Camellia Japonica -eteerinen öljy estää -MSH-indusoitua melaniinin tuotantoa ja tyrosinaasin aktiivisuutta B16F10-melanoomasoluissa

Ota yhteyttä: ali.ma@wecistanche.com

Si Young Ha, Ji Young Jung ja Jae-Kyung Yang

Eteeriset öljyt ovat aromaattisia öljyjä, jotka uutetaan luonnossa kasvatettujen tai luonnonmukaisesti kasvatettujen aromaattisten kasvien lehdistä, varresta, kuorista, terälehdistä ja juurista ja joilla on erilaisia ​​lääketieteellisiä vaikutuksia luonnollisina aineina. Camelliajaponica-siemenistä uutetulla eteerisellä öljyllä on erilaisia ​​toiminnallisia ominaisuuksia; kuitenkin sentyrosinaasiestävää aktiivisuutta ei ole tutkittu laajasti. - on tutkimus, jossa tutkitaan kemiallista koostumusta ja tyrosinaasia estävää aktiivisuuttaCamellia japonicaseed eteerinen öljy(CJS-EO). Heksametyylisyklotrisiloksaani (42,36 prosenttia) ja oktametyylisyklotetrasiloksaani (23,28 prosenttia) ovat CJS-EO:n kaksi pääkomponenttia, jotka on tunnistettu kaasukromatografia-massaspektrometrialla.The inhiboivia aktiivisuuksiaCJS-EOja positiivista kontrollia arbutiinia arvioidaan edelleen sienityrosinaasia vastaan.ThTulokset osoittavat, että CJS-EO ja arbutiini estävättyrosinaasitoiminta. Lisäksi CJS-EO estää merkittävästi melanogeneesiä -melanosyyttejä stimuloivalla hormonilla hoidetussa ryhmässä, ja merkittävä määrä melaniinia estyy. CJS-EO:n syyn selvittämiseksityrosinaasiinhiboiva vaikutus ja melaniinia vähentävä vaikutus, geneettiset ja proteiinianalyysit suoritetaan. Tulostemme perusteella päättelemme alustavasti, ettäCJS-EOvoi estää melanosyyttejä haitallisilta tekijöiltä, ​​kuten tyrosinaasille liittyvältä proteiinilta. Nämä tulokset osoittavat, että CJS-EO:lla on voimakasta tyrosinaasiaktiivisuutta ja se voi olla hyvä iho-valkaisuagentti.

NapsautaCistanche UK tyrosinaasin estäjille.

Johdanto

Ihon väriin vaikuttavat pigmentit, kuten epidermiksen melaniini, ihonahan verisuonissa oleva hemoglobiini ja ihonalaisen kudoksen karoteeni. Niistä ulkoisen ihon värin määrää melaniinipigmentin määrä ja jakautuminen [1]. Inmelaniinin synteesiin osallistuvat entsyymit tunnetaan hyvin nimellätyrosinaasi, tyrosinaasiin liittyvä proteiini-1 (TRP-1) ja dopakromitautomeraasi (DCT, TRP-2) [2]. Niistä tyrosinaasi on entsyymi, joka toimii alkureaktiossa, joka on melaniinin synteesin nopeuden määräävä vaihe, ja hapettaa tyrosinaasin DOPA-kinoniksi [3]. Siksi aineet, jotka estävättyrosinaasi,TRP-1 ja TRP-2 voivat estää melaniinin synteesiä ja siten aiheuttaa iho-valkaisutoiminto [4]. Melaniinilla on tärkeä rooli ihon suojaamisessa UV-säteiltä ja ihmisen ihon ulkoisilta haitallisilta tekijöiltä. Kuitenkin, kun sitä muodostuu liikaa ja kerääntyy iholle, se voi aiheuttaa melasmaa, pisamia, iholäiskiä jne. ja voi johtaa solukuolemaan melaniinin esiasteiden ja sairauksien, kuten ihosyövän, myrkyllisyyden vuoksi [5–7].

L-askorbiinihappo, arbutiini ja maitohappo on kehitetty edustaviksi melaniinin tuotannon estäjiksi, mutta niiden käyttö on tiukasti säänneltyä ihoärsytyksen tai turvallisuussyistä johtuen. Siksi tutkimusta tehdään aktiivisesti turvallisen ja tehokkaan luonnollisen valkaisuaineen löytämiseksi [8].

Kasvien eteeristen öljyjen tiedetään osoittavan erilaisia ​​toiminnallisia ominaisuuksia, kuten voimakasta antibakteerista vaikutusta sekä ikääntymistä estäviä ja ihoa uudistavia vaikutuksia [9, 10]. Cinnamomum cassia eteeristä öljyä [4], Polygonum odoratum eteeristä öljyä [11] ja Vitex negundo Linn lehtien eteeristä öljyä [12] on raportoitu sisältävän.tyrosinaasiestäviä aktiivisuuksia.

Camellia japonica ("tsubakin" japanilainen nimi) on suosittu puu sekä puutarhakasvina että öljymateriaalin ja kansanlääketieteen lähteenä Japanissa [13]. Koreassa C. japonica on ikivihreä puu, joka kuuluu Theaceae-heimoon ja Camellia-sukuun [14]. C. japonica -siemenöljyllä on pitkä käyttöhistoria kosmeettisena suojaaineena ihon ja hiusten terveyden varmistamiseksi sekä rauhoittavana aineena [15]. C. japonicaseed -öljyllä on raportoitu olevan erilaisia ​​biologisia aktiivisuuksia, mukaan lukien antioksidanttiaktiivisuus [16], antibakteerinen aktiivisuus [17], anti-inflammatorinen aktiivisuus [18] ja ihosuojatoiminto [19]. Huolimatta sen laajasta käytöstä, harvat tutkimukset ovat tutkineet C. japonica -siemenöljyn vaikutuksia ihoon.valkaisu-liittynyttyrosinaasitoiminta.

Siksi tässä tutkimuksessa C. japonica-siemenen eteeristä öljyä (CJS-EO) tutkittiin kaasukromatografia-massaspektrometrialla (GC-MS) jatyrosinaasiTämän eteerisen öljyn estävä vaikutus tutkittiin. Tämän estävän vaikutuksen käsittelemiseksi vaikutuksetCJS-EO-MSH-stimuloitu melanogeneesi ja tyrosinaasin esto B16F10-melanoomasoluissa arvioitiin.

2. Materiaalit ja metodit

2.1. Kasvimateriaalit.

C. japonican siemenet ostettiin maaliskuussa 2021 Seohyeon Herbal Medicine FarmingAssociationilta, Nonsanista, Etelä-Koreasta. Hee-Gon Kang, Gyeongsang National Universityn kokeellisen metsän edustaja, tunnisti kasvimateriaalit.

Cistanche on yksi perinteisestä kiinalaisesta lääketieteestä

2.2. Reagenssit.

Sienityrosinaasiostettiin T-3824:lta (Sigma–Aldrich, USA) ja hiiren B16F10 mela noma ostettiin CRL:ltä-6475 (AmericanType Culture Collection, Manassas, VA, USA). Soluviljelyyn tarvittavat väliaineet ja reagenssit ostettiin Invitrogenilta (USA), Sigmalta (USA) ja Nuncilta (USA). Western blot -analyysissä käytettiin Western blot -pakkausta ja puolikuivasiirtojärjestelmää (Bio-Rad, USA), ja tulokset vahvistettiin käyttämällä kuva-analyysijärjestelmää (Bio-Rad, USA). Vasta-aineet ostettiin Santa Cruz Biotechilta (USA). Dimetyyli sulfoksidi (DMSO) ostettiin Sigma-Aldrichilta (St. Louis, MO, USA).

2.3. Uutto ja näytteen valmistelu.

Uutto suoritettiin aiemmin julkaistulla menetelmällä pienin muutoksin [4]. Lyhyesti sanottuna C. japonica -siemenet (500 g) laitettiin astiaan ja uutettiin tislaamalla käyttäen 2000 ml vettä 4 tunnin ajan. Syntynyt höyry jäähdytettiin suljetulla jäähdytysjärjestelmällä ja syntynyt neste kerättiin astiaan. -öljy kellui kohti tislatun nesteen yläosaa, kun taas vesi laskeutui nesteen alempaan faasiin; siten,CJS-EOsaatu poistamalla nesteen ylempi faasi, joka sisälsi haluttua öljyä, ja säilytetty sitten -20 asteessa käyttöön asti. Solukokeisiin käytettiin CJS-EO:n 500 ppm:n varastoliuosta DMSO:ssa.

2.4. GC-MS-analyysi.

Haihtuvat komponentitCJS-EOanalysoitiin GC-MS:llä (Clarus 600 GC-MS, PerkinElmer, Shelton, CT, USA). Käytetty analyysipylväs oli PerkinElmer Elite-5 ms (3{{10}} mm × 0,3 mm × 0,25 μm). Liikkuvana faasina käytettiin heliumkaasua (1,0 ml/min). Uunin lämpötilaa nostettiin 40 astetta 100 asteeseen nopeudella 10 astetta/min ja pidettiin sitten 1,0 minuutin ajan. Seuraavaksi lämpötila nostettiin 230 asteeseen nopeudella 10 astetta/min ja pidettiin sitten 5 minuutin ajan. -suuttimen lämpötila asetettiin 200 asteeseen ja ilmaisimen lämpötilaksi 250 astetta. Analysoidut tulokset tunnistettiin käyttämällä NIST Mass Spectral Search Program -ohjelmaa (versio 2.0 g, National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg, MD, USA).

2.5. Soluviljely.

B16F10 hiiren melanoomasolut ostettiin Korea Cell Line Bankista. Soluviljely suoritettiin käyttämällä DMEM:ää (WELGENE, Daegu, Korea), jota oli täydennetty 10 prosentilla FBS:llä (naudan sikiön seerumi, WEL GENE, Daegu, Korea) ja 1 prosentilla penisilliini-streptomysiiniä (Gibco BRL) 37 asteen ja 5 prosentin CO2-olosuhteissa. Solumäärän lisääntymisen aiheuttaman ylitiheysilmiön ratkaisemiseksi viljellyt B16F10-solut pidettiin sopivassa määrässä trypsiiniä (Hyclone, USA) käyttäen.

2.6. Solujen elinkelpoisuusmääritys.

B16F10-melanoomasoluja kylvettiin 3 x 104/ml 6-kuoppalevylle soluviljelyä varten.CJS-EOKäsiteltiin sopivalla pitoisuudella (31,25 ppm - 500 ppm) kuoppaa kohti. -e-elatusaine poistettiin 72 tunnin kuluttua, ja 200 μL 3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) -liuosta (Promega, Madison, WI,USA) hoidettiin. MTT-reagenssi poistettiin puhtaasti 37-asteisessa CO2-inkubaattorissa 2 tunnin inkuboinnin jälkeen. Värjäytyneitä soluja varten käsiteltiin 2 ml DMSO:ta kaiken kuopissa syntyneen formatsaanin liuottamiseksi. Solujen elinkelpoisuus mitattiin absorbanssilla 540 nm:ssä ELISA-lukijalla (SpectraMax190, Molecular Devices LLC, San Jose, CA, USA).

2.7. Tyrosinaasin aktiivisuusmääritys.

Tyrosinaasiaktiivisuus arvioitiin mittaamalla L-DOPA:n hapettumisnopeus [20]. B16F10-soluja (2 × 105 solua/kuoppa) käsiteltiin -melanosyyttejä stimuloivalla hormonilla (-MSH) jaCJS-EOja viljeltiin 3 päivää. Solut kerättiin, lyysipuskuria (1 % Triton X-100, 0,1 M PMSF) lisättiin, ja sitten solut lyysattiin antamalla reagoida 4 asteessa 1 tunnin ajan. -e supernatantti kerättiin sentrifugoimalla 12,000 × g 15 minuutin ajan. Kerätyn supernatantissa olevan proteiinin kvantifioinnin jälkeen lisättiin 10 mmol/ml L-DOPA:ta. Seuraavaksi soluja inkuboitiin C02-inkubaattorissa 37 asteessa 30 minuuttia ja absorbanssi 490 nm:ssä rekisteröitiin käyttämällä absorbanssimikrolevylukijaa (SpectraMax 190, Molecular Devices LLC, San Jose, CA, USA). Saadut tiedot laskettiin käyttämällä seuraavaa kaavaa: tyrosinaasiaktiivisuus (prosenttia) � (näytteen OD 490 / kontrollin OD490) × 100.

2.8. Melaniinipitoisuuden määritys.

B16F10-soluja kylvettiin kuusikuoppalevylle (2 x 105 solua/kuoppa) 12 tunnin ajan sen jälkeen, kun solujen viljelyalusta oli uusittu eri konsentraatioilla CJS-EO:ta ja -MSH:ta 48 tunnin ajan ja pestiin PBS:llä kahdesti [21]. B16F10-soluja käsiteltiin -MSH:lla jaCJS-EOyhdessä, viljeltiin 3 päivää, ja solut kerättiin ja pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS). Sen jälkeen sitä käsiteltiin 1 N NaOH:lla, joka sisälsi 10 % DMSO:ta, ja sen annettiin reagoida 80 asteessa 1 tunnin ajan. Melaninpitoisuusanalyysiä varten absorbanssi mitattiin aallonpituudella 475 nmusii absorbanssimikrolevylukijalla (SpectraMax 190, Molecular Devices LLC, San Jose, CA, USA). - CJS-EO:lla käsiteltyjen solujen prosenttiarvo laskettiin suhteessa negatiiviseen kontrolliin. Yksityiskohtaisesti BCA Protein Assay Kitiä (Thermo Fisher Scientific, Waltham, US) käytettiin määrittämään kunkin näytteen proteiinikonsentraatio. -emaniinipitoisuus normalisoitiin solun proteiinipitoisuuteen (absorbanssi melaniini/ug proteiinia).

2.9. Geenien tutkiminen.

B16F10-melanoomasolut ympättiin 100 mm:n maljalla tiheydellä 1 x 106 solua DMEM:ssä (GIBCO, USA), jota oli täydennetty 10 prosentilla naudan seerumilla ja 1 prosentilla antibiootteja; myöhemmin niitä inkuboitiin 5 prosentin CO2:ssa 37 asteessa. Kun olet vaihtanut tuoreeseen 10 prosentin DMEMmediumiin,CJS-EOlisättiin viljelylevylle ja viljeltiin 3 päivää, ja 1 prosentti Amisoftia pinta-aktiivisena aineena lisättiin määrä, joka vastasi 1/1,000 elatusaineen tilavuudesta. 3 päivän kuluttua 1 ml TRIzolia (Invitrogen, USA) ) lisättiin soluihin mRNA-ekspressiotason tutkimiseksivalkaisu-sukuisia geenejä, ja RNA eristettiin Invitrogenin RNA-eristysmenetelmällä. Sen jälkeen kun RNA:n määrä oli kvantifioitu aallonpituudella 260 nm käyttämällä ultraviolettidetektoria, suoritettiin käänteistranskriptiopolymeraasiketjureaktio (RT-PCR). RT-PCR:ssä käytettiin all-in-one RT-PCR-sarjaa (Super Bio, Korea), koe suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaan ja alukkeet ja reaktio-olosuhteet olivat seuraavat: aktiinin sekvenssi oli 5'- GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC-3';antisense, 5'-GGC CAT CTC TTG CTC GAA GTC-3';käänteinen transkriptio 50 asteessa 30 minuutin ajan; käänteistranskriptaasi inaktivoitu 96 asteessa 3 minuutin ajan, 94 asteessa 30 s ja 62 asteessa 1 minuutin ajan, mitä seurasi 25 sykliä 72 asteessa 1 minuutin ajan. Järjestystyrosinaasioli 5'-GGC CAG CTT TCA GGC AGA GGT 3'; antisense, 5'-TGG TGC TTC ATG GGC AAA ATC-3';denaturoitu 90 asteessa 30 s; käänteinen transkriptio 60 asteessa 30 minuutin ajan; käänteistranskriptaasi inaktivoitu 94 asteessa 1 minuutin ajan. Sen jälkeen suoritettiin PCR 30 syklin ajan 94 asteessa 30 s, 56 asteessa 30 s ja 72 asteessa 1 minuutin ajan. -e tyrosinaasiin liittyvän proteiinin 1 (TRP-1) sekvenssi oli 5'-GCT GCA GGAGCC TTC TTT CTC-3'; antisense, 5'-AAG ACG CTG CACTGC TGG TCT-3'; denaturoitu 90 asteessa 30 s; käänteistranskriptio 60 asteessa 30 minuutin ajan; käänteistranskriptaasi inaktivoitu 94 asteessa 1 minuutin ajan. Sen jälkeen suoritettiin PCR 30 syklin ajan 94 asteessa 30 s, 56 asteessa 30 s ja 72 asteessa 1 minuutin ajan. -e sekvenssityrosinaasi-sukuinen proteiini 2 oli5'-TGA CCG TGA GCA ATG GCC-3'; antisense, 5'-CGGTTG TGA CCA ATG GGT GCC-3'; käänteinen transkriptio 50 asteessa 30 minuuttia; käänteistranskriptaasin inaktivointi 96 asteessa 3 minuutin ajan, 94 asteessa 1 minuutin ajan ja 60 asteessa 1 minuutin ajan. Sen jälkeen suoritettiin 72 PCR-reaktiota 25 syklissä 1 minuutin ajan.

2.10. Proteiinin ilmentymisen tutkiminen.

Hiiren B16F10-melanoomasolut ympättiin 100 mm:n maljalla tiheydellä 5 x 105 solua DMEM:ssä, jota oli täydennetty 10 prosentilla FBS:llä ja 1 prosentilla antibiootteja, ja sitten viljeltiin 5 prosentissa C02:ssa 37 asteessa 1 vuorokausi. Myöhemmin ne vaihdettiin uuteen välineeseen jaCJS-EOkäsiteltiin eri pitoisuuksilla ja viljeltiin 3 päivää. Amisoftin 1-prosenttinen vesiliuos pinta-aktiivisena aineena lisättiin tilavuudessa, joka vastasi 1/1 000 väliaineen tilavuudesta. -e viljellyt solut pestiin PBS:llä ja siirrettiin 1,5 ml:n mikroputkeen ja sitten solunhajotuspuskuriin (40 mM Tris-Cl [pH 7,4], 10 mM EDTA, 120 mM NaCl, 0,1 % NP-40, 1 mM PMSF ja proteaasi-inhibiittoricocktail). Kun solut oli tuhottu lisäämällä, suoritettiin sentrifugointi 15, 000 rpm 4 asteessa 10 minuutin ajan, ja supernatantti otettiin talteen proteiinien erottamiseksi. Eristetyt proteiinit kvantifioitiin käyttämällä Sigma'sBCA-menetelmää ja suoritettiin SDS-PAGE. Kun SDS-PAGE-geeli oli siirretty PVDF-kalvolle, proteiini leimattiin käyttämällä sekundaarista vasta-ainetta, joka oli konjugoitu primaarisen vasta-aineen ja peroksidaasin kanssa, ja sitten valotettiin röntgenfilmille käyttämällä Western blot -detektiopakkausta (Intron, Korea). Sen jälkeen ekspressiotasot analysoitiin.

3. Tulokset

3.1. CJS-EO:n kemiallinen koostumus.

CJS-EO saatiin 18 painoprosentin saannolla. -CJS-EO:n kemiallinen koostumus analysoitiin käyttäen GC-MS:ää (taulukko 1). -e-piikit erotettiin GC:ssä ja MS:n avulla tunnistettiin 17 yhdistettä, jotka muodostivat 90 prosenttia piikin kokonaispinta-alasta (taulukko 1). - tärkeimmät kemialliset komponentitCJS-EOolivat heksametyylisyklotrisiloksaani (42,36 prosenttia), oktametyylisyklotetrasiloksaani (23,28 prosenttia), dekametyylisyklopentasiloksaani (5,81 prosenttia), heksaanidihappo (5,56 prosenttia) ja vanilliini (2,96 prosenttia). Aikaisemmissa tutkimuksissa GC-MS-analyysi havaitsi heksametyylisyklotrisiloksaania Bauhinia acuminataLinnin lehti- ja varsiuutteista [22]. Moringa oleiferan haihtuvat komponentit koostuivat pääasiassa estereistä, hapoista, aldehydeistä ja hiilivedyistä, ja hiilivedyt ovat pääasiassa heksametyylisyklotrisiloksaania [23]. Vastaavasti tutkimuksessamme heksametyylisyklotrisiloksaani vahvistettiin CJS-EO:n pääkemialliseksi komponentiksi. Yksi CJS-EO:n tärkeimmistä kemiallisista aineosista, vanilliini, havaittiin Eugenia caryophyllatan ja Ocimum basilicumin [24], Hyssopus officinalis L. (Lamiaceae) eteerisen öljyn [25] ja Calea clematidea eteerisen öljyn [26] eteerisestä öljystä. Aiemmissa tutkimuksissa vanilliinin estävä vaikutus monofenolaasin ja difenolaasin aktiivisuuteentyrosinaasikerrottiin aiemmin [27]. Mielenkiintoista on, että alhaisen molekyylipainon omaavia syklisiä haihtuvia metyylisiloksaaniyhdisteitä, mukaan lukien heksametyylisyklotrisiloksaani, on käytetty useissa kosmetiikka- ja henkilökohtaisen hygienian tuotteissa ja monissa muissa kulutustuotteissa [28]. Tulevaisuudessa melaniinin tuotantoa ja tyrosinaasiaktiivisuutta estävä yhdiste on tarkoitus uuttaa ja sitä voidaan käyttää luonnonkosmetiikassa tai lääketieteessä.

3.2. CJS-EO:n indusoimien melanoomasolujen solujen elinkelpoisuus.

Tuloksemme osoittivat, että hiiren melanooma B16F10 -soluja käsiteltiin pitoisuudella 31,25-500 ppmCJS-EO24 tunnin ajan ei aiheuttanut muutoksia solujen elinkelpoisuuteen. Konsentraatiolla 31,25 - 500 ppm solujen elinkelpoisuus oli 90 - 100 prosenttia, mikä osoitti alhaista sytotoksisuutta (kuva 1). - Siksi kaikki pitoisuudet (31,25 - 500 ppm) olivat sopivia CJS-EO:n vaikutusten arvioimiseen edelleen.tyrosinaasiaktiivisuus ja melaniinin synteesi B16F10-soluissa.

3.3. CJS-EO:n solunsisäisen tyrosinaasiaktiivisuuden esto.

VaikutusCJS-EOL-DOPA:n katalysoiman bytyrosinaasin hapettumiseen sekä arbutiinin, hyvin tunnetuntyrosinaasiinhibiittoria, tutkittiin. Kuten kuviossa 2 esitetään, CJS-EO andarbutiinilla oli voimakkaita estäviä vaikutuksia L-DOPA-oksidaasiaktiivisuuteen annosriippuvaisella tavalla. Tulokset osoittavat, että CJS-EO ja arbutiini osoittivat samanlaisia ​​tyrosinaasia estäviä aktiivisuuksia. Tilastollisen analyysin perusteella arbutiinilla oli merkittävästi suurempi tyrosinaasia estävä aktiivisuus kuin CJS-EO:lla pitoisuuksilla 125 ja 500 ppm. Kuitenkin pitoisuuksilla 31,25, 32,50 ja 250 ppm osoitettiin samankaltaisia ​​estäviä vaikutuksia (ei merkitseviä) tyrosinaasille verrattuna CJS-EO:n tyrosinaasia estävään aktiivisuuteen hyvin tunnettuun tyrosinaasin estäjä arbutiiniin.

3.4. CJS-EO:n vaikutus melaniinipitoisuuteen B16F10-soluissa.

Sen varmistamiseksi, vaikuttiko CJS-EO melaniinin tuotannon estämiseen, ero melaniinin erittymisessä kullakin CJS-EO-pitoisuudella hoidon jälkeen analysoitiin ympäristössä, joka edisti melaniinin tuotantoa -MSH-stimulaatiolla.CJS-EOkäsiteltiin pitoisuuksilla 31,25, 62,5, 125, 250 ja 500 ppm, samalla tavalla kuintyrosinaasitoiminta. CJS-EO esti merkitsevästi melanogeneesiä -MSH-käsitellyssä ryhmässä, ja merkittävä määrä melaniinia suppressoitui (kuvio 3(b)).-is oli samanlainen kuin havainto positiivisessa kontrollissa, arbutiini (kuvio 3(a)). Erityisesti hoidetun ryhmän alimmalla pitoisuudella, 32,25 ppm, melaniinipitoisuus laski merkittävästi verrattuna käsittelemättömään ryhmään (0 ppm). Siksi pääteltiin, että CJS EO esti tehokkaasti melaniniini B16F10 -solujen synteesiä tai erittymistä. 31,25, 62,5, 125, 250 ja 500 ppmCJS-EO:lla käsitellyissä ryhmissä melaniinipitoisuus laski 1,1-, 1,5-, 2,6-, 2,7- ja 4,3-kertaisesti verrattuna käsittelemättömään ryhmään, mikä osoittaa, että melaniinin eritys on merkittävää. vaikutus. -Sytotoksisuustesti, tyrosinaasin estotesti ja melaniinipitoisuustestitulokset osoittavat, että CJS-EO on erittäin arvokas luonnonmateriaalinavalkaisukosmetiikka.

3.5. Geneettinen tutkimus.

Geenin määrittämiseksiCJS-EOjoka estää melaniinin biosynteesiä vaikuttamalla melaniinin biosynteesireittiin osallistuvien geenien ilmentymiseen, suoritettiin koe RT-PCR-menetelmällä ja tulokset on esitetty kuvassa 4. -MSH:ta käytettiin negatiivisena kontrollina ja CJS-EO osoitti estäviä vaikutuksia tyrosinaasin, TRP-1 ja TRP-2 ilmentyminen kaikissa pitoisuuksissa. Erityisesti CJS-EO esti tyrosinaasin ilmentymistä yli 50 prosentilla pitoisuudella 125 ppm tai enemmän. Löysimme, että estoteho ontyrosinaasi, TRP-1 ja TRP-2 -ilmentyminen väheni, kun CJS EO:n pitoisuus nousi. Tämän kokeen tulokset viittaavat siihen, että CJS-EO:n teemamelanogeneesiä estävä vaikutus vaikutti tyrosinaasin, TRP-1 ja TRP-2 ilmentymisen estämiseen.

3.6. Proteiinin ilmentymisen tutkiminen.

CJS-EO:n vaikutus melaniinin biosynteesiin osallistuvien proteiinien ilmentymiseen varmistettiin Western blot -menetelmällä, ja tulokset on esitetty kuvassa 5. Kun CJS-EO:ta verrattiin -MSH-käsiteltyyn ryhmään, joka oli negatiivinen kontrolliryhmä, se oli vahvisti senCJS-EOosoitti estävää vaikutusta; Itse asiassa CJS-EO:lla oli merkittävin tyrosinaasia ja TRP:tä estävä vaikutus-2. -e eston aste oli 46,6 prosenttia ja 40,7 prosenttia 500 ppm:llä tyrosinaasia ja TRP-2, vastaavasti, verrattuna -MSH-käsiteltyyn ryhmään. Vaikka TRP-1osoitti vähiten estävää vaikutusta, se osoitti merkittävää laskua verrattuna -MSH-käsiteltyyn ryhmään. Siksi proteiinianalyysi osoitti saman suuntauksen kuin geneanalyysi, ja vahvistettiin, että CJS-EO stimuloityrosinaasi, TRP-1 ja TRP-2 melaniinin vähentämiseksi.

4. Keskustelu

Tyrosinaasion entsyymi, joka osallistuu melaniinin tuotantoon entsymaattisen oksidatiivisen reitin kautta, joka määrittää ihon, hiusten ja silmien värin sekä tiettyjen elintarvikkeiden ruskehtumisen [29]. Kemiallisia aineita, jotka osoittavat antityrosinaasiaktiivisuutta, on käytetty kliinisessä lääketieteessä melaniinin hyperpigmentaatioon liittyvien dermatologisten sairauksien hoidossa [30]. Melaniinin tuotanto voi myötävaikuttaa joihinkin vain pahanlaatuisen syövän histopatologisiin piirteisiin [31]. Siksi antityrosinaasiaineet voivat helpottaa ihosyövän hoitoa. Viime vuosina luonnontuotteiden käyttö kemiallisten tai synteettisten yhdisteiden sijaan on herättänyt yhä enemmän kiinnostusta, koska ne ovat taloudellisempia, ympäristöystävällisempiä ja turvallisempia [32]. Lisäksi vihreän teknologian ja edullisien raaka-aineiden tutkimus ja kehittäminen on tärkeää teollisuudelle sekä kasviresurssien käytön parantamiseen. Viime aikoina on raportoitu tiettyjen kasvien antityrosinaasiaktiivisuutta [33]. Tietoa luonnonkasvien eteerisistä öljyistä on kuitenkin vähän. Siksi sellaisten kasvien eteeristen öljyjen tunnistaminen, joilla on korkea antityrosinaasiaktiivisuus, on herättänyt merkittävää kiinnostusta. -Pigmentaation etiologiaa ei tunneta hyvin. Melaniinin biosynteesiä katalysoivat melanosyyttispesifiset entsyymit, kuten TRP-1 ja TRP-2 [34].Tyrosinaasion elintärkeä melanosyyttien melaniinibiosynteesille, ja se on tunnettu jo vuosikymmeniä [34]. Siksi tyrosinaasi on tärkeä indeksi pigmentaation hoidossa. Tutkimuksessamme CJS-EO vähensi melaniinisynteesiä ja vaikutti antityrosinaasiaktiivisuuteen; siksi päätimme, että CJS-EO:n antimelanogeneesi saattaa liittyä muihin entsyymeihin (TRP-1 ja TRP-2). Haihtuvilla aineilla on raportoitu olevan korkea antioksidanttiaktiivisuus [35]. Haihtuvina aineina CJS-EO:lle on ominaista pistävä haju. Kasvit syntetisoivat sitä sekundäärisinä aineenvaihduntaliitteinä, ja sitä on käytetty laajalti sen bakteereja tappavan, virusidisen, fungisidisen, syöpää ehkäisevän, antioksidantin ja diabetesta ehkäisevän vaikutuksensa vuoksi [36]. -Tässä tutkimuksessa tutkittu CJS-EO koostui pääasiassa heksametyylisyklotrisiloksaanista, joka muodosti 42,36 prosenttia koko kemiallisesta sisällöstä. Heksametyylisyklotrisiloksaania sisältävällä Toxicodendron vernicifluumilla on osoitettu olevan erilaisia ​​biologisia ja farmakologisia vaikutuksia, mukaan lukien sentraalisia, antimikrobisia vaikutuksia [3]. Tutkimuksessamme korkeat CJS-EO-pitoisuudet osoittivat vain vähäisiä sytotoksisia vaikutuksia melanosyyteihin. Siksi havaittiin CJS-EO:n estävä vaikutus -MSH:n aiheuttamaan B16F10-solujen lisääntymiseen. -erulokset osoittivat, että esikäsittely CJS-EO:lla vähensi -MSH:n indusoimaa solujen lisääntymistä annoksesta riippuvaisella tavalla (kuvio 3), ja nämä tulokset olivat samanlaisia ​​positiivisena kontrollina käytetyn puhtaan butiinin kanssa. Useimmissa perinteisessä lääketieteessä käytetyissä luonnollisissa eteerisissä öljyissä käytetään monimutkaisia ​​yhdisteitä sisältäviä uutteita puhtaiden yhdisteiden sijaan. Nämä luonnolliset eteeriset öljyt eivät yleensä sisällä haihtuvia yhdisteitä, joilla on erittäin spesifinen bioaktiivisuus, vaan haihtuvuusyhdisteitä, joilla on laajempi vuorovaikutus [38]. Siksi CJS-EO:lla, joka sisältää monia komponentteja, on vaikea saada korkeampaa melanogeneesivaikutusta kuin puhtaalla arbutiinilla. Jatkossa on tarpeen erottaa sen sisältämät haihtuvat komponentitCJS-EOja tutkia antimelanogeneesivaikutusta erotettuun yksittäiseen komponenttiin. Tulostemme perusteella päättelemme, että CJS-EO voi estää melanosyyttejä haitallisilta tekijöiltä, ​​kuten TRP-1 (kuvat 4 ja 5).Thsiksi oletimme, että heksametyylisyklotrisiloksaani oli tärkein biologisesti aktiivinen yhdiste CJS-EO:ssa. Olemassa olevat tutkimukset koskienvalkaisuCJS-EO:n omaisuus on riittämätön; siksi sitä voidaan käyttää perustietona tulevaisuuden tutkimuksissa, jotka koskevat valkaisevia tehoa osoittavia pääainesosia.

5. Johtopäätökset

Tietojemme mukaan tämä on ensimmäinen tutkimus, joka raportoi CJS-EO:n tehosta melaniinin tuotannon estämisessä B16F10-melanoomasoluissa. Havaintomme osoittivat, että CJS-EO esti -MSH:n aiheuttamaa melanogeneesiä läpityrosinaasimelaniinin biosynteesiin osallistuvien proteiinien inaktivointi ja samanaikainen suppressio B16F10-melanoomasoluissa.CJS-EOtiedetään olevan turvallinen, ja vahvistimme, että se ei ole sytotoksinen tässä tutkimuksessa.ThTästä syystä CJS-EO:ta voidaan mahdollisesti käyttää tehokkaana iho-valkaisuAgentti täydentävän ja vaihtoehtoisen lääketieteen pohjautuvan aromaterapian tulevaan kehittämiseen.