Adenoviruskapsidien tulon jälkeisen lajittelun ymmärtäminen; Mahdollisuus muuttaa rokotevektorin ominaisuuksia Osa 1

Abstrakti:

Adenovirusvektoripohjaiset geneettiset rokotteet ovat nousseet tehokkaaksi strategiaksi SARS-CoV{2}}-terveyskriisiä vastaan. Tämä menestys ei ole odottamaton, koska adenovirukset yhdistävät monia geneettisen rokotteen toivottavia ominaisuuksia. Ne ovat erittäin immunogeenisiä ja niillä on alhainen ja hyvin karakterisoitu patogeeninen profiili yhdistettynä teknologiseen lähestyttävyyteen. Jatkuvat ponnistelut adenovirusrokotevektoreiden parantamiseksi sisältävät harvinaisten serotyyppien ja muiden kuin ihmisen adenovirusten käytön. Tässä katsauksessa keskitymme viruksen kapsidiin ja siihen, kuinka genotyyppien valinta vaikuttaa soluunottoon ja myöhempään subsellulaariseen lajitteluun. Kuvaamme, kuinka kapsidin ominaisuuksien, kuten stabiilisuuden ymmärtäminen sisääntuloprosessin aikana, voi muuttaa sisään tulevien hiukkasten kohtaloa ja kuinka tämä johtaa eroihin immuniteettituloksissa. Keskustelemme yksityiskohtaisesti, kuinka membraanin lyyttisen kapsidiproteiinin VI mutatointi vaikuttaa lajin C virusten lajitteluun sisääntulon jälkeisessä lajittelussa, ja keskustelemme lyhyesti, voisiko tällaisilla lähestymistavoilla olla laajempi vaikutus rokotteiden ja/tai vektorien kehitykseen.

Napsauta puhdasta vesisäiliötätuote

For more information:1950477648nn@gmail.com

1. Esittely

Virusinfektiot, toisin kuin bakteeri-infektiot, joita voidaan hoitaa antibiooteilla, ovat edelleen uhka terveydelle, koska viruslääkkeitä on vain vähän. Siksi rokotus on ainoa laajalti sovellettavissa oleva strategia ihmisten (ja eläinten) suojelemiseksi virusinfektioilta.

Viime aikoihin asti rokotusta virusinfektioita vastaan ​​harkittiin pääasiassa lastentautien ehkäisyn yhteydessä tai vuotuisena "influenssarokotuksena" influenssainfektioiden ehkäisyyn. SARS-CoV-2-terveyskriisin puhkeamisen myötä vuonna 2020 rokotukset ovat palanneet yleisen huomion keskipisteeseen, koska sitä pidetään nyt ainoana kestävänä keinona päästä pois tästä pandemiasta. Tässä yhteydessä adenovirus (Ad) -vektoripohjaiset rokotteet ovat nousseet yhdeksi kahdesta suuresta onnistuneesta rokotusstrategiasta. Hätätilanteen hyväksymisen jälkeen Ad-rokotteita ruiskutetaan nyt suureen osaan maapallon väestöstä ennennäkemättömällä tavalla luoda planeetan immuniteetti SARS-CoV-virusta vastaan-2.

Adenovirusvektorirokotteita ei käytetty laajasti ennen COVID{0}}-epidemiaa, mutta niiden menestys ei ole odottamaton. Virukset ovat yleensä erittäin sopivia rokotealustoja. Ne ovat biologisesti optimoituja ja mukautettuja nukleiinihappojen kuljetukseen, ja ne saavat aikaan immuunivasteita. Adenoviruksilla on monia ominaisuuksia, jotka tekevät niistä erityisen ihanteellisia rokoteehdokkaita. Niillä on alhainen ja hyvin karakterisoitu patogeeninen profiili, johon liittyy korkea tarttuvuus. Ne ovat teknisesti lähestyttäviä ja niitä on käytetty laajasti vektorisoinnissa. Niiden korkea tuotantosaanto ja stabiilisuus mahdollistavat teollisen tuotannon hyvän tuotantotavan (GMP) olosuhteissa ja tarjoavat käytännöllisiä ominaisuuksia (eli varastointia) alueelliseen jakeluun alennettuun hintaan [1]. Lisäksi Ad-solujen kuljetus antigeeniä esitteleviin soluihin on tehokasta, ja ne synnyttävät luonnollisesti synnynnäisen immuunivasteen, joka toimii adjuvanttina rokotuksen onnistumisen tehostamiseksi [2,3].

Ad-biologian ymmärtäminen on ollut ratkaisevan tärkeää mainospohjaisten (rokote)vektorien kehittämisessä. Esimerkiksi muiden kuin ihmisten tai harvinaisten Ad-serotyyppien käyttö joissakin tällä hetkellä markkinoiduissa SARS-CoV-2-rokotteissa valittiin tarkoituksella estämään olemassa olevaa vektoriimmuniteettia heikentämästä rokotteen tehokkuutta. Virusgeenideletoitujen vektoreiden käyttö parantaa vektorien turvallisuutta. Viruksen elinkaaressa on kuitenkin edelleen monia näkökohtia, joita ei ole otettu huomioon kehitettäessä Ad-pohjaisia ​​rokotevektoreita, ja tiedot harvinaisista tai ei-ihmisperäisistä genotyypeistä ovat rajalliset, mukaan lukien ne, joita tällä hetkellä käytetään SARS-CoV{8}}-rokotteina. . Tällä katsauksella haluamme lisätä tietoisuutta mahdollisista muutoksista, joita voitaisiin hyödyntää kehitettäessä mainosvektoreita lääketieteellisiin tarkoituksiin, mukaan lukien rokotukset.

Keskitymme viruksen kapsidiin ja siihen, kuinka genotyyppien valinta vaikuttaa soluunottoon ja myöhempään solunväliseen lajitteluun. Kuvaamme kuinka kapsidin ominaisuuksien, kuten stabiilisuuden ymmärtäminen sisääntuloprosessin aikana, voi muuttaa sisään tulevien hiukkasten kohtaloa ja mitä erilaisia ​​immuniteettituloksia havaitaan. Esimerkkinä siitä, kuinka kapsidin stabiilisuutta ja kohtaloa voidaan muuttaa, keskustelemme yksityiskohtaisesti, kuinka membraanin lyyttisen kapsidiproteiinin VI mutatoituminen vaikuttaa lajin C viruksiin. Lopuksi keskustelemme lyhyesti, onko tällaisilla lähestymistavoilla potentiaalia hyödyntää rokotteiden ja/tai vektorien kehittämiseen.

1.1. Adenovirukset muodostavat monimuotoisen infektiopatogeenien perheen

Historiallisesti Ad eristettiin ensimmäisen kerran vuonna 1953 hengitystieinfektioiden potilaiden adenoideista [4], ja pian sen jälkeen termi "adenovirus" otettiin yleisesti käyttöön [5]. Adenoviridae-heimoon kuuluu yli 120 jäsentä, jotka on jaettu viiteen sukuun – riippuen siitä, tartuttavatko ne nisäkkäitä (esim. Mastadenoviridae), lintuja (esim. Aviadenoviridae), matelijoita (esim. Atadenoviridae), sammakkoeläimiä (Siadenoviridae) vai kaloja (Ichtadenoviridae) ) [6,7]. Mastadenoviridae-sukuun kuuluu myös yli 70 ihmisen Ads-tyyppiä [8,9], jotka on luokiteltu seitsemään lajiin (A–G) niiden morfologisten, biologisten ja fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksiensa mukaan, kuten taulukossa 1 on lueteltu [10, 11].

Lisäksi Ads voi myös spontaanisti rekombinoitua, jolloin syntyy uusia lajeja [12], kuten tapahtui AdE4:lle, joka on ainoa ihmislajin E virus ja joka on todennäköisesti syntynyt ihmislajin B ja apina Adin välisestä rekombinaatiosta [13]. ]. Vaikka infektiot ihmisillä ei-inhimillisillä Adsilla ovat luonnollisesti harvinaisia, ne eivät ole mahdottomia [14,15]. Erilaisten ei-ihmismainosten kyky infektoida (tai transdusoida) ihmissoluja tekee niistä houkuttelevia (rokote) vektorialustoja. Niiden joukossa ovat simpansseista [16–18], gorilloista [19], lampaista [20], lehmistä [21], koirista [21,22] tai uuden maailman apinasta [23] peräisin olevia mainoksia.

Adenovirusinfektiot voivat aiheuttaa erilaisia ​​sairauksia riippuen niiden solu- tai kudostropismista, mukaan lukien hengitystie-, silmä-, virtsatie- tai maha-suolikanavan sairaudet (katso taulukko 1). Kudostropismi on usein seurausta erilaisten mainosten reseptoreiden käytöstä, ja se voi myös liittyä hiukkasten luontaiseen stabiilisuuteen [24]. Useimmat Adsin aiheuttamat infektiot ovat lieviä tai oireettomia immuunikykyisessä isännässä. Ensisijaiset Ad-infektiot esiintyvät useimmiten lapsuudessa ja johtavat vahvaan suojaavaan immuniteettiin. Sitä vastoin immunosuppressoituneilla yksilöillä Ads voi aiheuttaa hallitsemattomia, vakavia ja hengenvaarallisia systeemisiä infektioita, jotka johtavat vakavaan solutoksisuuteen, mikä voi johtaa liialliseen tulehdukseen ja useiden elinten vajaatoimintaan, mikä aiheuttaa korkean kuolleisuuden [12].

Parhaiten tutkitut ihmismainokset ovat C-tyypin 2 ja 5 virukset, joita esiintyy pääasiassa potilailla, joilla on ylempien hengitysteiden ja maha-suolikanavan infektioita [25] ja jotka ovat tämän katsauksen pääpaino. Adenovirukset voivat olla vastuussa satunnaisista taudinpurkauksista, kuten B-lajin virukset, jotka aiheuttavat keuhkokuumetta (esim. Ad3, 7 ja 14) immuunikykyisten yksilöiden keskuudessa [26] tai lajien F Ad40/41 ja lajin A Ad12, 18 ja 31. , jotka infektoivat maha-suolikanavaa (katsotaan [26,27]). D-lajin virukset ovat hyvin monimuotoinen ryhmä ja altis rekombinaatiolle ja ovat johtava silmäinfektioiden aiheuttaja [28].

1.2. Adenoviruskapsidit ovat metastabiileja rakenteita

Monimuotoisuudestaan ​​huolimatta kaikki mainokset noudattavat samanlaisia ​​rakenteellisia ja organisatorisia puitteita. Adenovirukset ovat vaipattomia DNA-viruksia, jotka sisältävät suhteellisen suuren, 26–45 kb:n lineaarisen kaksijuosteisen DNA-genomin [29–31]. Kapsidin halkaisija on ~70–90 nm ja se on muodoltaan ikosaedri, jossa on 20 fasettia ja 12 kärkeä [32]. Kapsidi koostuu kolmesta päärakenneproteiinista (heksoni, pentoni ja kuitu) ja useista vähäisistä sementtiproteiineista (eli IIIa, VI, VIII ja IX lajin C viruksissa), jotka stabiloivat rakennetta. Useiden Ad-kapsidien korkearesoluutioinen rakenne on saatu kryoelektronimikroskoopilla ja röntgenkristallografialla [24,33–36]. Ikosaedrisella kapsidilla on pseudo-T25-rakenne, jossa on 720 eksonia, jotka on koottu eri trimeereihin riippuen niiden sijainnista kapsidissa. Kapsidin 20 puolta koostuvat yhdeksästä kootusta eksonista (niin sanottu GON ryhmälle yhdeksän), kun taas 12 kärjessä eksonit kootaan GOS:ssa (ryhmälle kuusi) (katso [37,38] lisätietoja varten ). Pentameerinen pentonpohja työnnetään 12 kärkeen ja toimii pohjana ulkonevalle trimeerikuidulle [39,40]. Vuorovaikutus pää- ja sivukapsidiproteiinien välillä stabiloi kapsidin, pääasiassa vuorovaikutuksen kautta kuusikulmioiden kanssa.

Esimerkiksi IX stabiloi GON:n [41]; IX ja IIIa stabiloituvat itse vuorovaikutuksessa VIII:n kanssa, mikä yhdistää ne GOS:iin ja GON:iin, vastaavasti [37]. VIII-molekyylit hahmottelevat GON:ia ja auttavat stabiloimaan kuusikulmioita kapsidin sisäpuolella. Proteiini VI stabiloi myös heksonia sitomalla heksonitrimeerin keskusontelon, joka on alttiina viruksen sisäiselle luumenille [42–44].

Kapsidi ympäröi ja suojaa virusydintä, joka koostuu viruksen genomista, viruksen ydinproteiineista (eli V, VII, Mu-lajin C viruksissa) ja terminaalisesta proteiinista (TP), joka on sitoutunut kovalenttisesti jokaiseen 5'-päähän. Ad-genomi. Pienet kapsidiproteiinit ovat vuorovaikutuksessa ydinproteiinien kanssa muodostaen yhteyden kapsidin ja genomin välille; kuitenkin niiden avaruudellinen järjestys ydinproteiinien joukossa on edelleen huonosti ymmärretty. On osoitettu, että V ylläpitää DNA:ta kapsidin sisällä olemalla vuorovaikutuksessa VI:n (kapsidipuoli) ja VII:n (genomipuoli) kanssa [45–47] ja todennäköisesti myötävaikuttaa genomin vapautumiseen ydinhuokosessa [48]. VII on tärkein kapsidiproteiini, joka liittyy viruksen DNA:han ja edistää sen kondensaatiota kapsidin sisällä [49–51]. VII myös suojaa virusgenomia immuuni havaitsemiselta solutekijöiden kautta [50,52–54]. Mielenkiintoista on, että kapsidiproteiini IX ja proteiini V ovat läsnä vain Mastadenoviridaessa [55, 56], ja viruskapsideja voidaan tuottaa ilman IX:ää [57] tai proteiinia VII [58], mikä osoittaa jonkin verran joustavuutta kapsidirakenteessa.

Ihmisen Adsin genomi koodaa ~45 proteiinia (mukaan lukien rakenneproteiinit), jotka on järjestetty ajallisesti säädellyiksi transkriptioyksiköiksi [59]. Transkriptiotekijä E1A on ensimmäinen ekspressoitunut proteiini, ja se on välttämätön viruksen geenin ilmentymisen aloittamiseksi [60]. Genomissa on myös 5' kapsidoitumissekvenssi ja käänteisiä terminaalitoistoja (ITR) jokaisessa ääripäässä, joita tarvitaan replikaatioon [59,61–64]. Adenovirukset koodaavat adenovirusproteaasia (AVP), joka on pakattu partikkeliin ja prosessoi useita proteiineja (eli IIIa, VI, VII, VIII, µ, TP ja 52,55K C-lajin viruksissa) [65–67]. Tätä vaihetta tarvitaan kypsien tarttuvien hiukkasten muodostumiseen ja se saa aikaan metastabiilien (eli vähemmän stabiilien) kapsidien muodostumisen, jotka on valmisteltu kapsidin hajoamista varten solun kiinnittymisen ja sisäänpääsyn yhteydessä [68,69]

Ihmisten Adsin rakenteessa on myös lajikohtaisia ​​eroja, esim. kuidun pituudessa ja joustavuudessa, mikä vaikuttaa suoraan reseptorisitoutumiseen [70–72]. Erot voidaan havaita myös pentonien kokoonpanossa. B-lajin virusten pentonit voivat muodostaa pentonien välisiä kontakteja, mikä johtaa vaihtoehtoisiin ja vähemmän stabiileihin viruksen kaltaisiin partikkeleihin, joissa ei ole genomeja ja joissa ei ole joskus kuituja. Tällaisia ​​hiukkasia kutsutaan dodekaedreiksi, ja niitä tutkitaan plasmidien tai peptidien solunsiirron suhteen vaihtoehtona Ad-vektoreille. Dodekaedrit paljastavat paremmin useimpien Ad-lajien pentonissa olevan lyhyen RGD-peptidi-motiivin, jota tarvitaan kohdesolujen sitomiseen [73,74]. Erot kapsidin stabiilisuudessa, kuten alla käsitellään, voivat olla tärkeä ominaisuus, joka määrää Ad-hiukkasten sisäänpääsyn kohtalon.

1.3. Adenovirukset seuraavat lyyttistä elinkaaria

Ad-infektiosykliä on tarkasteltu laajasti muualla [75–77]. Tässä keskitymme lyhyesti elinkaaren tuloosaan, ja ellei toisin mainita, viitataan lajin C viruksiin, jotka ovat parhaiten tutkittuja (kuva 1). Adenovirukset käyttävät kapsidikuitua ensisijaisena solukiinnitysmolekyylinä. Useimmat Ads, mukaan lukien lajin C virukset, käyttävät coxsackievirusta ja Ad-reseptoria (CAR) kohdesolujen sitomiseen [78–81]. Sitä vastoin jotkin B-lajin virukset sitovat ensisijaisesti CD46-reseptoria [82] tai desmogleiini 2:ta [83], ja joidenkin D-lajin virusten osoitettiin olevan vuorovaikutuksessa siaalihappojen [84,85] tai suoraan v-integriinien kanssa (katso taulukko 1). 86].

Siten kuitujen vaihtaminen lajien välillä on houkutteleva strategia tropismin muuttamiseksi [87–89]. Kuitumolekyylin ensisijainen tehtävä on välittää fyysistä assosiaatiota kohdesolujen kanssa, mitä seuraa toinen vuorovaikutus pentonin ja integriinien, kuten v 5:n, välillä [90]. Tätä vuorovaikutusta välittää RGD-peptidi-motiivi pentonsekvenssissä [91]. Tämän motiivin puuttuminen, kuten lajin F viruksissa, liittyy vähemmän tehokkaaseen soluun pääsyyn [92]. Integriinin sitoutuminen johtaa integriinin klusteroitumiseen solun pinnalla [93], joka laukaisee signalointikaskadin, mikä johtaa aktiinin sytoskeleton uudelleenorganisoitumiseen [94, 95] ja endosyyttiseen sisäänottoon klatriinivälitteisen endosytoosin tai mikropinosytoosin kautta [96, 97]. RGD-sitoutuminen voi myös destabiloida kapsidia [98] vähentämällä kontakteja pentonin ja heksonin välillä, mikä auttaa kapsidia irrottamaan pinnoitteen [99]. Tämän seurauksena Ad-hiukkaset menettävät kuitunsa, ja endosomin sisältä voi löytää dissosioituneita heksonia ja pentonia [100–102]. Endosomi on dynaaminen organelli, joka on valmis kypsymään hajoaviksi lysosomeiksi, ja Adsin on paeta nopeasti sytosoliin. Endosomin happamoittaminen voi nopeuttaa poistumisprosessia heikentämällä edelleen kapsidia [100,103]. Endosomien tunkeutumisprosessi perustuu sisäisen kapsidiproteiinin VI:n vapautumiseen [103, 104].

Vapautuneelle VI:lle on tunnusomaista N-terminaalinen amfipaattinen heliksi, joka sitoutuu endosomin sisälehteen ja indusoi positiivisen kalvon kaarevuuden, mikä johtaa paikallisesti rajoitettuun kalvon repeämiseen [75,103,105,106]. Solut reagoivat viruksen aiheuttamaan kalvon repeämiseen ja aktivoivat paikallisen autofagiavasteen vaurioituneen organellin puhdistamiseksi [107–109]. Hajoamisen välttämiseksi Ads pysäyttää autofagian lyhyen PPxY-peptidi-motiivin kautta proteiinissa VI, kunnes partikkeli on saavuttanut sytosolin turvallisuuden [104, 108]. C-lajin virusten osoitettiin pakenevan varhaisista endosomeista [110]. Muut lajit, mukaan lukien A, B ja D, kulkevat ensin lysosomiin ennen pakenemista sytosoliin [111–113], mikä voi vaikuttaa näiden virusten laukaisemaan immuuniaktivaatioon [114].

Kun mainokset ovat saavuttaneet sytosolin, ne kytkeytyvät dyneiinimoottorien kanssa ja käyttävät retrogradista kuljetusta mikrotubuluksia pitkin saavuttaakseen mikrotubulusten organisointikeskuksen [115–117]. Motorinen sitoutuminen on luultavasti heksonin [115] välittämää ja saattaa vaatia happaman esikäsittelyn [118]. Ytimen läheisyydessä kapsidit vaihtavat kuljetuksen suuntaa, luultavasti sitoutumalla kinesiinimoottoriproteiineihin ja kerääntymällä tuman vaippaan [115, 117, 119, 120]. Ne kiinnittyvät ydinhuokoskompleksiin, sitten kapsidit puretaan kokonaan ja genomit vapautuvat ja tuodaan ytimeen [51,121–124]. Tuman sisällä sykli jatkuu genomin transkriptioaktivaatiolla ja välittömän varhaisen E1A-geenin ekspressiolla, joka toimii transkriptiotekijänä kaikille muille varhaisille transkriptioyksiköille [60,125–130]. Replikaatioentsyymien ilmentymisen jälkeen virusgenomit replikoituvat ja kerääntyvät replikaatiokeskusten reuna-alueille [131].

Sitten rakenneproteiinit ekspressoidaan myöhäisestä ilmentämisyksiköstä pääasiallisen myöhäisen promoottorin ohjauksessa [132, 133]. Myöhäisten geenien ilmentyminen huipentuu kaikkien rakenteellisten proteiinien tuotantoon ja tumaan kertymiseen, jossa ne kokoontuvat jälkeläisiksi ja pakkaavat vasta syntetisoituja genomeja. Seuraavan sukupolven Ads-ydinkokoonpano johtaa sitten hiukkasten poistoon ja solujen hajoamiseen [42,134–136]. Kuten edellä mainittiin, kapsidien kokoamista seuraa kypsyminen, eli useiden kapsidiproteiinien proteolyyttinen pilkkominen AVP:n toimesta tarttuvien partikkelien tuottamiseksi [66]. Tämän prosessin tärkeyttä havainnollistaa lämpötilaherkkä mutantti, Ts1, joka alun perin tunnistettiin mutageneesiseulonnassa Ad2:ssa. Ei-sallivassa lämpötilassa tämä mutantti ei pysty pakkaamaan AVP:tä, ja kootut hiukkaset eivät kypsy, mikä johtaa hyperstabiileihin partikkeleihin [137]. Vastuullinen AVP-mutaatio vietiin geneettisesti Ad5:een säilyttäen tämän fenotyypin. Ts1-kapsidit pystyvät edelleen kiinnittymään solureseptoreihin ja endosytoosiin, mutta jäävät sitten loukkuun endosomiin, koska ne eivät pysty vapauttamaan proteiinia VI:tä [103,138,139].

2. Adenoviruksen immuunitunnistus

Adenovirukset ovat laajalle levinneitä, ja suuri enemmistö väestöstä on kohdannut tämän viruksen pääasiassa lapsuudessa. Adenovirukset ovat erittäin immunogeenisiä, ja jokainen kohtaaminen saa aikaan spesifisen anti-Ad-immuniteetin, sekä synnynnäisen että adaptiivisen, joka voi kestää eliniän. Tämä on tärkeää viruksen torjunnassa ja tekee Adsista vähemmän haitallisia immuunipätevälle isännälle, mutta se voi olla este, kun Adsia käytetään vektorina rokotuksissa tai geeniterapiassa [140,141]. Kun ymmärrämme, kuinka Ad (ja sen vektorijohdannaiset) aktivoi immuunijärjestelmää, voimme parantaa rokotteiden tehokkuutta ja turvallisuutta. Kliinisiin kokeisiin osallistuneiden potilaiden in vivo -havainnot osoittivat selvästi, että mainokseen perustuvat vektorit voivat indusoida voimakkaan immuuniaktivaation [142,143], joilla on joskus kohtalokkaita seurauksia [144].

Lisäksi useat in vitro- tai eläinmalleilla tehdyt tutkimukset [145] viittaavat itse viruspartikkelin (eli kapsidin ja sisällytetyn DNA:n) keskeiseen rooliin alkuperäisen immuunivasteen aktivoinnissa. Tässä keskitymme lyhyesti immuunivasteisiin, jotka liittyvät sisääntulevaan kapsidiin; saadaksesi syvemmän yleiskatsauksen, katso aiemmin julkaistut arvostelut [146–149].

2.1. Adenovirukset laukaisevat solun sisäisen immuniteetin

Kun Ads kehitettiin vektoreiksi, kävi ilmeiseksi, että Adsin indusoima solun sisäinen tai luontainen immuniteetti on vaste tunkeutuvalle virionille. Mielenkiintoista on, että sekä replikatiiviset että ei-replikatiiviset virukset (eli UV-inaktivoidut virukset, ei-replikoituvat vektorit tai tyhjät kapsidit) aktivoivat immuunivasteita infektoiduissa soluissa, mikä osoittaa, että kapsidilla on avainrooli tässä vasteessa [145,150–156] .

Yleensä solut havaitsevat mainokset useissa vaiheissa viruksen koko elinkaaren ajan, ja ne aktivoivat synnynnäisiä immuniteettireittejä (kuva 1). Tämä aktivaatio alkaa Ad-kuitujen sitoutumisesta solun pintareseptoriin CAR, joka aktivoi mitogeenin aktivoiman proteiinikinaasin (MAPK) signaalin, joka johtaa transkriptiotekijän NF-KB:n aktivoitumiseen. Tämä laukaisin johtaa tulehdusta edistävien sytokiinien (IL-6, IL-8) tuotantoon [157,158]. Ad-lajeista riippuen muiden reseptorien käyttö voi kuitenkin moduloida sytokiinien ilmentymiseen liittyvän signalointikaskadin voimakkuutta [159]. Vuorovaikutus viruspentonin ja soluintegriinin välillä on lisälaukaisija immuuniaktivaatiolle. Hiiren makrofageilla tehty tutkimus osoitti, että tämä sitoutuminen aktivoi IL-1:n ilmentymisen RGD-motiivin kautta [160]. Tämä saattaa rajoittua immuunisoluihin, koska muissa solumalleissa (esim. HeLa, epiteelisolulinja) integriini/RGD-vuorovaikutuksen roolia kemokiinien ja tulehdusta edistävien sytokiinien tuotannossa ei vahvistettu [151,161,162]. Tämä viittaa siihen, että itse internalisaatioprosessilla on tärkeämpi rooli immuuniaktivaatiossa kuin vuorovaikutus integriinien kanssa. Itse asiassa pentonin sitoutuminen integriiniin aktivoi myös fosfoinositidi3--kinaasin (PI3K) signaalin, mikä lisää viruksen sisäistämistä [163].

Lisäksi PI3K-aktivaation on osoitettu Ad-infektion yhteydessä laukaisevan proinflammatoristen sytokiinien, kuten TNF:n, tuotannon [164], ja internalisaatioprosessin on kuvattu tarvittavan immuuniaktivaatioon [165]. Nämä tutkimukset viittaavat siihen, että immuuniaktivaatio tapahtuu pääosin sisäistämisen jälkeisessä vaiheessa, mikä korostaa tulon jälkeisen lajittelun tärkeyttä (tarkasteltu julkaisussa [166]).

Endosomiin päästyään Ads altistetaan intraluminaalisille patogeenin tunnistusreseptoreille (PRR), kuten TLR9, joka on kaksijuosteinen DNA-sensori, joka on rajoitettu immuunisoluihin. Hiiren makrofagit voivat havaita Ad-vektorit TLR9:n kautta indusoidakseen tulehdusta edistävien sytokiinien tuotannon [167]. TLR9 vaadittiin myös tiukasti IFN/tuotantoon, kun hiiren plasmasytoididendriittisolut (pDC) altistettiin Ad:lla [168]. TLR9 knock-out -hiirimalleissa kuitenkin tuotettiin edelleen IFN /:ää, mikä viittaa siihen, että muissa soluissa kuin pDC:ssä IFN:n tuotanto tapahtuu TLR9-signalointista riippumatta [168, 169].

Virusgenomit (tai vektorigenomit) ovat havaittavissa viruksen endosomaalisen karkaamisen aikana tai sen jälkeen. Kun ne saavuttavat sytosolin, sytosolinen kaksijuosteinen DNA-sensori cGAS havaitsee ne [168 170]. Viruksen genomin tunnistuksen jälkeen cGAS edistää transkriptiotekijän IRF3:n fosforylaatiota ja tumaan translokaatiota IFN/ekspression ohjaamiseksi ja indusoi virustenvastaisen tilan. Endosomaalinen kulku edellyttää viruksen aiheuttamaa endosomaalista kalvovauriota viruspartikkelien endosomaalisen karkaamisen helpottamiseksi. Kalvon repeäminen myötävaikuttaa siten merkittävästi immuuniaktivaatioon, mitä korostaa se tosiasia, että pakoon puutteellinen Ts1-mutantti ei pysty aktivoimaan täydellistä ja tehokasta immuunivastetta [161,162,170,171]. Keskeinen rooli tulehdusvasteessa Ad-kalvon tunkeutumisen yhteydessä on tankkia sitovalla kinaasilla, TBK1:llä, jonka oletetaan olevan osa viruksen genomin alavirran sytosolista tunnistamista cGAS/STING-reitin kautta [168, 170].

Adenoviruskalvovaurio johtaa myös katepsiini B:n vapautumiseen endo-lysosomaalisesta osastosta, mikä aiheuttaa oksidatiivista stressiä, joka aktivoi NLRP3-tulehduksen, mikä johtaa IL-1-kypsymiseen [114]. C-lajin virukset pakenevat varhaisista endosomeista, kun taas lajin B virukset kulkevat myöhäisiin endosomeihin saakka, mikä johtuu oletettavasti eroista reseptoreiden käytössä. Myöhäisen endosomin/lysosomin happamoittaminen aktivoi todennäköisemmin lysosomaalisia happohydrolaaseja. Molemmat lajit indusoivat tulehdusaktivaatiota [172], mutta luultavasti endosomissa viipymisajasta johtuen niiden vasteiden laajuus vaihtelee. Maailmanlaajuisesti B-lajin virukset indusoivat vahvemman synnynnäisen ja adaptiivisen immuuniaktivaation kuin lajin C virukset [113,173,174]. Tämä saattaa selittää, miksi B-lajin virukset ovat patogeenisempiä ja aiheuttavat taudinpurkauksia immuunipätevissä isännissä [26]. Se viittaa lisäksi siihen, että solut voivat erottaa tunkeutumisosaston (eli endosomi vs. lysosomi [109]) ja mukauttaa immuniteetin tehokkuutta. Endosomaalisten kalvojen vaurioituminen Ad-pakoprosessin aikana voi myös itsessään olla vaaramerkki. Kuten jäljempänä yksityiskohtaisesti käsitellään, membraanivaurio johtaa sytosoliseen altistumiseen intraluminaalisille glykaaneille, jotka solu havaitsee vaarasignaaleina (kuten tarkastellaan kohdassa [109]). Altistuneiden glykaanien havaitseminen galektiinien avulla aktivoi myöhemmin autofagian ja laukaisee antiviraalisen immuniteetin toisen haaran [108].

2.2. Adenovirukset aiheuttavat mukautuvan immuunivasteen ja heikentävät antiviraalista autofagiaa solujen sisäänpääsyn yhteydessä

Adsien tai niiden vektoreiden aiheuttamat luontaiset immuunivasteet muuttuvat myöhemmin adaptiiviseksi immuniteetiksi kemokiinierityksen kautta, joka houkuttelee immuunisoluja (neutrofiilejä, luonnollisia tappajasoluja ja makrofageja) ja vahvistaa voimakasta antigeenin esittelyä [153, 154]. Adenovirukset ovat erittäin immunogeenisiä, ja niiden tärkeimmät immunogeenit ovat tärkeimmät kapsidiproteiinit (heksoni, pentoni ja kuitu), jotka laukaisevat B-solujen lajispesifisen neutraloivien vasta-aineiden tuotannon [175–177].

Neutraloivat vasta-aineet kohdistuvat enimmäkseen heksoniproteiinin hypervariaabelisilmukoita vastaan ​​[178–180], ja ne muodostavat suuren rajoituksen Adsin käytölle samasta serotyypistä peräisin olevina vektoreina. Tämä ongelma on vältetty käyttämällä vähemmän seroprevalentteja tai muita kuin ihmisiin perustuvia mainoksia [181–185]. Tästä vektorien vastaisesta immuniteetista huolimatta, kun Adsia käytetään rokotealustoina (esim. immuunisuojan aikaansaamiseksi ebolaa vastaan ​​kliinisissä kokeissa), ne indusoivat silti vahvan B-soluvasteen, mikä mahdollistaa vasta-aineiden tuotannon haluttua rokoteimmunogeenia vastaan, joka voi kestää. enintään 6 kuukautta [186]. Lisäksi olemassa oleva vektoriimmuniteetti voitaisiin voittaa suuremmilla rokotevektoriannoksilla, kuten SARS-CoV-2-rokotevektorin tapauksessa, joka perustuu korkean seroprevalenssin AdC5:een [187].

Kuten neutraloivat vasta-aineet, Ad-infektiot laukaisevat jatkuvan T-soluimmuniteetin pääasiassa CD4 plus -aktivaation kautta. Tämä suoja löytyy edelleen aikuisilta, mikä viittaa pitkäaikaiseen immuniteettiin lapsuudesta [188–190]. Lisäksi CD8 plus:n aktivaation kuvataan myös ylläpitävän sytotoksista vastetta [191–193]. Tämä T-soluaktivaatio ei välttämättä ole serotyyppispesifistä ja mahdollistaa ristisuojauksen eri Ad-alaryhmiä ja serotyyppejä vastaan ​​[192–194].

Lisäksi Ad-infektoituneilla kantasolusiirrostetuilla potilailla on kuvattu voimakas CD4 plus- ja CD8 plus -aktivaatio [195]. Tämä aktivaatio on suunnattu heksonipeptidejä vastaan ​​ja johtaa Ad viremian puhdistumiseen, mikä korostaa sekä CD4 plus että CD8 plus T-soluaktivaation pääroolia immuunisuojassa. Vaikka tämä T-solupohjainen immuniteetti on suunnattu Ad-partikkelia vastaan, Ads laukaisee myös vahvan soluimmuniteetin, joka perustuu T-soluvasteeseen rokoteantigeeniä vastaan, mikä on pitkäkestoisen immuniteetin etu käytettäessä rekombinantti-Ad-vektoreita rokotealustoina [196,197 ]. Tärkeää on, että kliinisistä kokeista saadut tiedot ovat vahvistaneet, että kun Ad:ta käytetään rokotealustana (haluttu antigeeni siirtogeeninä), se indusoi sekä sytotoksisen CD8 plus T-solun että CD4 plus T-solun aktivoitumisen, mikä johtaa muistiimmuniteettiin rokotea vastaan. ilmentynyt siirtogeeni [184,186,198–202].

T-soluaktivaatio perustuu viruspeptidien esittelyyn suuren histokompatibiliteettikompleksin (MHC) kautta. Lyhyesti sanottuna, antigeenin esittely MHC-luokan I toimesta johtuu proteasomaalisesta hajoamisesta, ja saadut peptidit indusoivat CD8- ja T-soluaktivaation, mikä mahdollistaa sytotoksisen T-soluvasteen käynnistymisen ja lisääntymisen. MHC-luokan II antigeenin esittely johtuu lysosomaalisesta proteolyysistä, ja tuloksena olevat peptidit indusoivat CD4- ja T-soluaktivaation esittelyn yhteydessä, mikä laukaisee myöhemmän B-solujen aktivoitumisen [203]. Nyt on hyvin karakterisoitu, että autofagia edistää peptidien esittelyä MHC-luokan II molekyyleille [204]. Ei ole yllättävää, että autofagia on yksi vanhimmista puolustusmekanismeista infektioita vastaan ​​ja tärkeä osa soluvalikoimaa tunkeutuvia patogeenejä vastaan, osallistuen sekä synnynnäisiin että adaptiivisiin immuunivasteisiin. Se voi suoraan eristää patogeenin hajoamista varten (ksenofagia) ja osallistuu sen esittelyyn immuunijärjestelmälle [205–207]. Makroautofagia (jota kutsutaan yleisemmin autofagiaksi) on konservoitunut lysosomaalinen hajoamisreitti, joka osallistuu moniin perusfysiologisiin prosesseihin, kuten homeostaasiin ja synnynnäiseen ja adaptiiviseen immuniteettiin [208–210]. Autofagialle on ominaista kaksoiskalvovesikkelin muodostuminen, nimeltään "autofagosomi", joka imee sytoplasmiset lastit (eli organellet, aggregaatit ja patogeenit), jotka on tarkoitettu hajoamiseen (kuva 2). Tämän prosessin aikana lastia sisältävät autofagosomit sulautuvat lysosomien kanssa hajotettaviksi ja kierrätettäviksi.

Antigeenin esittely autofagian kautta on kuvattu sekä MHC-luokan I että luokan II kohdalla [204]. Autofagian induktion jälkeen solunsisäiset antigeenit imeytyvät autofagosomeihin ja fuusioituvat MHC:n luokan II sisältävien osastojen kanssa tarjotakseen niille ulkoista patogeenimateriaalia (kuva 2) [211]. Autofagian rooli tässä nimenomaisessa MHC-luokan II antigeenin esittelyssä kuvattiin ensin Epstein-Barr-virusinfektiolle, jossa autofagian esto johti CD4- ja T-soluaktivaation vähenemiseen [212,213]. Tähän mennessä esimerkkejä ovat useat virukset, mukaan lukien herpes simplex -virus [214], influenssavirus [215] ja ihmisen immuunikatovirus tyyppi 1 (HIV{11}}) [216], ja ne ulottuvat todennäköisesti mainoksiin (katso alla). MHC-luokan II esitys on yhdenmukainen autofagian prosessin kanssa, koska se on sytosolinen puolustusmekanismi. Autofagia on myös osallisena solunulkoisten antigeenien MHC-luokan II ristiesittelyssä [214]. Todellakin, solunulkoisen ovalbumiinin MHC-esitys on tehokkaampaa, kun autofagiakoneisto (ja erityisesti ATG5) toimii, ja solunulkoisen materiaalin oton osoitettiin sisältävän ei-kanonisen autofagian muodon, jota kutsutaan LC3--assosioituneeksi fagosytoosiksi. LAP) [217].

Kun jotkin solunulkoiset antigeenit ovat läsnä LAP-osassa, ne voidaan altistaa MHC-luokan II esittelyn kautta [218]. Autofagia on myös jossain määrin osallisena MHC-luokan I esittelyssä, vaikka suurin osa epitoopeista esitetään mekanismin kautta, joka on tiukasti riippuvainen antigeeninkäsittelykompleksiin (TAP) liittyvästä kuljettajasta [219]. Autofagian välittämä TAP-riippumaton esitys on toistaiseksi osoitettu vain TAP:n ehtymisen olosuhteissa [219 220]. Se, onko tämä esitystapa todella olemassa, on edelleen kiistanalainen [221] ja sitä käsitellään muualla [204 222 223].

Estääkseen MHC-esityksiä mainokset omistavat suuren osan genomistaan, nimittäin E3-alueesta, heikentämään MHC-esitysjärjestelmää soluissa [224–228]. Useimmissa (rokote)vektoreissa nämä geenit puuttuvat, ja viimeaikaiset työt viittaavat siihen, että MHC:n lisäämä antigeenin esittely voisi parantaa Ad-rokotteen tehokkuutta [229 230]. Autofagialla on ratkaiseva rooli Ad-antigeenien prosessoinnissa MHC-luokan II esittelyä varten Ad-indusoidussa immuniteetissa [108 229].

Montespan et ai. osoittivat, että Ads indusoi autofagiaa endosomiin tunkeutuessaan ja että tässä prosessissa autofagian puhdistamiin hiukkasiin pääseminen esitellään tehokkaasti immuunijärjestelmälle [108]. Tämä havainto on yhdenmukainen Kleinin et ai. julkaiseman tutkimuksen kanssa. osoittavat, että onkolyyttisten mainosten yhteydessä virusantigeenit kypsyvät JNK-riippuvaisen autofagian muodossa [229]. Syövän yhteydessä autofagialla on kuitenkin kaksinkertainen rooli. Homeostaasin ylläpitäjänä autofagia rajoittaa kasvaimen alkamista [231], kun taas pitkälle edenneessä syövässä autofagia toimii eloonjäämisprosessina, joka edistää kasvaimen kasvua [232,233]. Siten onkolyyttisten vektoreiden yhteydessä kasvainspesifiset autofagian ominaisuudet tulisi arvioida huolellisesti.

3. Adenovirukset (rokote)vektoreina

Viruksen vektorisointiin liittyy sen luonnollisten ominaisuuksien hyödyntäminen, samalla kun minimoidaan siihen liittyvä biologinen riski. Näillä termeillä Ads ovat erinomaisia ​​vektoriehdokkaita rokotteiden kehittämiseen [234]. Adenovirusvektorit ovat stabiileja, niitä on helppo tuottaa korkeaan tiitteriin ja niillä on suuret kloonauskapasiteetit. Tämä mahdollistaa siirtogeenin insertion, ts. valitun antigeenin ilmentämisen. Niillä on laaja tarttuvuuskirjo ja ne transdusoivat jakautumattomia soluja, ja niiden genomi ei ole integroituva [1]. Kuten edellä on kuvattu, ne aiheuttavat myös tulehdusvasteen antigeeniä esittelevissä soluissa (APC), jotka toimivat adjuvanttifunktiona vahvistaen immuunivastetta, joka tarvitaan tehokkaaseen rokotukseen [2,3,142,235,236].

Lisäksi ad-peräisiä vektoreita on käytetty laajasti prekliinisissä ja kliinisissä kokeissa niiden turvallisuuden osoittamiseksi [237 238]. Replikaatiosyklin ei-toivotun osan eliminoimiseksi viruksen replikaatio on estettävä solujen hajoamisen ja viruksen lisääntymisen estämiseksi. Adenovirusvektorin kehitys alkoi 1990-luvun alussa alustana laajalle valikoimalle terapeuttisia lähestymistapoja, kuten geeniterapiaa, onkolyyttisiä vektoreita ja rokotteiden kehittämistä. Suurin osa varhaisista vektorien kehityksestä oli lajin C virusten modifioituja versioita.

3.1. Adenovirusvektorin kehittäminen, sukupolvien lähestymistapa

Ad-vektorin ensimmäinen sukupolvi tehtiin poistamalla E1- ja E3-alueet virusgenomista, erityisesti koodaamalla välitöntä varhaista transkriptiotekijää, mikä esti näitä vektoreita replikoitumasta. Näillä vektoreilla oli noin 8 kb:n kloonauskapasiteetti siirtogeenin liittämiseksi säätelysekvensseineen [239–241]. Ensimmäisen sukupolven vektorit tuotettiin ihmisen alkion munuaissoluissa (HEK), jotka oli stabiilisti transformoitu Ad5-viruksen genomin osalla, joka täydentää E1-aluetta in trans [242–247]. Yksi tämän järjestelmän suurimmista haitoista on, että se mahdollistaa replikaatiokykyisten genomien uudelleenmuodostamisen spontaanin rekombinaation jälkeen [248]. E3:n lisädeleetio, joka ei ole välttämätön vektorituotannon kannalta, kasvattaa siirtogeenikasetin kokoa [243] ja edistää parempaa immuunivastetta [240].

Valitettavasti ensimmäisen sukupolven Ad-vektorit eivät olleet täysin transkriptionaalisesti inerttejä ja ne saivat silti aikaan vahvan immuunivasteen viruksen kapsidiproteiineja vastaan, jotka ilmentyivät lähtötasolla [141 249 250]. Tämä lentivector-immuniteetti vaikutti vektorin toksisuuteen ja transdusoitujen solujen lyhytaikaiseen eliminaatioon [145]. Ad-vektorien toisen sukupolven E2- ja E4-alueet oli lisäksi poistettu vektorin genomista. E2 koodaa replikaatioentsyymejä ja E4:n muita säätelyproteiineja [251–253]. Tämä antoi tilaa 10,5 kb:lle siirtogeenisekvensseille, mukaan lukien jopa neljä ilmentymiskasettia [254]. Samoin täydentävät deleetiot vähensivät voimakkaasti ei-toivottua rekombinaatiota ja pitkittynyttä siirtogeenin ilmentymistä [255]. Tämä johtui luultavasti vähentyneestä poikkeavasta virusgeenin ilmentymisestä, joka edelleen vähentää anti-vektoriimmuniteettia [141 250 251]. Kolmannen sukupolven adenovirusvektorit ovat käsitteellisesti erilaisia. Ne koostuvat pakatusta vektorigenomista ja pakkaamattomasta virusgenomista (auttajaviruksesta), joka tuottaa vektoripartikkeleita. Sellaiset vektorit tunnetaan myös "auttajasta riippuvaisina", "suolittomina" tai "suuren kapasiteetin" (HC-Ad) vektoreina. Niillä on suurin mahdollinen kloonauskapasiteetti ja ne voivat kuljettaa jopa 36 kb:n sekvenssejä [256–258]. Suuren kapasiteetin mainoksilta puuttuu viruskoodaussekvenssi paitsi ITR:t ja lyhyt kapselointisignaali, joka mahdollistaa genomin pakkaamisen ja joka puuttuu auttajaviruksesta [259–262]. Tämä strategia on antanut meille mahdollisuuden voittaa useimmat anti-vektoriimmuniteetit, mikä mahdollistaa siirtogeenien pitkäaikaisen ilmentymisen [263–267]. HC-Ads eivät kuitenkaan ole osa nykyistä rokotevektorivalikoimaa.

3.2. Adenovirus rokotevektorina

Ennen kuin tutkitaan, kuinka Ad-vektoreita on hyödynnetty, on huomionarvoista mainita, että rokotus Ad-lajin B viruksia tyyppiä 4 ja tyyppiä 7 vastaan ​​kehitettiin 1970-luvun alussa [268]. Tämä oraalinen elävä rokote on ollut pakollinen vuodesta 2011 lähtien USA:n armeijan rekrytoijille, ja se on laskenut dramaattisesti tartuntatasoa ja saavuttanut käytännössä nollan [269–271]. Tämä korosti Adsin luontaista tehokkuutta ja turvallisuutta rokotteena ja avasi kentän käyttää Adsia rokotusalustana. Tähän mennessä yli 200 mainoksiin perustuvaa rokotetta on aloitettu kliinisissä kokeissa [272]. Monet niistä on suunnattu tarttuvia patogeenejä, kuten HIV{10}} ja Ebola [230 273 274], vastaan. Adenoviruspohjaisilla rokotteilla ei ole haittoja. Äskettäin kehitetty anti-HIV-rokote, joka perustui lajin C virukseen Ad5, käytti vektoreiden seosta, jotka ilmensivät HIV-1 gag-, pol- ja nef-geenejä [275 276]. Vektorit olivat turvallisia, immunogeenisiä ja hyvin siedettyjä. Valitettavasti tuloksena saatu kliininen STEP-tutkimus jouduttiin keskeyttämään ennenaikaisesti [277–279]. Tämän rokotteen ei ole osoitettu ainoastaan ​​suojaavan HIV-tartunnalta, mutta epidemiologiset tiedot viittaavat siihen, että Ad-rokote tässä tapauksessa lisäsi HIV-infektioriskiä [280–282]. Aiemmin olemassa oleva immuniteetti Ad5:tä vastaan ​​tunnistettiin mahdolliseksi rokotuksen jälkeiseksi riskitekijäksi [283 284]. Tätä havaintoa ei kuitenkaan vahvistettu vastaavissa tutkimuksissa [285 286], ja se on edelleen mekaanisesti epäselvä [287 288]. HIV:n ohella mainokseen perustuvia vektorirokotteita on kehitetty taistelussa ebolaa (Ad-EBOV) vastaan, joka on toistuva uhka Länsi-Afrikassa [289]. Kaikki Ad-EBOV-rokotteet käyttävät Ebola-glykoproteiinia (GP) rokotteen antigeeninä. Alkuperäisissä prekliinisissä kokeissa jyrsijöillä ja kädellisillä käytettiin Ad5:tä, ja ne osoittivat suojan 3 kuukauden ajan neutraloivien vasta-aineiden ja CD8:n sekä aktivoitumisen myötä [273 290–292]. Tämä rokote kävi läpi vaiheen II kliinisen tutkimuksen; kuitenkin rokotetussa populaatiossa olemassa oleva immuniteetti Ad5:tä vastaan ​​on johtanut vaihteluun herätettyjen neutraloivien vasta-aineiden määrässä [293–297]. Tämän ongelman ratkaisemiseksi on kehitetty rokotteita, jotka perustuvat vähemmän yleisiin D Ad26 -lajeihin [186 298 299].

Ad26 on kuitenkin vähemmän immunogeeninen ihmisillä, mikä johtaa heikentyneeseen rokotuksen tehokkuuteen ja vaati ensisijaista tehostetta käyttämällä tuhkarokkoviruspohjaista rokotetta (MVA). Tämä rokotusohjelma on saavuttanut vaiheen III kliiniset tutkimukset [289 300 301]. Myös ei-ihmis-mainosvektoreiden käyttöä on kehitetty [184]. Simpanssin ChAd3:n käyttö rokotealustana EBOV:tä vastaan ​​osoitti suojaa jyrsijöillä ja simpansseilla [302 303], ja kliiniset tutkimukset, joissa käytettiin näitä vektoreita, ovat eri vaiheissa [17 300 301 304–306].

Viime aikoihin asti HIV{0}}- ja EBOV-rokotteet olivat kaksi tärkeintä esimerkkiä mainosvektoripohjaisten rokotteiden soveltamisesta, mutta ne eivät ole ainoita. Ad-rokotevektoreita on yritetty käyttää eri patogeenejä, kuten Mycobacterium tuberculosis [307–310], denguevirus [311–313], hepatiitti B ja C [314–320], raivotauti [321–324] tai influenssa, vastaan. [325–328]. Niiden tehokkuus oli kuitenkin aina odotuksia alhaisempi (lisätietoja [18 142 300 329]). EBOV-rokoteehdokas on pysynyt ainoana käytännössä käytettävänä Ad-rokotteena, ja sitä käytetään tietyin rajoituksin Kongon demokraattisessa tasavallassa. Tämä rokote perustuu Ad26-tyyppiin (Ad26-ZEBOV/MVA-BN-FILO), ja toukokuussa 2020 20 339 ihmistä sai ensimmäisen rokotusannoksen ja 9 560 oli täysin rokotettu [230 301 330].

Adenovirusvektoroidut rokotteet ovat saaneet suuren julkisen vauhdin vastauksena SARS-CoV-2-pandemiaan. Tilanteen kiireellisyys on mahdollistanut niiden kehityksen hyödyntämisen, mukaan lukien kokemukset, jotka on saatu rokotteista, jotka on kehitetty koronaviruksia vastaan, jotka aiheuttivat aikaisempia alueellisia SARS-CoV-1-epidemia [331]. Koronaviruksen piikki (S) glykoproteiini tunnistettiin parhaaksi rokoteantigeeniksi immuniteetille koronavirusinfektioita vastaan ​​[332 333]. Tähän mennessä neljä Ad vektorirokotetta, jotka kaikki koodaavat piikkiantigeenia, ovat edistyneessä tilassa ja ne on myönnetty hätäkäyttöön suuressa osassa maailmaa. Sovelletut vektoristrategiat ovat olleet hieman erilaisia, mutta niissä on pääasiassa käytetty ensimmäisen sukupolven vektoreita. Ne vaihtelevat lajiin C Ad5- perustuvien vektoreiden (Ad5-nCoV) käytöstä, olemassa olevan immuniteetin voittamisesta suurella vektoriannoksella (CanSino) [187 334] aina vähemmän yleisen D-lajin virusten käyttöön. Ad26, käyttämällä stabiloitua piikkiglykoproteiinia (JNJ-78436735/Ad26.COV2.S) [335]. Vaihtoehtoinen lähestymistapa käyttää ChAdOx1-S-(AZD1222), simpanssien mainosvektoria [336 337]. Ainoa käytössä oleva rokote, joka perustuu heterologiseen prime-boost-strategiaan vektoriimmuniteetin voittamiseksi (Gam-COVIDVac/Sputnik V), käyttää ensin Ad26--pohjaista vektoria ja sitten tehosteinjektiossa Ad5-vektoria [338,339]. Kaikissa tapauksissa kliinisistä kokeista saadut tiedot ovat olleet erittäin lupaavia, ja ne ovat osoittaneet indusoituneen suojaavan immuniteetin korkeaa tasoa, ja useissa maissa on myönnetty hätäkäyttöä Ad-pohjaisten rokotteiden käytölle. Lisäksi eri maissa käynnissä olevista rokotuskampanjoista tehdyt epidemiologiset tutkimukset viittaavat ylivoimaiseen menestykseen Ad-pohjaisten SARS-CoV{33}}-rokotteiden käytössä.

4. Adenoviruksen (rokotteen) vektorin tehokkuuden muuntaminen, kapsidi johtaa tietä

Adenovirus (rokote) vektorin suunnittelussa on otettava huomioon useita tekijöitä. Näitä ovat koodatun antigeenin pitkän ja jatkuvan ilmentymisen ylläpitäminen ja immunologisen kontekstin (adjuvanttivaikutus) aktivointi, joka mahdollistaa antigeenin ilmentymisen tehokkaan translaation pysyväksi adaptiiviseksi immuniteetiksi, joka on suunnattu immunogeeniä vastaan, mutta ei itse vektoria vastaan. Immunologisen kontekstin tarjoaa luontainen immuuniaktivaatio, jonka rokotevektori saa aikaan annon aikana. Tässä yhteydessä tehokkuus, jolla synnynnäiset immuunianturit havaitsevat vektorin, on tärkeää, ja se puolestaan ​​määrittää adaptiivisen vasteen amplitudin. Kuten yllä olevissa osissa on kuvattu, luontainen immuunitunnistus tapahtuu pääasiassa sisääntulon jälkeisellä tasolla, samanaikaisesti Ad-endosomien tunkeutumisen kanssa. (Rokote)antigeenin tehokas ilmentyminen riippuu sitten tasapainosta vektorin puhdistuman tason vs. onnistuneen kuljetuksen ja vektorigenomien tumaan ilmentymisen välillä. Kun kehitetään kapsidinäyttövektoreita, siirtogeenin ilmentämistä ei vaadita immuuniaktivaation aikaansaamiseksi. Tämä strategia perustuu kiinnostavan epitoopin liittämiseen Ad-kapsidiproteiineihin, mikä mahdollistaa sen suoran altistumisen immuunijärjestelmälle. Vaikka tällä lähestymistavalla on joitain etuja, useimmat rokotevektorit luottavat geneettisesti koodattuihin geeneihin. Lisätietoja kapsidinäyttövektoreista on näissä katsauksissa [340 341].

Aiemmin olemassa oleva immuniteetti virusvektoria vastaan ​​(esim. 30–90 prosenttia lajin C virusta Ad5 vastaan ​​maantieteellisestä sijainnista riippuen) voi vähentää vektorin sisäänottoa ja vähentää antigeenin ilmentymistä ja siitä johtuvaa immuunivastetta [342–344]. Useita strategioita on kehitetty vähentämään vektorivastaista immuniteettia, ja niitä on äskettäin tarkasteltu [249]. Lyhyesti sanottuna neutraloivat vasta-aineet tunnistavat pääasiassa eksonien hypervariaabelin silmukan ja ovat sen seurauksena serotyyppispesifisiä [178–180]. Nämä hypervariaabelit silmukat voidaan siksi korvata toisen, vähemmän yleisen serotyypin silmukailla [178 345]. Tämä estää vektorin neutraloitumisen ja inaktivoitumisen. Koska Ad5 on seroprevalenssityyppi, harvinaisten serotyyppien, kuten Ad26, Ad35 tai ei-ihmismainosten, käyttö myös välttäisi tämän ongelman [177,346–350].

Harvinaisten tyyppien käytön suuri haittapuoli on kuitenkin niiden alempi immunogeenisyys, mikä tekee niistä vähemmän tehokkaita rokotteiden kehittämisessä [298]. Siksi strategioita vektorin vastaisen immuniteetin vähentämiseksi tulisi kehittää rinnakkain vektorin immunogeenisyyden tehostamiseen tähtäävien strategioiden kanssa tehokkaimman vektorin saamiseksi. Vaikka vektoria vastaan ​​suunnattujen neutraloivien vasta-aineiden alkutaso on alhainen, rokotus tietyllä vektorityypillä voi laukaista vasteen, joka estää sen käytön tulevaisuudessa. Anti-vektorivasteen pohjustus tapahtuu myös sisääntulon jälkeisellä tasolla, kun vektoripartikkelit lajitellaan ja käsitellään itse antigeeneinä. Immunologisesti suotuisan kontekstin aikaansaaminen rokotuksen onnistumiselle voi tapahtua vektoriimmuniteetin lisääntyneen esikäsittelyn kustannuksella. Parametrien ymmärtäminen, jotka määräävät mainosvektorien kohtalon käyttöönoton jälkeen, voi tarjota mahdollisuuden vektorien suunnitteluun.

4.1. Vakaus on lajeissa

Reseptorivälitteinen sisäänotto ja poistuminen endo-lysosomaalisesta osastosta ovat Ad-infektion ja vektorin transduktion tunnusmerkkejä. Alkuperäinen sisäänotto määräytyy viruskuidun ja pentonimolekyylien vuorovaikutuksen perusteella solureseptorien kanssa. Kuitu ja pentoni ovat yhteisiä kaikille mainoksille, mutta lajinsa mukaan ne kytkeytyvät erilaisiin solureseptoreihin (taulukko 1). C-lajin virukset käyttävät CAR:a, ja sisään pääsevät hiukkaset pakenevat varhaisesta endosomaalisesta osastosta [79]. Jos lajin C virukset (Ad5) on suunniteltu sisältämään kuitumolekyyli B-lajin viruksesta (Ad16), tuloksena oleva partikkeli (Ad5F16) pakenee sitten lysosomaalisesta osasta (kuten värjäys lysosomaalisella markkerilla LAMP1) varhaisen sijasta. endosomi [351]. Tämä viivästynyt pakeneminen lysosomeista on ominaisuus, joka on yhteinen kaikille testatuille B-lajin viruksille [111 352 353].

Lisäksi hybridi Ad5F16 sekä lajin B virukset saavat aikaan vahvemman proinflammatorisen vasteen kuin lajin C virukset [159 351]. Tämä johtuu lisääntyneestä havaitsemisesta intraluminaalisen TLR9:n kautta immuunisoluissa [354]. Lisäksi lysosomin kalvovaurio, toisin kuin varhainen endosomivaurio, aiheuttaa voimakasta oksidatiivista stressiä. Lysosomin repeämä vapauttaa samanaikaisesti lysosomaalisia hydrolaaseja, kuten katepsiini B:tä, jotka voivat vahingoittaa mitokondrioita, mikä voimistaa vauriovastetta tulehduksen aktivoitumisen kautta [355–357]. Ad-ottoprosessi destabiloi kapsidin, mikä mahdollistaa virusproteiinin VI:n vapautumisen [103,106]. Vapautunut proteiini VI tunkeutuu sitten kalvon läpi endo-lysosomaalisesta osastosta, jotta virus pääsee sytosoliin. Lajien C ja B vertailu osoittaa, että molemmat virukset ovat yhtä tehokkaita sytosoliin pääsyssä ja genomin kuljetuksessa, mutta eroavat toisistaan ​​pakokinetiikassaan [111]. Se tosiasia, että yksinkertainen kuidunvaihto voi siirtää sisääntulo- ja immunogeeniset ominaisuudet lajista B lajin C virukseen, on huomattava. Se on todiste siitä, että hybridivektoreita, joilla on tietyt ominaisuudet, voidaan suunnitella. Taustalla oleva ero näyttää olevan se, että proteiini VI:n vapautuminen viivästyy B-lajin viruksissa (tai hybridiviruksessa) ja saattaa vaatia joko happamoitumista tai muuta tuntematonta purkamislaukaisinta.

Koska proteiini VI:n vapautuminen viivästyy tässä tapauksessa, tämä saattaa heijastaa lisääntynyttä kapsidin stabiilisuutta. Todellakin, lajin C Ad5 virusten osoitettiin vapauttavan kuitumolekyylin soluun sitoutuessaan, vaiheen oletettiin heikentävän kapsidia ja käynnistävän purkamisprosessin proteiini VI:n vapautumiselle. Tässä yhteydessä kuiduttoman Ad5:n osoitettiin olevan vähemmän stabiili kuin alkuperäiset hiukkaset [358]. Sitä vastoin kypsymättömät, hyperstabiilit Ts1 Ad2/5 eivät vapauta kuitua tai proteiini VI:tä ja ovat huonoja tulehduksen indusoijia, koska ne eivät laukaise TLR9:ää eivätkä aiheuta kalvovaurioita [114,138,359,360].

Ei ole tutkittu, mutta se on todennäköistä, estääkö kuitujen vaihto lajilla B kuidun vapautumisen alkuvaiheessa ja tekeekö lajin C kapsidista vakaampaa. Kapsidin stabiilius voi olla olennainen määrittäjä tunkeutumisen jälkeiselle kapsidin kohtalolle ja laajemmin ominaisuus, jota voitaisiin hyödyntää vektorien suunnittelussa. B-lajin virukset voivat olla stabiilimpia eri reseptorin käytön tai ainutlaatuisen kuitu-pentoni-vuorovaikutuksen vuoksi. Sitä vastoin lajin F virukset Ad40/41 infektoivat maha-suolikanavaa ja niillä on lisääntynyt kapsidin stabiilisuus johtuen niiden tropismista ja sopeutumisesta ankaraan suolistoympäristöön [24 361]. Suolen sisälämpötila on muutaman asteen ylähengitysteiden yläpuolella lajin C virusten kohteena (37 ◦C vs. 33 ◦C) [362]. Siten Ad40/41 ovat luonnostaan ​​lämpöstabiilimpia ja tukevat infektioprosessia [24], mikä tekee niiden leviämisestä myös vaikeaa [24 361 363].

Lisäksi heiltä puuttuu RGD-motiivi pentonimolekyylistä, mikä johtaa entisestään vähentyneeseen soluun pääsyyn [92]. Ei tiedetä, muuttuvatko nämä ainutlaatuiset kapsidiominaisuudet pakoksi lysosomaalisesta osastosta tai osittaisesta purkamisesta/proteiini VI:n vapautumisvirheistä sisäänpääsyn yhteydessä. Sitä vastoin nämä ominaisuudet voivat tarjota kontekstin oraalisten rokotesovellusten kehittämiselle. Toisin kuin lajin B kuidut, lajin F kuituja sisältävillä vektoreilla on vähentynyt immuuniaktivaatio [364], kun niitä käytetään normaaleissa ympäristöolosuhteissa. Jos tietty ihmislaji poistetaan kontekstista ja sitä käytetään rokotevektorina, voisi olla hyödyllistä tarkastella tämän vektorin luonnollista tropismia ja etsiä vihjeitä sen käyttäytymisen ennustamiseksi. Tällä hetkellä käytössä oleva Ad26:een perustuva rokotevektori on D-lajin virus, ja sen luonnollinen tropismi on silmät ja maha-suolikanava [365]. D-lajin virukset, mukaan lukien Ad26, ovat vähemmän immunogeenisiä kuin Ad5 [366], ja niiden osoitettiin kulkeutuvan myöhäiseen endosomaaliseen osastoon, mikä todennäköisesti sisältää viivästynyttä proteiini VI:n vapautumista.

Näin ollen myöhäisen endosomaalisen osan happamoitumisen estäminen vähensi entisestään sen immunogeenisyyttä [113]. Toisin kuin ihmismainoksissa, myös rokotuksissa ja vektorisoinnissa käytetyt ei-ihmismainokset ovat hyvin rajallisia. Simpanssista peräisin olevat mainokset, mukaan lukien ChAd3, ovat läheistä sukua D-lajin viruksille [367 368]. Mielenkiintoista on, että Ad5-vektorit ovat immunogeenisempiä kuin simpanssista peräisin olevat Ad-vektorit ja niillä on suurempi transduktiopotentiaali. Tämä havainto ei liittynyt eroihin penton RGD -motiivissa tai kuidussa, ja sen mekaaninen syy on tuntematon [369]. Mahdollisia eroja kapsidin stabiilisuudessa ei ole tutkittu. Toinen ei-ihmismainos, jota käytetään vektorina, on koiran mainostyyppi 2 (CAV-2). Tällä vektorilla on merkittävä ominaisuus transdusoida hermosoluja selektiivisesti, mutta ei ympäröivää gliasoluja, toisin kuin Ad5-kontrollivektorilla, vaikka molemmat vektorit käyttävät samaa reseptoria [370–372]. Tämä kyky voi liittyä lisääntyneeseen kapsidin stabiilisuuteen, mikä mahdollistaa päällyksen poistamisen vain hermosoluissa. Koirien ruumiinlämpö on ~2 ◦C korkeampi kuin ihmisten, mikä saattaa johtaa kohonneeseen CAV-2-kapsidistabiilisuuteen [373], joka on analoginen lajin F viruksille. CAV-2 saa huonosti aikaan synnynnäisen immuunivasteen, mikä vastaa tehokkaan hajoamisen puutetta kohdesoluissa [372]. Näin ollen CAV2-vektorit voivat olla toinen esimerkki, jossa sen luonnolliseen tropismiin tai isäntään liittyvällä biofysikaalisella ominaisuudella on potentiaalia tarjota uusia vektorin ominaisuuksia.

4.2. Kapsidirakenteen hienosäätö, esimerkki proteiini VI:stä lajissa C Ad2/5

Jos kapsidin stabiilisuus ja proteiini VI:n vapautuminen määräävät viruskapsidin alavirran kohtalon, herää kysymys, voidaanko tätä modifioida Ad-vektoreissa, eli antaa virusvektoreille uusia ominaisuuksia (kuvio 3). Suurin osa ymmärryksestämme siitä, kuinka mainokset tunkeutuvat endolysosomaaliseen osastoon, on peräisin lajin C viruksista Ad2/5. Proteiini VI:n löytäminen kalvolyyttisenä tekijänä oli olennaista tämän prosessin ymmärtämiseksi [103,106]. Proteiini VI koodaa N-terminaalista amfipaattista heliksiä, joka on proteiinin varsinainen kalvolyyttinen osa. Viruksen tuotannon aikana proteiini VI ilmentyy esiasteproteiinina, joka assosioituu heksonitrimeerien kanssa amfipaattisen heliksin kautta [42 374]. Kompleksi tuodaan tumaan proteiini VI:n N- ja C-päässä koodaamien kuljetussignaalien kautta, jotka poistetaan viruksen kokoamisen ja viruksen proteaasin kypsymisen aikana. C-terminaalinen 11 aminohapon peptidi aktivoi myös proteaasin, mikä tarjoaa älykkään tavan yhdistää viruskokoonpano amfipaattisen heliksin suojaukseen. Ts1 Ad2/5-mutanttiviruksella on proteaasin pakkausvirhe, eikä mitään kapsidiproteiineista, mukaan lukien proteiini VI, prosessoida. Tuloksena olevat hiukkaset ovat hyperstabiileja, säilyttävät kuidut eivätkä käytä proteiinia VI:ta.

Tämän seurauksena Ts1-partikkelit lajitellaan lysosomeihin reseptorivälitteisen endosytoosin seurauksena. Proteiini VI:n tarkka sijainti kypsässä viruksessa ei ole selvä, mutta pilkottu N-pää lokalisoituu peripersonaalisten eksonien sisäheksonipinnalle [37,104,375]. Kahden pistemutaation proteiinissa VI, G33A ja S28C, osoitettiin lisäävän Ad5-kapsidin stabiilisuutta (kuvio 3A) [376 377]. Ensimmäinen mutantti edeltää N-terminaalista proteaasin pilkkoutumiskohtaa proteiinissa VI ja heikentää prosessointia. Tuloksena olevat hiukkaset ovat osittain epäkypsiä, ja niille on ominaista endosomin hajoamisvika, mikä viittaa siihen, että proteiini VI:n N-pää stabiloi virionin sisäisiä proteiini-proteiinivuorovaikutuksia [376]. Toinen mutantti valittiin sen kyvyn perusteella muodostaa molekyylinsisäisiä disulfidisiltoja [377].

Virus sisälsi osittain prosessoimattomia proteiineja, mahdollisesti sisältäen proteiinin VII, mutta se ei yllättäen osoittanut mitään tarttuvuusvirheitä, huolimatta sen lisääntyneestä stabiilisuudesta. Ei tiedetä, onko jommankumman viruksen immuuniaktivaatioprofiili muuttunut. Toinen proteiini VI:n pistemutaatio, joka vaikuttaa viruksen kohtaloon, on proteiini VI L40Q -mutaatio, joka sijaitsee suoraan amfipaattisessa heliksissä (kuva 3A) [378 379]. Virukset, joilla on tämä mutaatio, kypsyvät normaalisti, mutta ovat osittain puutteellisia endosomin lyysivaiheessa. Toisin kuin edellä mainitut mutantit, L40Q-virionit ovat vähemmän stabiileja kuin niiden villityypin vastineet. Viiveen sijaan proteiini VI sekä pentoni vapautuvat ennenaikaisesti L40Q-kapsidista. L40Q-virionit ovat vähemmän tarttuvia ja ovat osittaisen lysosomien lajittelun kohteena. L40Q-mutaatio ei kuitenkaan täysin poista kalvon hajoamista, ja jotkut virukset pakenevat sytosoliin, mikä johtaa L40Q-vektorin kokonaistarttuvuuden vähenemiseen noin nelinkertaisesti [379 380]. Havainnot viittaavat siihen, että amfipaattinen heliksi vaikuttaa vuorovaikutuksellaan hiukkasten stabiilisuuteen. Ei tiedetä, muuttaako L40Q-mutaatio Ad5-vektorien immunogeenisiä ominaisuuksia ja miten. Viimeaikaiset havainnot viittaavat siihen, että proteiini VI:n vapautumisen kapsidista laukaisee sisäinen kilpailu proteiini VII:n kanssa samoista tai päällekkäisistä sitoutumiskohdista eksoneissa [375].

Johdonmukaisesti mutanttivirus, josta puuttuu proteiini VII, ei pääse pakoon endosomista ja sillä on vika endosomin hajoamisessa [58]. Sisäisen kapsidin (eli proteiini VI) ja ydinproteiinien (eli proteiini V ja VII) rakenteellisen ja dynaamisen organisaation ymmärtäminen hiukkasessa ja soluun pääsyn aikana auttaa suuresti ymmärtämään, mikä määrittää (palautuvan) kapsidin stabiilisuuden.

Ad-vektoreiden immuuniaktivaation tehokkuuden kontrollointi on tärkeä kiinnostuksen kohde rokotteiden kehittämisessä, ja antigeenien MHC-esittelyn laajentaminen parantaisi rokotteiden kehitystä [381]. Kuten aiemmin mainittiin, autofagia säätelee immuuniaktivaatiota ja syöttää peptidejä MHC:hen. Autofagia on yksi vanhimmista solujen puolustusmekanismeista infektioita vastaan, mutta Ads, mukautuneina ihmisen patogeeneina, eivät ole kehittäneet mekanismeja autofagian välttämiseksi sisääntulon yhteydessä. Sen sijaan ne näyttävät omaksuvan autofagian aktivoinnin ja siirtävän vastuun tartunnan edistämiseen. Proteiini VI:llä on keskeinen rooli solun autofagiavasteen säätelyssä. Proteiini VI:n aiheuttama adenoviruksen kalvon hajoaminen johtaa galektiini 3:n ja galektiini 8:n kerääntymiseen, jotka solu tunnistaa vaarasignaaleiksi (kuvio 3B) [108,109,382]. Ad-penetraatiokohtien havaitseminen galektiinien avulla aktivoi selektiivisen autofagian infektoidussa solussa, kuten autofagiareseptorien (esim. NDP52 ja p62) kerääntyminen ja LC3-pisteiden muodostuminen osoittavat [108].

Mielenkiintoista on, että Ad5-vektoripartikkelit onnistuvat pakenemaan repeytyneestä endosomista ja voivat kulkea ytimeen. Autofagian estäminen ei vaikuta viruksen tarttuvuuskykyyn, mutta viivästyttää niiden genomin toimitusta ytimeen, mikä osoittaa, että Ads kaappaa solukoneiston voittonsa vuoksi [108]. Endosomista pakeneminen antaa siksi virukselle mahdollisuuden välttää autofagian aiheuttamaa hajoamista aktiivisen prosessin kautta. Tämän prosessin löysi vielä toinen proteiini VI -mutantti, M1-mutantti. Kaikki ihmismainokset (ja useat ei-ihmismainokset) koodaavat erittäin konservoitunutta PPxY-peptidi-motiivia proteiinissa VI. M1-mutantissa tämä motiivi muutettiin PGAA:ksi (kuvio 3) [104]. Sekä villityyppi että M1-mutantti vapauttavat tehokkaasti proteiini VI:n sisäänpääsyn jälkeen ja laukaisevat autofagian endosomaalisen kalvon repeämisen jälkeen. M1-mutanttivirus ei kuitenkaan pysty pakenemaan tehokkaasti sytosoliin, ja EM-kuvat ovat osoittaneet, että M1-mutanttivirukset ovat loukussa repeytyneisiin endosomeihin, joihin autofagia kohdistuu.

Näin ollen M1-mutanttiviruksella osoitettiin olevan voimakas tarttuvuusvika, joka palautuu autofagian farmakologisella ja geneettisellä estolla. Tutkimus osoitti, että villityypin virukset käyttävät PPxY-motiiviaan rekrytoidakseen ubikvitiiniligaasi NEDD4.2:ta ja rajoittaakseen autofagosomien kypsymistä riittävän pitkään pakenemaan sytosoliin. Lisäksi tämä ominaisuus sallii viruksen rajoittaa antigeenistä esitystään [108]. Tärkeää on, että hiiriin injektoitu M1-mutanttivektori johti paljon vahvempaan vektorivastaiseen immuniteettiin ja vähentyneeseen CD8 plus -vasteeseen koodatulle siirtogeenille, mikä osoittaa, että yksinkertaisella kapsidin muutoksella voi olla syvällinen vaikutus Ad5-kapsidin immunogeenisyyteen. Ei tiedetä, vaikuttaako jokin muu proteiini VI -mutaatio immunogeenisuuteen. PPxY-motiivin läsnäolo L40Q-viruksessa saattaa kuitenkin selittää, miksi vektori säilyttää suhteellisen korkean tarttuvuuden kalvon hajoamisvirheestä huolimatta [379 380]. Koska endosomin hajoaminen on vähemmän tehokasta ja L40Q-vektorit päätyvät osittain lysosomaaliseen osastoon, on mahdollista, että herätetty immuunivaste on vielä erilainen kuin villityypin, Ts1- tai M1-Ad5-kapsidit.