubuliinia (Gentex, Holland, MI, USA) käytettiin sisäisenä latauskontrollina.

4.4. Melaniinipitoisuus

Karvedilolin sytotoksinen vaikutus arvioitiin käyttämällä Ez-Cytox Cell Viability Assay -pakkausta (Dogen-Bio Co., Ltd., Soul, Korea) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Mel-Ab-solut ja NHM:t ympättiin kuusikuoppalevyille. tiheydellä 6 × 105 ja 3 × 105 solua/kuoppa, vastaavasti. Soluja käsiteltiin karvedilolilla, kuten kuvioissa esitetään, 3 tai 5 päivää (d). Ennen melaniinipitoisuuden mittaamista soluja tarkkailtiin faasikontrastimikroskoopilla ja valokuvattiin (Olympus, Tokio, Japani). Solut liuotettiin 550 µl:aan 1 N NaOH:ta 100 ◦C:ssa 30 minuutin ajan ja sentrifugoitiin 13, 000 rpm 5 minuuttia. Supernatanttien absorbanssi mitattiin 405 nm:ssä mikrolevylukijalla. Solunsisäinen melaniinipitoisuus esitettiin prosentteina suhteessa solujen käsittelemättömään kontrolliin. Arbutiinia (100 mg/ml) käytettiin positiivisena kontrollina.

4.5. Solujen tyrosinaasiaktiivisuus

Tyrosinaasiaktiivisuus arvioitiin mittaamalla L-DOPA:n dopakromin muodostumisnopeus. Karvedilolin kanssa inkuboinnin jälkeen solut pestiin jääkylmässä PBS:ssä ja hajotettiin tyrosinaasin lyysipuskurissa (fosfaattipuskuri, pH 6,8, joka sisälsi 1 % Triton X{:ta). {5}}) toistuvilla pakastus-/sulatussykleillä. Lysaatit kirkastettiin sentrifugoimalla 15,000 rpm 4 ◦C:ssa 10 minuutin ajan. Lysaatin proteiinitasojen kvantifioinnin ja proteiinipitoisuuksien säätämisen jälkeen hajotuspuskurilla 90 µl supernatanttia sekoitettuna 10 µl:aan 10 mM L-DOPA:ta tyrosinaasin lyysipuskurissa inkuboitiin 37 ◦ C:ssa. Solujen aktiivisuus mitattiin tyrosinaasilla. 475 nm käyttämällä mikrolevylukijaa 10 minuutin välein vähintään 1 tunnin ajan. Arbutiinia (100 mg/ml) käytettiin positiivisena kontrolliaineena.

yrttisäiliöt

4.6. Immunohistokemiallinen analyysi

Parafiiniin upotetut ihmisen ihokudokset leikattiin 6-µm paksuisiksi leikkeiksi ja värjättiin Melan-A:lla (Novocastra, Newcastle, UK), Fontana-Masson-sarjoilla (ID Labs, Lontoo, ON, Kanada) ja HMB45:llä (Santa Clara) , CA, USA), valmistajan ohjeiden mukaan. Melaniiniindeksi määritettiin mittaamalla värjäytyneen alueen prosenttiosuus kudosten kokonaisalueesta käyttämällä ImageJ 1.52a -ohjelmistoa (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

4.7. Tilastollinen analyysi

Tiedot esitetään keskiarvona ± keskiarvon standardivirhe (SEM), ja tilastollinen merkitsevyys määritettiin parittomalla Studentin t-testillä käyttäen GraphPad Prism5 -ohjelmistoa (San Diego, CA, USA). Tässä tutkimuksessa p < 0.05,="" p="">< 0,01="" ja="" p="">< 0,001="" pidettiin="" tilastollisesti="" merkitsevinä="" ja="" niitä="" edustavat="" *,="" **="" ja="" ***,="">

Viitteet

1. Gillbro, JM; Olsson, MJ Ihoa vaalentavien aineiden melanogeneesi ja mekanismit – olemassa olevat ja uudet lähestymistavat. Int. J. Cosmet. Sci. 2011, 33, 210–221. [CrossRef] [PubMed]

2. Lee, YJ; Shin, HJ; Ei, TK; Choi, KH; Chang, SE Melasman ja tulehduksen jälkeisen hyperpigmentaation hoito pikosekundin 755-nm aleksandriittilaserilla aasialaispotilailla. Ann. Dermatol. 2017, 29 779–781. [CrossRef] [PubMed]

3. Lee, YJ; Park, JH; Lee, DY; Lee, JH hankki kasvojen ja kaulan kahdenvälisen dyspigmentaation: kliinisesti sopivat lähestymistavat. J. Korean Med. Sci. 2016, 31, 2042–2050. [CrossRef] [PubMed]

4. Kang, HJ; Na, JI; Lee, JH; Roh, MR; Ko, JY; Chang, SE Tulehduksen jälkeinen hyperpigmentaatio, joka liittyy auringon lentigiinien hoitoon Q-Switched 532-nm Nd: YAG-laserilla: Monikeskustutkimus.J. Ihotautilääkäri. Kohdella. 2017, 28, 447–451. [CrossRef] [PubMed]

5. Kato, H.; Araki, J.; Eto, H.; Doi, K.; Hirai, R.; Kuno, S.; Higashino, T.; Yoshimura, K. Prospektiivinen satunnaistettu kontrolloitu tutkimus suun kautta otettavasta traneksaamihaposta tulehduksen jälkeisen hyperpigmentaation estämiseksi Q-kytketyn rubiinilaserin jälkeen. Dermatol. Surg. 2011, 37, 605–610. [CrossRef] [PubMed]

6. Taylor, CR; Anderson, RR Tulenkestävän melasman ja tulehduksen jälkeisen hyperpigmentaation tehoton hoito Q-kytketyllä rubiinilaserilla. J. Dermatol. Surg. Oncol. 1994, 20, 592–597. [CrossRef]

7. Gillbro, JM; Marles, LK; Hibberts, NA; Schallreuter, KU Autokriininen katekoliamiinin biosynteesi ja beeta-adrenoseptorisignaali edistävät pigmentaatiota ihmisen epidermaalisissa melanosyyteissä. J. Investig. Dermatol.2004, 123, 346–353. [CrossRef]

8. Schallreuter, KU; Korner, C.; Pittelkow, MR; Swanson, NN; Gardner, ML Thealfa-1-adrenoseptorin signaalinsiirtojärjestelmän induktio ihmisen melanosyyteissä. Exp. Dermatol. 1996, 5, 20–23.[CrossRef]

9. Sivamani, RK; Shi, B.; Griffiths, E.; Vu, SM; Lev-Tov, HA; Dahle, S.; Chigbrow, M.; La, TD; Mashburn, C.;Peavy, TR; et ai. Akuutti haava muuttaa beeta2-adrenergistä signaalia ja katekoliamiinin synteettisiä reittejä keratinosyyteissä. J. Investig. Dermatol. 2014, 134, 2258–2266. [CrossRef]

10. Emery, AC Katekoliamiinireseptorit: Prototyypit GPCR-pohjaiseen lääkekehitykseen. Adv. Pharmacol. 2013, 68 335–356.

11. Do Vale, GT; Ceron, CS; Gonzaga, NA; Simplicio, JA; Padovan, JC Kolme beetasalpaajien sukupolvea: historia, luokkaerot ja kliininen soveltuvuus. Curr. Hypertensistä. Ilm. 2019, 15, 22–31. [PubMed]

12. McTavish, D.; Campoli-Richards, D.; Sorkin, EM Carvedilol: Katsaus sen farmakodynaamisiin ja farmakokineettisiin ominaisuuksiin ja terapeuttiseen tehokkuuteen. Drugs 1993, 45, 232-258. [CrossRef] [PubMed]

13. Hsu, CC; Lee, JY Karvediloli, ei-selektiivinen beetasalpaaja, hoitaa tehokkaasti kasvojen punoitusta ja jatkuvaa ruusufinnin punoitusta. J. Am. Acad. Dermatol. 2012, 67, 491–493. [CrossRef][PubMed]

14. Pietschke, K.; Schaller, M. Sellaisen kasvojen punoituksen ja jatkuvan erythema ofrosacean pitkäaikainen hoito karvedilolilla. J. Dermatolog. Kohdella. 2018, 29, 310–313. [CrossRef] [PubMed]

15. Chang, A.; Yeung, S.; Thakkar, A.; Huang, KM; Liu, MM; Kanassatega, RS; Parsa, C.; Orlando, R.; Jackson, EK; Andresen, BT; et ai. Ihon karsinogeneesin estäminen beetasalpaajalla karvediloli. SyöpäEd. Res. 2015, 8, 27–36. [CrossRef] [PubMed]

16. Chen, M.; Liang, S.; Shahid, A.; Andresen, BT; Huang, Y. Beetasalpaaja karvediloli esti ultraviolettisäteilyn aiheuttaman hiiren epidermaalisten solujen ja 3D-ihmisen rekonstruoidun ihon vaurion. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 798. [CrossRef] [PubMed]

17. Huang, KM; Liang, S.; Yeung, S.; Oiyemhonlan, E.; Cleveland, KH; Parsa, C.; Orlando, R.; Meyskens, FL, Jr.; Andresen, BT; Huang, Y. Paikallisesti levitetty karvediloli vaimentaa auringon ultraviolettisäteilyn aiheuttamaa ihokarsinogeneesiä. Syöpä Ed. Res. 2017, 10, 598–606. [CrossRef]

18. Brenner, M.; Kuulo, VJ Melaniinin suojaava rooli UV-vaurioita vastaan ​​ihmisen ihossa. Photochem.Photobiol. 2008, 84, 539–549.

19. Cleveland, KH; Liang, S.; Chang, A.; Huang, KM; Chen, S.; Guo, L.; Huang, Y.; Andresen, BT Carvedilolines estää EGF-välitteisen JB6 P:n ja pesäkkeiden muodostumisen adrenoseptoreista riippumattoman mekanismin kautta.PLoS ONE 2019, 14, e0217038. [CrossRef]

20. Dzong, G.; Zhongbing, M.; Qinye, F.; Zhigang, Y. Carvedilol estää pahanlaatuisten rintasolujen migraatiota ja tunkeutumista inaktivoimalla Src:n, joka sisältää cAMP/PKA- ja PKCdelta-signalointireitin. J. Cancer Res. Ther.2014, 10, 998–1003.

21. Rzepka, Z.; Bussman, E.; Beberok, A.; Wrzesniok, D. Tyrosiinista melaniiniin: Signalointireitit ja melanogeneesiä säätelevät tekijät. Postepy Hig. Med. Dosw. Verkossa 2016, 70, 695–708. [CrossRef]

22. Kim, Y.; Cho, JY; Voi SW; Kang, M.; Lee, SE; Jung, E.; Park, YS; Lee, J. Globular adiponektiini toimii melanogeenisenä signaalina ihmisen epidermaalisissa melanosyyteissä. Br. J. Dermatol. 2018, 179, 689–701. [CrossRef][PubMed]

23. Slominski, A.; Tobin, DJ; Shibahara, S.; Wortsman, J. Melaniinin pigmentaatio nisäkkäiden ihossa ja sen hormonaalinen säätely. Physiol. Rev. 2004, 84, 1155–1228. [PubMed]

24. Slominski, A.; Zmijewski, MA; Pawelek, J. L-tyrosiini ja L-dihydroksifenyylialaniini hormonin kaltaisina melanosyyttien toimintojen säätelijöinä. Pigment Cell Melanoma Res. 2012, 25, 14–27. [CrossRef] [PubMed]

25. Howe, J.; Costantino, R.; Slominski, A. L-tyrosiinin melanogeneesin induktion ja säätelyn oletetusta mekanismista. Acta Derm Venereol. 1991, 71, 150-152.

26. D'Mello, SA; Finlay, GJ; Baguley, BC; Askarian-Amiri, ME Signaling Pathways in Melanogenesis. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1144. [CrossRef]

27. Jung, JA; Kim, BJ; Kim, MS; Sinä, HJ; Yoon, ES; Dhong, ES; Park, SH; Kim, DW Botuliinitoksiinin suojaava vaikutus ultraviolettisäteilyn aiheuttamaa ihon pigmentaatiota vastaan. Plast. Reconstr. Surg. 2019, 144, 347–356.[CrossRef]

28. Jeong, YM; Voi WK; Tran, TL; Kim, WK; Sung, SH; Bae, K.; Lee, S.; Sung, JH Rh4:n aglykoni estää melaniinin synteesiä B16-melanoomasoluissa: Proteiinikinaasi A -reitin mahdollinen osallistuminen. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2013, 77, 119–125. [CrossRef]

29. Kim, YH; Kim, D.; Hong, AR; Kim, JH; Joo, H.; Kim, J.; Kim, I.; Kang, SW; Chang, SE; Song, Y. Rottlerinin terapeuttinen potentiaali ihon hyperpigmentaarisiin häiriöihin estämällä CREB-säädeltyjen transkription koaktivaattoreiden transkriptioaktiivisuutta. J. Investig. Dermatol. 2019, 139, 2359–2367.e2.[CrossRef]

30. Das, A.; Ghosh, A.; Kumar, P. Hydrokinonin aiheuttama kemiallinen leukoderma: epätavallinen ilmiö. Intialainen J. Dermatol. Venereol. Leprol. 2019, 85, 567. [CrossRef]

31. Jow, T.; Hantash, BM Hydrokinonin aiheuttama depigmentaatio: Tapausraportti ja kirjallisuuskatsaus. Dermatitis 2014, 25, e1–e5. [CrossRef]

32. Kersey, P.; Stevenson, CJ Vitiligo ja työperäinen altistuminen hydrokinonille itsevalokuvauskoneiden huollosta. Ota yhteyttä Dermatiin. 1981, 7, 285–287. [CrossRef] [PubMed]

33. Sasaki, M.; Kondo, M.; Sato, K.; Umeda, M.; Kawabata, K.; Takahashi, Y.; Suzuki, T.; Matsunaga, K.; Inoue, S. Rhododendron, depigmentaatiota indusoiva fenoliyhdiste, saa aikaan melanosyyttien sytotoksisuutta tyrosinaasista riippuvaisen mekanismin kautta. Pigment Cell Melanoma Res. 2014, 27, 754–763. [CrossRef] [PubMed]

34. Yoshikawa, M.; Sumikawa, Y.; Hida, T.; Kamiya, T.; Kase, K.; Ishii-Osai, Y.; Kato, J.; Kan, Y.; Kamiya, S.; Sato, Y.; et ai. Kliininen ja epidemiologinen analyysi 149 rhododendronin aiheuttaman leukoderman tapauksessa.J. Dermatol. 2017, 44, 582–587. [CrossRef] [PubMed]

35. Harris, JE Chemical-Induced Vitiligo. Dermatol. Clin. 2017, 35, 151–161. [CrossRef] [PubMed]

36. Li-Sha, G.; Yi-He, C.; Na-Dan, Z.; Teng, Z.; Yue-Chun, L. Karvedilolihoidon vaikutukset sydämen cAMP-responsielementtejä sitovan proteiinin ilmentymiseen ja fosforylaatioon akuutissa coxsackievirus B3--indusoidussa sydänlihastulehduksessa. BMC Cardiovasc. Häiriö. 2013, 13, 100. [CrossRef] [PubMed]

37. Zhang, F.; Steinberg, SF S49G ja R389G beeta(1)-adrenergisen reseptorin polymorfismit vaikuttavat signalointiin cAMP-PKA- ja ERK-reittien kautta. Physiol. Genom. 2013, 45, 1186–1192. [CrossRef]

38. Lee, AY; Noh, M. Epidermaalisen melanogeneesin säätely cAMP- ja/tai PKC-signalointireittien kautta: Näkemyksiä hypopigmentoituneiden aineiden kehittämiseen. Kaari. Pharm. Res. 2013, 36, 792–801. [CrossRef]

39. Garcia-Borron, JC; Abdel-Malek, Z.; Jimenez-Cervantes, C. MC1R, cAMP-reitti ja vaste auringon UV-säteilylle: Horisontin laajentaminen pigmentaation ulkopuolelle. Pigment Cell Melanoma Res. 2014, 27, 699–720.[CrossRef]

40. Lin, CB; Babiarz, L.; Liebel, F.; Roydon Price, E.; Kizoulis, M.; Gendimenico, GJ; Fisher, DE; Seiberg, M. Mikroftalmiaan liittyvän transkriptiotekijägeenin ilmentymisen modulaatio muuttaa ihon pigmentaatiota. J. Tutki. Dermatol. 2002, 119, 1330–1340. [CrossRef]

41. Kim, JH; Hong, AR; Kim, YH; Joo, H.; Kang, SW; Chang, SE; Song, Y. JNK tukahduttaa melanogeneesiä häiritsemällä CREB-säädeltyä transkription koaktivaattorin 3-riippuvaista MITF-ilmentymistä. Theranostics2020, 10, 4017–4029. [CrossRef] [PubMed]

42. Rios, M.; Habecker, B.; Sasaoka, T.; Eisenhofer, G.; Tian, ​​H.; Landis, S.; Chikaraishi, D.; Roffler-Tarlov, S. Katekoliamiinisynteesiä välittää tyrosinaasi tyrosiinihydroksylaasin puuttuessa. J. Neurosci. 1999, 19, 3519–3526. [CrossRef] [PubMed]

43. Cosentino, M.; Marino, F.; Bombelli, R.; Ferrari, M.; Lecchini, S.; Frigo, G. Endogeeninen katekoliamiinisynteesi, aineenvaihdunta, varastointi ja sisäänotto ihmisen neutrofiileissä. Life Sci. 1999, 64, 975-981. [CrossRef]

44. Marino, F.; Cosentino, M.; Bombelli, R.; Ferrari, M.; Lecchini, S.; Frigo, G. Endogeeninen katekoliamiinisynteesi, aineenvaihdunnan varastointi ja sisäänotto ihmisen ääreisveren mononukleaarisissa soluissa. Exp. Hematol.1999, 27, 489-495. [CrossRef]

45. Sorrento, D.; Santulli, G.; Del Giudice, C.; Anastasio, A.; Trimarco, B.; Iaccarino, G. Endoteelisolut kykenevät syntetisoimaan ja vapauttamaan katekoliamiineja sekä in vitro että in vivo. Hypertension 2012, 60, 129–136.[CrossRef] [PubMed]

46. ​​Cucchi, ML; Frattini, P.; Santagostino, G.; Preda, S.; Orecchia, G. Katekoliamiinit lisääntyvät ei-segmentaalisen vitiligon virtsassa erityisesti sen aktiivisen vaiheen aikana. Pigment Cell Res. 2003, 16, 111–116. [CrossRef][PubMed]

47. Salzer, BA; Schallreuter, KU Persoonallisuuden rakenteen tutkiminen potilailla, joilla on vitiligo ja mahdollinen yhteys heikentyneeseen katekoliamiinimetaboliaan. Dermatology 1995, 190, 109–115. [CrossRef][PubMed]

48. Slominski, A. Melanosyyttien neuroendokriininen aktiivisuus. Exp. Dermatol. 2009, 18, 760–763. [CrossRef]

49. Gannu, R.; Vishnu, YV; Kishan, V.; Rao, YM Karvedilolin in vitro läpäisy sian ihon läpi: Kuljettimien ja tunkeutumista edistävien aineiden vaikutus. PDA J. Pharm. Sci. Technol. 2008, 62, 256–263.

50. Kshirsagar, SJ; Bhalekar, MR; Mohapatra, SK Karvedilolilla täytetyn transdermaalisen lääkkeenantojärjestelmän kehittäminen ja arviointi: In vitro ja in vivo karakterisointitutkimus. Drug Dev. Ind. Pharm. 2012, 38, 1530–1537. [CrossRef]

51. Tanwar, YS; Chauhan, CS; Sharma, A. Carvediloli-depotlaastarien kehittäminen ja arviointi. Acta Pharm. 2007, 57, 151–159. [CrossRef] [PubMed]