Biomphalaria Alexandrinan biokemialliset ja histopatologiset vasteet RIPEXiin (kasvin kasvun säätelijä)Ⅰ

Abstrakti

Tausta

Kasvien kasvunsäätelyaineita käytetään laajasti maataloudessa kasvien kasvun ja kypsymisen lisäämiseen, mutta ne vaarantavat vesiekosysteemin. Nykyisessä tutkimuksessa arvioitiin subletaalisen altistuksen vaikutusta RIPEX 48 prosentin EY-pitoisuuksille (8 ja 16 µL/L) oksidatiivisiin stressiparametreihin, sukupuolihormoneihin, immuunipotentiaalisiin entsyymeihin, hemosyyttien eriarvoihin sekä ruuansulatusrauhasten ja munasolujen histopatologiaan. Biomphalaria alexandrina -etanat.

Klikkaa nähdäksesi herba testosteronille

Tulokset

RIPEX-altistus aiheutti yleisen kasvun superoksididismutaasin ja glutationi-S-transferaasin aktiivisuuksissa B. Alexandrinassa. Äärimmäinen RIPEX-altistus kuitenkin estää SOD-aktiivisuutta etanoissa. Malondialdehydiaktiivisuus osoitti molemmille pitoisuuksille altistetun B. Alexandrinan lisääntymistä kaikkien altistusjaksojen jälkeen. RIPEX aiheutti myös merkittävän testosteronin nousun etanoissa, jotka altistettiin 16 µL/L:lle, mutta se kuitenkin alensi hormonitasoja etanoissa, jotka altistettiin 8 µl/l:lle 7 päivänä. Mitä tulee estradioliin, havaittiin merkitsevä nousu 3 päivän altistuksen jälkeen 16 µl/l:lle ja 7 päivän altistuksen jälkeen 8 µl/l:lle. RIPEX-altistus lisäsi myös myeloperoksidaasi- ja adenosiinideaminaasientsyymien aktiivisuutta etanoiden ruoansulatusrauhasissa. Se lisäsi paljastuneiden etanoiden hemosyyttien kokonaismäärää sekä granulosyyttien määrää. Etanan ruuansulatusrauhasissa ja munasoluissa havaittiin patologisia muutoksia 7 päivän RIPEX-altistuksen jälkeen.

Johtopäätökset

Nämä havainnot viittaavat siihen, että RIPEX on myrkyllinen B. Alexandrinalle ja että tätä etanaa voidaan käyttää bioindikaattorina ympäristön saastumiselle kasvien kasvunsäätelyaineilla.

Avainsanat

Biomphalaria alexandrina, RIPEX, Testosteroni, Estradioli, Myeloperoksidaasi, Adenosiinideaminaasi, Histopatologia

1 Tausta

Pintavesien maatalouskemiallinen saastuminen on kasvava globaali ympäristöongelma, erityisesti alueilla, joilla maatalous laajenee ja tehostuu nopeasti. Erilaisia ​​synteettisiä kemikaaleja, kuten torjunta-aineita tai lannoitteita, käytetään muokkaamaan sadon määrää ja laatua asiakkaiden tarpeiden tyydyttämiseksi [7, 40]. Kasvien kasvua edistävät aineet ovat yleisiä maatalouskemikaaleja monissa maissa [18].

Kun näitä kemikaaleja hengitetään suoraan sisään tai nautitaan saastuneiden vihannesten kanssa, ne vahingoittavat ihmisten terveyttä [39]. Organofosforitorjunta-aine, etefoni (2-kloorietyylifosfonihappo) on eteeniä vapauttava synteettinen kemikaali, jota käytetään yleisesti kasvien kasvun säätelijänä (PGR) edistämään siemenien muodostumista, hedelmien kypsymistä ja muita fysiologisia reaktioita. Se on hyväksytty käytettäväksi erilaisissa ulkona kasvatetuissa elintarvikkeissa, rehuissa, non-food-kasveissa, kasvihuonekasveissa ja koristekasveissa [3, 50]. Etefonin toksisuuden laboratorioarviointi osoitti, että etefoni aiheutti Daphnia magnan toisen antennin, sensoristen harjasten, hännän selkärangan ja rostrumin morfometrisiä epämuodostumia, jotka johtivat toiminnan menettämiseen ja kuolemaan [54].

Abd-El Azeem [1] havaitsi etanan Deroceras reticulatumin ruoansulatusrauhassolujen kasvunopeuden, DNA-vaurioiden ja apoptoottisten vaikutusten vähenemisen etefonille altistuksen jälkeen. Monet kirjoittajat hyväksyivät Etefonin myrkyllisyyden rotille ja linnuille [2, 17, 55]. Lisäksi etefonille altistuminen aiheutti genotoksisuutta, oksidatiivista stressiä ja lisääntymistoksisuutta hiirillä [16]. Teratogeenisuus ja sukurauhasten toimintahäiriöt hiirillä on myös yhdistetty etefonialtistukseen [2, 16]. Etefonin on myös osoitettu olevan immunotoksinen, sillä on mutageenisia vaikutuksia [26], se lisää oksidatiivista stressiä ja alentaa deoksiribonukleiini- ja ribonukleiinihappopitoisuuksia [4].

Etefoni vesistöissä voi vaarantaa vesieläimistön; sen vaikutuksista vesieliöihin on kuitenkin vähän tietoa. Useita vesilajeja on käytetty kasvien kasvuhormonien havaitsemiseen vesijärjestelmissä. Joitakin näistä organismeista on kuitenkin haastavaa käsitellä ja ylläpitää laboratoriossa, mikä tekee niiden käyttämisestä ekotoksikologisissa arvioinneissa vaikeampaa [54]. Vesinilviäiset, mukaan lukien etanat, ovat viime aikoina saaneet huomiota testiorganismeina, koska on tarpeen kehittää selkärangattomien malleja vesistöjen saasteiden ympäristön seurantaan [21, 45]. Etanat ovat vesieliöissä runsain nilviäisten ryhmä. Etanat ovat vähemmän hyväksikäyttöinen vaihtoehto korkeammille selkärankaisille bioindikaattoreina, koska niitä voidaan käyttää erilaisissa kokeissa ilman eettistä hyväksyntää, ja niiden hankinta ja ylläpito ovat edullisia [13].

Tässä suhteessa Biomphalaria alexandrina -etanaa on käytetty laajalti torjunta-aineiden aiheuttaman makean veden saastumisen indikaattoriorganismina [29, 30]. Bioindikaattoripotentiaalinsa lisäksi tämä etana toimii väliisäntänä Schistosoma mansonin leviämiselle [35]. Siksi ympäristön maatalouskemialliset pitoisuudet voivat vaikuttaa skitosomiaasin leviämiseen suorien ja välillisten vaikutusten kautta väliisäntään ja loisten tiheyteen [27]. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia subletaalisen altistuksen vaikutusta kasvien kasvunsäätelyaineelle, RIPEX 48 % EC:lle (etefonin kauppanimi, 2-kloorietyylifosfonihappo) B. alexandrina -bakteerin erilaisiin biokemiallisiin, immunologisiin ja histologisiin näkökohtiin. etanat bioindikaattoriorganismina.

2 menetelmät

2.1 Testiorganismi

Biomphalaria alexandrina -etanat kerättiin Manzalah-järvestä, joka sijaitsee El-Matareyassa, Dakahlia Governoratessa, Egyptissä (31 astetta 11′ N 32 astetta 2′ I) ja pidettiin hyvin ilmastetussa vesijohtovedessä 20 asteen vakiolämpötilassa. Heille syötettiin tuoreita salaatinlehtiä päivittäin. Neljän viikon laboratorio-olosuhteissa suoritetun ylläpidon jälkeen seuraavissa kokeissa käytettiin terveitä kypsiä etanoita (kuoren halkaisija 10–12 mm).

2.2 Kokeellinen materiaali ja altistusolosuhteet

Kasvien kasvunsäädin, RIPEX (liuosmuoto, joka sisältää 48 prosenttia etefonia [2- kloorietyylifosfonihappoa (C2H6ClO3P)] ja 52 prosenttia inerttejä ainesosia) ostettiin Chema Industriesilta (New Nubaria kaupunki, Behira, Egypti; rekisterilisenssinro . 1840). Valmistettiin sarja konsentraatioita. Puiden jäljennökset, joissa kussakin oli kymmenen etanaa, paljastettiin. 1-päivän altistuksen jälkeen kuolleet etanat laskettiin ja poistettiin ja LC50 ja LC90 laskettiin yhteiskuntatieteiden tilastoohjelmistolla (SPSS; IBM Corp. Armonk, NY, USA).

2.3 Kokeellinen suunnittelu

Käytettiin kahta subletaalista pitoisuutta, jotka edustivat LC10- ja LC20-arvoja (8 ja 16 µL/L). 90 etanat jaettiin kolmeen ryhmään, joissa kussakin ryhmässä oli kolme toistoa (10 etanat/replikaatti): kontrolliryhmä, 8 µl/l altistettu ryhmä ja 16 µl/l altistettu ryhmä. Ruoansulatusrauhasessa arvioitiin 1-, 3- ja 7-päivän välein oksidatiivisen stressin biomarkkerit ja immuunipotentiaaliset entsyymit. steroidihormonit arvioitiin Ovotestiksessä. Hemosyyttien erotus sekä ruoansulatusrauhasten ja munasolujen histologia arvioitiin. Biokemiallisia tutkimuksia varten 0,5 g kudosta (ruoansulatusrauhaset tai munasolut) kustakin ryhmästä homogenisoitiin 0,5 ml:ssa fosfaattipuskuria (pH 6,5) käyttäen lasihomogenisaattoria ja sentrifugoitiin 10, 000 × g, 4 astetta 10 minuuttia. . Tuloksena saatuja supernatantteja käytettiin seuraaviin määrityksiin.

2.4 Oksidatiivisen stressin merkkiaineiden määritys

2.4.1 Superoksididismutaasi (SOD, EC 1.15.1.1)

SOD-aktiivisuus määritettiin käyttämällä EnzyChrom™ Superoxide Dismutase Assay -määrityssarjaa (luettelonumero: ESOD{{0}}; BioAssay Systems, Hayward, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kudoshomogenaattia käyttämällä kylmää lyysipuskuria (50 mM kaliumfosfaattia, 0,1 mM EDTA:ta ja 0,5 % Triton X-100) sentrifugoitiin 12, 000g 5 minuutin ajan 4 asteessa. , ja supernatantti kerättiin SOD:n määrittämistä varten [43]. SOD:n aktiivisuus mitattiin optisella tiheydellä (OD) 440 nm:ssä.

2.4.2 Glutationi-S-transferaasi (GST, EC 2.5.1.18)

Tis-entsyymi katalysoi GSH-konjugaatiota {{0}}kloori-2,4-dinitrobentseenin (CDNB) kanssa. Se mitataan spektrofotometrisesti 340 nm:ssä. Reaktioseos sisältää kaliumfosfaattipuskuria 0,1 M, pH 6,5, GSH:ta liuotettuna kaliumfosfaattipuskuriin (140 mg/100 ml) ja CDNB:tä 4 mg/ml etyylialkoholissa. Yksi yksikkö entsyymiaktiivisuutta määritellään entsyymimääräksi, joka katalysoi 1 μmoolin S-konjugaatin muodostumista minuutissa [11].

2.4.3 Malondialdehydi (MDA)

Malondialdehydi kokonaisissa homogenaateissa määritettiin tiobarbituurihapporeaktiivisina aineina (TBARS) Ohkawan et ai. [37]. Reaktioseos sisälsi 0,1 ml kudoshomogenaattia, yhtä suuri määrä natriumdodekyylisulfaattiliuosta, 0,75 ml etikkahappoa, 0,75 ml tiobarbituurihappoa, ja 0,3 ml tislattua vettä. Nämä komponentit sekoitettiin pyörteessä ja inkuboitiin kiehuvassa vesihauteessa 1 tunti ja jäähdytettiin sitten huoneenlämpötilaan. Kymmenen 0,5 ml tislattua vettä ja 2,5 ml n-butanolia lisättiin kuhunkin putkeen ja sekoitettiin voimakkaasti pyörteen kanssa ja pyöritettiin sitten sentrifugissa 2 500 x g:ssä 10 minuutin ajan. Absorbanssi luettiin aallonpituudella 532 nm.

2.5 Hormonien määritys

2.5.1 Testosteroni

Testosteroni määritettiin käyttämällä testosteroni Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) -sarjaa (luettelonumero: ADI-900-065; Enzo Life Sciences, NY, USA). Testosteroni on tärkein androgeeni, joka vaikuttaa sekä primaariseen että sekundaariseen seksuaaliseen kehitykseen. seksihalu. 100 µl standardilaimennusainetta (määrityspuskuri 3 tai kudosviljelyelatusaine) pipetoitiin epäspesifiseen sitoutumiseen ja maksimi sitoutumiseen (0 pg/ml standardi) kuoppiin. Sen jälkeen 100 µl standardia #1 - #5 asianmukaisiin kuoppiin. Näyte (100 ui) pipetoitiin sopiviin kuoppiin ja 50 ui määrityspuskuria 3 epäspesifisiin sitoutumiskuoppiin. Myös 50 ui keltaista vasta-ainetta lisättiin kuhunkin kuoppaan, paitsi nollakoe-, kokonaisaktiivisuus- ja epäspesifisen sitoutumiskuopan. Levyn inkubointi huoneenlämmössä levyravistelijassa 1 tunti nopeudella 500 rpm. Sen jälkeen kuhunkin kuoppaan lisättiin 50 ui sinistä konjugaattia lukuun ottamatta kokonaisaktiivisuutta ja nollakuoppia. Kun kuopat oli tyhjennetty sisällöstä, pesu suoritettiin lisäämällä jokaiseen kuoppaan 400 ui pesuliuosta 3 kertaa. Sinistä konjugaattia (5 ui) lisättiin kokonaisaktiivisuuskuoppiin ja 200 ui p-nitrofenyylifosfaattiliuosta lisättiin jokaiseen kuoppaan ja inkuboitiin 37 asteessa 1 tunti ravistamatta. Levyn lukeminen aallonpituudella 405 nm suoritettiin sen jälkeen, kun jokaiseen kuoppaan oli lisätty 50 µl pysäytysliuosta [12, 48].

2.5.2 Estradioli

Estradioli määritettiin käyttämällä estradioli ELIZA -sarjaa (luettelonumero: 501890; Cayman Chemical, Michigan, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tämän reaktion periaate perustuu siihen, että estradioliasetyylikoliiniesteraasin (AChE) merkkiaineen pitoisuus on vakio, mutta natiivi estradiolipitoisuus vaihtelee, joten estradioliasetyylikoliiniesteraasin (AChE) merkkiaineen määrä, joka sitoutuu estradioliantiseerumiin, on kääntäen verrannollinen luonnollisen estradiolin pitoisuuteen. kaivossa. 100 ui ELISA-puskuria lisättiin epäspesifiseen sitoutumiseen ja maksimaaliseen sitoutumiseen. Lisätään 50 µl putkesta nro 8 molempiin alimpiin standardikuoppiin (standardi 8) ja 50 µl putkesta nro 7 kuhunkin seuraavaan standardikuoppaan (standardi 7). Näyte (50 ui) lisättiin kuhunkin kuoppaan. Estradiol AChE Tracer (50 ui) lisättiin kuhunkin kokonaisaktiivisuuteen ja nollakuoppaan. Tämän jälkeen estradioli-ELISA-antiseerumia (50 ui) lisättiin jokaiseen kuoppaan lukuun ottamatta kokonaisaktiivisuutta, epäspesifistä sitoutumista ja nollakuoppia. Orbitaaliravistelija-inkuboinnin jälkeen (2 tuntia huoneenlämpötilassa) absorbanssi mitattiin 414 nm:ssä [52].

2.6 Immuunipotentiaalientsyymien määritys

2.6.1 Myeloperoksidaasi (MPO, EC 1.11.2.2)

Yksi MPO-aktiivisuuden yksikkö määritellään entsyymimääräksi, joka hydrolysoi substraatin ja tuottaa tauriinikloramiinia kuluttamaan 1.0 μmol TNB:tä minuutissa 25 asteessa. MPO määritettiin käyttämällä myeloperoksidaasin kolorimetrisen aktiivisuuden määrityspakkausta (luettelonumero: MAK068; Sigma-Aldrich, MO, USA). Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 412 nm.

2.6.2 Adenosiinideaminaasi (ADA, EC 3.5.4.4)

ADA on entsyymi, joka katalysoi adenosiinin ja 2'-deoksiadenosiinin muuttumista inosiiniksi ja 2'-deoksiinosiiniksi. ADA määritettiin teknisen tiedotteen adenosiinideaminaasiaktiivisuusmäärityssarjan periaatteiden mukaisesti (luettelonumero: MAK400; Merck KGaA, Darmstadt, Saksa). Yksi adenosiinideaminaasiyksikkö on entsyymimäärä, joka hydrolysoi adenosiinin tuottaen 1,0 μmol inosiinia minuutissa 37 asteessa. Reagenssit ovat 1 × ADA-määrityspuskuri (41 μL), ADA Converter (2 μL), ADA-kehitin (2 μL) ja ADA-substraatti (5 μL).

2.7 Differentiaalinen hemosyyttien määrä

Hemolymfi kerättiin etanalta (kontrolli, altistettu) Sminian [47] mukaisesti. Sen jälkeen, kun Pasteur-pipetti kosketti päätä-jalkaa, etana pakotettiin vetäytymään syvälle kuorensa sisään ja puristamaan hemolymfiä, joka kerättiin differentiaalista hemosyyttimäärää varten. Hemolymfia levitettiin mikroskoopin objektilasille levittämistä varten. 99,8-prosenttisessa metanolissa 5 minuutin kiinnityksen jälkeen objektilasia käännettiin 45 asteen kulmaan huoneenlämpötilassa kuivaamista varten ja värjättiin Giemsa-värillä 20 minuutin ajan. Hemosyyttien erilaistumisen määritettiin olevan verrannollinen 100:n laskemiseen.

2.8 Histologiset tutkimukset

Histologiset tutkimukset suoritettiin 7 päivän altistuksen jälkeen 8 ja 16 µl/l RIPEX:lle. Ruoansulatusrauhaset ja munasolut leikattiin pois ja kiinnitettiin välittömästi Bouin᾿s-nesteeseen. Yhden vuorokauden kiinnittämisen jälkeen näytteet kuivattiin sitten alkoholisarjan läpi ja kirkastettiin ksyleenissä. Valmistettiin parafiinivahalohkoja [42]. Kymmenen lahkoa. (5–7 μm paksuus) leikattiin ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (Mayerin H ja E). Värjäystä seurasi hyvä pesu vesijohtovedellä. Histologiset leikkeet valokuvattiin käyttämällä valokuvaautomaattikameraa (Optika, Italia).

2.9 Tilastollinen analyysi

Tiedot ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonna ja analysoitiin yhteiskuntatieteiden tilastollisella ohjelmistolla (SPSS; IBM Corp. Armonk, NY, USA). Kaksisuuntaista ANOVA-varianssianalyysiä käytettiin tunnistamaan erot kontrolli- ja altistuneiden ryhmien välillä, eri pitoisuuksien ja altistuksen aikapisteiden välillä. Merkitystasoksi asetettiin p Pienempi tai yhtä suuri kuin 0.05.

Cistanchen mekanismi lisää testosteronin vaikutusta

Cistanchen on todettu lisäävän testosteronitasoja useilla tavoilla. Ensinnäkin se sisältää yhdisteitä, jotka tunnetaan nimellä ekinakosidi ja akteosidi, joiden on osoitettu lisäävän luteinisoivan hormonin (LH) tuotantoa aivolisäkkeessä. LH stimuloi kiveksissä olevia Leydig-soluja tuottamaan testosteronia. Cistanche sisältää myös polysakkarideja ja fenyylietanoidiglykosideja, joilla on osoitettu olevan antioksidanttisia ja anti-inflammatorisia ominaisuuksia. Tämä voi auttaa vähentämään oksidatiivista stressiä ja tulehdusta kiveksissä, mikä voi heikentää testosteronin tuotantoa. Lisäksi Cistanchen on havaittu lisäävän testosteronin synteesiin osallistuvien geenien ilmentymistä ja vähentävän testosteronia hajottavien entsyymien, kuten {{1} }alfa-reduktaasi. Kaiken kaikkiaan näiden mekanismien yhdistelmän uskotaan edistävän Cistanchen testosteronia lisääviä vaikutuksia.

Hoda H. Abdel-Azeem1*, Azza H. Mohamed1 ja Mohamed R. Habib2