Varicella zoster -viruksen katkaistu glykoproteiini E on ihanteellinen immunogeeni Escherichia coli -pohjaiselle rokotesuunnittelulle

Varicella zoster -virus (VZV) on erittäin tarttuva tekijä, joka on vastuussa sekä vesirokko- että herpes zoster -taudista. Korkeasta tehokkuudesta huolimatta lisensoitujen rokotteiden turvallisuuteen ja saatavuuteen liittyy edelleen ongelmia. Tässä pyrimme tuottamaan VZV gE -immunogeenin käyttämällä E. coli -ilmentämisjärjestelmää. Havaitsimme, että gE-proteiinin liukoista ilmentymistä ja saantoa voitaisiin parantaa proteiinin C-terminaalisten katkaisujen kautta, mikä helpottaa vankkaa ja skaalautuvaa puhdistusprosessia rokotteiden valmistuksessa. Lyijyllä typistetty gE (aa 31–358), josta käytetään jäljempänä nimitystä tgE, oli homogeeninen monomeeri liuoksessa ja osoitti erinomaista antigeenisyyttä. Lopuksi arvioimme ja vertasimme tgE:n immunogeenisyyttä kaupalliseen vodkan LAV- ja Shingrix-rokotteeseen. Havaitsimme, että alumiiniadjuvantilla varustettu tgE oli immunogeeninen verrattuna vodka-LAV:hen. Kun tgE:llä annettiin adjuvanttia AS01B:llä, kahden annoksen tgE-immunisaatio osoitti vastaavan tai paremman tehon vasta-ainevasteissa ja soluvälitteisessä immuniteetissa Shingrix-rokotteen kanssa samalla annoksella, erityisesti mitä tulee IFN- --ilmentämisen osuuteen. CD4+ T-solut. Yhteenvetona voidaan todeta, että tämä menetelmä E. coli -välitteiselle tgE-ilmentymiselle tarjoaa kustannustehokkaan ja skaalautuvan strategian ihanteellisen VZV gE-immunogeenin luomiseksi sekä vesirokko- että zoster-rokotteiden kehittämiseen.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

varicella zoster -virus, glykoproteiini E, Escherichia coli, rokote

JOHDANTO

Varicella zoster -virus (VZV) on patogeeninen ihmisen alfaherpesvirus, joka aiheuttaa kaksi pääasiallista sairausluokkaa: primaarinen vesirokkoinfektio, erittäin tarttuva sairaus, jolle on tunnusomaista rakkulamainen ihottuma iholla ja lieviä systeemisiä oireita, kuten kuumetta ja huonovointisuutta. pääasiassa lapsilla; ja herpes zoster (HZ), viruksen piilevä uudelleenaktivoituminen vasteena ikääntymisen aiheuttamaan heikentyneelle soluimmuunijärjestelmälle, joka aiheuttaa tuskallisen, paikallisen vesikulaarisen ihottuman (HZ) useiden muiden komplikaatioiden kanssa tai ilman niitä (Cohen, 2013; Heininger ja Seward, 2006; Zerboni et ai., 2014). Vesirokko ja HZ voidaan molemmat estää elävien heikennettyjen virusrokotteiden (LAV) avulla. Ensimmäisen LAV:n vesirokon ehkäisyyn kehittivät Takahashi et al. (1974), joka perustui vOka-viruskantaan, ja se lisensoitiin myöhemmin nimellä Varivax rutiinikäyttöön Yhdysvalloissa. Tätä seurasi Zostavaxin kehittäminen ja lisensointi HZ:n ehkäisyyn (Tseng et al., 2011). Valitettavasti 10 vuoden aikana Varivax-rokotusten alkamisesta lähes 1/3 HZ-tapauksista on vahvistettu liittyvän vOka-kantaan (Galea et al., 2008), mikä viittaa siihen, että vOka voi tartuttaa ja muodostaa latenssin villin tapaan. -tyyppiä virusta ja aktivoida sitten uudelleen aiheuttaakseen HZ:n. Lisäksi Zostavaxin teho on kääntäen verrannollinen potilaan ikään antohetkellä, ja iän lisääntyminen liittyy alhaisempaan tehoon (Oxman et al., 2005). Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että VZV-glykoproteiini E (gE) on runsain viruksen glykoproteiini virionin vaipan ja infektoituneen solun pinnalla. GE on myös yksi tärkeimmistä VZV:tä suojaavista antigeeneistä, joka pystyy indusoimaan solu- ja humoraalista immuniteettia luonnollisen vesirokkoinfektion aikana sekä vOka-rokotteen jälkeen (Arvin, 1992; Oliver et al., 2016). Äskettäin rekombinantti HZ-alayksikkörokote Shingrix (HZ/su) hyväksyttiin HZ:n ja siihen liittyvän postherpeettisen neuralgian (PHN) ehkäisyyn yli 50-vuotiailla aikuisilla (Shah et al., 2019; Syed, 2018). Kliinisissä tutkimuksissa Shingrix indusoi tehokkaan, VZV-spesifisen soluvälitteisen immuniteetin (CMI), jonka rokotteen kokonaisteho oli 97,2 % vähintään 50-vuotiaiden osallistujien keskuudessa ja 91,3 %:n suojausaste osallistujien keskuudessa, joka oli suurempi tai yhtä suuri kuin 70 vuoteen. Nämä havainnot osoittavat yhdessä merkittävästi pienentyneen HZ-riskin rokotetuilla henkilöillä iästä riippumatta ja siten tehokkaamman rokotevaihtoehdon verrattuna ZOSTAVAXiin (Lal et al., 2015; Shah et al., 2019).

cistanche-kasveja lisäävä immuunijärjestelmä

Shingrix on suunniteltu kiinanhamsterin munasarjasoluissa (CHO) ekspressoidusta yhdistelmä-gE-antigeenistä ja liposomipohjaisesta adjuvanttijärjestelmästä (AS01B), joka sisältää 3-Odesasyyli-4′-monofosforyylilipidi A (MPL) ja Quillaja saponaria Molina, fraktio 21 (QS21) (Dendouga et ai., 2012). Rekombinantti-CHO-solut vaativat kuitenkin pitkän tuotantosyklin, ja ne liittyvät monimutkaiseen puhdistusprosessiin, joka johtaa korkeisiin valmistuskustannuksiin ja rajoitettuun tarjontaan. Sinänsä Shingrix ei ole ihanteellinen rokotusratkaisu laajaan käyttöön etenkään kehitysmaissa (Kim et al., 2012). Mikrobiekspressiojärjestelmät tarjoavat useita etuja verrattuna nisäkkään ilmentämisjärjestelmiin, mukaan lukien nopea kasvu, viljelyn helppous ja alhaisemmat tuotantokustannukset (Overton, 2014), ja siksi niitä käytetään laajalti useiden biofarmaseuttisten valmisteiden ilmentämisessä ja tuotannossa (Adkins ja Wagstaff, 1998; Monie). et ai., 2008; Wu et ai., 2012). Useita vaikeuksia tuotannon aikana on kuitenkin voitettava, jotta yhdistelmä-DNA-teknisten eukaryoottisten proteiinien ekspressio prokaryoottisissa järjestelmissä onnistuisi, kuten virheellinen laskostuminen ja translaation jälkeisen modifikaation puute (Singh ja Panda, 2005). Näistä vaikeuksista huolimatta mikrobiekspressiojärjestelmät voisivat tarjota ihanteellisen järjestelmän laajalle levinneelle, kustannustehokkaalle rokotevalmistukselle, ja siksi se oikeuttaa tutkimaan antigeenit E. coli -ilmentämisjärjestelmästä VZV-rokotteen suunnittelua varten. Aiemmassa työssä osoitimme yhdistelmä-gE (rgE) -proteiinin onnistuneen ilmentymisen hyönteissoluissa ja saimme puhdistettuja proteiineja hiiren immunisaatioon ja mAb-tuotantoon (Liu et al., 2015). Tämän työn pohjalta tutkimme tässä, voidaanko gE-proteiini ilmentää E. colissa. Tutkimme gE-kandidaattiantigeenien ei-fuusioliukoista ilmentymistä C-terminaalisella typistyksellä (jäljempänä lyhennetyksi gE:ksi (tgE) tai tgE:ksi) E. colissa ja karakterisoimme puhdistetut tgE-proteiinit. Osoitamme, että puhdistettu tgE on antigeeninen, samanlainen kuin natiivi gE, ja kykenee indusoimaan korkeita vasta-ainetiittereitä vOka-neutralisoivalla aktiivisuudella hiirissä. Vertaamalla tutkimuksessamme tuotetun tgE-antigeenin immunogeenisyyttä LAV:hen ja Shingrixiin havaitsemme, että antigeenimme ei ainoastaan ​​osoita tehokasta humoraalista vastetta, vaan myös indusoi antigeenispesifisen CMI:n. Kaiken kaikkiaan E. coli -strategiamme tgE-proteiinin tuottamiseksi voi tasoittaa tietä vaihtoehtoiselle teollisesti tuotetulle immunogeenille sekä vesirokko- että HZ-rokotuksiin.

cistanche-edut miehille - vahvistavat immuunijärjestelmää

Napsauta tästä nähdäksesi Cistanche Enhance Immunity -tuotteet

【Kysy lisää】 Sähköposti:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

TULOKSET

Rekombinantin tgE:n ilmentäminen ja puhdistaminen E. colissa

VZV gE:n solunulkoista domeenia koodaavat DNA-sekvenssit valmistettiin rakenteina erilaisilla N- tai C-terminaalisilla typistyksillä ja kloonattiin pTO-T7-vektoriin proteiinin ilmentämistä varten E. colissa. gE:n täyspitkä ekstrasellulaarinen domeeni pyrki muodostamaan inkluusiokappaleita E. colissa ilmentymisen aikana, ja tätä voitaisiin parantaa C-terminaalisen katkaisun avulla. Erilaisista typistetyistä proteiineista paras liukoisuus saavutettiin gE (aa 31–358) -konstrukilla (kuva 1A), jota kutsutaan tästä eteenpäin typistetyksi gE:ksi tai tgE:ksi. Ehdokas tgE ekspressoitiin onnistuneesti liukoisena rekombinanttiproteiinina ja puhdistettiin bakteerilysaattien supernatantista käyttämällä kolmivaiheista kromatografiaa laboratoriomittakaavassa lisäarviointia ja mahdollisena rokotteena kehittämistä varten. Sieppaukseen käytettiin vahvaa anioninvaihtokromatografiaa, mitä seurasi keraaminen hydroksiapatiitti ja hydrofobinen kromatografia (kuvio 1B). Puhdistusprosessin peräkkäisissä vaiheissa tgE:n puhtaus lisääntyi SDS-PAGE:lla (kuvio 1C). tgE vaelsi noin 40 kD:n vyöhykkeenä ja osoitti hyvää reaktiivisuutta spesifisen vasta-aineen 1B11 kanssa (kuvio 1D). Kokonaissaanto oli noin 500 ug puhdistettua tgE:tä grammaa kohden bakteereja.

Typistetyn gE:n karakterisointi

Korkean suorituskyvyn kokoekskluusiokromatografiaa (HPSEC) ja analyyttistä ultrasentrifugointia (AUC) käytettiin analysoimaan puhdistettujen proteiinien homogeenisuus- ja sedimentaatiokertoimia. Kontrollina käytettiin hyönteissolujärjestelmästä puhdistettua rgE-proteiinia (Liu et al., 2015). HPSEC:ssä tgE esiintyi terävänä piikkinä vallitsevalla 16,1 minuutin retentioajalla (kuvio 2A), mikä kuvastaa puhdistettujen tgE-proteiinien suurta homogeenisuutta. AUC-kokeissa vallitseva sedimentaatiohuippu havaittiin -2,3 S:ssa (kuvio 2B), mikä vastaa -39,4 kD:tä, mikä osoittaa, että tgE esiintyy monomeerinä liuoksessa. Differentiaalista pyyhkäisykalorimetriaa (DSC) käytettiin testaamaan tgE-proteiinin lämpöstabiilisuutta seuraamalla lämpökapasiteettia termisen avautumisprosessin aikana. DSC-profiilit osoittivat vain yhden lämpömuutoksen proteiinin laskostumisen aikana siirtymälämpötilan (Tm) arvossa 63,80 astetta tgE:lle, joka on verrattavissa rgE:n (63,64 astetta) (kuvio 2C). Puhdistettujen tgE-proteiinien konformationaalisen eheyden tutkimiseksi analysoimme tgE:n antigeenisyyden ELISA-määrityksellä, jolloin kontrolleina toimivat hyönteissoluissa ilmennetyt puhdistetut rgE-proteiinit. ELISA-testissä käytettiin yhdeksää mAb:tä, jotka pystyivät tunnistamaan konformaatioepitooppeja (mAb 1B11, 4G4, 14G1) tai lineaarisia epitooppeja (4A2, 11B11, 11B12, 6H6, 10H6, 11E3). Löysimme samanlaiset mediaani tehokkaat pitoisuudet (EC50, ng mL−1) tgE- ja rgE-proteiineille useimmille vasta-aineille paitsi 1B11:lle, jonka reaktiivisuus oli lähes 10- kertaa pienempi, mikä viittaa niiden samanlaiseen antigeenisyyteen. Nämä tulokset viittaavat siihen, että rgE:n avainepitoopit ovat hyvin säilyneet tgE-proteiinissa.

Kuva 1 (väri online) Proteiinien ilmentäminen ja puhdistus. Kaavioesitys tgE-rakenteen suunnittelusta. E. coli -solut transformoitiin rekombinanttiplasmideilla, jotka sisälsivät typistetyn gE-geenin (aa 31-358). B, Kaavamainen esitys tgE-puhdistusprosessista. tgE puhdistettiin lysoidusta supernatantista käyttämällä kolmivaiheista kromatografiaa. C, tgE:n SDS-PAGE-profiili puhdistusprosessin aikana. TgE:n molekyylipaino on noin 40 kD. M: molekyylipainomerkki. Kaista 1: solulysaatista erotettu supernatantti; kaista 2: fraktio, joka sisältää tgE:n Q-FF-kromatografista; kaista 3: tgE:tä sisältävä fraktio CHT-kromatografista; kaista 4: fraktio butyylikromatografista, joka sisältää erittäin puhtaan tgE-proteiinin. D, puhdistetun tgE:n immunoblottaus.

TgE:n indusoimien immuunivasteiden analyysi hiirillä

Vertaaksemme tgE:n immunogeenisyyttä rgE:hen formuloimme proteiinit kahdella tutkimustyössä yleisesti käytetyllä adjuvantilla: alumiinipohjaisella adjuvantilla Al-001 ja Freundin adjuvantilla. Hiiret immunisoitiin kolmesti viikoilla 0, 2 ja 4 annoksella 1 ug sekä adjuvantoidulle tgE:lle että rgE:lle. gE-spesifisiä vasta-ainetiittereitä ja T-soluvasteita viikolla 5 ensimmäisen immunisoinnin jälkeen käytettiin eri adjuvanttiformulaatioiden immunogeenisyyden määrittämiseen. Hiirillä, jotka oli immunisoitu Al-001:lla formuloidulla tgE-rokotteella, oli samanlaisia ​​vasta-aineprofiileja kuin rgE-ryhmän hiirillä, ja Freundin adjuvantilla oli parempi stimulaatiovaikutus formuloituna tgE:llä kuin rgE:llä (kuvio 4A). Neutralisaatiotiittereissä ei havaittu eroja tgE- tai rgE-rokotteella immunisoiduissa hiirissä, ja neutraloivat tiitterit olivat ~103 tgE:lle, joka oli formuloitu eri adjuvanttien kanssa (kuvio 4B). Kuitenkin pernasolujen CD4+ T-solujen analyysissä intrasellulaarisella sytokiinivärjäyksellä (ICS), sekä tgE- että rgE-rokotteet saivat aikaan samanlaisia ​​gE-spesifisiä IFN-tasoja kuin suolaliuosryhmässä (kuva 4C, ~{ {22}},1 % joko rokoteryhmille tai suolaliuosryhmille) ja vain kohtalainen simulaatio gE-spesifisestä IL:stä{{20}} (Kuva 4D, ~0,2 % rokoteryhmissä vs. ~0,1 % suolaliuosryhmälle). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että tgE/Al-001 ja tgE/Freundin adjuvantti saavat aikaan gE-spesifisiä immuunivasteita, jotka ovat verrattavissa rgE:n aikaansaamiin immuunivasteisiin, joilla on erityisen voimakas humoraalinen vaste.

TgE-varicella-rokoteehdokkaan arviointi verrattuna LAV:hen

Seuraavaksi arvioimme vasta-ainetuotantoa ja alumiiniadjuvantilla varustettujen tgE-proteiinien pysyvyyttä BALB/c-hiirissä. Kaksi hiiriryhmää (n=5 ryhmää kohden) immunisoitiin kolmesti viikoilla 0, 2 ja 4 eri annoksilla 0,5 ug ja 5 ug tgE/Al{{ 8}} (kuvat 5A ja B). Vasta-ainevasteprofiilit osoittivat, että tgE-proteiinin primaarinen rokotus sai aikaan korkeat vasta-ainetiitterit, jotka nousivat jatkuvasti kahden tehosteimmunisaation jälkeen viikoilla 2 ja 4 ja saavuttivat maksimitason viikolla 6 ennen kuin laskivat hitaasti yli 1{{ 20}}4 seurantajakson aikana. Eri annostusryhmillä oli samanlaiset vasta-ainetiitteriprofiilit seurantajakson aikana ja samanlaiset korkeat neutraloivat tiitterit viikolla 6. TgE:n immunogeenisyys arvioitiin ja sitä verrattiin vodkaan. Puolitehokasta annosta (ED50) hiirillä käytettiin serokonversion mittana, ja alhaisempi ED50 osoitti parempaa immunogeenisuutta. Balb/c-hiiret erotettiin ryhmiin ja immunisoitiin intraperitoneaalisesti alumiiniadjuvantilla varustetulla tgE:llä (1, 0.5, 0.25, {{50}}.125, {{). 54}}.0625 tai 0.03125 ug; n{{30}}) tai vOka-rokote (1,000, 500, 250, 125 tai 62,5 pfu; n=6) sarjalaimennoksissa. Seerumit kerättiin 4 viikon kuluttua ja testattiin ELISA:lla. Serokonversio analysoitiin Reedin ja Muenchin menetelmän mukaisesti (kuvio 5C). Ikäryhmissä hiirillä serokonversioprosentti oli 83 %, 100 %, 100 %, 100 %, 50 % ja 17 % 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625 ja 0,03125 ug:n annoksilla. Vodkaryhmissä hiirillä oli alhaisemmat serokonversioluvut 67 %, 50 %, 33 %, 17 % ja 0 % 1, 000, 500, 250, 125 tai 62,5 pfu:n annoksilla. ED50-arvot olivat 0,063 ug tgE:lle ja 449,425 pfu vOkalle, mikä osoittaa, että tgE:n immunogeenisyys pienemmällä 0,3 ug:n annoksella vastasi kerta-annoksella vOkaa sisältävää vesirokkorokotetta (yleensä yli 2,{{78}). } pfu annosta kohti).

Kuvio 2 tgE- ja rgE-proteiinien karakterisointi. A, puhdistetun tgE:n HPSEC-profiilit. gE:n retentioaika on osoitettu. B, puhdistetun tgE-proteiinin sedimentaationopeusanalyysi. TgE:n sedimentaatiokerroin ja molekyylipaino määritettiin c(s)- ja c(M)-menetelmillä itsenäisesti. Kohdissa (A) ja (B) tgE näkyy mustana ja punainen sinisenä. C, puhdistetun tgE- ja rgE-proteiinin differentiaalipyyhkäisykalorimetriaprofiilit.

Kuvio 3 tgE:n ja rgE:n reaktiivisuudet mAb:iden kanssa. mAb:t sarjalaimennettiin ja saatettiin reagoimaan päällystettyjen tgE- tai rgE-proteiinien kanssa ELISA-määrityksessä. Reaktiot havaittiin käyttämällä HRP-leimattuja hiiren vastaisia ​​vasta-aineita. Kaksinkertaiset kuopat mitattiin samalla levyllä jokaiselle laimennokselle. EC50-arvot laskettiin sigmoidisuuntauksen sovituksella käyttäen GraphPad Prism -ohjelmistoa.

Kuvio 4 BALB/c-hiirillä testattujen tgE:n ja rgE:n immunogeenisyys 1 viikko kolmen annoksen immunisaation jälkeen. A, Vasta-aineiden tuotanto hiirissä tgE:lle ja rgE:lle, jotka on formuloitu erilaisilla adjuvanteilla. B, Neutraloivat vasta-ainetiitterit hiirissä tgE:lle ja rgE:lle, jotka on formuloitu eri adjuvanteilla. C ja D, tgE- tai rgE-rokotteiden indusoimien gE-spesifisten IFN- ja IL-2-vasteiden arvioinnit.

Kuva 5 Alumiinilla formuloidun tgE-rokotteen immunogeenisuustestit BALB/c-hiirillä. A ja B, tgE/Al-001:n vasta-aineiden pysyvyys ja neutraloiva vasta-ainevaste. Tiittereitä tarkkailtiin jopa 16 viikon ajan. C, ED50 hiirissä alumiiniformuloidulle tgE:lle ja vodkalle.

tgE Zoster -rokoteehdokkaan arviointi verrattuna Shingrixiin

Vertaaksemme tgE-rokotteemme immunogeenisyyttä Shingrixiin, lyofilisoitu tgE-proteiini formuloitiin Shingrix-adjuvantin AS01B kanssa. C57BL/6-hiiret immunisoitiin kahdella annoksella tgE/AS01B:tä tai Shingrixiä lihaksensisäisesti säärilihakseen viikoilla 0 ja 4. Vasta-ainetasot ensimmäisen immunisaation jälkeen viittaavat siihen, että Shingrix-immunisointi oli riittävä indusoimaan korkeita anti-gE-vasta-aineita. huomattavasti korkeampi kuin tgE/AS01B:n tuottamat; toisen immunisaation jälkeen ei kuitenkaan ollut merkittävää eroa vasta-ainetuotannossa näiden kahden ryhmän välillä (kuvio 6A). Mitä tulee neutraloivien vasta-aineiden tasoihin, tgE/AS01B:n kerta-annosimmunisointi johti merkityksettömien määrien neutraloivan vasta-aineen tuotantoon, mikä on merkittävästi pienempi kuin Shingrixin tuottama. Kuitenkaan jälleen kerran tehosteimmunisaation jälkeen emme voineet havaita merkittävää eroa neutraloivan vasta-aineen tuotannon suhteen näiden kahden ryhmän välillä (kuvio 6B). Immunisoinnin vaikutuksen CMI:hen todentamiseksi gE-spesifiset IFN- ja IL-2-tasot havaittiin ensimmäisen ja toisen immunisaation jälkeen käyttämällä entsyymikytketyn immunosorbenttipisteen (ELISPOT) määritystä ja solunsisäistä sytokiinivärjäystä. TgE/AS01B-immunisaatio indusoi heikon humoraalisen immuunivasteen verrattuna yksittäiseen Shingrix-annokseen, mutta osoitti vertailukelpoista tehoa IFN- -- ja IL-2--pernasoluja tuottavien pernasolujen indusoinnissa (kuva 6C). Todellakin, toisen immunisaation jälkeen tgE/AS01B-ryhmässä havaittiin merkittävä määrä gE-spesifisiä sytokiinia tuottavia soluja verrattuna suolaliuoskontrolliryhmään, jotka olivat myös vertailukelpoisia tai parempia kuin Shingrix-ryhmässä (kuva 6D). ). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin virtaussytometria-analyysissä, kun havaittiin samankaltaisia ​​osuuksia IFN- -ilmentävistä CD4+ T-soluista (kuva 6E) ja IL-2-ilmentävistä CD4+ T-soluista. soluja (kuvio 6F) ja IFN- -CD8+ T-soluja (kuvio 6G) tgE/AS01B- ja Shingriximmunisoitujen hiirten välillä riippumatta yksittäisestä tai tehosteannosimmunisaatiosta. Nämä tulokset osoittavat, että bakteerien ilmentämisjärjestelmästä peräisin oleva tgE-proteiini voi indusoida sekä humoraalisia että sellulaarisia immuunivasteita, kun se formuloidaan sopivien adjuvanttien kanssa, ja näin ollen sitä voidaan pitää kandidaattiantigeeninä VZV-rokotteen tuottamiseksi.

Kuvio 6 tgE:n immunogeenisyys C57BL/6-hiirissä. Annettiin 5 ug tgE:n annoksia, jotka oli formuloitu 50 μL AS01B-adjuvantin kanssa. Tämä oli 1/10 Shingrix-rokotteen annoksesta. Immunisointi suoritettiin viikoilla 0 ja 4. A, tgE/AS01B-rokotteen indusoiman vasta-ainetuotannon vertailu Shingrixiin verrattuna. Seerumititterit määritettiin ELISA-määrityksellä käyttämällä rgE-päällystettyjä levyjä. B, vOka-vasta-ainevasteen vertailu tgE/AS01B-rokotteella tai Shingrix-rokotteella rokotuksen jälkeen. Antiseerumin neutralointitiitterit viikolla 2 (vasen paneeli) ja viikolla 6 (oikea paneeli) ilmaistaan ​​seerumilaimennoksen käänteisarvona, joka johtaa 50 %:n estoon. C, tgE/AS01B-rokotteen tai Shingrixin indusoimien gE-spesifisten IFN- ja IL-2-vasteiden arviointi viikolla 2. IFN- -- ja IL-2--tuottavien pernasolujen määrät laskettiin ELISPOT-määritys uudelleenstimuloinnin jälkeen gE-peptidien poolilla. D, tgE/AS01B-rokotteen tai Shingrixin aiheuttamien gE-spesifisten IFN- ja IL-2-vasteiden arviointi viikolla 8. IFN- -- ja IL-2--tuottavien pernasolujen määrät laskettiin ELISPOT-määritys uudelleenstimuloinnin jälkeen gE-peptidien poolilla. E–G, virtaussytometriset määritykset gE-spesifisille sytokiinia ilmentäville CD4+- ja CD8+-soluille. IFN- -tuottavien CD4+ T-solujen, IL-2-CD4+ T-solujen ja IFN- -CD8+ T-solujen osuus solut määritettiin pernasolujen joukosta.

KESKUSTELU

VZV gE on humoraalisen ja soluvälitteisen immuunivasteen pääkohde luonnollisen vesirokkoinfektion aikana ja VZV Oka -rokotuksen jälkeen. Shingrix (GSK) on rekombinanttialayksikkörokote, joka sisältää CHO-soluissa ilmennetyn VZV-gE:n ja liposomipohjaisen adjuvantin AS01B:n. Toisessa työssä on pyritty tutkimaan alayksikkörokotteita HZ:tä vastaan ​​käyttämällä gE-proteiineja, jotka on tuotettu CHO:sta tai hyönteissoluista, jotka on formuloitu uusien adjuvanttien kanssa (Cao et al., 2021; Lee et al., 2020; Luan et al., 2022a, Luan et al., 2022b; Wang et ai., 2021; Wui ym., 2019; Wui ym., 2021). Tässä tutkimme ja osoitimme, että gE-proteiinia voitiin ekspressoida liukoisesti ja puhdistaa E. colista, ja sitten se voidaan formuloida alayksikkörokoteehdokkaaksi sopivan adjuvantin kanssa, joka ei saa aikaan ainoastaan ​​vahvaa neutraloivaa tiitteriä vaan myös vahvaa CMI-vastetta.

cistanche-kasveja lisäävä immuunijärjestelmä

E. coli ekspressiosysteeminä tarjoaa useita etuja: nopean solun kasvunopeuden, halvat viljelyolosuhteet ja tehokkaan ja monipuolisen työkalun rekombinanttiproteiinien tuottamiseksi. Herpesvirukseen liittyvällä antigeenitutkimuksella on ollut useita menestyksiä käyttämällä E. coli -pohjaista ekspressiojärjestelmää. Neutraloiva lineaarinen epitooppi gE (aa 121–135) on fuusioitu 149 aa:n kanssa hepatiitti B -viruksen ydinproteiinista (HBc) kimeeristen VLP:iden tuottamiseksi, jotka voivat indusoida VZV-spesifisiä neutraloivia vasta-aineita hiirissä (Zhu et al., 2016). Toisessa tutkimuksessa homologinen gE-proteiini Apinan vesirokkoviruksesta (SVV) ekspressoitiin E. colissa käyttämällä GST-fuusiomerkkiä gE-antiseerumin muodostamiseksi (Gray et ai., 2001). Toistaiseksi ei ole raportoitu VZV:n gE-proteiinista ilman E. colista puhdistettua fuusiomerkkiä rokoteehdokkaana.

gE koostuu kolmesta alueesta: 544-aa hydrofiilinen ektodomeeni, jossa on signaalipeptidi (aa 1–30), 17-aa hydrofobinen transmembraanialue ja 62-aa sytoplasminen häntäalue. Tutkimme useita ehdokasmolekyylejä, joissa oli erilaisia ​​katkaisuja gE-ektodomeenin N- tai C-terminaalisilla alueilla, ja havaitsimme, että näiden proteiinien eksogeeninen ilmentyminen E. colissa oli parasta käyttämällä katkaistua osaa (tietoja ei esitetty). Ehjällä gE-ektodomeenilla ilman fuusiomerkkiä on taipumus muodostaa inkluusiokappaleita, kun sitä ekspressoidaan E. colilla, ja sitä on vaikea puhdistaa. Testattujen katkaisuehdokkaiden joukossa gE (aa 31–358) proteiini osoitti korkeaa liukoista ilmentymistä minimaalisilla vaikeuksilla sen puhdistamisessa, sekä korkean puhtauden ja korkean homogeenisuuden (kuva 1). Näin ollen tätä typistysrakennetta pidettiin ihanteellisena ehdokasrokotteena. antigeeni. Tällä katkaisustrategialla olisi voinut olla mahdollinen vaikutus proteiinin ominaisuuksiin, erityisesti sen antigeenisyyteen. Olimme aiemmin ilmentäneet rekombinantti-gE:tä hyönteissoluissa ja puhdistaneet tämän rakenteen BALB/c-hiirten immunisoimiseksi, jolloin saatiin 70 gE monoklonaalisia vasta-aineita epitooppianalyysiä varten (Liu et al., 2015). Analyysimme avulla tunnistimme aa 1–194 immunodominantiksi alueeksi (tietoja ei näytetä). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin muuallakin, jolloin gE-spesifiset monoklonaaliset vasta-aineet osoittavat aa 109–123 ja 160–316 alueita, jotka ovat vastuussa vasta-aineiden stabiilien vasta-aineiden sitoutumisesta variantti-isolaattien joukossa (Vafai, 1994). Toisessa tutkimuksessa, jossa käytettiin rekombinantteja hybridi-gE-fragmentti-VLP:itä, kirjoittajat tunnistivat tähteet 1–134 gE-proteiinin antigeenisisimmäksi alueeksi ja osoittivat, että gE:n C-pää (tähteet 303–623), joka sisälsi useita kysteiinitähteitä, ei pystynyt tuottamaan hiukkasia. hiivassa (Fowler et ai., 1995), mikä viittaa siihen, että gE:n heterologisen ilmentymisen tulisi ottaa huomioon antigeenisyyden lisäksi myös ilmentymisen helppous. Tässä optimoimme gE-proteiinin pituuden sen tehokkaalle liukoiselle ilmentymiselle minimaalisella antigeenisyyden vähenemisellä. TgE osoitti samanlaista reaktiivisuutta useimpien kuvion 3 vasta-aineiden kanssa kuin hyönteissoluissa tuotettu rgE, mikä viittaa siihen, että avainepitoopit ovat hyvin säilyneet E. colista puhdistetussa tgE-proteiinissa. Eräs tutkimus kuitenkin osoitti, että Shingrix-rokotteen luovuttajien tunnistamat immunodominantit CD4+ T-soluepitoopit olivat hajallaan koko gE-proteiinissa (Voic et al., 2020). Tutkimuksessamme tgE:n immunogeenisyys oli identtinen Shingrixin CHO-soluista peräisin olevan gE:n kanssa, kun antigeeni yhdistettiin AS01B-adjuvanttiin, ja samalla tehokkaat humoraaliset vasteet ja CMI-vasteet, kuten kuvassa 5. Nämä tulokset osoittivat, että katkaistu gE prokaryoottijärjestelmästä peräisin oleva ektodomeeni oli yhtä hyvä kuin ehjä gE-ektodomeeni eukaryoottijärjestelmästä antigeenisyyden suhteen.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Eri ilmentämisjärjestelmistä peräisin olevien gE-proteiinien välillä on huomattavia eroja. Merkittävimmät erot havaitaan translaation jälkeisillä modifikaatioilla, erityisesti glykosylaatiolla. Kalvon glykoproteiineista peräisin olevilla O-kytketyillä glykaaneilla on merkitystä viruksen glykopeptidiepitooppien T-solujen ja vasta-aineiden tunnistamisessa, ja tällä tunnistuksella on suuri biolääketieteen merkitys yrityksissämme välittää immuunisuojaa viruksia vastaan ​​käyttämällä alayksikkörokotteita. Glykaanien poistaminen CHO-K1-soluissa tuotetusta gE:stä johti 17 %:n vähenemiseen reaktiivisuudessa VZV-positiivisten seerumien kanssa. Sitä vastoin O-glykosylaatio voi häiritä B-soluepitooppien immunoreaktiivisuutta: jotkin tärkeät epitoopit estyvät ylimääräisillä O-kytketyillä glykaaneilla (Nordén et al., 2019). Tutkimuksessamme E. colista tuotettu tgE näyttää käyttäytyvän yhtä hyvin kuin hyönteissoluista peräisin oleva rgE immunoreaktiivisuuden ja immunogeenisyyden suhteen, mikä viittaa siihen, että "paljaalla" tgE-proteiinilla on lupaus rokoteehdokkaana. Rokotteet, joissa on tgE antigeeninä, eivät todennäköisesti indusoi vain korkeita IgG-tiittereitä, mikä osoittaa sen potentiaalin vesirokkorokotteen alayksikkörokotteena ilman mahdollista viruksen latenssin riskiä, ​​vaan myös korkean CMI:n, mikä viittaa sen potentiaaliin myös zoster-rokotteena. Kaiken kaikkiaan tässä tutkimuksessa bakteerien ilmentämisjärjestelmästä peräisin oleva gE-antigeeni tarjoaa paljon taloudellisemman strategian VZV-rokotteiden kehittämiseen.

Viitteet

Adkins, JC ja Wagstaff, AJ (1998). Rekombinantti hepatiitti B -rokote: katsaus sen immunogeenisyyteen ja hepatiitti B:tä vastaan ​​suojaavaan tehokkuuteen. Biodrugs 10, 137–158.

Arvin, AM (1992). Soluvälitteinen immuniteetti varicella zoster -virukselle. J Infect Dis 166, S35-S41.

Cao, H., Wang, Y., Luan, N. ja Liu, C. (2021). Varicella-zoster-viruksen glykoproteiini E:n immunogeenisyys, joka on formuloitu lipidinanohiukkasten ja nukleiinisten immunostimulaattoreiden kanssa hiirissä. Rokotteet 9 310.

Chen, L., Liu, J., Wang, W., Ye, J., Wen, L., Zhao, Q., Zhu, H., Cheng, T. ja Xia, N. (2014). Varicella zoster -viruksen neutralointimäärityksen kehittäminen käyttämällä glykoproteiini K -vasta-aineentsyymikytkettyä immunosorbenttipistemääritystä. J Virol Methods 200, 10–14.

Cohen, JI (2013). Kliininen käytäntö: herpes zoster. N Engl J Med 369, 255–263. Dendouga, N., Fochesato, M., Lockman, L., Mossman, S. ja Giannini, SL (2012). Soluvälitteiset immuunivasteet varicella zoster -viruksen glykoproteiini E -rokotteelle käyttäen sekä TLR-agonistia että QS21:tä hiirillä. Rokote 30, 3126-3135.

Fowler, WJ, Garcia-Valcarcel, M., Hill-Perkins, MS, Murphy, G., Harper, DR, Jeffries, DJ, Burns, NR, Adams, SE, Kingsman, AJ ja Layton, GT (1995). Varicella zoster -viruksen gE-vaippaproteiinin immunodominanttien alueiden ja lineaaristen B-soluepitooppien tunnistaminen. Virology 214, 531–540.

Galea, SA, Sweet, A., Beninger, P., Steinberg, SP, LaRussa, PS, Gershon, AA ja Sharrar, RG (2008). Vesirokkorokotteen turvallisuusprofiili: 10-vuosikatsaus. J Infect Dis 197, S165-S169.

Gray, WL, Mullis, LB ja Soike, KF (2001). Apinan vesirokkoviruksen glykoproteiinin ilmentyminen E. Virus Res 79, 27-37.

Heininger, U. ja Seward, JF (2006). Vesirokko. Lancet 368, 1365–1376.

Kim, JY, Kim, YG ja Lee, GM (2012). CHO-solut bioteknologiassa rekombinanttiproteiinien tuotantoon: nykytila ​​ja lisäpotentiaali. Appl Microbiol Biotechnol 93, 917–930.

Lal, H., Cunningham, AL, Godeaux, O., Chlibek, R., Diez-Domingo, J., Hwang, SJ, Levin, MJ, McElhaney, JE, Poder, A., Puig-Barberà, J., et ai. (2015). Adjuvantoidun herpes zoster -alayksikkörokotteen teho iäkkäillä aikuisilla. N Engl J Med 372, 2087–2096.

Lee, SJ, Park, HJ, Ko, HL, Lee, JE, Lee, HJ, Kim, H. ja Nam, JH (2020). Glykoproteiini E -alayksikön ja elävien heikennettyjen varicella zoster -virusrokotteiden arviointi, jotka on formuloitu yksijuosteisen RNA-pohjaisen adjuvantin kanssa. Immun Inflamm Dis 8, 216-227.

Liu, J., Zhu, R., Ye, X., Yang, L., Wang, Y., Huang, Y., Wu, J., Wang, W., Ye, J., Li, Y., et ai. (2015). Monoklonaalinen vasta-ainepohjainen VZV-glykoproteiini E:n kvantitatiivinen määritys ja sen soveltaminen antigeenin kvantifiointiin VZV-rokotteessa. Appl Microbiol Biotechnol 99, 4845–4853.

Luan, N., Cao, H., Wang, Y., Lin, K. ja Liu, C. (2022a). Ionisoituvat lipidinanohiukkaset tehostivat CpG ODN:n ja QS21:n synergististä adjuvanttivaikutusta vesirokkoviruksen glykoproteiini E -alayksikkörokotteessa. Pharmaceutics 14, 973.

Luan, N., Cao, H., Wang, Y., Lin, K. ja Liu, C. (2022b). LNP-CpG ODN -adjuvantilla varicella-zoster-viruksen glykoproteiini E indusoi vertailukelpoisia immuniteettitasoja Shingrix™:n kanssa VZV-pohjustetuissa hiirissä. Virol Sin 37, 731–739.

Monie, A., Hung, CF, Roden, R. ja Wu, TC (2008). Cervarix: rokote HPV 16:n, 18-liittyvän kohdunkaulan syövän ehkäisyyn. Biologics 2, 97–105.

Nordén, R., Nilsson, J., Samuelsson, E., Risinger, C., Sihlbom, C., Blixt, O., Larson, G., Olofsson, S. ja Bergström, T. (2019). Varicella zoster -viruksen rekombinantti glykoproteiini E sisältää glykaanipeptidi-motiiveja, jotka moduloivat B-soluepitooppeja erillisiksi immunologisiksi allekirjoituksiksi. Int J Mol Sei 20, 954.

Oliver, SL, Yang, E. ja Arvin, AM (2016). Varicella-zoster-viruksen glykoproteiinit: sisäänpääsy, replikaatio ja patogeneesi. Curr Clin Microbiol Rep 3, 204–215.

Overton, TW (2014). Rekombinanttiproteiinin tuotanto bakteeri-isännissä. Drug Discov Today 19, 590-601.

Oxman, MN, Levin, MJ, Johnson, GR, Schmader, KE, Straus, SE, Gelb, LD, Arbeit, RD, Simberkoff, MS, Gershon, AA, Davis, LE, et ai. (2005). Rokote herpes zosterin ja postherpeettisen neuralgian ehkäisyyn vanhemmilla aikuisilla. N Engl J Med 352, 2271-2284.

Shah, RA, Limmer, AL, Nwannnunu, CE, Patel, RR, Mui, UN ja Tyring, SK (2019). Shingrix herpes zosterille: arvostelu. Skin Therapy Lett 24, 5–7. Singh, SM ja Panda, AK (2005). Bakteerien inkluusiokehoproteiinien liukeneminen ja uudelleenlaskostaminen. J Biosci Bioeng 99, 303-310.

Syed, YY (2018). Rekombinantti zoster-rokote (Shingrix®): katsaus herpes zosteriin. Drugs Aging 35, 1031–1040.

Takahashi, M., Otsuka, T., Okuno, Y., Asano, Y., Yazaki, T. ja Isomura, S. (1974). Elävää rokotetta käytetään estämään vesirokon leviämistä sairaaloissa olevilla lapsilla. Lancet 304, 1288–1290.

Tseng, HF, Smith, N., Harpaz, R., Bialek, SR, Sy, LS ja Jacobsen, SJ (2011). Herpes zoster -rokote vanhemmilla aikuisilla ja myöhemmän herpes zoster -taudin riski. JAMA 305, 160–166.

Vafai, A. (1994). Vasta-aineita sitovat kohdat varicella zoster -viruksen gpI(gE)-glykoproteiinin typistetyissä muodoissa. Rokote 12, 1265–1269.

Voic, H., de Vries, RD, Sidney, J., Rubiro, P., Moore, E., Phillips, E., Mallal, S., Schwan, B., Weiskopf, D., Sette, A., et ai. (2020). CD4+ T-soluepitooppien tunnistaminen ja karakterisointi Shingrix-rokotuksen jälkeen. J Virol 94, e01641-20.

Wang, Y., Qi, J., Cao, H. ja Liu, C. (2021). Immuunivasteet varicella zoster -viruksen glykoproteiini E:lle, joka on formuloitu poly(maito-koglykolihappo) nanopartikkeleilla ja nukleiinihappoadjuvanteilla hiirissä. Virol Sin 36, 122–132.

Wu, T., Li, SW, Zhang, J., Ng, MH, Xia, NS ja Zhao, Q. (2012). Hepatiitti E -rokotteen kehitys: 14-vuoden odysseia. Hum Vaccin Immunother 8, 823-827.

Wui, SR, Kim, KS, Ryu, JI, Ko, A., Do, HTT, Lee, YJ, Kim, HJ, Lim, SJ, Park, SA, Cho, YJ jne. (2019). Tehokas soluvälitteisen immuniteetin indusointi kationisella liposomipohjaisella adjuvantilla hiirillä lyofilisoitua varicella-zoster-viruksen glykoproteiinia E vastaan. Rokote 37, 2131–2141.

Wui, SR, Ko, A., Ryu, JI, Sim, E., Lim, SJ, Park, SA, Kim, KS, Kim, H., Youn, H. ja Lee, NG (2021). TLR4-agonistin/kationisen liposomiadjuvantin vaikutus varicella zoster -viruksen glykoproteiini E -rokotteen tehokkuuteen: antigeenin esitys, sisäänotto ja toimittaminen imusolmukkeisiin. Pharmaceutics 13, 390.

Zerboni, L., Sen, N., Oliver, SL ja Arvin, AM (2014). Varicella zoster -viruksen patogeneesin molekyylimekanismit. Nat Rev Microbiol 12, 197-210.

Zhu, R., Liu, J., Chen, C., Ye, X., Xu, L., Wang, W., Zhao, Q., Zhu, H., Cheng, T. ja Xia, N. (2016). Erittäin konservoitunut epitooppirokoteehdokas varicella zoster -virusta vastaan ​​indusoi neutraloivia vasta-aineita hiirissä. Rokote 34, 1589–1596.