fiKieli
Etusivu / Tietoa / Sisältö

Tietoa

Kimeerinen ihmisen papilloomavirus-16 Viruksen kaltaiset hiukkaset, jotka esittelevät HIV:stä peräisin olevia P18I10- ja T20-peptidejä-1 vaippa indusoivat HPV16- ja HIV--1-spesifisen humoraalisen ja T-soluvälitteisen immuniteetin BALB/c-hiirissä

Dec 07, 2023

Abstrakti:

Tässä tutkimuksessa HIV-1 P18I10 CTL-peptidi, joka oli peräisin HIV-1 gp120:n V3-silmukasta, ja HIV-1 gp41:n T20-antifuusiopeptidi liitettiin HPV16 L1 -kapsidiproteiiniin. kimeeristen HPV: HIV (L1:P18I10 ja L1:T20) VLP:iden rakentamiseen käyttämällä nisäkässoluekspressiojärjestelmää. HPV: HIV:n VLP:t puhdistettiin kromatografialla. Osoitimme, että P18I10- tai T20-peptidien liittäminen HPV16 L1 -kapsidiproteiinien DE-silmukkaan ei vaikuttanut kimeeristen HPV:iden: HIV VLP:iden in vitro -stabiilisuuteen, itsekokoamiseen ja morfologiaan. Tärkeää on, että se ei häirinnyt HIV-1-vasta-ainereaktiivisuutta, joka kohdistuu peräkkäisiin ja konformationaalisiin P18I10- ja T20-peptideihin, jotka esiteltiin kimeerisissä HPV:issä: HIV:n VLP:issä, eikä HPV16 L1--spesifisten vasta-aineiden induktiota in vivo. Havaitsimme, että kimeeriset L1:P18I10/L1:T20 VLP-rokotteet saattoivat indusoida HPV16- mutta heikot HIV-1-spesifiset vasta-ainevasteet ja saivat aikaan HPV16-- ja HIV-1-spesifisiä T- soluvasteet BALB/c-hiirillä. Lisäksi se voisi olla potentiaalinen tehoste lisäämään HIV-spesifisiä soluvasteita heterologisessa immunisaatiossa BCG.HIVA-rokotteen esikäsittelyn jälkeen. Tämä tutkimustyö auttaisi askeleen kohti uuden kimeerisen HPV:n kehittämistä: HIV VLP -pohjainen rokotealusta HPV16- ja HIV{42}}-infektion hallintaan, jota tarvitaan kiireellisesti kehitysmaissa ja teollisuusmaissa.

Desert ginseng-Improve immunity (12)

Cistanche-edut miehille - vahvistavat immuunijärjestelmää

Napsauta tästä nähdäksesi Cistanche Enhance Immunity -tuotteet

【Kysy lisää】 Sähköposti:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Avainsanat:

HIV-1; HPV16; rokote; viruksen kaltaiset hiukkaset; P18I10; T20 enfuvirtidi; BCG.HIVA; humoraalinen immuniteetti; T-soluvälitteinen immuniteetti

1. Esittely

Ihmisen immuunikatovirus-1 (HIV-1), joka aiheuttaa hankitun immuunikatooireyhtymän (AIDS), löydettiin 1980-luvun alussa, ja sen jälkeen siitä on tullut maailmanlaajuinen epidemia [1]. Vaikka erittäin aktiivisella antiretroviraalisella hoidolla (HAART) yhdessä altistumista edeltävän ennaltaehkäisyn (PrEP) kanssa voi olla todellinen vaikutus HIV{6}}-infektion hallintaan, rokotus on edelleen keskeinen lähestymistapa yleisen edun ja maailmanlaajuisen HIV{7}}-epidemian loppu [2]. Huolimatta yli kolme vuosikymmentä kestäneestä perusteellisesta HIV{9}}-tutkimuksesta ja lukuisista rokotekliinisistä kokeista, lisensoitua HIV{10}}-rokotetta ei ole vieläkään saatavilla. Thaimaassa suoritettu RV144-tutkimus oli ensimmäinen tapaus, joka paljasti vaatimattoman 31,2 %:n tehon HIV-tartunnan saamiseen [3]. Suurin osa muista kliinisissä kokeissa tehdyistä HIV{16}}-rokoteehdokkaista perustui pääasiassa DNA:han, rekombinanttisiin virusvektoreihin tai alayksikköproteiinimalleihin [4,5]. Ihannetapauksessa tehokas HIV{19}}-rokote pystyy indusoimaan synnynnäisiä immuunivasteita, neutraloimaan vasta-aineita virusinfektion estämiseksi [6] sekä sytotoksisia T-lymfosyyttejä (CTL) poistamaan infektoituneita soluja [7]. Jokaisen vasteen saaminen voi kuitenkin edellyttää erilaisia ​​rokotestrategioita, mikä edellyttää erilliset mutta rinnakkaiset kehitystyöt. Immunogeenien ja kuljetusvektoreiden valinnalla on merkittäviä vaikutuksia HIV-1-rokotteiden toimintaan ja spesifisyyteen [8,9]. Toistuvat epäonnistumiset HIV-1-rokotteen kehittämiseen käytettävien standardilähestymistapojen yhteydessä johtivat antovektorin valinnan, prime-boost-ohjelmien ja immunogeenispesifisyyden tärkeyden tunnustamiseen sekä humoraalisissa että soluvasteissa. Yli 100 ihmisen papilloomaviruksen (HPV) tyyppiä tunnetaan jo, ja HPV-genotyyppien 16 ja 18 katsotaan aiheuttavan noin 70 % kohdunkaulan syövistä maailmanlaajuisesti [10]. HPV L1 -viruksen kaltaiset hiukkaset (VLP:t), jotka luokitellaan alayksikkörokotteiden tyypeiksi, voivat pääasiassa indusoida vastaavia L1--spesifisiä humoraalisia vasteita villityypin virionille ja myös T-soluvälitteisiä vasteita [11–13]. Tällä hetkellä markkinoille on lisensoitu kolme HPV:tä ehkäisevää rokotetta, jotka kaikki perustuvat HPV L1 -kapsidiproteiinin VLP:ihin. Kaksi niistä, Gardasil (Merck, Rahway, NJ, USA) ja Gardasil -9 (Merck) tuotetaan hiivan (Saccharomyces cerevisiae) ilmentämisjärjestelmällä, kun taas toinen, Cervarix (GSK, Brentford, UK), tuotetaan. bakulovirusekspressiovektori/hyönteissolujärjestelmällä (BEVS/IC) [14]. Tähän mennessä optimaalisia olosuhteita HPV16 L1 -proteiinien tuottamiselle nisäkkään ilmentämisjärjestelmässä ei ole vakiinnutettu. Näin ollen HPV- ja HIV-tartunnalta suojaavan yhdistelmärokotteen kehittäminen on looginen yritys taistelussa näitä kahta suurta maailmanlaajuista patogeenia vastaan.

Aikaisemmassa katsauspaperijulkaisussamme, joka koski virusten kaltaisiin partikkeleihin (VLP) perustuvien HIV-1-rokotteiden suunnittelukonsepteja, mainitsimme, että vaipattomilla VLP:illä, kuten papilloomaviruksen VLP:llä, voisi olla toiminnallinen rooli esittelyvektoreina. HIV-1 CTL tai neutraloivat vasta-aineepitoopit [15,16]. Tämä hypoteesi on vahvistettu useissa kimeerisissä naudan papilloomaviruksissa (BPV) L1 VLP:ssä, jotka esittelevät P18I10 CTL-epitooppia gp120 HIV-1 -vaippaproteiinin V3-silmukasta (Env) ja 2F5-epitooppia tai gp41 HIV{16}} Env:n MPER-aluetta. [17–22]. Ihmisen papilloomaviruksen tyypin -16 (HPV16) L1-kapsidiproteiinien rakenteellinen piirre on samanlainen kuin BPV:n, ja ne voivat koota itsestään yksikerroksisiksi L1-VLP:iksi [23]. Viisi HPV16 L1 -proteiineista muodostaa pentameerin ja 72 pentameerista kokoontuu itsestään HPV16 VLP:ksi [24]. Kuitenkaan ei ole vieläkään selvää näyttöä siitä, että kimeeriset HPV16:HIV-kapsidiproteiinit voisivat olla stabiileja in vitro ja koota itsestään morfologisesti integraaleiksi VLP:iksi. Toisaalta HPV16 L1 -VLP:iden on osoitettu olevan erittäin immunogeenisiä ja pystyvät indusoimaan antigeenispesifisiä T- ja B-soluimmuunivasteita [11–13]. Nähtäväksi jää, voiko HIV-1-epitooppien esiintyminen HPV:n kautta: HIV:n VLP:t olla immunogeenisiä. Tässä tutkimuksessa pyrimme kehittämään kimeerisen VLP-pohjaisen HPV: HIV -rokotteen käyttämällä ihmisen 293F-soluja, vakiintunutta nisäkässolujen ilmentämisjärjestelmää. HPV 16 L1 -proteiini toimi rakenteellisena rokotteen tukikehyksenä, ja P18I10- ja T20-peptidit valittiin HIV-1-immunogeeneiksi ja liitettiin HPV 16 L1 -proteiinin DE-silmukkaan. Immunodominantti P18I10 CTL-epitooppi, joka sisältää 10 aminohappoa (tähteet 311–320: RGP GRAFVTI), on peräisin HIV-1-vaipan gp120-vaippaglykoproteiinin kolmannesta vaihtelevasta domeenista (V3). P18I10-peptidi on tunnistettu H-2Dd-rajoitetuksi MHC-luokan I molekyyliksi indusoimaan sytotoksisia T-lymfosyyttejä (CTL) [25,26]. T20-peptidi, joka tunnetaan nimellä Enfuvirtide ja joka on suunniteltu antiretroviraaliseen multimeeriseen fuusiopeptidiin, koostuu 36 aminohapon sekvenssistä (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ ELLELDKWASLWNWF), joka jäljittelee C-terminaalista heptadheliksisekvenssiä lähellä kalvoa.0 HIV{0}}-vaipan glykoproteiini 41:n (gp41) proksimaalisen ulkoisen alueen (MPER) [27]. Nämä kaksi HIV-1 T (P18I10) ja B (T20) -solupohjaista epitooppia valittiin lähtöpisteeksi ja konseptikokeen todisteeksi kimeeriselle VLP-pohjaiselle HPV:lle: HIV-rokotteen kehitysalustalle.

Viimeisen vuosikymmenen aikana on testattu monia erilaisia ​​VLP-pohjaisten HIV{2}}-rokotteiden prime-boost-muotoja [15]. Vaikka suurin osa aiemmista HIV-1 VLP [28]- tai kimeerisistä BPV: HIV VLP [17–22] -rokotestrategioista keskittyi immuunivasteiden indusoimiseen käyttämällä homologista prime-boost-ohjelmaa, kaksi aikaisempaa tutkimusta viittaavat siihen, että heterologinen immunisaatio koostuu rekombinantistaMycobacterium bovisBacillus Calmette-Guérin (rBCG), joka ilmentää HIV-1 Gag primea ja HIV-1 Gag VLP -tehostetta, voi osaltaan parantaa T-soluimmuniteettia [29,30]. Tutkimusryhmässämme olemme osoittaneet esikäsittelyn HIVA-immunogeeniä ilmentävällä rBCG:llä ja tehosteen antaminen rekombinanttivirusvektorilla MVA.HIVA oli turvallinen ja sai aikaan HIV-1--spesifisiä T-soluimmuunivasteita BALB/c-hiirissä [31–33]. Tohtori Tomas Hanken suunnittelema HIVA-immunogeeni koostuu täyspitkästä HIV-1 Gag-proteiinista yhdistettynä useisiin CTL-epitooppeihin, mukaan lukien P18I10-epitoopit C-päässä [34]. Siksi pyrimme arvioimaan, voisiko BCG.HIVA tehostaa HIV: HPV:n (L1:P18I10) VLP:iden indusoimia T-solujen immuunivasteita BALB/c-hiirissä.

Tässä tutkimuksessa kimeeriset HPV:HIV-immunogeenit (L1:P18I10 ja L1:T20) suunniteltiin ja tuotettiin käyttämällä 293F-ilmentämisjärjestelmää. Kimeerinen L1:P18I10- ja L1:T20-proteiinin ilmentyminen varmistettiin immunovärjäyksellä. HPV: HIV:n VLP:t puhdistettiin myöhemmin 3-vaihekromatografisella menetelmällä, mukaan lukien kationi (CEC), kokoekskluusio (SEC) ja hepariiniaffiniteetti (H-AC) kromatografia. Sitten puhdistetun HPV:n in vitro -stabiilisuus, in vitro -itsekokoautuminen ja morfologia: HIV:n VLP:t varmistettiin vastaavasti ei-pelkistävällä SDS-PAGE:lla, molekyylimassamäärityksellä ja transmissioelektronimikroskoopilla (TEM). Kimeerisellä HPV:llä esitellyt peräkkäiset ja konformationaaliset P18I10- ja T20-peptidit: HIV VLP:t karakterisoitiin edelleen anti-HIV-1 gp120 V3- ja 2F5-monoklonaalisilla vasta-aineilla in vitro käyttämällä Western blot -testiä ja epäsuoraa ELISA-määritystä. Lopuksi HPV: HIV:n VLP:iden immunogeenisyys arvioitiin BALB/c-hiirimallissa. Osoitimme, että kimeeriset L1:P18I10 ja L1:T20 VLP-pohjaiset rokotteet voivat indusoida HPV16- ja HIV-1-spesifisiä vasta-ainevasteita ja kimeeriset L1:P18I10 VLP:t voivat indusoida HPV16- ja HIV{36} {37}}spesifiset T-soluvasteet BALB/c-hiirissä. Koska immunogeenisen HPV: HIV -rokotteen kehittäminen ja valmistus on edelleen mahdotonta, tämä tutkimus tarjosi perusstrategian, joka saattaa olla kannattavaa tukea maailmanlaajuisia pyrkimyksiä kehittää uusia kimeerisiä VLP-pohjaisia ​​rokotteita HPV- ja HIV-infektioiden hallintaan.

2. Materiaalit ja metodit

2.1. BCG.HIVA2auxo.int-rokotekannan rakentaminen

HIVA-immunogeeniä ilmentävä rekombinantti BCG:tä konstruoitiin aiemmin käyttämällä integroivaa E. coli-mycobacterial -sukkulavektoria p2auxo.int. HIVA-antigeeniä ilmentävän E. coli/mykobakteerivektorin rakentaminen on kuvattu aiemmin [31–33]. BCG.HIVA2auxo.int laimennettiin PBS-Tween20:een 2 x 107 pmy/ml:ksi, sonikoitiin bakteeripaakkujen hajottamiseksi ja siirrostettiin takaruokatyynyyn tai BALB/c-hiiriin (50 ui, 106 pmy/hiiri).

Desert ginseng-Improve immunity (23)

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

2.2. Bakteeriviljelmät ja transformaatio

E. colin glysiiniauksotrofisen kannan M151GlyA (Invitrogen, Waltham, MA, USA) soluja, toimittaja tohtori Pau Ferrer, viljeltiin minimaalisessa M9--johdannaiselatusaineessa (M9-D: Na2HPO4, 6,78 g/l, KH2PO4, 3 g/l, NaCl, {{10}},5 g/l, NH4Cl, 1 g/l, glukoosi, 1{{20 }} g/l; MgSO4, 2 mmol/L; CaCl2, 0,1 mmol/L; tiamiini, 0,1 g/l; FeCl3, 0.{{56 }}25 g/l; AlCl3·6H2O, 0,13 mg/l; ZnSO4·7H2O, 2,6 mg/l; CoCl2·6H2O, 0,47 mg/l; CuSO4·H2O, 4,6 mg/l; H3BO3, 0.03 mg/l; MnCl2·4H2O, 4,2 mg/l; NiCl2·6H2O, 0,02 mg/l; Na2MoO4·2H2O, 0,06 mg/l) täydennettynä glysiinillä (70 ug/ml). E. coli M151Gly -solut transformoitiin p2auxo.HIVA-plasmideilla elektroporaatiolla. Tätä varten E. coli -viljelmät kasvatettiin optiseen tiheyteen 0,9 aallonpituudella 600 nm ja transformoitiin käyttämällä Bio-Rad-geenipulssielektroporaattoria 2,5 kV:ssa, 25 uF:ssa ja 200 Ω:ssa. Transformoituja soluja viljeltiin myöhemmin M9-D-agarmaljoilla (komponentit kuten aiemmin on kuvattu, 1,5 % baktoagarilla lisättynä) ilman glysiinilisää valintaa varten tai glysiinilisää kontrollina. Lysiiniauksotrofinen BCG-kanta, BCG∆lys, jonka ystävällisesti toimittivat WR Jacobs Jr., BR Bloom ja T. Hsu, transformoitiin p2auxo.HIVAint-plasmidi-DNA:lla elektroporaatiolla. Mykobakteerit viljeltiin Middlebrook 7H9 -liemielatusaineessa tai Middlebrook agar 7H10 -elatusaineessa, jota oli täydennetty albumiini-dekstroosi-katalaasilla (ADC; Difco), joka sisälsi 0,05 % Tween 80:tä. L-lysiinimonohydrokloridia (Sigma, Kawasaki, Japani) liuotettiin veteen ja käytetään lisäaineena lopullisessa pitoisuudessa 40 µg/ml. Transformaatiota varten BCG:tä viljeltiin optiseen tiheyteen 1,5 600 nm:ssä ja transformoitiin käyttämällä Bio-Rad-geenipulssielektroporaattoria 2,5 kV:ssa, 25 uF:ssa ja 1000 Ω:ssa. Transformantteja viljeltiin sitten ADC:llä täydennetyssä Middlebrook agar 7H10 -elatusaineessa, joka sisälsi 0,05 % Tween 80:tä ilman lysiinilisää.

2.3. Solulinjat ja soluviljelmä

Ihmisalkion munuaissoluista (HEK) 293 peräisin olevia 293F-soluja (Tibco) viljeltiin FreeStyle 293 -ekspressioväliaineessa (Tibco), jota oli täydennetty 5 ml/l penisilliini-streptomysiiniä (Tibco) ja inkuboitiin 37 ◦C:n inkubaattorissa. kostutettu ilmakehä, jossa on 5 % CO2, kiertoradalla ravistinalustalla, joka pyörii nopeudella 125 rpm.

2.4. L1:P18I10- ja L1:T20-proteiinien tuotanto käyttämällä 293F-ekspressiojärjestelmää

pCDNA3.1-konstrukti sisälsi L1:P18I10- tai L1:T20-DNA:ta koodaavat sekvenssit, jotka vastasivat kimeerisiä L1:P18I10- ja L1:T20-proteiineja, vastaavasti. HIV-1 P18I10 CTL-peptidi (RGPGRAFVTI) tai T20-peptidi (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE LLELD KWASLWNWF) liitettiin HPV16 L1 -kapsidiproteiinin DE-silmukkaan. 130–136 aminohappoa koodaava HPV16 L1 DE -silmukkasekvenssi korvattiin joko P18I10I10- tai T20-peptidillä. L1:P18I10- tai L1:T20-DNA:ta koodaavat sekvenssit modifioitiin Kozak-sekvenssillä, optimoitiin ihmisen kodonilla, reunustettiin HindIII:n ja Xbal:n restriktioentsyymikohdista ja kloonattiin pcDNA3.1(+)-vektoriin käyttämällä GeneArt-geenisynteesipalveluita ( Thermo Fisher, Waltham, MA, USA). Rekombinanttiplasmidi-DNA (pDNA) transformoitiin E. coli DH5 -kompetenttisiin soluihin (Invitrogen) monistusta varten ja uutettiin käyttämällä plasmidi Maxi -pakkauksia (QIAGEN, Hilden, Saksa). 293F-soluja viljeltiin 30 ml FreeStyle 293 -ekspressioväliaineella 125 ml:n Erlenmeyer-pullossa (Corning, New York, NY, USA) tiheyteen 1,0 × 106/ml ja transfektoitiin tilapäisesti L1:P18I10:llä tai L1:T20 pDNA:lla käyttämällä haarautuneita pDNA:ita. polyetyleeni-imiini, jonka molekyylipaino on 25 kDa (PEI-25K) (Polysciences) optimoidulla DNA:n suhteella PEI:hen 1:3 (w/w) ja DNA:n ja viljelyalustan suhteen 1:1 (w/v) mukaisesti. valmistajan ohjeiden mukaisesti [35]. 293F-solut kerättiin 96 tuntia transfektion jälkeen. 293F-solut voivat saavuttaa konfluenttitiheyden 3,6 × 106 solua/ml noin 50 %:n elinkyvyllä.

2.5. Immunofluoresenssivärjäys

Solut permeabilisoitiin lasilevyllä 100 % kylmällä asetonilla. Tämän jälkeen kiinnitetyt solut tutkittiin anti-HPV16 L1 -vasta-aineella CAMVIR-1 (Abcam, Cambridge, UK) ja siepattiin anti-hiiri-IgG-FITC:llä (Sigma). Immuunivärjätyt yksisolukerrokset pestiin perusteellisesti PBS:llä ja peitettiin kiinnitysväliaineella, jossa oli DAPI (Abcam). Immunofluoresenssikuvat tarkastettiin käänteisellä mikroskoopilla 40-kertaisella suurennuksella. Transfektion tehokkuus määritettiin FITC (vihreä) -positiivisten solujen ja DAPI (sininen) -värjäytyneiden solujen suhteena.

2.6. HPV: HIV (L1:P18I10 ja L1:T20) VLP:iden puhdistaminen

Yhteensä 108 transfektoitua 293F-solua 125 ml:n Erlenmeyer-pullossa (30 ml viljelyalustaa/pullo) kerättiin sentrifugoimalla nopeudella 1500 rpm 5 minuutin ajan ja pestiin kahdesti PBS:llä. Solupelletit suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin, joka oli formuloitu 1 % Triton X-100:lla, proteaasi-inhibiittorilla (1:100) (Millipore) ja bentsonaasilla (25 U/ml) (Millipore). Solulysaatit selkeytettiin 0,45 um PVDF-ruiskusuodattimella (Millipore). HPV: HIV (L1:P18I10 ja L1:T20) VLP-näytteet puhdistettiin sarjassa käyttämällä kationinvaihtoa (Capto SP ImpRes, GE, Boston, MA, USA), kokoekskluusiota (Capto Core 700, GE) ja affiniteettia (HiTrap Heparin HP). , GE) kromatografia. Kromatografiset protokollat ​​kuvattiin aiemmissa tutkimuksissamme [36, 37] ja ne noudattivat valmistajan protokollaa [38]. L1-proteiinisignaali kussakin puhdistusvaiheessa karakterisoitiin Western blot -analyysillä ja testattiin anti-HPV16 L1 -vasta-aineella CAMVIR-1 [39].

2.7. Ei-pelkistävä SDS-SIVU

HPV16 L1, L1:P18I10 ja L1:T20 VLP:t sekoitettiin 2 x Laemmli-näytepuskurin (BIO-RAD) kanssa ilman 5 % (tilavuus/tilavuus) 2-merkaptoetanolia ({{11}). }ME) ja annettiin reagoida huoneenlämpötilassa (RT) 24 tuntia. Näytteet erotettiin 8–16 % TGX tahrattomilla proteiinigeeleillä (BIO-RAD). Sitten geelit siirrettiin PVDF-kalvoille. Kalvoille tehtiin koetin anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 -mAb:lla laimennuksella 1:4000. Tämän jälkeen kalvoja inkuboitiin anti-hiiri-IgG-peroksidaasikonjugaatilla (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) laimennuksessa 1:4000. Signaali kehitettiin ja visualisoitiin kemiluminesenssilla käyttäen Western Blot ECL -substraattisarjaa (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Blot-kuvat hankittiin käyttämällä Odyssey Fc -kuvausjärjestelmää.

2.8. Molekyylimassaanalyysi

HPV16 L1-, L1:P18I10- ja L1:T20 VLP:t ilman 2-ME-käsittelyä suodatettiin pois 1000 kDa:n molekyylipainon rajan (MWCO) ultrasuodatuslaitteiden (SARTORIUS) läpi. HPV16 L1, L1:P18I10 ja L1:T20 VLP:t, joissa oli 2-ME-käsittely, vietiin 100 kDa MWCO-ultrasuodatuslaitteiden (Amicon) läpi. Retentaatit rekonstituoitiin alkuperäiseen tilavuuteen ja kerättiin suodatinlaitteen näytesäiliöstä, kun taas suodokset kerättiin sentrifugiputken pohjalle. L1-signaali mitattiin käyttämällä dot blottia, joka tutkittiin anti-HPV16 L1 -mAb:llä ja havaittiin anti-hiiri-IgG-peroksidaasikonjugaatilla (Sigma-Aldrich). Kuvat hankittiin käyttämällä Odyssey Fc Imaging System -järjestelmää kemiluminesenssikanavalla.

Desert ginseng-Improve immunity

Cistanche tubulosan edut- vahvistaa immuunijärjestelmää

2.9. Negatiivinen värjäys ja transmissioelektronimikroskoopia

Kun hiilipinnoitettuja kupariritilöitä (Sigma-Aldrich) oli ladattu ultraviolettivalossa 5 minuutin ajan, kaupalliset HPV16 L1 (Abcam), puhdistetut L1:P18I10 ja L1:T20 VLP:t tasapainotettiin 20 mM Tris-HCl:lla (pH 7,4, 137 mM NaCl) ) imeytyivät ritiloihin 1 minuutin ajan ja huuhdeltiin kolme kertaa miliQ-vedellä. HPV: HIV:n VLP:t värjättiin negatiivisesti 2 % uranyyliasetaatilla pH:ssa 4,5 (Sigma-Aldrich) 1 minuutin ajan. Ylimääräiset värjäysaineet poistettiin Whatmanin kvalitatiivisella suodatinpaperilla (Sigma-Aldrich). Ristikot sijoitettiin ilmankuivauskammioon vähintään 2 tuntia ennen tarkkailua. Kuvat otettiin käyttämällä transmissioelektronimikroskooppia (Tecnai Spirit 120 kV) suurennuksella SA135K (100 nm) ja SA59000 (200 nm), vastaavasti.

2.10. Natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi ja Western blot -analyysi

Samat määrät (500 ng) HPV16 L1 -proteiinia (Abcam), puhdistettua L1:P18I10- ja L1:T20 VLP:tä sekoitettiin 2x Laemmli-näytepuskuriin, joka sisälsi 5 % 2-ME:tä, ja keitettiin 95 ◦C:ssa 5 minuuttia. . Näytteet erotettiin 8–16 % TGX tahrattomilla proteiinigeeleillä ja siirrettiin sitten PVDF-kalvolle (Millipore, Burlington, MA, USA) käyttämällä Semi-Dry-siirtolaitetta (Bio-Rad). Kalvo tukkettiin 5 % rasvattomalla maidolla TBST:ssä. Sitten kalvot tutkittiin anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 -mAb:llä laimennoksella 1:4000, anti-HIV-1 gp120 V3 loop -mAb:llä (NIBSC, EVA3012) laimennuksella 1: 40 ja HIV1 gp41 (2F5) mAb (NIBSC, ARP3063) laimennoksella 1:4000, vastaavasti. Sen jälkeen kalvoja inkuboitiin anti-hiiri-IgG-peroksidaasikonjugaatilla (Sigma-Aldrich) laimennuksessa 1:4000. Western ECL -substraattisarjaa (BIO-RAD) käytettiin signaalin kehittämiseen. Blot-kuvat hankittiin käyttämällä Odyssey Fc -kuvausjärjestelmää kemiluminesenssikanavalla.

2.11. Hiirten immunisointi, seerumien kerääminen ja splenosyyttien eristäminen

Tämä on alustava proof-of-concept-tutkimus HPV:n immunogeenisyyden osoittamiseksi: HIV:n VLP:t (L1:P18I10 ja L1:T20 VLP:t). HPV:n annos, antoreitti ja ensisijainen tehosteväli: HIV:n VLP:t viittaavat aikaisempiin tutkimuksiin, joissa hiiriä immunisoitiin naudan papilloomaviruksella (BPV): HIV VLP:t vasta-ainevasteiden indusoimiseksi [20,21]. Puhdistettu HPV: HIV-VLP:t emulgoitiin yhtä suurella tilavuudella (225 µg per 0,5 ml annosta) alumiinihydroksifosfaattisulfaattia (Thermo Fisher), jotta varmistettiin samanlainen koostumus kuin lisensoidulla Gardasil{13}} HPV-rokotteella [40]. Kaikissa hiiriryhmissä oli sama sukupuolijakauma (urokset n=4 ja naaraat n=4 ryhmää kohti). Ryhmissä A ja B BALB/c-hiiret immunisoitiin lihaksensisäisesti (im) 10 ug:lla L1:P18I10- tai L1:T20-VLP:itä, vastaavasti, noudattamalla homologista alkutehosteohjelmaa. Ryhmässä C hiiret siirrostettiin 106 cfu:lla BCG.HIVA2auxo.int intradermaalisesti (id, ruokatyynyssä) ja tehostettiin 10 ug:lla L1:P18I10 VLP:tä lihaksensisäisesti. Ryhmässä D positiiviset kontrollihiiret inokuloitiin Gardasil- 9 prime -valmisteella ja sen jälkeen Gardasil-9-tehosteannoksella lihaksensisäisesti 10 µg:lla HPV16 L1 VLP:itä. Ryhmässä E negatiiviset kontrollihiiret immunisoitiin kahdesti PBS-puskurilla. Ensisijainen tehosteväli oli 2 viikkoa. Hiiret lopetettiin päivänä 28. Verinäytteet kerättiin hiirten sydämistä. Seerumit otettiin talteen sentrifugoimalla ja säilytettiin -20 ◦C:ssa ELISA-määritystä varten. Hiiren pernat poistettiin ja puristettiin yksitellen solusiivilä (Falcon) läpi 5 ml:n ruiskun kumimännällä. Sen jälkeen kun punasolut oli poistettu ACK-lyysipuskurilla (Lonza), pernasolut pestiin ja suspendoitiin uudelleen lymfosyyttiväliaineeseen R10 (RPMI 1640 täydennettynä 10 % vasikan sikiön seerumilla (FCS), penisilliini-streptomysiini, 20 mM HEPES ja 15 mM {{ 46}}ME) pitoisuudella 2 × 107 solua/ml.

2.12. Entsyymi-immunosorbenttimääritys

Kimeeriseen HPV:hen sitoutuvien HPV16 L1-- ja HIV-1--spesifisten vasta-aineiden testaamiseksi: HIV VLP -konstruktit in vitro, 50 µl yhtä suurella konsentraatiolla (200 ng/ml) rekombinanttia HPV16 L1 -proteiinia (Abcam, ab119880). ), puhdistetut L1:P18I10 ja L1:T20 VLP:t 50 mM karbonaattibikarbonaattipuskurissa (pH=9,6) (Sigma) 2-kertain laimennettiin sarjassa ja päällystettiin Maxisorb-levyille (Nunc). Levyjä inkuboitiin 4 °C:ssa yön yli. Levyt blokattiin estopuskurilla (5 % rasvatonta maitoa TBST:ssä) 37 ◦C:ssa vähintään 2 tunnin ajan. Kun VLP-päällystetyt levyt oli pesty kaksi kertaa TBST:llä, niitä inkuboitiin anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb:n kanssa laimennoksessa 1:8000, 2F5 mAb:n (NIBSC, ARP3063) laimennoksessa 1:8000 ja anti-HPV16:n kanssa. HIV-1 gp120 V3 -silmukan mAb (NIBSC, EVA3012) laimennoksena 1:40 estopuskurissa, vastaavasti, 37 ◦C:ssa 2 tunnin ajan. Kolmen TBST:llä pesun jälkeen levyjä inkuboitiin rekombinantin proteiini G -peroksidaasikonjugaatin (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) kanssa laimennuksessa 1:4000 estopuskurissa 37 °C:ssa 1 tunnin ajan. TMB:tä käytettiin kehittämään entsyymikytketyn immunosorbenttimäärityksen (ELISA) signaali ja se pysäytettiin 50 ul:lla 2 M H2S04:a. Kunkin kuopan optinen tiheys (OD) mitattiin ja tallennettiin aallonpituudella 450 nm käyttämällä EL × 800 absorbanssimikrolevylukijaa.

VLP-indusoitujen vasta-aineiden mittaamiseksi BALB/c-hiirissä mikrotiitterilevyt päällystettiin 50 µl:lla 2 µg/ml rekombinantti HPV16 L1 -proteiinia (Abcam, ab119880), HIV-1 P18I10 peptidiä (NIBSC, ARP734). T20-peptidi (NIBSC, ARP984), vastaavasti, 50 mM karbonaatti-bikarbonaattipuskurilla (pH=9,6). Levyjä inkuboitiin 4 °C:ssa yön yli. Levyt blokattiin estopuskurilla (5 % rasvatonta maitoa TBST:ssä) 37 ◦C:ssa vähintään 2 tunnin ajan. Samanaikaisesti AE-immunisoiduista hiiristä kerätyt seerumit laimennettiin 5-prosenttisella rasvattomalla maidolla TBST:ssä suhteessa 1:50. Kun levyjä oli pesty kahdesti TBST:llä, niitä inkuboitiin laimennetun seerumin kanssa 37 ◦C:ssa 2 tuntia. Kolmen TBST:llä pesun jälkeen levyille lisättiin rekombinantti G-proteiinin HRP-konjugaattia laimennoksessa 1:4000 estopuskurissa ja inkuboitiin 37 ◦C:ssa 1 tunti. TMB:tä käytettiin ELISA-signaalin kehittämiseen ja se pysäytettiin 50 ul:lla 2 M H2S04:a. Kunkin kuopan OD mitattiin aallonpituudella 450 nm käyttämällä EL × 800 absorbanssimikrolevylukijaa (Biotek).

2.13. IFN-ELISpot Assay

Entsyymikytkentäinen immuuniabsorbenttitäplä (ELISpot) -määritys suoritettiin käyttämällä kaupallista hiiren IFN-ELISpot-pakkausta (Mabtech, Nacka Strand, Ruotsi) valmistajan ohjeiden mukaisesti. ELISpot-levyt (MSISP4510, 96-kuoppalevyt polyvinylideenidifluoridikalvoilla, Millipore, Middlesex County, MA, USA) käsiteltiin 70 % EtOH:lla ja päällystettiin puhdistetulla anti-hiiri-interferoni- (IFN-) sieppausvasta-aineella, joka oli laimennettu fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS) lopulliseen pitoisuuteen 5 µg/ml 4 ◦C:ssa yön yli. Sitten kuhunkin kuoppaan lisättiin 2,5 x 105 tuoretta pernasolua. Sen jälkeen ryhmien A ja B soluja stimuloitiin 2 ug/ml:lla HPV16 L1 VLP:itä ja vastaavasti HIV-1 P18I10-peptidejä. Kaikki näytteet ja kontrollit maljattiin kahteen rinnakkaiskuoppaan. ELISpot-määrityksiä inkuboitiin 16 tuntia 37 °C:ssa, 5 % C02:ssa. Tämän jälkeen levyt pestiin 5 kertaa PBS:llä, inkuboitiin 2 tuntia biotinyloidun anti-IFN-monoklonaalisen vasta-aineen (mAb) kanssa, joka oli laimennettu PBS:ään 2 % fetal Calf Serum (FCS) lopulliseen pitoisuuteen 2 µg/ml, pestiin 5 kertaa. PBS:ssä ja inkuboitiin streptavidiini-alkalifosfataasikonjugaatin kanssa PBS:ssä 2 % FCS. Sitten levyt pestiin 5 kertaa PBS:llä ennen inkubointia 100 µl:n kanssa 5-bromi-4-kloori-3-indolyylifosfaattia (BCIP)/nitrosininen tetratsolium (NBT) -substraattiliuosta (Sigma-Aldrich). , St. Louis, MO, USA). 5–10 minuutin kuluttua levyt pestiin vesijohtovedellä, kuivattiin ja muodostuneet täplät laskettiin ELISPOT-lukijalla (AID, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasberg, Saksa). Kullekin eläimelle taustavasteiden keskiarvo vähennettiin erikseen kaikista kuopista, jotta IFN-täpliä muodostavien solujen (SFC)/106 vertailu ryhmien välillä oli mahdollista. Positiivisten vasteiden määrittämiseksi kynnys määriteltiin vähintään viideksi täpläksi kuoppaa kohden ja vasteiksi, jotka ylittivät negatiivisten kontrollikuoppien täplien keskimääräisen lukumäärän plus kolme negatiivisten kontrollikuoppien standardipoikkeamaa.

2.14. Tilastollinen analyysi

Kaikki tilastollinen analyysi suoritettiin Prism 6 GraphPad -ohjelmistolla (CA, USA). Käytimme tietoja kokeista, jotka suoritettiin viidellä eri ELISA-levypinnoituspitoisuudella (0, 50, 100, 150, 200 ng/ml) rekombinantti-HPV16 L1 -proteiinia (Abcam, ab119880) ja HPV: HIV VLP:itä. Keräsimme tietoja kahdesta ryhmästä (HPV16 L1 ja HPV: HIV VLP:t) ja keräsimme kolme kopiota jokaisesta pinnoitepitoisuudesta. Prismassa oleva kaavio osoitti tiedot sirontakuvaajana, joka näyttää pinnoitteen pitoisuuden (ng/ml) X-akselilla ja OD450:n Y-akselilla. Koska oletimme, että in vitro ELISA-tietomme liittyvät lineaariseen kuvioon, suoritimme lineaarisen regressioanalyysin ja vertasimme kahden viivan kaltevuutta vahvistaaksemme, että tietojoukko-1 ja tietosarja-2 (vasta-aine) reaktiivisuus HPV16 L1:n ja HPV:n välillä: HIV VLP:t) ovat toiminnaltaan erilaisia. Valitsimme 95 %:n luottamusvälit parhaiten sopivan linjan rinnalle. Prisma peitti automaattisesti lineaarisen regressioviivan molemmissa tietojoukoissamme ja se on piirtänyt pisteviivan, joka edustaa 95 %:n luottamusväliä. Lineaarisen regressioanalyysin aikana ohjelmisto laski vain datajoukkomme keskimääräisen Y-arvon, joka osoitti sovituksen hyvyyden. Lisäksi Prism antoi meille kommentin, joten voimme päätellä, että erot näiden kahden rinteen välillä ovat erittäin merkittäviä.

Meillä oli 5 sarjaa (ELISA) ja 4 sarjaa (ELISPOT) tietoja, jotka kerättiin hiiren immunisaatiokokeista. Näitä tietojoukkoja oli yhtä monta (mies n=4 ja nainen n=4) jokaisessa ryhmässä. Käytimme Gardasil{4}}immunisoituja hiiriä positiivisena kontrolliryhmänä ja PBS-immunisoituja hiiriä negatiivisena kontrolliryhmänä. Suunniteltujen kokeidemme tiedot eivät olleet yhteensopivia tai pareja. Teimme yksisuuntaisen varianssianalyysin (ANOVA) nähdäksemme, olivatko nämä keskiarvot erilaisia. Tarkistimme ensin, että tietomme sopivat Gaussin normaalijakaumaan. Havaitsimme, että jotkin ELISA-määrityksen dataryhmät eivät läpäisseet Gaussin normaalijakaumatestiä. Siksi teimme ei-parametrisen tilastollisen analyysin näistä tiedoista. Sitä vastoin kaikki ELISPOT-määrityksen tietoryhmät ylittivät Gaussin normaalijakaumatestin. Näin ollen suoritimme näille tiedoille parametrisen tilastollisen analyysin. Merkityskynnys ja luottamustaso asetettiin arvoon 0,05 (vastaa 95 %:n luottamusväliä). p-arvo, joka osoittaa yleisesti todennäköisyyden, että ryhmien välillä on eroja. Koska pääasiallinen huolenaiheemme tässä kokeessa on ryhmiemme väliset erot, Prismissa tehdyt useat vertailut antoivat meille tuloksen vertailusta kaikissa ryhmissä kaikkien muiden ryhmien kanssa.

2.15. Eettiset lausunnot

Kuudesta kahdeksaan viikon ikäiset BALB/c-hiiret ostettiin Envigolta (Inotiv Company, Chicago, IL, USA) ja paikallisviranomaisten (Generalitat de Catalunya, projektinumero 11157) ja Universitat Autònoma de Barcelonan eettisen komitean hyväksymät. Eläinkokeet noudattivat tiukasti Generalitat de Catalunyan eläinten hyvinvointia koskevaa lainsäädäntöä. Kaikki kokeet hyväksyi paikallinen tutkimuseettinen komitea (menettely 43.19, Hospital de la Vall d'Hebron, Universitat Autònoma de Barcelona).

3. Tulokset

3.1. L1:P18I10- ja L1:T20-immunogeenien suunnittelu ja HPV:n arviointi: HIV-proteiinin ilmentyminen käyttämällä 293F-ekspressiojärjestelmää

P18I10-peptidi HIV-1Env kolmannen variaabelin domeenin (V3) silmukasta ja T20-peptidi HIV-1 Env-kalvon proksimaalisesta ulkoisesta alueesta (MPER) liitettiin HPV16 L1 DE -silmukkaproteiiniin kimeerisen L1:n luomiseksi. :P18I10 ja L1:T20 immunogeenit. Kimeeriset L1:P18I10- ja L1:T20-DNA:ta koodaavat sekvenssit kloonattiin pcDNA3.1 (+) -plasmidi-DNA-ekspressiovektoriin ohimenevää transfektiota varten 293F-soluissa (kuvio 1A). HPV16 L1-, kimeeristen L1:P18I10- ja L1:T20-kapsidiproteiinien monomeerirakenteet ennustettiin alustavasti käyttämällä SWISS-mallipalvelinta (kuvio 1B). HPV16:n pääkapsidiproteiini L1 (7cn2.1.R) valittiin rakennetemplaatiksi HPV16:n L1-, L1:P18I10- ja L1:T20-kapsidiproteiinin homologiamallinnuksen rakentamiseksi. Verrattuna sitoutuneen P18I10-peptidin konformaatioon edellisessä tutkimuksessa [41], kimeerisen L1:P18I10-proteiinimme P18I10-peptidin pääketjun N-C-pääketju kulkee oikealta vasemmalle (kuva 1B, keski- ja yläpaneeli). ja paljastavat P18I10-sivuketjut voivat mahdollisesti olla vuorovaikutuksessa T-solureseptorien kanssa (kuvio 1B, keski- ja alapaneeli). Verrattuna HIV-1-fuusioinhibiittoripeptidin rakenteeseen edellisessä katsauksessa [42], HPV16 L1 -kapsidiproteiiniin lisätty T20-peptidi on esitetty heliksimäisenä muodostumana (kuva 1B, oikea ja yläpaneeli). ), ja B-solureseptorit voivat mahdollisesti tunnistaa paljastavat T20-sivuketjut (kuvio 1B, oikea ja alapaneeli). Koska HPV16 L1 -kapsidiproteiinit voisivat koota homogeenisesti T=7 ikosaedrisiksi hiukkasiksi, joissa on 72 pentameerista kapsomeeriä [43], P18I10- tai T20-peptidien suuritiheyksinen esitys kimeerisen HPV:n ulkopinnalle: HIV:n VLP:t ovat mahdollisesti erittäin immunostimuloivaa. indusoimaan epitooppispesifisiä immuunivasteita.

Figure 1. L1:P18I10 and L1:T20 immunogen design and construction of chimeric HPV: HIV VLPs by using 293F expression system. (A) The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 DNA coding sequences were cloned into pcDNA3.1+ expression vectors, respectively, for transient transfection in 293F cells. (B) Prediction of monomer structures of HPV16 L1 and chimeric HPV: HIV capsid proteins by using the SWISS-model server. HPV16 major capsid protein L1 (7cn2.1.R) was selected as the structural template to build the HPV16 L1 (left panel), L1:P18I10 (middle panel), and L1:T20 (right panel) capsid protein homology modeling. Secondary structural elements of HPV16 L1 capsid protein are labeled, with letters h1–h5 for the 5 α-helices. Loops of HPV16 L1 capsid protein between strands are labeled BC, CD, DE, EF, FG, and HI. Secondary structural elements of HIV-1 P18I10 and T20 peptides L1 are labeled by the arrows (top panel). The part of the P18I10 and T20 peptide that protrudes above the surface of the HPV16 L1 capsid protein is indicated by the arrows (bottom panel). (C) Immunofluorescence staining of L1 protein in 293F cells. The following pDNA.L1:P18I10 (left), pDNA.L1:T20 (middle), and pDNA.without insertion (right) were transfected in 293F cells. The transfected cells were probed with anti-HPV16 L1 mAb and detected with anti-mouse IgG-FITC (green channel). Cell nuclei were stained with DAPI (blue channel). Immunofluorescence images were merged by using Adobe Photoshop


Kuva 1. L1:P18I10- ja L1:T20-immunogeenisuunnittelu ja kimeeristen HPV: HIV:n VLP:iden rakentaminen käyttämällä 293F-ilmentämisjärjestelmää. (A) Kimeeriset L1:P18I10- ja L1:T20-DNA:ta koodaavat sekvenssit kloonattiin pcDNA3{13}}-ekspressiovektoreihin, vastaavasti, tilapäistä transfektiota varten 293F-soluissa. (B) HPV16 L1:n ja kimeerisen HPV:n monomeerirakenteiden ennustaminen: HIV-kapsidiproteiinit käyttämällä SWISS-mallipalvelinta. HPV16:n pääkapsidiproteiini L1 (7cn2.1.R) valittiin rakennetemplaatiksi HPV16 L1:n (vasen paneeli), L1:P18I10:n (keskipaneeli) ja L1:T20:n (oikea paneeli) kapsidiproteiinin homologiamallinnuksen rakentamiseksi. HPV16 L1 -kapsidiproteiinin sekundaariset rakenneelementit on merkitty kirjaimilla h1–h5 5 -heliksit osoittavat. HPV16 L1 -kapsidiproteiinin silmukat juosteiden välillä on merkitty BC, CD, DE, EF, FG ja HI. HIV-1 P18I10- ja T20-peptidien L1 sekundaariset rakenneelementit on merkitty nuolilla (yläpaneeli). P18I10- ja T20-peptidin osa, joka työntyy HPV16 L1 -kapsidiproteiinin pinnan yläpuolelle, on osoitettu nuolilla (alapaneeli). (C) L1-proteiinin immunofluoresenssivärjäys 293F-soluissa. Seuraavat pDNA.L1:P18I10 (vasemmalla), pDNA.L1:T20 (keskellä) ja pDNA. ilman insertiota (oikealla) transfektoitiin 293F-soluihin. Transfektoidut solut tutkittiin anti-HPV16 L1 -mAb:llä ja havaittiin anti-hiiri-IgG-FITC:llä (vihreä kanava). Soluytimet värjättiin DAPI:lla (sininen kanava). Immunofluoresenssikuvat yhdistettiin Adobe Photoshopilla

Koska HPV16 L1 -proteiinin C-terminaalinen sekvenssi välittää solun tuman tuontikoneistoa infektion aikana [44], HPV16 L1 -proteiinin tuman lokalisaatiosignaalit (NLS) on tunnistettu aikaisemmissa tutkimuksissa [45]. CAMVIR-1 monoklonaalinen vasta-aine valittiin tunnistamaan HPV16 L1 -epitooppi (GFGAMDF, 230–236 aa) [39], ja fluoreseiinipohjaista FITC-väriä käytettiin reportterina L1:P18I10:n ja L1:n ilmentymisen seuraamiseen: T20 proteiinit. Immunofluo-esikuvat osoittivat selvästi, että HPV16 L1 (vihreänä) oli pääasiassa paikantunut 293F-solujen ytimiin (sinisellä). Ll-signaalia ei havaittu kontrolliplasmidilla transektioiduissa 293F-soluissa (pcDNA3.1-plasmidi ilman inserttiä) (kuvio 1C). Tulokset viittasivat siihen, että sekä kimeerisiä L1:P18I10- että L1:T20-kapsidiproteiineja voitiin ilmentää käyttämällä polyetyleeni-imiinin (PEI) välittämää transfektiota ja tunnistaa HPV16 L1 CAMVIR{35}} -monoklonaalinen vasta-aine.

3.2. L1:P18I10 ja L1:T20 VLP:iden puhdistus kromatografisia menetelmiä käyttämällä

The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 proteins were produced by using the 293F expression system. The capture, intermediate purification, and polishing (CiPP) strategy to develop our chromatographic purification protocol is shown in Figure 2A. Flowthrough (FT) in each purification step was collected and the level of L1 protein expression was detected by Western blot analysis using anti-L1 mAb to trace intermediate HPV: HIV VLPs (Figure 2B, C). A cation exchange (CEC) column was selected as a capturing step to isolate HPV: HIV VLPs from host cell proteins (HCPs). The result of CEC FT revealed that most of the L1:P18I10 and L1T20 VLPs were lost in the FT over the CEC column (Figure 2B, C, lane 2). Traditional CEC matrices we used heavily rely on diffusion-limited mass transfer [46]. Large macromolecular complexes, such as our HPV: HIV VLP samples, might be inefficient for the VLP binding to CEC matrices. In order to reach the maximum binding capacities of the CEC column (~50 mg protein/mL resin), we loaded a double amount of soluble cell lysate containing approximately 2% of HPV: HIV VLPs into the CEC column. In the intermediate purification step, HPV: HIV VLPs were purified using a layered-bead size exclusion chromatography (SEC) resin [38]. Large HPV: HIV particles (>700 kDa) were eluted while most of the small impurities were trapped in the beads (Figure 2B, C, lane 5). Due to heparin having a similar structure as DNA and possibly binding to positively charged peptides of conformational HPV16 L1 VLPs, we selected a heparin affinity chromatography (H-AC) as a polishing step to remove heterogeneous or closely related particles [47]. Analysis of densitometry from Western blot analysis and bovine serum albumin (BCA) assay confirmed that purity of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs after diafiltration step was high, over 76% (Figure 2B, C, lane 10). The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were detected as a band in size of approximately 56 kDa and 58 kDa, respectively. We found that the commercial HPV16 L1 protein and our purified chimeric HPV: HIV VLPs (L1:P18I10 and L1:T20) share a similar protein pattern (a target band >50 kDa ja heterologinen alempi vyöhyke<50 kDa). These heterologous lower bands could be detected, especially, when we loaded SDS-PAGE gel with a high amount of chimeric HPV: HIV VLP samples (Figure 2B, C, lane 1 to 10). It is probably caused by proteolytic degradation or heterogeneous formation of L1 proteins. A similar pattern (2 bands) was also found in many previous HPV16 L1 purification studies [23,48–51]. These data demonstrated that the 293F expression system and chromatographic purification methods are feasible approaches to engineer chimeric HPV: HIV VLPs.

Figure 2. Purification and characterization of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Schematic process flowchart of L1:P18I10 and L1:T20 VLP purification by chromatography. (B, C) Western blot analysis of L1:P18I10 and L1:T20 VLP samples from each purification step. The signal of L1 in each purification step was characterized by Western blot analysis probed with anti-HPV16 L1 mAb. The arrow indicates the molecular weight of ~56 kDa of L1:P18I10 and ~58 kDa of L1:T20 proteins. Lane 1: clarified cell lysate (CCL); Lane 2: flow-through (FT) from cation exchange chromatography (CEC) sample loading; Lane 3: CEC eluate; Lane 4: FT from CEC 2M NaCl regeneration step; Lane 5: size exclusion chromatography (SEC) FT-1; Lane 6: SEC FT-2; Lane 7: FT from heparin affinity chromatography (H-AC) sample loading; Lane 8: H-AC eluate; Lane 9: FT from H-AC 2M NaCl regeneration step; Lane 10: 10-fold diafiltration.


Kuva 2. L1:P18I10- ja L1:T20-VLP:iden puhdistus ja karakterisointi. (A) Kaavamainen prosessin vuokaavio L1:P18I10- ja L1:T20 VLP-puhdistuksesta kromatografialla. (B, C) L1:P18I10- ja L1:T20-VLP-näytteiden Western blot -analyysi kustakin puhdistusvaiheesta. Ll:n signaali kussakin puhdistusvaiheessa karakterisoitiin Western blot -analyysillä, joka tutkittiin anti-HPV16 L1 -mAb:llä. Nuoli osoittaa L1:P18I10-proteiinien -56 kDa:n ja L1:T20-proteiinien -58 kDa:n molekyylipainon. Kaista 1: kirkastettu solulysaatti (CCL); Kaista 2: läpivirtaus (FT) kationinvaihtokromatografian (CEC) näytelatauksesta; Kaista 3: CEC-eluaatti; Kaista 4: FT CEC 2M NaCl:n regenerointivaiheesta; Kaista 5: kokoekskluusiokromatografia (SEC) FT-1; Kaista 6: SEC FT-2; Kaista 7: FT hepariiniaffiniteettikromatografiasta (H-AC) näytelatauksesta; Kaista 8: H-AC-eluaatti; Kaista 9: FT H-AC 2M NaCl:n regenerointivaiheesta; Kaista 10: 10-kertainen diasuodatus.

3.3. L1:P18I10- ja L1:T20-VLP:iden in vitro -vakaus ja itsekokoonpano

Vahvistaaksemme, että puhdistetut HPV:HIV-VLP:t osoittivat samanlaista in vitro -stabiilisuutta kuin HPV16 L1 -VLP:t, suoritimme ei-pelkistävän SDS-PAGE:n arvioidaksemme HPV:HIV-kapsidiproteiinien disulfidisilloittumista (kuvio 3A). Tiedetään, että pH, ionivahvuus, lämpötila [52] ja redox-ympäristö korreloivat HPV16 L1 -kapsidiproteiinien disulfidisidosten kanssa [53]. HPV L1 VLP:illä on taipumus koota itsekseen alhaisessa pH:ssa ja suuressa ionivahvuudessa. VLP:iden maksimaalinen purkaminen vaatii tyypillisesti altistumista suurelle pitoisuudelle pelkistysaineelle, kuten 5 % 2-merkaptoetanolille (2-ME) suhteellisen pitkän ajan [54]. Pelkistysaineiden 2-ME puuttuessa vain pieni osa HPV-16 L1-, L1:P18I10- ja L1:T20-proteiinista siirtyi monomeereihin, joiden näennäinen molekyylipaino (MW) oli 55 kDa. . Noin 70 % L1-proteiineista oli disulfidisidottuina suurempiin dimeereihin tai pentameereihin, joiden ennustettu MW oli 110 kDa ja 280 kDa (kuvio 3A, kaistat 2, 4 ja 6). Sitä vastoin lähes kaikki purkamispuskurissa olevat HPV-16 L1-, L1:P18I10- ja L1:T20-proteiinit näyttivät monomeerisiltä rakenteilta ei-pelkistävässä SDS-PAGE:ssa (kuvio 3A, kaistat 3, 5 ja 7). Nämä tulokset osoittivat, että puhdistettujen L1:P18I10- ja L1:T20-VLP:iden in vitro -stabiilisuus esitti samanlaisia ​​disulfidisilloittumiskuvioita kuin HPV16 L1 -VLP:t samoissa pH-, ionivahvuus- ja lämpöolosuhteissa. Puhdistetut VLP:t näyttävät hajoavan pentameerien, trimeerien ja dimeerien tasolle pitkäaikaisen altistuksen jälkeen suurille pelkistysainepitoisuuksille. Nämä tiedot ovat sopusoinnussa aikaisempien tutkimusten kanssa [53,54] HPV:n HIV:n VLP:iden purkaminen oli kuitenkin vielä kaukana täydellisestä (monomeerit).

Figure 3. In vitro stability of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Disulfide cross-linking of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs in non-reducing SDS-PAGE. The HPV16 L1 VLPs, purified L1:P18I10, and L1:T20 VLPs were mixed with Laemmli sample buffer in the absence or presence of 2-mercaptoethanol (2-ME), respectively, and analyzed by non-reducing SDS-PAGE. The position of the L1 monomer (55 kDa), L1 dimer (110 kDa), and L1 pentamer (280 kDa) are indicated by the arrow. Lane 1: protein molecular weight marker; Lane 2: HPV16 L1 VLP; Lane 3: HPV16 L1 VLP treated with 2-ME; Lane 4: L1:P18I10 VLP; Lane 5: L1:P18I10 VLP treated with 2-ME; Lane 6: L1:T20 VLP; Lane 7: L1:T20 VLP treated with 2-ME. (B) Molecular mass analysis of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. Assembled VLPs untreated with 2-ME (lanes 2, 4, and 6) were filtered out through 1000kDa molecular weight cutoff (MWCO) diafiltration devices (upper panel). Disassembled VLPs treated with 2-ME (lanes 3, 5, and 7) were filtered out through 100kDa MWCO centrifugal filter devices (lower panel). Retentates (R) were collected from filter device sample reservoirs, while the filtrates (F) were collected at the bottom of centrifuge tubes. The L1 protein signal was detected by using a dot blot probed with anti-HPV16 L1 mAb.


Kuvio 3. L1:P18I10- ja L1:T20-VLP:iden in vitro -stabiilisuus. (A) L1:P18I10:n ja L1:T20:n VLP:iden disulfidisilloitus ei-pelkistävässä SDS-PAGE:ssa. HPV16 L1 VLP:t, puhdistetut L1:P18I10 ja L1:T20 VLP:t sekoitettiin Laemmli-näytepuskurin kanssa vastaavasti 2-merkaptoetanolin (2-ME) poissa tai läsnä ollessa, ja analysoitiin ei-pelkistävällä. SDS-SIVU. L1-monomeerin (55 kDa), L1-dimeerin (110 kDa) ja L1-pentameerin (280 kDa) sijainti on osoitettu nuolella. Kaista 1: proteiinin molekyylipainomarkkeri; Kaista 2: HPV16 L1 VLP; Kaista 3: HPV16 L1 VLP käsitelty 2-ME:llä; Kaista 4: L1:P18I10 VLP; Kaista 5: L1:P18I10 VLP käsitelty 2-ME:llä; Kaista 6: L1:T20 VLP; Kaista 7: L1:T20 VLP käsitelty 2-ME:llä. (B) L1:P18I10- ja L1:T20-VLP:iden molekyylimassaanalyysi. Kootut VLP:t, joita ei ollut käsitelty 2-ME:llä (kaistat 2, 4 ja 6), suodatettiin pois 1000 kDa:n molekyylipainon rajan (MWCO) diasuodatuslaitteiden (ylempi paneeli) läpi. Puretut VLP:t, jotka oli käsitelty 2-ME:llä (kaistat 3, 5 ja 7), suodatettiin pois 100 kDa MWCO:n keskipakosuodatinlaitteiden läpi (alapaneeli). Retentaatit (R) kerättiin suodatinlaitteen näytesäiliöistä, kun taas suodokset (F) kerättiin sentrifugiputkien pohjalta. L1-proteiinisignaali havaittiin käyttämällä dot blottia, joka oli tutkittu anti-HPV16 L1 -mAb:llä.

To demonstrate that purified HPV: HIV proteins by chromatography are able to self-assemble to icosahedral particles, we further performed molecular mass analysis under the same reducing condition (5% 2-ME). The commercial HPV16 L1, purified L1:P18I10, and L1T20 proteins without reducing agent treatment were filtered out through 1000 kDa molecular weight cut-off (MWCO) diafiltration devices individually (Figure 3B, top panel). The L1 monomers (55 kDa), oligomers (110~200 kDa), or pentameric capsomers (280 kDa) were expected to pass through an ultrafiltration membrane retaining the integral VLPs (MW~20,000 kDa). The L1 signal of commercial HPV16 L1 proteins was detected in both retentates and filtrates. Most of the purified L1:P18I10 and L1T20 proteins formed large particles (>1000 kDa) ja säilytettiin retentaateissa. Kuvio oli yhtäpitävä ei-pelkistävässä SDS-PAGE:ssa havaittujen tietojen kanssa. Vaikka kaikki 2-ME:llä käsitellyt VLP-ryhmät esitettiin monomeerisena vyöhykkeenä (~55 kDa) ei-pelkistävässä SDS-PAGE:ssa (kuvio 3A, kaistat 3, 5 ja 7). Vastaavia pelkistettyjä VLP:itä ei kuitenkaan suodatettu pois 100 kDa:n ultrasuodatuskalvojen läpi (kuvio 3B, pohjapaneeli). Nämä tulokset viittasivat siihen, että kimeeriset HPV:n HIV-proteiinit kykenivät kokoamaan itse suuremmiksi hiukkasiksi, mutta VLP:iden maksimaalinen hajottaminen monomeereiksi vaati disulfidisidosten pelkistyksen lisäksi myös muita denaturoivia tekijöitä, kuten pH:n tai ionivahvuuden.

3.4. L1:P18I10 ja L1:T20 VLP:iden morfologinen karakterisointi

Transmissioelektronimikroskooppia (TEM) käytettiin HPV16 L1:n ja HPV: HIV:n VLP:iden morfologisen konformaation tutkimiseen. HIV-1 P18I10- ja T20-peptidit insertoitiin HPV16 L1 -proteiinin DE-silmukoihin, vastaavasti. Nämä kaupalliset HPV16 L1 ja kimeeriset HPV: HIV-kapsidiproteiinit voivat koota spontaanisti itsestään in vitro integraaleiksi VLP:iksi, joiden halkaisija on noin 50–60 nm (kuva 4A–C, oikea paneeli). Verrattuna aiemmissa tutkimuksissa julkaistuihin HPV16 L1 VLP:iden elektronimikroskooppikuviin [55,56], HPV16 L1:n, L1:P18I10:n ja L1:T20:n VLP:n ikosaedrirakenne oli tässä vähemmän kontrastinen ja epämääräinen. Se voi johtua negatiivisesta värjäysreagenssista, jota käytimme tässä tutkimuksessa. Äskettäisessä tutkimuksessamme, joka julkaistiin aiemmassa tutkimuksessa [37] ja toisessa meneillään olevassa vertaisarvioinnissa (tietoja ei näytetä), meillä on hyvä laatu ja erotuskyky elektronimikroskooppikuvista, kun hiiva- ja bakulovirusperäiset L1:P18I10 VLP:t (sama kimeerinen konstrukti) tasapainotettiin PBS:ssä ja värjättiin negatiivisesti fosfovolframihapolla (PTA). Koska käytimme tässä tutkimuksessa erilaisia ​​VLP:n tuotanto- ja puhdistusjärjestelmiä, nisäkässoluista peräisin olevat L1:P18I10- ja L1:T20-VLP:t tasapainotettiin Tris-HCl:lla ja värjättiin negatiivisesti uranyyliasetaatilla. Vaikka elektronimikrovalokuvia voitaisiin parantaa, pystyimme silti havaitsemaan selkeän kuvion, että suurin osa HPV16 L1-, L1:P18I10- ja L1:T20-kapsidiproteiinista voisi koota itsekseen morfologisia VLP:itä TEM-näytön alla (kuva 4A–C, vasen paneeli). ). Pohjimmiltaan HPV VLP:t ovat suojattuja aggregoitumiselta olosuhteissa, joissa on paljon suolaa [57]. Osa HPV16 L1:n ja HPV:n havaittavista aggregaatioista: HIV:n VLP:t vähäsuolaisessa Tris-HCl-puskurissa voitiin nähdä pienemmällä suurennuksella (kuva 4A–C, vasen paneeli). Näistä tuloksista päätimme, että osittaisen L1 DE -silmukkasekvenssin modifiointi HIV-1 P18I10- tai T20-peptidien liittämisellä ei vaikuttanut merkittävästi HPV:n: HIV VLP:iden morfologiaan.

Figure 4. Electron micrographs of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Morphology of HPV16 VLPs. (B) Morphology of L1:P18I10 VLPs. (C) Morphology of L1:T20 VLPs. Purified VLPs were absorbed on UV-charged carbon-coated copper grids, and negatively stained with 2% uranyl acetate. Images were acquired under transmission electron microscopy. The bar represents 200 nm at magnification 59,000 (left panel) and 100 nm at magnification 135K (right panels), respectively


Kuva 4. Elektronimikroskooppikuvat L1:P18I10- ja L1:T20 VLP:istä. (A) HPV16 VLP:iden morfologia. (B) L1:P18I10 VLP:iden morfologia. (C) L1:T20 VLP:iden morfologia. Puhdistetut VLP:t absorboitiin UV-varattuihin hiilipäällystettyihin kupariritiloihin ja värjättiin negatiivisesti 2-prosenttisella uranyyliasetaatilla. Kuvat otettiin transmissioelektronimikroskoopilla. Pylväs edustaa 200 nm suurennuksella 59, 000 (vasen paneeli) ja 100 nm suurennuksella 135K (oikea paneeli).

3.5. HPV-16- ja HIV-1-epitooppien esittely ja reaktiivisuus 

Sen varmistamiseksi, että peräkkäiset HIV{0}} P18I10- tai 2F5-epitoopit esiteltiin kromatografialla puhdistetuissa L1:P18I10- tai L1:T20-VLP:issä, suoritettiin Western blot -analyysi ja epäsuora ELISA käyttämällä epitooppispesifisiä mAb:ita. Valitsimme tunnetun monoklonaalisen vasta-aineen (mAb), nimeltään CAMVIR-1, tunnistamaan HPV16 L1 -proteiinin erittäin konservoituneen epitoopin (GFGAMDF, aa 230–236) [39,58]. Aiemmin julkaistu HIV{20}} gp120 V3 -silmukan epitooppiin kohdistuva mAb (RIQRGPGRAFVTIGK, aa308–322) valittiin havaitsemaan peräkkäisiä P18I10-epitooppeja (RGPGRAFVTI, aa311–320) [59]. Toisaalta T20-peptidin karakterisointiin valittiin laaja neutraloiva vasta-aine (bnAb), joka tunnistaa HIV-1 gp41 2F5-epitoopin (ELDKWA) monenlaisia ​​laboratorio-HIV-1 -kantoja vastaan ​​[ 60,61]. Western blot -määritys, joka tutkittiin HPV16 L1 -mAb:llä, osoitti vyöhykkeet 55, 56 ja 58 kDa, jotka vastaavat HPV16 L1-, L1:P18I10- ja L1:T20-proteiinia, vastaavasti (kuvio 5A, B, vasemmalla). L1:P18I10-proteiinin molekyylipaino (MW) oli samanlainen kuin HPV16 L1-proteiinin (kuvio 5A, vasemmalla). L1:T20-proteiinia vastaava vyöhyke havaittiin hieman korkeammalla kuin HPV16:n L1-proteiini, kuten lisäaminohapposekvenssistä ennustettiin (kuvio 5B, vasemmalla). Noin 56 ja 58 kDa:n vyöhykkeet, jotka vastaavat L1:P18I10- ja L1:T20-proteiinia, havaittiin Western blot -määrityksessä, joka testattiin anti-HIV-1 gp120 V3:lla ja 2F5-mAb:llä, vastaavasti (kuva 5A, B, oikealla). ). Ajattelimme, että anti-2F5-värjäytyneen L1:T20-proteiinin molekyylipaino (MW) oli oikea ja vastasi odotettua 58 kDa:ta (kuva 5B, oikealla). Anti-HIV-1 gp120 V3-värjäytyneen L1:P18I10-proteiinin MW on kuitenkin hieman pienempi (kuva 5A, oikealla). Tämä voidaan johtua kimeeristen L1:P18I10-proteiinien heterogeenisestä rakenteesta. Koska peräkkäinen epitooppikonformaatio saattaa kadota denaturoivassa olosuhteissa SDS-PAGE:ssa. Siksi suoritimme edelleen epäsuoran ELISA:n osoittaaksemme konformationaalisen P18I10-peptidin, joka oli oikein esitelty kimeerisissä L1:P18I10 VLP:issämme (kuvio 5E). Toisaalta käyttämämme anti-HIV{100}} gp120 V3 -silmukan vasta-aine tunnisti koko HIV-1 V3-silmukan P18I10-epitoopin sijaan. Tämän seurauksena yleinen anti-V3-signaali oli alhaisempi (kuvio 5A, B, oikeat paneelit). Silti nämä tulokset osoittivat, että peräkkäiset HIV-1 P18I10- ja T20-peptidit ovat HPV:n HIV VLP:issä.

Figure 5. Presentation of HPV-16 and HIV-1 epitopes. (A, B) Sequential epitope detection of chimeric L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were analyzed by Western blot, using anti-HPV16 L1, anti-HIV-1 gp120 V3 and 2F5 mAb. The HPV16 L1 VLPs were used as a control. The molecular weight of the L1 (55 kDa), L1:P18I10 (56 kDa), and L1:T20 (58 kDa) proteins are indicated by the arrow. Lane 1: protein molecular weight marker; Lane 2: HPV16 L1 protein; Lane 3: L1:P18I10 protein; Lane 4: L1:T20 protein. (C, D) Binding of HPV16 L1 mAb to chimeric L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (E) Binding of anti-HIV-1 gp120 V3 mAb to chimeric L1:P18I10 VLPs. (F) Binding of HIV-1 2F5 mAb to chimeric L1:T20 VLPs. The line graph of indirect ELISAs was performed to detect the conformational epitopes of recombinant HPV16 L1, L1:P18I10, and L1:T20 VLPs bound to anti-L1, anti-HIV-1 gp120 V3 or 2F5 mAbs, respectively. Data are representative of three independent experiments. A simple linear regression test was done to compare the line difference of purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs with the standard curve of commercial L1 VLPs; ns: not significant; ** p < 0.01.


Kuva 5. HPV-16- ja HIV{2}}-epitooppien esitys. (A, B) Kimeeristen L1:P18I10 ja L1:T20 VLP:iden peräkkäinen epitooppidetektio. Puhdistetut L1:P18I10 ja L1:T20 VLP:t analysoitiin Western blot -menetelmällä käyttämällä anti-HPV16 L1:tä, anti-HIV-1 gp120 V3:a ja 2F5 mAb:tä. HPV16 L1 VLP:itä käytettiin kontrollina. L1 (55 kDa), L1:P18I10 (56 kDa) ja L1:T20 (58 kDa) proteiinien molekyylipaino on osoitettu nuolella. Kaista 1: proteiinin molekyylipainomarkkeri; Kaista 2: HPV16 L1 -proteiini; Kaista 3: L1:P18I10-proteiini; Kaista 4: L1:T20-proteiini. (C, D) HPV16 L1 mAb:n sitoutuminen kimeerisiin L1:P18I10- ja L1:T20-VLP:ihin. (E) Anti-HIV-1 gp120 V3 mAb:n sitoutuminen kimeerisiin L1:P18I10 VLP:ihin. (F) HIV-1 2F5-mAb:n sitoutuminen kimeerisiin L1:T20 VLP:ihin. Epäsuorien ELISA-testien viivakaavio suoritettiin anti-L1-, anti-HIV-1-gp120 V3- tai 2F5-mAb-molekyylien sitoutuneiden rekombinantti-HPV16 L1-, L1:P18I10- ja L1:T20-VLP:iden konformaatioepitooppien havaitsemiseksi. Tiedot edustavat kolmea riippumatonta koetta. Yksinkertainen lineaarinen regressiotesti suoritettiin vertaamaan puhdistettujen L1:P18I10- ja L1:T20-VLP:iden viivaeroa kaupallisten L1-VLP:iden standardikäyrään; ns: ei merkitsevä; ** p < 0,01.

Lisäksi suoritimme epäsuoran ELISA-määrityksen tarkistaaksemme, onko HPV:ssä esiintyviä HIV{{{{50}}}} konformationaalisia epitooppeja: HIV:n VLP:t tunnistettavissa gp120 V3:n ja 2F5:n neutraloivien vasta-aineiden avulla in vitro. epitooppia sitova spesifisyys ja reaktiivisuus. Kuten kuviossa 5C esitetään, anti-L1-mAb tunnisti D, HPV16 L1, L1:P18I10 ja L1:T20 VLP:t. Teimme lineaarisen regressioanalyysin vertaillaksemme kunkin laimennusviivan kaltevuutta. Tulokset paljastivat, että L1:P18I10- tai L1:T20-VLP:iden L1-epitooppia sitova spesifisyys ei eronnut HPV16 L1-VLP:istä. Lisäksi anti-HIV-1 gp120 V3 -mAb kykeni sitomaan L1:P18I10 VLP:itä, mutta ei HPV16 L1 VLP:itä (kuvio 5E). Lisäksi 2F5-mAb pystyi tunnistamaan L1:T20 VLP:itä, mutta ei HPV16 L1 VLP:itä (kuvio 5F). Lineaarisen regressioanalyysin jälkeen ero gp120 V3 -epitooppisitoutumisspesifisyydessä L1:P18I10:n ja HPV16 L1:n välillä oli erittäin merkitsevä (p < 0,01 %). L1:T20-VLP:iden 2F5-epitooppisitoutumisspesifisyys oli merkittävästi erilainen kuin HPV16 L1-VLP:iden (p < 0,01 %). Tämä malli paljasti, että hydrofobiset solulipidit eivät olleet välttämättömiä 2F5-neutralisoivien vasta-aineiden sitoutumiseen HPV:hen: HIV VLP:t in vitro. Vaikka anti-HIV-1 gp120 V3 ja 2F5 neutraloivien vasta-aineiden reaktiivisuus HPV: HIV:n VLP:itä vastaan ​​on suhteellisen lievää, anti-HIV-1 gp120 V3 ja 2F5 mAb:n sitoutuminen HPV: HIV:n VLP:ihin oli merkittävästi epitooppispesifinen.

3.6. L1:P18I10- ja L1:T20-VLP:iden immunogeenisyys BALB/c-hiirten immunisoinnin jälkeen

Arvioimme HPV{0}}- ja HIV-1--spesifiset immuunivasteet BALB/c-hiirten immunisoinnin jälkeen L1:P18I10- ja L1:T20-VLP:illä. Immunisointiaikataulu on esitetty kuviossa 6A. Koska VLP:n aiheuttama immunogeenisyys limakalvon kautta annon jälkeen oli yleensä heikompaa kuin systeemisen annon jälkeen, hiiret immunisoitiin lihakseen kuudesosalla Gardasil{10}} HPV16 L1-annoksesta [22,62]. Alumiinihydroksifosfaattisulfaattiadjuvantti annokselle (10 µg/100 µl) kimeeristä HPV:tä: HIV VLP:t säädettiin samaan pitoisuuteen (1 mg/1 ml) kuin Gardasil{19}}. Sukupuolierojen arvioimiseksi rokotustuloksissa arvioitiin vasta-ainevasteiden vertailu uroshiirten (n=4) ja naaraspuolisten (n=4) välillä. Ryhmässä L1:P18I10 VLP, L1:T20 VLP ja Gardasil-9 naarashiirten anti-HPV16 L1-vasta-ainevasteet olivat keskimäärin korkeammat kuin uroshiirillä (kuvio 6B). 2/4 (50 %) L1:P18I10 VLP-immunisoidusta naaraasta, 3 4:stä (75 %) L1:T20 VLP-immunisoidusta naaraasta ja kaikki (100 %) Gardasil-immunisoidut naaraspuoliset hiiret saivat aikaan korkeamman anti-L1-vasta-aineiden tiitterin kuin uroshiiret. Naarashiirten Gardasil{51}}-ryhmässä indusoimat anti-L1-vasteet olivat merkittävästi korkeammat kuin uroshiirillä (p=0.0041) (kuvio 6B). Erittäin alhainen anti-L1-vasta-ainevasteiden taso havaittiin ryhmässä, jossa BCG.HIVA-aloitus ja L1:P18I10 VLP-tehoste. Tämä kuvio vastaa aikaisempia havaintoja, jotka kuvaavat, että BCG indusoi pääasiassa T-soluvasteita IgG-tuotannon sijaan [63].

Figure 6. Induction of humoral immune responses by L1:P18I10 and L1:T20 VLPs in BALB/c mice. The immunization schedule is depicted in (A) All mouse groups had equal gender distribution (male n = 4 and female n = 4). Groups A and B: homologous prime-boost immunization with 10 µg L1:P18I10 or L1:T20 VLPs intramuscularly (i.m.); Group C: priming with 106 cfu rBCG.HIVA intradermally (i.d.) and boosting with 10 µg L1:P18I10 VLPs i.m.; Group D: homologous prime-boost vaccination with Gardasil-9 containing 10 µg of HPV16 L1 VLPs i.m.; Group E: immunization twice with PBS buffer. The prime-boost interval was 2 weeks. The endpoint of this trial was on day 28. Sera were collected and diluted at a titer of 1:50 for ELISA assay. (B) HPV L1-specific IgG in male and female mice. (C–E) Epitope-specific IgG induced by L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. ELISA was performed to analyze anti-L1, anti-P18I10, and anti-T20 IgG induced by BALB/c mice following different prime-boost combinations as described above. Data are shown as mean ± S.D. One-way ANOVA (nonparametric) test was done to compare differences between groups. OD: opticaldensity. Ns not significant; ** p < 0.01


Kuva 6. Humoraalisten immuunivasteiden induktio L1:P18I10- ja L1:T20 VLP:illä BALB/c-hiirillä. Immunisointiaikataulu on kuvattu kohdassa (A) Kaikilla hiiriryhmillä oli sama sukupuolijakauma (uros n=4 ja naaras n=4). Ryhmät A ja B: homologinen prime-boost-immunisaatio 10 ug:lla L1:P18I10- tai L1:T20-VLP:itä lihaksensisäisesti (im); Ryhmä C: esikäsittely 106 cfu:lla rBCG.HIVA:lla intradermaalisesti (id) ja tehoste 10 ug:lla L1:P18I10 VLP:tä im; Ryhmä D: homologinen prime-boost-rokotus Gardasililla-9, joka sisältää 10 ug HPV16 L1 VLP:itä im; Ryhmä E: immunisointi kahdesti PBS-puskurilla. Ensisijainen tehosteväli oli 2 viikkoa. Tämän kokeen päätepiste oli päivänä 28. Seerumit kerättiin ja laimennettiin tiitteriin 1:50 ELISA-määritystä varten. (B) HPV L1-spesifinen IgG uros- ja naarashiirillä. (C–E) L1:P18I10- ja L1:T20-VLP:iden indusoima epitooppispesifinen IgG. ELISA suoritettiin BALB/c-hiirten indusoimien anti-L1-, anti-P18I10- ja anti-T20-IgG:n analysoimiseksi eri alkutehosteyhdistelmien jälkeen, kuten edellä on kuvattu. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD Yksisuuntainen ANOVA (ei-parametrinen) testi tehtiin ryhmien välisten erojen vertaamiseksi. OD: optinen tiheys. Ns ei merkitsevä; ** p < 0,01

Arvioimme, voisivatko L1:P18110- ja L1:T20-VLP:illä immunisoidut hiiret indusoida HPV-16 L1-spesifisiä ja HIV-1-epitooppispesifisiä vasta-aineita BALB/c-hiirissä. VLP-indusoidut IgG-vasta-aineet hiiren seerumeissa mitattiin ELISA:lla, joka oli päällystetty rekombinantilla HPV16 L1 -proteiinilla, vastaavasti P18I10- tai T20-peptideillä. Tilastollinen ero L1-spesifisessä IgG:ssä seerumitiitterillä 1:50 Gardasil-9-ryhmässä verrattuna PBS-kontrolliryhmään (p=0.0039). Anti-L1-vasteet Gardasil-9-, L1:P18I10- ja L1:T20-VLP-immunisoitujen hiirten välillä olivat samanlaisia ​​eivätkä eronneet merkittävästi toisistaan ​​(kuvio 6C). BCG.HIVA2auxo.int-prime- ja L1:P18I10 VLP-tehostehiiret saivat aikaan erittäin alhaisen anti-L1-IgG-tason. Nämä tulokset viittaavat siihen, että HPV: HIV:llä VLP-immunisoidut hiiret tuottivat saman tason anti-L1 IgG:tä kuin Gardasil{39}}immunisoidut hiiret (kuvio 6C). Vaikka L1:P18I10 VLP -ryhmällä näyttää numeerisesti olevan suuntaus kohti korkeampaa P18I10-epitooppispesifistä IgG-tasoa kuin muilla immunisaatioryhmillä, nämä erot eivät olleet tilastollisesti merkitseviä (kuvio 6D). Joissakin L1:P18I10 VLP-immunisoiduissa hiirissä (4/8, 50 %) havaittiin korkeampia anti-P18I10:tä sitovia vasta-aineita verrattuna Gardasil{58}}immunisoituihin hiiriin. Vaihtoehtoisesti T-testianalyysi paljasti, että ero L1:P18I10 VLP- ja Gardasil{63}}-ryhmän välillä oli merkittävä (p=0.005) (tietoja ei näytetä). L1:T20 VLP -ryhmässä havaittiin merkittävästi korkeampi vasta-ainevaste T20-peptidiä vastaan ​​verrattuna Gardasil-9-ryhmään (p=0,0083). Kuten odotettiin, anti-T20-tiitterit olivat havaitsemattomia Gardasil-9-, PBS-, L1:P18I10 VLP:ssä ja BCG.HIVA-prime yhdistettynä L1:P18I10 VLP-tehosteryhmiin (kuvio 6E). T20-peptidispesifisen vasta-aineen tiitteri oli suhteellisen alhainen. Tämä johtuu todennäköisesti seuraavista syistä: (1) T20 on subdominantti peptidi; (2) neutraloivien MPER- tai 2F5-vasta-aineiden herättäminen vaatii peptidi-lipidikonjugaatteja (kuvio 6E). Kaiken kaikkiaan tuloksemme osoittivat, että L1:P18I10 ja L1:T20 VLP:t voivat indusoida HPV16- mutta heikkoja HIV-1-spesifisiä vasta-ainevasteita hiirillä.

Desert ginseng-Improve immunity (2)

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

HPV- ja HIV-spesifisten T-solujen immuunivasteiden arvioimiseksi hiirillä noudatimme kuviossa 7A esitettyä immunisointiaikataulua. Lisäksi heterologista BCG.HIVA2auxo.int esikäsittelyä ja L1:P18I10 VLP:iden tehostusta verrattiin homologiseen L1:P18I10 VLP-aloitus- ja tehosteimmunisaatioon spesifisten HPV16- ja HIV{12}}-T-solujen immuunivasteiden tiheyden arvioimiseksi. Gardasil{14}}- ja PBS-ryhmien välillä ei ollut eroja IFN-erityksen suhteen splenosyyttistimulaation jälkeen HPV16 L1 VLP:illä. Erot L1--spesifisessä IFN-erittymisessä eivät myöskään olleet merkittäviä L1:P18I10 VLP- ja Gardasil{23}}-ryhmien välillä. Päätimme, että heikko L1-spesifinen IFN-eritys saattaa johtua ärsykkeinä käytettyjen HPV16 L1 VLP:iden alhaisesta pitoisuudesta (2 µg/ml). BCG.HIVA2auxo.int prime- ja L1:P18I10 VLP -tehosteryhmä indusoi IFN:ää erittävien pernasolujen tiheämpää ja IFN:n erittymisessä havaittiin merkittäviä eroja verrattuna Gardasil-9-rokotettuihin hiiriin (p {{36} }}.0103). Kolme kahdeksasta hiirestä (~38 %) sai aikaan korkeimmat L1--spesifiset IFN-vasteet (kuvio 7B). Tämä saattaa johtua BCG:n epäspesifisestä adjuvantisuudesta aiempien tutkimuksiemme mukaan [64–66]. Ilmeinen esivaikutus, jopa villityypin BCG:llä, on linjassa rBCG-johdannaisten kyvyn kanssa toimia tehokkaina adjuvantteina myöhemmissä tehosterokotteissa [64,65]. Mitä tulee HIV-1-spesifisiin T-soluvasteisiin, suurin IFN-täpliä muodostavien solujen (SFC)/106 pernasolujen kokonaissuuruus havaittiin BCG.HIVA2auxo.int-pohjaisilla hiirillä verrattuna Gardasilia saaviin hiiriin{54} } rokotteet tai L1:P18I10 VLP:t. Hiiret, jotka oli rokotettu BCG.HIVA:lla ja tehostettu L1:P18I10 VLP:illä, saivat aikaan merkittävästi korkeamman IFN-erityksen verrattuna hiiriin, jotka oli rokotettu L1:P18I10 VLP homologisella prime-boostilla (p=0.0268). Lisäksi L1:P18I10 VLP:illä rokotetuissa hiirissä havaittiin merkittävästi korkeampi IFN-eritys verrattuna Gardasil-9-rokotteita saaviin hiiriin (p=0.0157) (kuvio 7C). Kuten odotettiin, IFN-eritystä ei voitu havaita Gardasil-9- ja PBS-ryhmissä. Nämä tulokset osoittivat, että (1) L1:P18I10 VLP:t saivat aikaan HIV-1-spesifisiä T-soluimmuunivasteita; (2) L1:P18I10 VLP:t saivat aikaan HPV-spesifisiä T-soluimmuunivasteita ja (3) BCG.HIVA2auxo.int saattoi tehostaa L1:P18I10 VLP:n herättämiä HIV-1-spesifisiä T-soluimmuunivasteita.

Figure 7. Induction of HPV16 and HIV-1 specific T cell responses by chimeric L1:P8I10 VLPs and BCG.HIVA in BALB/c mice. The immunization schedule is depicted in (A). All mouse groups had equal gender distribution (male n = 4 and female n = 4). Group A: homologous prime-boost immunization with 10 µg L1:P18I10 VLPs intramuscularly (i.m.); Group B: priming with 106 cfu rBCG.HIVA intradermally (i.d.) and boosting with 10 µg L1:P18I10 VLPs i.m.; Group C: homologous prime-boost vaccination with Gardasil-9 containing 10 µg of HPV16 L1 VLPs i.m.; Group D: immunization twice with PBS buffer. The prime-boost interval was 2 weeks. The endpoint of this trial was on day 28. Splenocytes were isolated for IFN-γ ELISpot assay. T-cell immune responses to HPV16 and HIV-1 were assessed ex vivo by IFN-γ ELISpot after splenocyte stimulation with HPV16 L1 VLP and P18I10 peptide. (B, C) HPV16 L1- and HIV-1 P8I10-specific T-cell responses elicited by L1:P8I10 VLPs and BCG.HIVA prime combined with L1:P18I10 VLP boost. Data are shown as median ± S.D. A one-way ANOVA test was done to compare differences between groups. Ns not significant; * p < 0.05.


Kuva 7. HPV16- ja HIV{2}}-spesifisten T-soluvasteiden induktio kimeerisillä L1:P8I10 VLP:illä ja BCG.HIVA:lla BALB/c-hiirissä. Immunisointiaikataulu on kuvattu kohdassa (A). Kaikissa hiiriryhmissä oli sama sukupuolijakauma (uros n=4 ja naaras n=4). Ryhmä A: homologinen prime-boost-immunisaatio 10 ug:lla L1:P18I10 VLP:itä lihaksensisäisesti (im); Ryhmä B: esikäsittely 106 cfu:lla rBCG.HIVA:lla intradermaalisesti (id) ja tehoste 10 ug:lla L1:P18I10 VLP:tä im; Ryhmä C: homologinen prime-boost-rokotus Gardasil-9:lla, joka sisältää 10 ug HPV16 L1 VLP:itä im; Ryhmä D: immunisointi kahdesti PBS-puskurilla. Ensisijainen tehosteväli oli 2 viikkoa. Tämän kokeen päätepiste oli päivänä 28. Pernasolut eristettiin IFN-ELISpot-määritystä varten. T-solujen immuunivasteet HPV16:lle ja HIV:lle-1 arvioitiin ex vivo IFN-ELISpotilla pernasolustimulaation jälkeen HPV16 L1 VLP:llä ja P18I10 peptidillä. (B, C) HPV16 L1- ja HIV-1 P8I10-spesifiset T-soluvasteet, jotka herättivät L1:P8I10 VLP:t ja BCG.HIVA-prime yhdistettynä L1:P18I10 VLP:n tehostukseen. Tiedot esitetään mediaanina ± SD Yksisuuntainen ANOVA-testi tehtiin ryhmien välisten erojen vertaamiseksi. Ns ei merkitsevä; * p < 0,05.

4. Discussion

Sekä HPV16 että HIV{1}} ovat sukupuolitauteja, ja ne ovat tällä hetkellä monien rokotetutkimusten kohteena. Vaikka HPV-profylaktiset rokotteet on kaupallistettu ja HIV{2}}-tartunta on hallittu suuresti antiretroviraalisella hoidolla (ART) ja PrEP:llä, tehokas, turvallinen ja edullinen kimeerinen HPV: HIV-rokote molempia viruksia vastaan ​​on kiireellinen tarve. Tässä tutkimuksessa (1) osoitimme, että 293F:n ilmentämisjärjestelmä ja kromatografinen puhdistusmenetelmä voisivat olla käyttökelpoisia lähestymistapoja kimeeristen L1:P18I10- ja L1:T20-VLP:iden tuottamiseksi ja puhdistamiseksi; (2) vahvistimme, että P18I10- tai T20-peptidien liittäminen HPV16 L1 -kapsidiproteiinien DE-silmukkaan ei vaikuttanut kimeeristen HPV:n: HIV VLP:iden in vitro -stabiilisuuteen, itsekokoamiseen ja morfologiaan; (3) Kimeerisen HPV:n DE-silmukoille altistetut peräkkäiset ja konformationaaliset P18I10- tai T20-peptidit: HIV:n VLP:t voitiin havaita anti-HIV-1 gp120 V3:a ja 2F5:tä neutraloivilla vasta-aineilla in vitro; (4) Kimeeriset L1:P18I10- ja L1:T20-VLP:t voivat saada aikaan HPV:tä, mutta heikkoja HIV{34}}spesifisiä sitovia vasta-aineita BALB/c-hiirissä. Lisäksi HIV-1 P18I10- tai T20-peptidien liittäminen HPV16 L1 -proteiiniin ei vaikuttanut HPV16 L1--spesifiseen vasta-aineen induktioon in vivo; (5) L1:P18I10 VLP:t voivat indusoida sekä HPV16- että HIV{48}}spesifisiä T-soluvasteita; (6) BCG.HIVA-aloitus- ja L1:P18I10-VLP-tehoste sai aikaan suurimman IFN:ää tuottavien pernasolujen määrän verrattuna L1:P18I10-VLP:iden homologiseen alkutehostukseen BALB/c-hiirissä. Nämä havainnot tukivat rBCG:hen ja kimeeriseen HPV:hen (HIV VLP:ihin) perustuvien HIV{59}}-rokotteiden jatkokehitystä. Kaiken kaikkiaan tämä tutkimus tarjoaa perusstrategian, joka voi olla arvokas tukemaan maailmanlaajuisia pyrkimyksiä kehittää uusia kimeerisiä VLP-pohjaisia ​​rokotteita HPV- ja HIV-infektioiden hallintaan.

Tässä tutkimuksessa L1:P18I10 ja L1:T20 VLP:t saattoivat indusoida saman tason anti-HPV16 L1:tä sitovia vasta-aineita kuin HPV Gardasil{8}} -rokote. Kuitenkin L1:P18I10 ja L1:T20 VLP:t saavat aikaan vain alhaisia ​​P18I10- ja T20-epitooppispesifisiä HIV:tä sitovia vasta-ainevasteita. Oletimme, että tämä saattaa johtua siitä, että ELISA-määrityslevyt on päällystetty rekombinantilla HPV16 L1 -proteiinilla, HIV-1 P18I10-peptidillä ja HIV-1 T20-peptidillä, vastaavasti. L1:P18I10- ja L1:T20-VLP:idemme indusoimat hiiren anti-L1-vasta-aineet voivat kohdistaa L1-proteiinin useisiin sitoutuvaisiin epitooppeihin. Sitä vastoin L1:P18I10- ja L1:T20-VLP:idemme herättämät hiiren anti-HIV{35}}-vasta-aineet kohdistuvat vain yhteen HIV-peptidiin (P18I10 tai T20) HPV: HIV:n VLP:issä. Tämän seurauksena anti-HIV{46}}-sitovien vasta-aineiden kokonaismaksimi OD450-arvot olivat paljon alhaisemmat kuin anti-HPV16 L1 -vasta-aineet.

Syy siihen, että valitsimme HPV16 L1 kapsidiproteiinin DE-silmukan HIV-1-immunogeenin alustavaksi insertioalueeksi, viittasi aikaisempaan tutkimukseen, jossa hiiriä immunisoitiin naudan papilloomaviruksella (BPV): HIV-VLP:t vasta-ainevasteiden indusoimiseksi [20]. Tiedetään, että HPV L1:n pääkapsidiproteiinien pinnalle altistetuissa DE- ja FG-silmukoissa sijaitsevat epitoopit vaikuttavat hallitsevasti rokotteen aiheuttamiin ristiin neutraloiviin vasta-aineisiin [67]. Lisäksi aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että HIV-1 MPER:n liittäminen BPV L1 DE -silmukkaan voi indusoida osittain neutraloivia vasta-aineita, jotka tunnistavat spesifisesti MPER:n natiivin konformaation HIV-1 Env:ssä [20]. Mikään data ei kuitenkaan ole osoittanut, vaikuttaako rekombinantti BPV L1:MPER VLP immunogeenisyyteen ja neutralointiin BPV:tä vastaan ​​sen jälkeen, kun HIV-1 MPER on liitetty BPV L1 -proteiiniin. Tutkimuksessamme, jossa käytettiin HPV16 L1 VLP:itä HIV-antigeenin kuljetusvektorina, olemme havainneet, että HIV-1-peptidin insertio ei ole muuttanut HPV L1:n rakennetta ja että kimeerisellä HPV:n HIV-proteiinilla on edelleen kyky muodostaa VLP:itä. Lisäksi toteutimme immunobledging-konseptin osoittaaksemme vertailukelpoisia immuunivasteita HPV:n HIV:n VLP-ehdokkaan (meidän) ja hyväksytyn VLP-pohjaisen HPV-rokotteen (lisensoitu Gardasil-9) välillä. Tietomme paljastivat, että HIV-1 P18I10- tai T20-peptidin liittäminen kimeeriseen HPV:hen: HIV VLP:t voivat saada aikaan samanlaisen tiitterin HPV16 L1-spesifisiä sitoutuvia vasta-aineita verrattuna HPV Gardasil-9 rokote. Tyyppispesifiset anti-HPV16 L1:tä sitovat vasta-aineet, jotka havaittiin lisensoidulla HPV Gardasil-9 VLP -rokotteella verrattuna HPV Gardasil-9 VLP -rokotteen kimeerisiin versioihin, olivat tietojemme mukaisia.

HPV16 L1 VLP:iin sisällytetyn optimaalisen HIV-1 vieraan antigeenin pituus ja paikka sekä tuloksena olevien kimeeristen HPV: HIV:n VLP:iden in vitro -stabiilisuus tulee varmistaa ennen hiirten immunisointia. Nykyinen tutkimuksemme on osoittanut, että P18I10- tai T20-peptidien liittäminen HPV16 L1 -proteiiniin ei vaikuttanut kimeerisen HPV:n: HIV VLP:iden in vitro -stabiilisuuteen, itsekokoamiseen ja morfologiaan. Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten kanssa, jotka osoittivat, että HIV-1 MPER-domeenin liittäminen BPV L1:n DE-silmukkasekvenssiin ei vaikuttanut BPV L1 -kapsidiproteiinin kykyyn kokoontua itse VLP:ihin [20]. Pohjimmiltaan epitoopit, jotka sijaitsevat HPV L1 -kapsidiproteiinien pinnalle altistuvissa DE- ja FG-silmukoissa, vaikuttavat hallitsevasti L1-spesifisten ristiin neutraloivien vasta-aineiden indusointiin [67]. Tässä osoitimme, että HIV-1 P18I10- tai T20-peptidien liittäminen HPV16 L1 DE -silmukkaan ei vaikuttanut L1--spesifiseen vasta-aineen induktioon kimeerisellä HPV:llä: HIV VLP:t hiiren immunisoinnin jälkeen. Lisäksi HIV-1 P18I10- tai T20-epitoopit kimeerisen HPV:n HPV16 DE -silmukoille: HIV:n VLP:t havaittiin in vitro ja olivat immunogeenisiä in vivo. HPV16 L1 VLP:t muodostavat potentiaalisen tukikehyksen kiinnostavan HIV-1-epitoopin pinnalle. Tässä tutkimuksessa olemme suorittaneet epäsuoran ELISA:n osoittaaksemme konformationaalisen P18I10- ja T20-peptidin, joka on esitelty kimeerisen HPV:n: HIV VLP:iden pinnalla. Tulevaisuudessa immuunielektronimikroskooppi voisi olla myös lisälähestymistapa P18I10- tai T20-antigeenin rakenteellisen lokalisoinnin ja organisoitumisen osoittamiseksi HPV:ssä: HIV:n VLP:issä.

Itsekokoaminen on edustava indeksi HPV16 L1 -VLP:iden in vitro -stabiilisuudesta. Tiedetään, että pH, ionivahvuus, lämpötila [52] ja redox-ympäristö korreloivat HPV16 L1 -kapsidiproteiinien disulfidisidosten kanssa [53]. Aiemmat papilloomaviruksen VLP:itä koskevat työt ehdottivat disulfidisidosten tärkeyttä L1:n pääkapsidin itsekokoamisessa [68,69]. Disulfidin muodostuminen osoitti korkeampaa kysteiiniä L1-kapsidiproteiinissa sopivassa geometriassa [53]. Nämä disulfidiristisidokset yhdistävät tähteet 175 ja 428 (HPV16:lle), jotka stabiloivat HPV-virioneja ja VLP:itä [70]. Tässä tutkimuksessa analysoimme molekyylien välisiä disulfidisilloittumiskuvioita epäsuorina todisteina osoittamaan, että L1:P18I10- ja L1:T20-kapsidiproteiineillamme on taipumus koota itsekseen in vitro. Kuvassa 3A osoitimme, että puhdistetut L1:P18I10 ja L1:T20 VLP:t esittivät samanlaisia ​​molekyylien välisiä disulfidisilloittumiskuvioita kuin HPV16 L1 VLP:t samoissa pH:ssa, ionivahvuudessa ja lämpöolosuhteissa. Kuvassa 3B osoitimme edelleen, että puhdistetut L1:P18I10- ja L1:T20-proteiinit kykenivät kokoamaan itse suuremmiksi hiukkasiksi (suurempia kuin L1-pentameeri, MW 280 kDa) in vitro. Siksi yhdessä kuviossa 4 havaitun morfologisen itsekokoonpanon VLP-kuvion (vaikka ikosaedrinen rakenne ei ollut aivan hyvä) kanssa päätimme, että puhdistettu kimeerinen HPV: HIV:n VLP:t ovat stabiileja in vitro. VLP:n stabiilisuuden lisäksi monia muita kriittisiä tekijöitä, jotka voivat vaikuttaa kimeerisen HPV:n immunogeenisyyteen: HIV:n VLP:t tulee ottaa huomioon, kuten immunogeenin lisäyskohta VLP:iden eri silmukoiden välillä [71], annos, tehostuksen aikavälit ja antoreitti [22]. , jne.

HIV-1 gp120 V3-silmukasta johdetut P18I10-peptidit esitellään HIV-infektoituneissa soluissa MHC-I-luokan I molekyylien avulla [26]. CD8+, sytotoksiset T-lymfosyytit (CTL), pystyivät tunnistamaan MHC-I:n rajoittamia P18I10-antigeenejä ja erittämään erilaisia ​​sytokiinejä, kuten IFN-, HIV-infektoituneiden solujen eliminoimiseksi [72–75]. Rekombinanttivirus- tai plasmidi-DNA ovat hyviä rokotevehikkeleitä P18I10-peptidien ilmentämiseen isäntäsoluissa ja P18I{20}}-spesifisten soluvasteiden indusoimiseksi MHC-I-reitin kautta [76–79]. Esimerkiksi yhdistetty DNA-prime- ja modifioidun vacciniaviruksen Ankara- (MVA)-tehostehoito oli riittävä indusoimaan IFN- ja CTL-vasteet P18I10-epitooppia vastaan ​​[79]. Päinvastoin, eksogeenisiä P18I10-peptidejä ei esitetä tehokkaasti CD8+ T-soluille MHC-I-reitin kautta [80,81] ja ne edellyttävät asianmukaisten adjuvanttien [82–85] tai antigeenin kantajien, kuten esim. VLP:t. Esimerkiksi adjuvanteilla täydennettyjen synteettisten P18I10-peptidien immunogeenisyys oli marginaalista johtuen T-auttajadeterminanttien puuttumisesta [82–85]. Aiemmin on raportoitu, että HIV-1 Gag VLP:t [86], hepatiitti B:n pinta-antigeenin (HBsAg) VLP:t [87], parvoviruksen VP2 VLP:t [88] ja papilloomaviruksen L1 VLP:t [17–19] voisi toimia kuljetusvektoreina MHC-I-rajoitetun CTL-epitoopin esittelyyn in vivo. Vaikka VLP-indusoitujen MHC-I:n rajoittamien T-soluvasteiden mekanismi on edelleen epäselvä, VLP:iden hiukkasrakenne saattaa edistää makrofagien tai dendriittisolujen endosyyttistä ottoa, jolloin ne pääsevät sytosoliin ja pääsevät myöhemmin tyypilliseen MHC-I-reittiin [89, 90]. Lisäksi MHC-I-rajoitetun P18I10-determinantin havaittiin indusoivan CD4+-auttaja-T-soluvasteita MHC-II-reitin kautta [91,92]. Hybridi-BPV1 L1 VLP:itä voidaan käyttää antigeenisinä epitoopin kantajina terapeuttisten virusspesifisten CTL-vasteiden aikaansaamiseksi MHC-I- ja MHC-II-reittien kautta [17,19], mikä tarjoaa lupaavan strategian rokotesuunnittelulle virusinfektion hallitsemiseksi. Jotkut varhaiset tutkimukset osoittivat myös BPV L1 VLP:t, jotka ilmensivät HIV-1 gp120 V3 -silmukan indusoimien limakalvopintojen HPV16 E7-epitooppia tai P18I10-epitooppia ja myös systeemistä VLP-epitooppispesifistä humoraalista ja T-soluimmuniteettia [18]. Aiempien tutkimusten mukaisesti olemme alustavasti osoittaneet, että kimeeriset HPV: HIV (L1:P18I10) VLP:t voivat indusoida HIV-spesifisiä T-soluimmuunivasteita BALB/c-hiirissä pernasolustimulaation jälkeen P18I10-peptidillä. Lisäksi BCG.HIVA-pohjustus tehosti HIV-spesifisiä T-soluimmuunivasteita hiirillä. L1:P18I10 VLP:iden indusoimat monifunktionaaliset T-soluimmuunivasteet vaatisivat kuitenkin lisäimmunologisia tutkimuksia.

Laajemmat CD{0}} T-soluvasteet useita konservoituneita CTL-epitooppeja vastaan ​​ovat hyödyllisiä HIV-1 geneettisen monimuotoisuuden voittamiseksi ja pakoon pääsemiseksi [7,93–100]. HIV-1 T-soluimmunogeenien, kuten HIVA:n, järkevän suunnittelun pitäisi pystyä reagoimaan useisiin CTL-epitooppeihin [34]. Tohtori Tomas Hanken suunnittelema HIV-1 HIVA-immunogeeni koostuu täyspitkästä HIV-1 Gag-proteiinista yhdistettynä useisiin CTL-epitooppeihin, mukaan lukien P18I10-epitoopit C-päässä [34]. DNA, MVA ja rBCG valittiin HIVA-immunogeenin kuljetusvälineiksi ja indusoivat suuria ja laajoja CTL-epitooppispesifisiä soluvasteita käyttämällä heterologisia prime-boost-ohjelmia hiiri- ja ei-ihmiskädellisissä (NHP) malleissa [34,101]. Aiemmat tutkimuksemme ovat osoittaneet, että BCG.HIVA-prime yhdessä MVA.HIVA-tehosteen kanssa sai aikaan HIV-1-spesifisiä IFN:ää tuottavia CD8+ T-soluja BALB/c-hiirissä [31–33,102]. Mielenkiintoista on, että VLP:t voisivat olla potentiaalinen tehoste lisäämään HIV-spesifisiä soluvasteita heterologisessa immunisaatiossa rBCG:llä [29, 30] tai DNA-rokotteilla [103, 104]. Esimerkiksi rBCG:tä ilmentävä HIV-1 Gag-proteiini voisi tehokkaasti pohjustaa T-solujen immuunijärjestelmää Gag-VLP:iden tehostamiseksi NHP-malleissa [29,30]. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että BCG.HIVA-aloitus voi tehostaa HPV:n: HIV (L1:P18I10) VLP:iden indusoimia T-solujen immuunivasteita. Tutkimme edelleen tämän rBCG-aloitus- ja VLP-tehostusjärjestelmän synnyttämien polyfunktionaalisten CD4+-, CD8+- ja muisti-T-soluvasteiden suuruutta.

Cistanche deserticola-improve immunity -

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Tällä hetkellä tutkimusryhmämme keskittyy lupaavien rBCG:n kehittämiseen: HIV-rokotteet, jotka ilmentävät uusia HIV{0}} T-soluimmunogeenejä, kuten tHIVconsvX ja HIVACAT (HTI) T-soluimmunogeeni, parantamaan HIV:tä-1 varianttien vastaavuus ja T-soluvasteen leveys. Toisen sukupolven HIVconsvX-immunogeenit suunniteltiin määrittelemällä uudelleen M-ryhmän konservoituneet alueet ja käyttämällä kaksiarvoista mosaiikkimallia maksimoimaan rokotteessa olevien 9-mer-T-soluepitooppien ja globaalien varianttien yhteensopivuus [64]. HTI-immunogeeni suunniteltiin peittämään T-solukohteet, joita vastaan ​​T-soluvasteita havaitaan pääasiassa HIV{12}}infektoituneilla yksilöillä, joilla on alhainen HIV{13}}-viruskuorma [65,66]. Koska papillooma-VLP:iden on osoitettu olevan useiden CTL-epitooppien kantajia [17], pyrimme rakentamaan kimeerisiä HPV16 L1 VLP:itä, jotka kantavat useita konservoituneita HIV{19}} CTL-epitooppeja yhdessä ThivconsvX- tai HTI-T-soluimmunogeenejä ilmentävän rBCG:n kanssa laajemman indusoimiseksi. CTL-immuunivasteet HIV:tä vastaan-1. HIV-1 CTL-epitoopin suuri tiheys ja useat kopiot kimeerisessä HPV:ssä: HIV:n VLP:t voivat parantaa antigeenin kulkua immuunijärjestelmään ja indusoida CTL-vasteita useammin. Sitä vastoin rekombinantti BCG tuottaa todennäköisemmin alhaisemman frekvenssin CTL-vasteita hitaasta replikaatiosta in vivo. Koska BCG:llä on selvä vaikutus T-solujen erilaistumiseen, mikä tarkoittaa, että BCG voi indusoida CD8+ T-solujen muistia CD4+ T-auttajasolujen osallistumisen kautta [105], tämä immunogeeninen ominaisuus saattaa tehdä BCG:stä sopivan pohjustusaineena heterologisissa prime-boost-ohjelmissa. Näin ollen odotimme, että HPV: HIV:n VLP:t saattavat vaikuttaa lupaavilta tehosteilta lisäämään HIV-1 CTL-vasteiden suuruutta ja laajuutta, kun esivalmistellaan rekombinantilla BCG:llä, joka ilmentää uutta HIV-1 T-soluimmunogeeniä. .

T20-peptidi sisältää erittäin konservoituneen lineaarisen epitoopin 2F5 (ELDKWA). Pitkäaikaisilta HIV-tartunnan saaneilta potilailta kerätyllä 2F5-vasta-aineella on raportoitu olevan laajalti neutraloiva teho [106,107]. Gp41:n MPER:n katsotaan olevan huonosti immunogeeninen, mikä saattaa liittyä sen sijaintiin lähellä solun ja viruksen fosfolipidikaksoiskerrosta [108]. MPER:iä esittelevien DNA-vektoreiden käyttö lipidiympäristössä on hyödyllistä gp{11}}spesifisten nAb:iden indusoinnissa [109–111]. Esimerkiksi tohtori Britta Wahrenin suunnittelemien HIV-1 T20--koodaavien DNA-rokotteiden on osoitettu indusoivan ristikkäisiä neutraloivia vasta-aineita (nAb) [109]. Sitä vastoin monet varhaiset yritykset indusoida gp41:een kohdistuvia nAb:ita käyttämällä peptidi- tai alayksikkörokotestrategioita ovat epäonnistuneet [112–116]. Äskettäin jotkut tutkimukset osoittavat, että BPV L1 VLP:t, jotka ilmentävät 2F5-epitooppia tai HIV{24}} gp41:n indusoimien 2F5--spesifisten vasta-aineiden MPER:iä hiirissä, johtivat ristikkäisiin kladeihin kohdistuvaan neutralointiin [20,21]. Samanlainen immunogeenisuuskuvio havaittiin, kun hepatiitti B -pinta-antigeeni (HBsAg) fuusioitiin HIV-1 2F5-epitoopin tai MPER:n kanssa [59,117–119]. Tässä osoitimme, että HIV-1 T20- ja P18I10-peptidien esiintyminen kimeerisessä HPV16 L1 VLP:ssämme voi indusoida vasta-ainevasteita HIV-1 ja HPV16:ta vastaan. Neutraloivat epitoopit, jotka on stabiloitu konformationaaliselle tukirakenteelle, kuten HIV-1-funktionaaliset piikit tai VLP:t, voisivat olla B-soluimmunogeenisuunnittelun valtavirta leveiden neutraloivien vasta-aineiden (bnAbs) aikaansaamiseksi [93]. Useimmat uudet bnAb-epitoopit (noin 90 %) ovat kuitenkin epäjatkuvia ja muodostuneita alueita, jotka on koottu yhteen 3-ulotteisiksi konfiguraatioiksi [120]. Vaikka epäjatkuvien epitooppien esiintyminen proteiinirungossa voitiin ennustaa laskennallisella mallinnuksella [121], nämä bnAb-epitoopit saatetaan haastaa upottautumaan vaipattomaan HPV16 L1 -proteiinirunkoon. Sitä vastoin pieni osa HIV-1 B-soluimmunogeeneistä, kuten HIV-1 gp41:n MPER (2F5) tai gp120:n V3-silmukka (P18IIB), sisältää lineaarisia neutraloivia epitooppeja ja saattaa olla sopivia HPV: HIV-proteiinin runko. Siksi valitsimme lineaarisen 2F5:tä neutraloivan epitoopin, joka sisältyy HIV-1 MPER:n pidennettyyn T20-peptidiin, koska sen rakenne on suotuisa -heliksin muodostumiselle [122]. T20-peptidit voitaisiin fuusioida ja stabiloida L1-kapsiditelineillä neutraloivien vasta-ainevasteiden aikaansaamiseksi, jos 2F5-epitoopin natiivi konfiguraatio voitaisiin esittää. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että 2F5 nAb:t sitoutuivat kimeerisiin HPV:HIV (L1:T20) VLP:ihin in vitro. Lisäksi L1:T20 VLP:t voivat myös indusoida T20-spesifisiä sitoutuvia vasta-aineita BALB/c-hiirissä. Oli yhä enemmän todisteita siitä, että HIV-1-fuusionestopeptidin (T20) indusoimilla vasta-aineilla on samanlaiset ominaisuudet kuin anti-HIV-1-fuusiopeptidillä Enfuvirtidilla, jotka sitovat hydrofobista transmembraanista T20-tähdettä, joka sijaitsee gp41:n MPER:ssä HIV-1-fuusio ja edistää virustorjuntaa [109,123,124]. Aiempien arvostelujemme mukaan kimeeristen VLP-pohjaisten rokotteiden rationaalinen suunnittelu HPV- ja HIV-spesifisten neutraloivan vasta-aine- ja CTL-vasteiden indusoimiseksi olisi aina otettava huomioon immunogeenivalinnan, antigeenin kuljetusvektoreiden ja prime-boost-ohjelmien kannalta. Yhteenvetona voidaan todeta, että tämä tutkimus on osoittanut vaihtoehtoisen nisäkässolupohjaisen ilmentämisalustan ja skaalautuvan kromatografisen puhdistusmenetelmän kimeerisen HPV:n HIV:n VLP:iden suunnitteluun. Uskomme, että uudet puhdistusmenetelmämme auttavat saamaan talteen antigeeniset HPV:t: HIV VLP:t nisäkässoluista tavoitteena vähentää aikaa, kustannuksia ja työvoimaa samalla kun lisätään teollisen tuotannon kapasiteettia. Lisäksi osoitimme, että HPV16 L1 VLP:t voivat toimia kuljetusalusta HIV-1-peptidiantigeenin kuljettamiseen, koska P18I10- tai T20-peptidien liittäminen HPV16 L1 -kapsidiproteiinien DE-silmukkaan ei vaikuttanut kimeerisen HPV:n in vitro -stabiilisuuteen, itsekokoamiseen ja morfologiaan: HIV-VLP:t ja vaikutti eivät häiritse HPV16 L{107}}spesifistä vasta-aineinduktiota in vivo. Toisaalta kimeerinen HPV: HIV:n VLP:t voivat saada aikaan HPV16- ja HIV-spesifisiä B- ja T-soluimmuunivasteita molempia viruksia vastaan. Tässä raportissa tutkittiin mahdollisuutta kehittää HIV{111}}-rokotteita, jotka perustuvat HIV-1-immunogeenejä ilmentäviin rekombinanttisiin BCG:hen ja HPV:hen: HIV-VLP:ihin, joita voidaan käyttää lapsuuden HIV{113}}-immunisaatioon. Koska tehokkaan kimeerisen rokotteen kehittäminen HPV16:ta ja HIV:tä vastaan{115}} on edelleen haaste, tämä työ edistää askeleen kohti uuden kimeerisen HPV:n kehittämistä: HIV VLP-pohjainen rokotealusta HPV16:n ja HIV:n hallintaan{118 }} -infektio, jota tarvitaan kiireellisesti kehitysmaissa ja teollisuusmaissa.

Viitteet

1. UNAIDSin maailmanlaajuiset HIV- ja AIDS-tilastot-2018 Tietosivu. 2019. Saatavilla verkossa: http://www.unaids.org/en/resources/fact sheet (saatavilla 15. kesäkuuta 2020).

2. Baeten, JM PREP HIV:lle: A-luokka todisteiden osalta, mutta vaikutusta odotetaan. Nat. Pastori Urol. 2019, 16, 570–571. [CrossRef]

3. Rerks-Ngarm, S.; Pitisuttithum, P.; Nitayaphan, S.; Kaewkungwal, J.; Chiu, J.; Paris, R.; Premsri, N.; Namwat, C.; De Souza, M.; Adams, E.; et ai. Rokotus ALVAC- ja AIDSVAX-rokotteella HIV-1-tartunnan estämiseksi Thaimaassa. N. Engl. J. Med. 2009, 361, 2209–2220. [CrossRef]

4. Ng'uni, T.; Chasara, C.; Ndhlovu, ZM Tärkeimmät tieteelliset esteet HIV-rokotteen kehittämisessä: Historiallinen näkökulma ja tulevaisuuden suunnat. Edessä. Immunol. 2020, 11, 590780. [CrossRef]

5. Robinson, HL HIV/AIDS-rokotteet: 2018. Clin. Pharmacol. Siellä. 2018, 104, 1062–1073. [CrossRef]

6. Wang, Q.; Zhang, L. Yleisesti neutraloivat vasta-aineet ja rokotesuunnittelu HIV{1}}-infektiota vastaan. Edessä. Med. 2020, 14, 30–42. [CrossRef]

7. Collins, DR; Gaiha, GD; Walker, BD CD8+ T-solut HIV:n hallinnassa, hoidossa ja ehkäisyssä. Nat. Rev. Immunol. 2020, 20, 471–482. [CrossRef] [PubMed]

8. Pollard, AJ; Bijker, EM Rokotteiden opas: perusperiaatteista uuteen kehitykseen. Nat. Rev. Immunol. 2021, 21, 83–100. [CrossRef]

9. Shapiro, SZ Yleisen rokotustutkimuksen oppitunteja yrityksistä kehittää HIV-rokote. Rokote 2019, 37, 3400–3408. [CrossRef]

10. Ahmed, HG; Bensumaidea, SH; Alshammari, FD; Alenazi, FSH; ALmutlaq, BA; Alturkstani, MZ; Aladani, IA Ihmisen papilloomaviruksen alatyyppien 16 ja 18 esiintyvyys jemeniläisten kohdunkaulansyöpäpotilaiden keskuudessa. Aasian ja Tyynenmeren alue J. Syöpä Esim. 2017, 18, 1543–1548. [CrossRef]

11. Olcese, VA; Chen, Y.; Schlegel, R.; Yuan, H. HPV16 L1 -silmukkadomeenien karakterisointi tyyppispesifisen konformaatioepitoopin muodostumisessa. BMC Microbiol. 2004, 4, 29. [CrossRef]

12. Dupuy, C.; Buzoni-Gate, D.; Touze, A.; Le Cann, P.; Bout, D.; Coursaget, P. Soluvälitteinen immuniteetti, jonka HPV 16 L1 -viruksen kaltaiset partikkelit indusoivat hiirissä. Microb. Patog. 1997, 22, 219–225. [CrossRef] [PubMed]

13. Schiller, J.; Lowy, D. Selitykset HPV-profylaktisten rokotteiden voimakkaasta tehosta. Rokote 2018, 36, 4768–4773. [CrossRef] [PubMed]

14. Markowitz, LE; Schiller, JT Ihmisen papilloomavirusrokotteet. J. Infect. Dis. 2021, 224, S367–S378. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, CW; Saubi, N.; Joseph-Munné, J. Suunnittelukonseptit viruksen kaltaisiin hiukkasiin perustuviin HIV-1-rokotteisiin. Edessä. Immunol. 2020, 11, 573157. [CrossRef] [PubMed]

16. Eto, Y.; Saubi, N.; Ferrer, P.; Joseph, J. Kimeerisen viruksen kaltaisten hiukkaspohjaisten rokotteiden suunnittelu ihmisen papilloomavirukselle ja HIV:lle: Oppitunnit. AIDS Rev. 2019, 21, 218–232. [CrossRef]

17. Liu, WJ; Liu, XS; Zhao, KN; Leggatt, GR; Frazer, IH Papillomavirus viruksen kaltaiset partikkelit useiden sytotoksisten T-soluepitooppien kuljettamiseen. Virology 2000, 273, 374–382. [CrossRef]

18. Liu, XS; Abdul-Jabbar, I.; Qi, YM; Frazer, IH; Zhou, J. Limakalvon immunisaatio papilloomaviruksen kaltaisilla hiukkasilla saa aikaan systeemisen ja limakalvon immuniteetin hiirillä. Virology 1998, 252, 39–45. [CrossRef]

19. Peng, S.; Frazer, IH; Fernando, GJ; Zhou, J. Papillomavirus viruksen kaltaiset partikkelit voivat kuljettaa määriteltyjä CTL-epitooppeja MHC-luokan I -reitille. Virology 1998, 240, 147–157. [CrossRef]

20. Zhai, Y.; Zhong, Z.; Zariffard, M.; Spear, GT; Qiao, L. Naudan papilloomaviruksen kaltaiset hiukkaset, jotka esittelevät konservoituneita epitooppeja HIV-1 gp41:n kalvon proksimaalisesta ulkoisesta alueesta, jotka aiheuttivat limakalvon ja systeemisiä vasta-aineita. Rokote 2013, 31, 5422–5429. [CrossRef]

21. Zhang, H.; Huang, Y.; Fayad, R.; Spear, GT; Qiao, L. Limakalvojen ja systeemisten neutraloivien vasta-aineiden induktio ihmisen immuunikatoviruksen tyyppiä 1 (HIV-1) vastaan ​​oraalisella immunisaatiolla naudan papilloomavirus-HIV-1 gp41 kimeerisillä viruksen kaltaisilla partikkeleilla. J. Virol. 2004, 78, 8342–8348. [CrossRef]

22. Xiao, SL; Wen, JL; Kong, NZ; Yue, HL; Leggatt, G.; Frazer, IH Kimeerisen BPV1 VLP:n antoreitti määrittää indusoitujen immuunivasteiden luonteen. Immunol. Cell Biol. 2002, 80, 21–29. [CrossRef]

23. Kirnbauer, R.; Taub, JANET; Greenstone, kanerva; Roden, RICHARD; Dürst, M.; Gissmann, L.; Lowy, DR; Schiller, JT Ihmisen papilloomaviruksen tyypin 16 LI ja L1-L2 tehokas itsekokoaminen viruksen kaltaisiksi partikkeleiksi. J. Virol. 1993, 67, 6929–6936. [CrossRef] [PubMed]

24. Zhao, Q.; Potter, CS; Carragher, B.; Lander, G.; Sworen, J.; Towne, V.; Abraham, D.; Duncan, P.; Washabaugh, MW; Sitrin, RD Viruksen kaltaisten hiukkasten karakterisointi GARDASIL®:ssa kryotransmissioelektronimikroskoopilla. Hyräillä. Rokotteet Immunother. 2014, 10, 734–739. [CrossRef] [PubMed]

25. Achour, A.; Lemhammedi, S.; Picard, O.; M'bika, JP; Zagury, JF; Moukrim, Z.; Willer, A.; Beix, F.; Burny, A.; Zagury, D. HIV-1 gp160-antigeenille spesifiset sytotoksiset T-lymfosyytit ja synteettinen P18IIIB-peptidi HLA-A11-immunisoidussa yksilössä. AIDS Res. Hyräillä. Retroviruses 1994, 10, 19-25. [CrossRef]

26. Nakagawa, Y.; Kikuchi, H.; Takahashi, H. TCR:n ja peptidi/MHC-vuorovaikutuksen molekyylianalyysi käyttämällä P18-I10--peräisiä peptidejä, joissa on yksi D-aminohapposubstituutio. Biophys. J. 2007, 92, 2570–2582. [CrossRef]

27. Qiu, Z.; Chong, H.; Yao, X.; Su, Y.; Cui, S.; He, Y. HIV-1 Gp41:n N-trimeerin alipaskun tunnistaminen ja karakterisointi: Vaikutus viruksen sisäänpääsyyn ja lääkekohteeseen. Aids 2015, 29, 1015–1024. [CrossRef]

28. Peters, BS; Cheingsong-Popov, R.; Callow, D.; Foxall, R.; Patou, G.; Hodgkin, K.; Weber, JN Pilottivaiheen II tutkimus HIV p17/p24:VLP:n (p24-VLP) turvallisuudesta ja immunogeenisuudesta oireettomilla HIV-seropositiivisilla koehenkilöillä. J. Infect. 1997, 35, 231-235. [CrossRef]

29. Chege, GK; Hampurilaiset, WA; Stutz, H.; Meyers, AE; Chapman, R.; Kiravu, A.; Bunjun, R.; Shephard, EG; Jacobs, WR; Rybicki, EP; et ai. Vankka immuniteetti auksotrofiselle Mycobacterium bovis BCG-VLP Prime-Boost -HIV-rokoteehdokkaalle ei-ihmiskädellisissä mallissa. J. Virol. 2013, 87, 5151–5160. [CrossRef]

30. Chege, GK; Thomas, R.; Shephard, EG; Meyers, A.; Bourn, W.; Williamson, C.; Maclean, J.; Harmaa, CM; Rybicki, EP; Williamson, AL Prime-boost-immunisointiohjelma, jossa käytetään rekombinantti-BCG- ja Pr55gag-viruksen kaltaisia ​​hiukkasrokotteita, jotka perustuvat HIV-tyypin 1 alatyyppiin C, saa aikaan Gag-spesifisiä vasteita paviaaneissa. Rokote 2009, 27, 4857–4866. [CrossRef]

31. Joseph, J.; Saubi, N.; Im, EJ; Fernández-Lloris, R.; Gil, O.; Cardona, PJ; Gatell, JM; Hanke, T. Vastasyntyneiden hiirten rokotus BCG.HIVA222 + MVA.HIVA:lla tehostaa HIV-1-spesifisiä immuunivasteita: Iän ja immunisointireittien vaikutus. Clin. Dev. Immunol. 2011, 2011, 516219. [CrossRef]

32. Saubi, N.; Gea-Mallorquí, E.; Ferrer, P.; Hurtado, C.; Sánchez-Úbeda, S.; Eto, Y.; Gatell, JM; Hanke, T.; Joseph, J. Suunnittelemme uutta mykobakteerirokotetta BCG:n lysiiniauksotrofilla vektoroidulle lasten HIV-TB-rokotteelle. Mol. Siellä. Methods Clin. Dev. 2014, 1, 14017. [CrossRef]

33. Mahant, A.; Saubi, N.; Eto, Y.; Guitart, N.; Gatell, JM; Hanke, T.; Joseph, J. Integratiivisen ilmentämisvektorin sisältävän BCG.HIVA2auxo.int:n prekliininen kehittäminen lasten HIV-TB-rokotteelle. Vakauden ja spesifisen HIV-1 T-soluimmuniteetin parantaminen. Hyräillä. Rokotteet Immunother. 2017, 13, 1798–1810. [CrossRef] [PubMed]

34. Hanke, T.; McMichael, AJ Kokeellisen HIV-1-rokotteen suunnittelu ja rakentaminen vuoden-2000 kliiniseen tutkimukseen Keniassa. Nat. Med. 2000, 6, 951–955. [CrossRef] [PubMed]

35. Durocher, Y.; Perret, S.; Kamen, A. Korkean tason ja tehokkaan rekombinanttiproteiinin tuotanto suspensiossa kasvavien ihmisen 293-EBNA1-solujen ohimenevällä transfektiolla. Nucleic Acids Res. 2002, 30, E9. [CrossRef] [PubMed]

36. Kim, HJ; Kim, SY; Lim, SJ; Kim, JY; Lee, SJ; Kim, HJ Saccharomyces cerevisiaesta peräisin olevan ihmisen papilloomaviruksen tyypin 16 L1-proteiinin yksivaiheinen kromatografinen puhdistus. Protein Expr. Purif. 2010, 70, 68–74. [CrossRef] [PubMed]

37. Eto, Y.; Saubi, N.; Ferrer, P.; Joseph-Munné, J. Kimeerisen HPV-HIV-proteiinin L1P18 ilmentäminen pichia pastoriksessa; viruksen kaltaisten hiukkasten puhdistus ja karakterisointi. Pharmaceutics 2021, 13, 1967. [CrossRef]

38. GE. CaptoTM Core 700:n ja Capto Q ImpResin käyttö ihmisen papilloomaviruksen kaltaisten hiukkasten puhdistuksessa. J. Asia's Pharm. Biopharm. Ind. 2014, 1–4.

39. McLean, CS; Churcher, MJ; Meinke, J.; Smith, GL; Higgins, G.; Stanley, M.; Minson, AC Monoklonaalisen vasta-aineen tuotanto ja karakterisointi ihmisen papilloomavirukselle tyyppi 16 käyttäen rekombinanttivacciniavirusta. J. Clin. Pathol. 1990, 43, 488–492. [CrossRef]

40. Merck Canada Inc. Tuotemonografia Gardasil®. Tuot. Monogr. Monopril Prod. Monogr. 2015, 1–71.

41. Achour, A.; Persson, K.; Harris, RA; Sundbäck, J.; Sentman, CL; Lindqvist, Y.; Schneides, G.; Kärre, K. H-2D(d) MHC-luokan I kiderakenne kompleksoituneena HIV-1--peräisen peptidin P18-110 kanssa 2,4 Å:n resoluutiolla: vaikutukset T-soluihin ja NK-soluihin tunnustaminen. Immunity 1998, 9, 199–208. [CrossRef]

42. Pang, W.; Tom, SC; Zheng, YT Nykyiset peptidi-HIV-tyypin-1 fuusioestäjät. Antivir. Chem. Chemother. 2009, 20. [CrossRef]

43. Chen, XS; Garcea, RL; Goldberg, I.; Casini, G.; Harrison, SC Ihmisen papilloomaviruksen L1-proteiinista koottu pienten viruksen kaltaisten hiukkasten rakenne 16. Mol. Cell 2000, 5, 557-567. [CrossRef] [PubMed]

44. päivä, PM; Weisberg, AS; Thompson, CD; Hughes, MM; Pang, YY; Lowy, DR; Schiller, JT Ihmisen papilloomavirus 16 kapsidit välittävät tumaan pääsyä infektion aikana. J. Virol. 2019, 93, e00454-19. [CrossRef]

45. Zhou, J.; Doorbar, J.; aurinko, XY; Crawford, LV; McLean, CS; Frazer, IH Ihmisen papilloomaviruksen tyypin 16 L1-proteiinin tuman lokalisaatiosignaalin tunnistaminen. Virology 1991, 185, 625–632. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Vlps, A.; Middelberg, APJ; Lua, LHL Virusmainen hiukkasten bioprosessointi: Haasteita ja mahdollisuuksia. Pharm. Bioprosessi. 2013, 1, 407–409.

47. Bousarghin, L.; Touzé, A.; Combita-Rojas, AL; Coursaget, P. Ihmisen papilloomaviruksen tyypin 16 kapsidiproteiinien positiivisesti varautuneet sekvenssit ovat riittäviä välittämään geenin siirtoa kohdesoluihin heparaanisulfaattireseptorin kautta. J. Gen. Virol. 2003, 84, 157–164. [CrossRef]

48. Sasagawa, T.; Pushko, P.; Steers, G.; Gschmeissner, SE; Nasser Hajibagheri, MA; Finch, J.; Crawford, L.; Tommasino, M. Ihmisen papilloomavirusten tyypin 6 ja tyypin 16 viruksen kaltaisten partikkelien synteesi ja kokoonpano fissiohiivassa Schizosaccharomyces pombe. Virology 1995, 206, 126–135. [CrossRef]

49. Biemelt, S.; Sonnewald, U.; Galmbacher, P.; Willmitzer, L.; Müller, M. Ihmisen papilloomaviruksen tyypin 16 viruksen kaltaisten hiukkasten tuotanto siirtogeenisissä kasveissa. J. Virol. 2003, 77, 9211–9220. [CrossRef]

50. Zahin, M.; Joh, J.; Khanal, S.; Husk, A.; Mason, H.; Warzecha, H.; Ghim, SJ; Miller, DM; Matoba, N.; Jenson, AB Skaalautuva HPV16 L1 -proteiinin ja VLP:iden tuotanto tupakanlehdistä. PLoS ONE 2016, 11, e0160995. [CrossRef]

51. Aires, KA; Cianciarullo, AM; Carneiro, SM; Villa, LL; Boccardo, E.; Pérez-Martinez, C.; Perez-Arellano, I.; Oliveira, MLS; Ho, PL Ihmisen papilloomaviruksen tyypin 16 L1 viruksen kaltaisten partikkelien tuottaminen rekombinantti Lactobacillus casei -soluilla. Appl. Ympäristö. Microbiol. 2006, 72, 745–752. [CrossRef]

52. Shank-Retzlaff, ML; Zhao, Q.; Anderson, C.; Hamm, M.; High, K.; Nguyen, M.; Wang, F.; Wang, N.; Wang, B.; Wang, Y.; et ai. Gardasilin® lämpöstabiilisuuden arviointi. Hyräillä. Rokote. 2006, 2, 147–154. [CrossRef] [PubMed]

53. Mukherjee, S.; Thorsteinsson, MV; Johnston, LB; DePhillips, PA; Zlotnick, A. Kvantitatiivinen kuvaus ihmisen papilloomaviruksen 16 viruksen kaltaisen hiukkasen in vitro -kokoonpanosta. J. Mol. Biol. 2008, 381, 229–237. [CrossRef] [PubMed]

54. McCarthy, kansanedustaja; Valkoinen, WI; Palmer-Hill, F.; Koenig, S.; Suzich, JA Ihmisen papilloomaviruksen tyypin 11 viruksen kaltaisten hiukkasten kvantitatiivinen purkaminen ja uudelleen kokoaminen in vitro. J. Virol. 1998, 72, 32–41. [CrossRef] [PubMed]

55. Kirnbauer, R.; Booy, F.; Cheng, N.; Lowy, DR; Schiller, JT Papilloomavirus L1:n pääkapsidiproteiini kokoontuu itsestään viruksen kaltaisiin partikkeleihin, jotka ovat erittäin immunogeenisiä. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 88, 12180–12184. [CrossRef]

56. Patel, MC; Patkar, KK; Basu, A.; Mohandas, KM; Mukhopadhyaya, R. Immunogeenisten ihmisen papilloomaviruksen-16 tärkeimpien kapsidiproteiiniperäisten virusten kaltaisten hiukkasten tuotanto. Intialainen J. Med. Res. 2009, 130, 213–218.

57. Shi, L.; Sanyal, G.; Ni, A.; Luo, Z.; Doshna, S.; Wang, B.; Graham, TL; Wang, N.; Volkin, DB Ihmisen papilloomaviruksen kaltaisten hiukkasten stabilointi ionittomilla pinta-aktiivisilla aineilla. J. Pharm. Sci. 2005, 94, 1538–1551. [CrossRef]

58. Carter, JJ; Wipf, GC; Benki, SF; Christensen, ND; Galloway, DA Ihmisen papilloomavirustyypin 16-spesifisen epitoopin tunnistaminen pääkapsidiproteiinin L1 C-terminaalissa. J. Virol. 2003, 77, 11625–11632. [CrossRef]

59. Von Brunn, A.; Brand, M.; Reichhuber, C.; Morys-Wortmann, C.; Deinhardt, F.; Schdelt, F. HIV-I:n pääasiallinen neutraloiva domeeni on erittäin immunogeeninen, kun sitä ilmennetään hepatiitti B -ydinpartikkelien pinnalla. Vaccine 1993, 11, 817-824. [CrossRef]

60. Dennison, SM; Anasti, K.; Scearce, RM; Sutherland, L.; Parks, R.; Xia, S.-M.; Liao, H.-X.; Gorny, MK; Zolla-Pazner, S.; Haynes, BF; et ai. Ei-neutralisoivat HIV-1 gp41 Envelope Cluster II -monoklonaaliset vasta-aineet osoittavat polyreaktiivisuutta sitoutuessaan fosfolipideihin ja proteiiniautoantigeeneihin. J. Virol. 2011, 85, 1340–1347. [CrossRef]

61. Tkola, A.; Kuster, H.; Rusert, P.; Joos, B.; Fischer, M.; Leemann, C.; Manrique, A.; Huber, M.; Rehr, M.; Oxenius, A.; et ai. HIV-1-reboundin viivästyminen antiretroviraalisen hoidon lopettamisen jälkeen ihmisen neutraloivien vasta-aineiden passiivisen siirron seurauksena. Nat. Med. 2005, 11, 615–622. [CrossRef]

62. Shank-Retzlaff, M.; Wang, F.; Morley, T.; Anderson, C.; Hamm, M.; Brown, M.; Rowland, K.; Pancari, G.; Zorman, J.; Alempi.; et ai. Korrelaatio hiiren tehon ja ihmisen papilloomaviruksen tyypin 16 viruksen kaltaisten hiukkasten ja Gardasil-rokotenäytteiden suhteellisen tehon välillä. Hyräillä. Rokote. 2005, 1, 191–197. [CrossRef] [PubMed]

63. Kilpeläinen, A.; Maya-Hoyos, M.; Saubí, N.; Soto, CY; Joseph Munne, J. Edistyminen ja haasteet rekombinantti Mycobacterium bovis BCG-pohjaisen HIV-rokotteen kehittämisessä: Oppitunnit. Expert Rev. Vaccines 2018, 17, 1005–1020. [CrossRef] [PubMed]




Saatat myös pitää