Cistanchesta peräisin oleva akteosidi parantaa glukokortikoidien aiheuttamaa osteoporoosia aktivoimalla PI3K/AKT/mTOR-reitin

Abstrakti

Tavoite

Glukokortikoideja käytetään laajalti kliinisessä käytännössä; ne voivat kuitenkin aiheuttaa sivuvaikutuksia, kutenosteoporoosi. Acteoside(ACT) Cistanchesta on käytetty useiden sairauksien torjuntaan. Tutkimus suoritettiin ACT:n tehokkuuden arvioimiseksi glukokortikoidi-indusoidussa hoidossaosteoporoosi(GIOP) ja sen mahdollinen mekanismi.

menetelmät
Deksametasoni (Dex) injektoitiin lihakseen indusoimiseksiosteoporoosirottamallissa ja ACT annettiin suun kautta. ACT:tä täydennettiin in vivo Dex-stimuloidussaosteoblastinenMC3T3-E1-solut. RT-qPCR suoritettiin mRNA-tasojen arvioimiseksiluun muodostuminen(Runx2, CoL1A1) ja luun resorptio (OPG ja RANKL). Kaupallista ELISA-pakkausta käytettiin seerumin OC- ja CTX-tasojen arvioimiseksi. Western blot suoritettiin proteiinitasojen arvioimiseksi PI3K/AKT/mTOR-signalointireitillä. CCK-8-määritys ja virtaussytometria suoritettiin osteoblastien elinkelpoisuuden ja apoptoosin arvioimiseksi.

Napsauta tästä saadaksesi Cistanche Acteoside Dex-stimuloitujen osteoblastien hoitoon

Tulokset
ACT vähensi Dexin aiheuttamaa luun mikrorakenteen heikkenemistä, nosti seerumin OC-tasoja ja alensi CTX-tasoja (P< 0.05). In the MC3T3-E1 cells, Dex inhibited cell viability and edistänyt apoptoosia; ACT kuitenkin heikensi tätä vaikutusta suuresti (P< 0.05). Concurrently, ACT reversed the reduction in Runx2, osterix, CoL1A1, and OPG mRNA levels, ALP activity, and the promotion of RANKL by Dex. Additionally, ACT attenuated Dex-induced inhibition of p-AKT/AKT, p-mTOR/mTOR, and p-PI3K/PI3K protein levels by Dex (P < 0.05), while the PI3K/AKT/mTOR pathway inhibitor LY294002 diminished the potential effect of ACT (P < 0.05).

Johtopäätös
ACT alkaenCistanchevoi aiheuttaa osteosuojaavia vaikutuksia aktivoimalla PI3K/AKT/mTOR-signalointireitin Dexin aiheuttaman osteoporoosin lievittämiseksi.

Avainsanat:Acteoside Cistancheglukokortikoidien aiheuttamiaosteoporoosi

Johdanto
Osteoporoosi (OP) on yleistynyt luuston sairaus, jolle on ominaista alhainen luumassa, luukudoksen mikrorakenteen tuhoutuminen ja luun homeostaasin epätasapaino [1]. OP aiheuttaa yli 8,9 miljoonaa murtumaa vuodessa ja osteoporoottisia murtumia tapahtuu lähes joka kolmas sekunti, mikä johtaa elinikäiseen työkyvyttömyyteen tai kuolemaan [2]. Glukokortikoideja (GC:t) annetaan yleisesti ei-tarttuvien tulehdussairauksien (kuten astman ja tulehduksellisen suolistosairauden) sekä autoimmuunisairauksien hoitoon [3]. Pitkäaikainen GC-käyttö altistaa kuitenkin yli 30 prosentille OP-tapauksista ja yli 10 prosentille osteonekroositapauksista [4]. GC:t estävät suoraan osteoblastien proliferaatiota ja erilaistumista [5], vähentävät kypsymistä ja aktiivisuutta sekä indusoivat osteoblastien apoptoosia, mikä puolestaan ​​johtaa glukokortikoidien aiheuttaman osteoporoosin (GIOP) kehittymiseen [6]. Lisäksi kasvava näyttö viittaa siihen, että osteoblastien toimintahäiriö on luukadon pääasiallinen syy. Siksi osteoblastien määrän ja toiminnan lisääminen näyttää olevan tärkein strategia OP:n, erityisesti GIOP:n, estämiseksi.

Kasviperäisiä lääkkeitä, erityisesti luonnollisiin yhdisteisiin perustuvia, on käytetty tuhansia vuosia erilaisten sairauksien hoitoon [7]. Cistanche on arvokas yrtti, joka on kirjattu Kiinan farmakopeaan ja joka kasvaa Xinjiangin Uygurin autonomisen alueen eteläisellä alueella ja tunnetaan nimellä aavikon ginseng [8]. Cistanchella on todistettu olevan erilaisia ​​​​vaikutuksia, kuten immuunijärjestelmää vahvistavia, munuaisia ​​suojaavia, ikääntymistä estäviä, antioksidantteja, tulehdusta ehkäiseviä ja hermoja suojaavia vaikutuksia [9].Acteoside(ACT) on fenyylietanoliglukosidi Cistanchessa, jolla on biologisia vaikutuksia, kuten hermosolujen apoptoosin esto [10], maksavaurion lievitys [11], tulehdusta ehkäisevä [12], hapettumisen esto [13]. diabeteksen [14] ja liikalihavuuden [15] ehkäisy sekä nivelruston rappeutuminen [16]. Lisäksi useat tutkimukset ovat raportoineet ACT:n farmakokinetiikasta ja vahvistaneet, että terapeuttinen vaikutus on olemassa, vaikka oraalinen käyttö on vain 0,12 prosenttia. ACT:tä pidetään aihiolääkkeenä, jolla on aktiivisia metaboliitteja in vivo [17].

Zhang et ai. osoittivat ACT:n mahdollisen suojaavan vaikutuksen munasarjojen poiston aiheuttamaan luukadoon rotilla [18]. ACT moduloi IGF-1/PI3K/mTOR-signalointireittiä estääkseen luukadon diabeettisilla rotilla [19]. PI3K/AKT/mTOR-reitillä on raportoitu olevan kriittinen säätelyrooli useissa sairauksissa, mukaan lukien GIOP [20]. Naringin lievittää GIOP:tä säätelemällä PI3K/AKT/mTOR-signalointireittiä [21]. Lisäksi tämä signalointireitti säätelee osteoblastien erilaistumista [22], luun muodostumista [23] ja murtumien paranemista [24]. ACT:n mahdollista roolia GIOP:ssa ja sitä, sääteleekö sitä PI3K/AKT/mTOR-signalointireitin modulaatio, ei kuitenkaan tunneta.

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli ymmärtää ACT:n suojaavia vaikutuksia GIOP-rottamallissa ja osteoblasteissa in vitro sekä selvittää taustalla olevia molekyylimekanismeja.

Materiaalit ja menetelmät
Koeeläimet
Neljäkymmentä 8-viikkoista urospuolista Sprague-Dawley (SD) -rottaa, jotka painoivat 280–340 g, hankittiin Shanghai Laboratory Animal Centeristä (CAS, Shanghai, Kiina). Koe-eläinten hoitotoimenpiteet suoritettiin Qiqiharin lääketieteellisen yliopiston eläinetiikkakomitean Third Affiliated Hospital -sairaalan hyväksymän protokollan mukaisesti. Ja tutkimus tehtiin ARRIVEn ohjeiden mukaisesti. Eläimiä pidettiin eläinkeskuksissa, joissa ei ollut taudinaiheuttajia, 24 ± 2 astetta, 12 tunnin valo- ja pimeysjaksot, 50 ± 5 prosentin kosteus ja vapaa pääsy ruokaan ja veteen.

GIOP mallin rakentaminen
7 päivän mukautuvan ruokinnan jälkeen rotat jaettiin satunnaisesti kontrolli- ja malliryhmiin satunnaislukutaulukon menetelmää käyttäen. Deksametasonia (Dex, Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA) ruiskutettiin 5 mg/kg kahdesti viikossa 6 viikon ajan. lihaksensisäisesti OP:n indusoimiseksi rotilla malliryhmässä [25]. Kontrolliryhmän (n = 10) rotille injektoitiin yhtä suuri määrä suolaliuosta. Rotilla ei havaittu merkittäviä ruumiinpainon muutoksia molemmissa ryhmissä 6 viikon kohdalla. Tämän jälkeen malliryhmän rotat jaettiin malliryhmään, ACT-pienen annoksen ryhmään (malli plus ACT-L) ja ACT-suuren annoksen ryhmään (malli plus ACT-H). ACT (HPLC 98 prosenttia) saatiin yhtiöltä Baoji Herbest Bio-tech., Ltd. (Baoji, Kiina) ja käsiteltiin vesipitoisella liuotinsuspensiolla. Annos 50 mg/kg/d ja 100 mg/kg/d ACT:tä annettiin oraalisesti pieni- ja suuriannosryhmissä (8 rottaa ryhmää kohden). jatkettiin 8 viikkoa. Niistä otoskoko laskettiin aikaisemman tutkimuksen [26] perusteella. Kun otetaan huomioon kaksipuolinen merkitsevyystaso 0,05 [95 prosentin luottamusväli ( = 0.05)], 80 prosentin teho ja vaikutuskoko 0,5, tehoanalyysi arvioi tarvittavan otoksen kooksi 6 eläintä ryhmää kohden olettaen, että 30 prosentin osteoporoosin vaikutustaso. Lisäksi 20 prosentin keskeyttämisasteella 8 eläintä ryhmää kohden (yhteensä 32 rottaa) pidettiin ihanteellisena.

Rotan seeruminäytteet
8 viikon kuluttua rotat nukutettiin 10-prosenttisella kloraalihydraatilla (400 mg/kg, intraperitoneaalisesti, Solarbio, Peking Kiina), veri kerättiin vatsa-aortasta, hyytyttiin huoneenlämpötilassa ja sentrifugoitiin nopeudella 3500 rpm/min 10 minuuttia. Seerumia säilytettiin 1,5 ml:n sentrifugiputkissa jatkokäyttöön asti.

Luun mineraalitiheyden arviointi
Luun mineraalitiheyttä (BMD) käytettiin DAX-pienen eläimen luutiheysmittarilla (Ranzhe Instrument Equipment Co., Shanghai, Kiina). Lyhyesti sanottuna rotat asetettiin makuuasentoon ja takaraajat sijoitettiin ulospäin. Rottien oikea reisiluu skannattiin valmistajan ohjeiden mukaisesti ja BMD-arvot kirjattiin [27].

Luun morfologinen analyysi
Kokeen lopussa rotat lopetettiin ruiskuttamalla vatsaonteloon ylimääräistä kloraalihydraattia, ja reisiluut kiinnitettiin 70-prosenttisessa etanolissa. Myöhemmin skannattiin VivaCT 40μCT -järjestelmällä edellisessä tutkimuksessa kuvatulla tavalla ja luun tilavuus/kokonaistilavuus (BV/TV), luun trabekulaariluku (Tb.N), luun trabekulaarisen paksuus (Tb.Tn) ja luun trabekulaarisen erotuksen (Tb.Sp) arvioitiin [28]. Eutanasiaa varten SD-rotat nukutettiin luun morfologian analyysin jälkeen antamalla intraperitoneaalisesti 10-prosenttista kloraalihydraattia (350 mg/kg).

Entsyymi-immunosorbenttimääritys (ELISA)
Kaupallisia ELISA-pakkauksia käytettiin osteokalsiini- (OC, E-EL-R0243c, Elabscience) ja C-terminaalisen telopeptidin (CTX, E-EL-R1405c, Elabscience) tasojen havaitsemiseen rottien seerumissa. Lyhyesti sanottuna reagenssit poistettiin 18-25 asteessa liuoksen tasapainottamiseksi ja valmistelemiseksi pesua ja standardityöskentelyä varten. Entsyymilevyt Levyille asetettiin standardi-, nolla- ja näytekuopat. Noin 100 µl näytelaimennesteliuosta lisättiin kuoppiin, inkuboitiin 90 minuuttia 37 asteessa ja korvattiin biotinyloidulla vasta-aineella 60 minuutin ajan 37 asteessa. Pesun jälkeen lisättiin entsyymiä sitova työliuos ja inkuboitiin 30 minuuttia. Substraattiliuos (90 µl) lisättiin ja inkuboitiin 15 minuuttia valolta suojattuna. Kun sininen gradientti ilmestyi standardikuoppiin, lisättiin 50 µl lopetusliuosta ja OD450:n muutos analysoitiin.

Käänteistranskriptio-kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (RT-qPCR)
TRlzol LS -reagenssia lisättiin rottien ja ACT-käsiteltyjen MC3T3-E1-solujen seerumiin ja kokonais-RNA uutettiin inkuboimalla huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen lisättiin kloroformia. RNA:n pitoisuus ja puhtaus varmistettiin mittaamalla A260/280-absorbanssi Nanodrop ND-1000 -spektrofotometrillä. SuperScript II -käänteistranskriptaasipakkausta käytettiin RNA:n käänteistranskriptioon cDNA:ksi. Myöhemmin cDNA käytettiin templaattina, aluke lisättiin ja SYBR-Green PCR-masterisekoituspakkaus sekoitettiin ja täydennettiin ddH2O:lla 20 µl:aan, ja PCR-monistusreaktio suoritettiin käyttämällä Applied biosystems AMI7500 Fast Real-time PCR:ää. järjestelmä (ABI, CA, USA). GAPDH:ta käytettiin sisäisenä referenssinä normalisoinnissa, ja suhteelliset ilmentymistasot laskettiin 2-ΔΔCt-menetelmällä ja suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Runtiin liittyvän transkriptiotekijän 2 (Runx2), kollageenin tyypin I 1 (CoL1A1), ydintekijä-KB-ligandin (RANKL) reseptoriaktivaattorin, osterixin ja osteoprotegeriinin (OPG) alukesekvenssi on esitetty taulukossa 1.

Western blot -analyysi
Soluihin lisättiin RIPA-lysaattia, joka sisälsi 1 % proteaasi-inhibiittoria, ja kunkin ryhmän kokonaisproteiini kerättiin solujen hajotuksen jälkeen ravistamalla 5 minuuttia 4 °C:ssa. BCA-määrityssarjaa käytettiin proteiinien pitoisuuden kvantifiointiin kussakin ryhmässä. Tämän jälkeen proteiininäytteet sekoitettiin 10-prosenttiseen natriumdodekyylisulfaatti (SDS) -puskuriin yhtä suuressa tilavuudessa ja keitettiin vesihauteessa 95 asteessa 5 minuuttia proteiinin denaturoimiseksi. Valmistettiin 12-prosenttinen SDS-polyakryyliamidi pystysuora geeli, ja geelin jähmettymisen jälkeen otettiin 30 ug proteiinia 120 mA:n 90 minuutin geelielektroforeesierotusta varten. Proteiini siirrettiin sitten PVDF-kalvolle 90 V jännitteellä 120 minuutin ajaksi. 5-prosenttisella naudan seerumialbumiinilla sulkemisen jälkeen PVDF-kalvo leikattiin markkerin ja kohdeproteiininauhan molekyylipainon perusteella ja inkuboitiin vastaavan primaarisen vasta-aineen kanssa yön yli 4 °C:ssa. Kanin polyklonaaliset vasta-aineet p-AKT:tä, p-mTOR:ta ja p-PI3K:ta vastaan ​​laimennettiin suhteeseen 1:1000 (Proteintech, Wuhan, Kiina). TBST pestiin 30 minuuttia ja inkuboitiin vastaavan piparjuuriperoksidaasilla leimatun sekundaarisen vasta-aineen kanssa huoneenlämpötilassa 1 tunti. Blotti visualisoitiin käyttämällä tehostettuja kemiluminesenssireagensseja. Proteiinivyöhykkeiden tiheys määritettiin käyttämällä Image J:tä. GAPDH:ta käytettiin kontrollina suhteellisten proteiinitasojen laskemiseen.

Soluviljely ja ryhmittely
Hiiren pre-osteoblastit MC3T3-E1 ostettiin Chinese Tissue Culture Collectionista (CTCC, Kiina) ja viljeltiin -MEM:ssä, joka sisälsi 10 prosenttia naudan sikiön seerumia ja 100 U/ml penisilliiniä ja 100 mg/ml streptomysiiniä kostutettu inkubaattori 37 asteessa ja 5 % CO2. Luun erilaistumisviljelmää varten tehtiin osteogeeninen induktioelatusaine sekoittamalla 10 mM- -glyserofosfaattia ja 50 mg/ml askorbiinihappoa (Sigma-Aldrich) -MEM:n kanssa ja lisättiin MC3T3-E1-soluihin indusoimaan niiden erilaistuminen. Elatusaine vaihdettiin 3 päivän kuluttua. 14 päivän viljelmiä käytettiin alkalisen fosfataasin (ALP) elinkelpoisuuden määrittämiseen. Lisäksi soluja esikäsiteltiin PI3K-estäjällä LY294002 (10 μM) 30 minuutin ajan, minkä jälkeen niitä käsiteltiin Dexillä ja ACT:llä.

Solujen elinkelpoisuusmääritys
Cell Counting Kit-8 (CCK-8) -määritys suoritettiin ACT:llä käsiteltyjen osteoblastien elinkelpoisuuden arvioimiseksi. MC3T3-E1-solut siirrostettiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 5 x 103 solua/kuoppa. Aiempien tutkimusten [29] perusteella arvioitiin 1 μM:n Dex-määrää, ja sitä inkuboitiin yhdessä ACT:n gradienttipitoisuuksien kanssa (10-8, 10-7, 10-6 ja 10-5 M). Elatusaine 96-kuoppalevyillä vaihdettiin, kun oli lisätty sekoituselatusaine ja CCK-8-reagenssi suhteessa 10:1. Kun oli inkuboitu 1 tunti 37 asteessa, OD450:n muutos arvioitiin.

Osteoblastien apoptoosin määrän havaitseminen
MC3T3-E1-solut, joille tehtiin erilaisia ​​käsittelyjä, digestoitiin käyttämällä EDTA-vapaata trypsiiniä ja kerättiin sentrifugoimalla. Pesun jälkeen 1 x sitoutumispuskurilla lisättiin 5 µl Annexin V-FITC:tä ja inkuboitiin huoneenlämmössä 5 minuuttia, täydennettiin 5 µl:lla PI:tä ja vietiin 200-verkko nailonverkon läpi. Näytteet analysoitiin käyttämällä FACScan-virtaussytometriajärjestelmää.

ALP-aktiivisuusmääritys
MC3T3-E1-solut siirrostettiin 24-kuoppalevyille, ja ACT ja Dex lisättiin rappauksen jälkeen. Soluviljelyväliaine korvattiin osteogeenisellä erilaistumisväliaineella viljelyä varten. Sen jälkeen, kun solut oli hajotettu solulyysiliuoksella (P0012J, Beyotime Biotechnology), supernatantti kerättiin sentrifugoimalla ja standardikäyrä piirrettiin. ALP-sarjaa (P0132S, Beyotime Biotechnology) käytettiin ALP-aktiivisuuden arvioimiseen ja OD450 laskettiin.

Tilastollinen analyysi
Kolmen riippumattoman kokeen suorittamisen jälkeen tiedot analysoitiin GraphPad Prism 6.0 -ohjelmistolla ja ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonta. ANOVAa käytettiin vertaamaan tilastollisia eroja useiden ryhmien välillä. P-arvo < 0,05 katsottiin tilastollisesti erilaiseksi.