Seeprakalan alkio mallina ruoan antioksidanttiyhdisteiden suojaavien vaikutusten testaamiseen

Sähköpostitina.xiang@wecistanche.comLisätietoja.

Abstrakti:antioksidanttielintarvikeyhdisteiden aktiivisuus on yksi eniten kiinnostusta herättävistä ominaisuuksista johtuen sen terveyshyödyistä ja korrelaatiosta kroonisten sairauksien ehkäisyn kanssa. Tämä aktiivisuus mitataan yleensä in vitro -määrityksillä, joilla ei voida ennustaa in vivo -vaikutuksia tai -mekanismeja. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida kuuden elintarvikkeissa luonnollisesti esiintyvän fenoliyhdisteen (naringeniini, apigeniini, rutiini, oleuropeiini, klorogeenihappo ja kurkumiini) ja kolmen karotenoidin (lykopeeni B, -karoteeni ja astaksantiini) suojaavia vaikutuksia in vivo. seeprakalan alkiomalli. Seeprakalan alkio esikäsiteltiin jokaisella yhdeksästä antioksidanttiyhdisteestä ja altistettiin sitten tertbutyylihydroperoksidille (tBOOH), joka on tunnettu indusoijaoksidatiivista stressiäseeprakaloissa. Merkittävät erot määritettiin vertaamalla tBOOH:n aiheuttaman kuolleisuuden ja dysmorfogeneesin pitoisuus-vastetta esikäsiteltyihin alkioihin.antioksidanttiyhdisteet. Jokaisella yhdisteellä, paitsi -karoteenilla, havaittiin suojaava vaikutus oksidatiivisen stressin aiheuttamaa kuolleisuutta vastaan. Lisäksi apigeniini, rutiini ja kurkumiini osoittivat myös suojaavia vaikutuksia dysmorfogeneesiä vastaan. Toisaalta -karoteeni osoitti lisääntynyttä kuolleisuutta ja dysmorfogeneesiä verrattuna pelkkään tBOOH-hoitoon.

Avainsanat: oksidatiivista stressiä; seeprakalan alkio; antioksidanttivaikutus; polyfenolit; karotenoidit

1. Esittely

Reaktiiviset happilajit (ROS) ja reaktiiviset typpilajit (RNS) syntyvät soluaineenvaihdunnan aikana. Ne ovat välttämättömiä normaalille fysiologiselle tilalle, mutta ne osallistuvat patologisiin prosesseihin, kun niitä on liikaa [1]. Aerobisilla organismeilla on puolustuskyky, joka estää ROS:n aiheuttamia oksidatiivisia vaurioita, mukaan lukienantioksidanttientsyymit ja/tai ei-entsymaattiset mekanismit, mukaan lukien endogeenisesti tuotetut antioksidanttiyhdisteet tai antioksidanttien nauttiminen ruokavaliosta [2].
Epätasapaino, kun reaktiivisten lajien pitoisuus on suurempi kuinantioksidanttielimistön puolustukseksi kutsutaanoksidatiivista stressiä(OS) [3]. Käyttöjärjestelmän seurauksiin kuuluu makrofagien rekrytointi; lipidien ja proteiinien normaalin toiminnan estäminen; sekä mitokondrioiden, kalvojen ja DNA:n vauriot [4–7]. Nämä muutokset ovat korreloineet useiden patologioiden kanssa, kuten syövän, ikääntymisen, diabeteksen, nivelreuman sekä sydän- ja verisuonisairauksien sekä hermostoa rappeuttavien sairauksien kanssa [8–11].

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että organismi tarvitsee antioksidanttien saantia ruokavalion kautta vähentääkseen oksidatiivisia vaurioita [12] fysiopatologisissa tilanteissa (UV-altistuksen, tupakoinnin, saastuneen ilman jne. vuoksi), jotka tuottavat ylimääräistä ROS:ää. Ruokavalion mukana tulee erilaisia ​​antioksidantteja, kuten fenoliyhdisteitä, vitamiineja, karotenoideja jaflavonoidit. Termi "fenoliyhdisteet" tarkoittaa mitä tahansa ainetta, jossa on aromaattisiin tai alifaattisiin rakenteisiin kiinnittynyt fenoliryhmä. Fenoliyhdisteet tulevat kasveista ja ovat tärkeimpiä sekundaarisia aineenvaihduntatuotteita; niiden läsnäolo eläinkunnassa johtuu niiden nauttimisesta ruokavalion kautta. Näiden yhdisteiden joukossaflavonoiditovat tutkituimpia ja runsaimpia; niiden kemialliset rakenteet sisältävät aflavonoidiydin, joka koostuu 15 hiiliatomista, jotka on järjestetty kolmeen renkaaseen (C6-C3-C6) [13]. Niiden antioksidanttimekanismeihin kuuluvat entsyymien estäminen tai vapaiden radikaalien tuottamiseen osallistuvien hivenaineiden kelatointi, ROS:n otto ja endogeenisten antioksidanttipuolustusten suojaaminen [14]. Ilkeätflavonoidisaannin arvioidaan olevan 23 mg/vrk [15,16], ja ensisijaisia ​​lähteitä ovat musta tee, punaviini, sipulit, omenat ja olut [17,18].

Toinen ryhmä yhdisteitä, joita on tutkittu niiden antioksidanttisen vaikutuksen vuoksi, ovat karotenoidit. Ne ovat pigmenttejä, joiden rakenteet käsittävät sarjan konjugoituja C=C -sidoksia (polyeeni), jotka mahdollistavat niiden vuorovaikutuksen vapaiden radikaalien kanssa; siksi ne voivat toimia tehokkaina antioksidantteina [19]. Karotenoidit ovat levinneet laajalti luonnollisissa järjestelmissä, ja niiden roolia eri sairauksien ehkäisyssä on tutkittu lähinnä ruokavaliossa olevien yhdisteiden, kuten karoteenin, luteiinin ja lykopeenin osalta [18,20,21].

Roolien tunnistaminenantioksidanttejasairauksissa ja häiriöissä, jotka korreloivat oksidatiivisten prosessien kanssa, on olennaista suojaavien vaikutusten analysoinnissa in vivo. Tästä syystä laboratoriomme on kehittänyt seeprakalan (ZF) alkiomallin näiden suojaavien vaikutusten arvioimiseksi.antioksidanttiyhdisteet [22].Oksidatiivista stressiäindusoidaan käyttämällä tertbutyylihydroperoksidia (tBOOH). tBOOH synnyttää butoksyyliradikaaleja Fentonin reaktion kautta [23]. Muodostuneet radikaalit suosivat tioliryhmien ja glutationivarantojen solunsisäistä ehtymistä, mikä lisää merkittävästi altistuneiden seeprakalan alkioiden kuolleisuutta ja dysmorfogeneesiä. Tämä malli mahdollistaa tBOOH:lle altistuneiden seeprakalan alkioiden kuolleisuuden ja dysmorfogeneesin pitoisuus-vaikutuskäyrien vertailun antioksidanteilla esikäsiteltyjen alkioiden käyrien välillä; voidaan suorittaa tilastollinen analyysi analysoidun antioksidanttiyhdisteen suojaavan vaikutuksen tutkimiseksi.

Tämän työn tavoitteena oli arvioida antioksidanttisesti vaikuttavien elintarvikeyhdisteiden in vivo suojaavia vaikutuksia hapettumisen aiheuttamaa kehitysmyrkyllisyyttä vastaan ​​seeprakalan alkioissa.

2. Tulokset

2.1. Konsentraatiovaikutuskäyrät tBOOH:lle seeprakalan alkioissa

Tutkimusryhmämme kehitti ja validoi aiemmin ZF-alkionoksidatiivista stressiämalli, jolla arvioida suojaava aktiivisuusantioksidanttiaineet (22).

Seeprakalan alkiot altistetaan tertbutyylihydroperoksidille (tBOOH), jotta saadaan kuolleisuus- ja dysmorfogeneesikäyrät. Seeprakalan alkiot altistetaan tBOOH:lle 24–48 tuntia hedelmöityksen jälkeen (hpf) eri pitoisuuksilla, jotka vaihtelevat 1–3,5 mM (kuva 1). Kuolettavan pitoisuuden 50 (LC50) havaittiin olevan 2,1 mM, kun taas dysmorfogeneesin (EC50) tehokas konsentraatio 50 oli 1,7 mM. Edellä mainittuja käyriä käytettiin vertaamaan seeprakalan alkioita, jotka oli aiemmin altistettu antioksidanttiyhdisteille tai ei, minkä jälkeen ne altistettiin tBOOH:lle.

2.2. Antioksidanttiyhdisteiden suojaavien vaikutusten tunnistaminen seeprakalan alkioissa

Aiemmin kuvattua seeprakalamallia käytettiin ruoan sisältämän kuuden polyfenolin ja kolmen karotenoidin suojaavien vaikutusten arvioimiseen.

Kuudesta polyfenolista kolme oliflavonoidit: naringeniini (20 uM), apigeniini (10 uM) ja rutiini (10 uM). Kolmeflavonoiditaiheutti merkittävän poikkeaman kuolleisuuden pitoisuus-vastekäyrissä. Lisäksi apigeniini ja rutiini osoittivat suojaavia vaikutuksia dysmorfogeneesiä vastaan, kun taas naringeniini ei osoittanut mitään suojaavaa vaikutusta dysmorfogeneesiä vastaan ​​(kuva 2).

Oleuropeiini (15 μM), klorogeenihappo (20 uM) ja kurkumiini (15 μM) analysoitiin myös. Nämä polyfenolit johtivat merkittävään ajautumiseen kuolleisuuden pitoisuus-vastekäyrissä. Vain kurkumiinilla oli suojaava vaikutus dysmorfogeneesiä vastaan ​​(kuva 3).

Lisäksi arvioitiin karotenoidit lykopeeni (20 μM), astaksantiini (20 μM) ja -karoteeni (25 μM). Lykopeeni ja astaksantiini johtivat merkittävään ajautumiseen kuolleisuuden pitoisuus-vastekäyrissä. Sitä vastoin yksikään karotenoideista ei osoittanut suojaavaa vaikutusta dysmorfogeneesiä vastaan ​​(kuva 4). Lisäksi -karoteeni johti vasemmalle siirtymiseen kuolleisuuden ja dysmorfogeneesin käyrissä, mikä voisi viitata mahdolliseen prooksidanttivaikutukseen.

3. Keskustelu

Happi on välttämätön ihmisen elämälle; kuitenkin samalla se tuottaa myrkyllisiä aineita, kuten vapaita radikaaleja ja reaktiivisia happilajeja (ROS); nämä aineet ovat hapettavia, epästabiileja ja reaktiivisia. Lisäksi ne voivat reagoida minkä tahansa makromolekyylin kanssa ja aiheuttaa soluvaurioita [24]. Näiden hapettavien aineiden estämiseksi elimistö käyttää antioksidanttisia entsyymejä, kuten superoksididismutaasia ja glutationiperoksidaasia, sekä ruokavaliosta peräisin olevia antioksidanttiyhdisteitä. Siksi yhdisteiden antioksidanttikapasiteetin tutkimus on herättänyt mielenkiintoa viime vuosina. On olemassa useita in vitro -tekniikoita antioksidanttiaktiivisuuden määrittämiseen, vaikka niillä on rajoituksia ravitsemuksellisesti, koska mikään niistä ei toista fysiologista tilannetta [25]. Tästä syystä in vivo -tekniikoita sisältävä menetelmä johtaisi tehokkaampiin tuloksiin, koska oksidatiivinen stressi merkitsee mekanismeja, jotka riippuvat monista järjestelmän olosuhteista, erityisesti reaktioiden kineettisistä osista. Tiimimme käytti ZF-alkiomallia [22], joka voisi olla arvokas in vivo -menetelmä testatakseen yhdeksän antioksidanttiyhdisteen suojaavia vaikutuksia, joita on laajasti tutkittu in vitro. Arvioimme kuusi fenoliyhdistettä ja kolme karotenoidia. Fenoliyhdisteet edistävät merkittävästi ihmisen ruokavalion antioksidanttipotentiaalia; Näistä yhdisteistä flavonoidit ovat tutkituimpia ja runsaimpia. Flavonoidien apigeniinin, rutiinin ja naringeniinin antioksidanttista aktiivisuutta tutkittiin. Nämä flavonoidit ovat bioaktiivisia yhdisteitä, joita löytyy pääasiassa erilaisista hedelmistä, kasveista ja vihanneksista, pähkinöistä ja sipulista. In vitro -tutkimukset ovat osoittaneet, että nämä flavonoidit neutraloivat tehokkaasti hydroksyyliradikaaleja, superoksidia, vetyperoksidia, typpioksidiradikaaleja, DPPH:ta ja lipidiperoksidaatiota [26–29]. Chen ym. vuonna 2012 [30] suorittivat QSAR-analyysin seeprakalan toukkamallilla arvioidakseen viidentoista flavonoidin, mukaan lukien rutiinin, ROS-poistokykyä UV-indusoitua fototoksisuutta vastaan. Aikaisempien tutkimusten mukaisesti he päättelivät kahden hydroksyyliryhmän tärkeyden ja niiden aseman siten, että vähintään kaksi hydroksyyliryhmää ovat välttämättömiä vahvalle biologiselle aktiivisuudelle [30,31]. Lisäksi määritettiin, että hydroksyyliryhmät asemissa C3, C5 ja C7 antavat paremman flavonin stabiilisuuden ja aktiivisuuden [31]. Tuloksemme osoittivat kolmen flavonoidin suojaavan vaikutuksen tBOOH:n aiheuttamaa kuolleisuutta vastaan. Apigeniini ja rutiini osoittivat myös suojaavia vaikutuksia dysmorfogeneesiä vastaan; naringeniini ei kuitenkaan osoittanut mitään vaikutusta dysmorfogeneesiä vastaan.

Flavonoidien lisäksi arvioitiin oleuropeiinin, klorogeenihapon ja kurkumiinin antioksidanttisia vaikutuksia. In vitro ja in vivo -tutkimukset ovat osoittaneet, että nämä

kolmella fenoliyhdisteellä on tärkeitä antioksidanttisia vaikutuksia [32–34]. Oleuropeiini on biofenoli, jota löytyy oliivinlehdistä, ekstra-neitsytoliiviöljystä ja joistakin Oleaceae-heimon lajeista [32]. Klorogeenihapot (CGA) ovat estereitä, jotka muodostuvat kahvi- ja kiniinihappojen välillä ja edustavat ryhmää ihmisen ruokavaliossa olevia polyfenoleja [35]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että CGA:ta sisältävät juomat, kuten kahvi, tee, viini ja erilaiset hedelmämehut, vähentävät riskiä sairastua erilaisiin kroonisiin sairauksiin [36–38]. Yksi syy tähän pelkistykseen on CGA:iden antioksidanttikapasiteetti, sillä ne luovuttavat vetyatomeja vähentämään vapaita radikaaleja ja estämään hapettumisreaktioita [35]. Kurkumiini on polyfenoli, jota käytetään elintarvikkeiden värjäämiseen ja maustamiseen. Sen antioksidanttista aktiivisuutta on tutkittu muutaman viime vuoden aikana, ja yksi tutkimus viittaa siihen, että se voi suojata biokalvoja peroksidatiivisilta vaurioilta [39]. ZF-alkiomallia käyttämällä havaittiin, että esikäsittely oleuropeiinilla, klorogeenihapolla tai kurkumiinilla vähensi tBOOH:n aiheuttaman oksidatiivisen stressin kuolleisuutta aiheuttavaa vaikutusta; kuitenkin vain kurkumiinilla havaittiin merkittävä suojaava vaikutus dysmorfogeneesiä vastaan.

Toinen ryhmä, jolla on antioksidanttisia ominaisuuksia, ovat karotenoidit, joka on kaikkialla esiintyvä isoprenoidipigmenttien ryhmä. Ne ovat singlettihapen sammuttajia ja ROS:n poistajia [40]. Karotenoidien anti- ja prooksidanttiaktiivisuuden taustalla olevia molekyylimekanismeja ei vieläkään täysin ymmärretä. Tutkituimpia karotenoideja ovat lykopeeni ja -karoteeni. Näitä löytyy runsaasti tomaateista, tomaattikastikkeesta, erilaisista hedelmistä, levistä ja vihanneksista [18,41]. Arvioitaessa näiden karoteenien suojaavia vaikutuksia havaittiin, että lykopeeni osoitti antioksidanttiaktiivisuutta, ja sillä oli suojaava vaikutus alkion kuolleisuutta vastaan; mitään vaikutusta dysmorfogeneesiä vastaan ​​ei kuitenkaan havaittu. Toisaalta -karoteeni lisäsi kuolleisuuden ja dysmorfogeneesin ilmaantuvuutta ZF-alkioissa verrattuna pelkän hapettimen vaikutukseen; tämä on sopusoinnussa tutkimusten kanssa, jotka ovat osoittaneet, että suurilla karoteenin annoksilla on antioksidanttisia vaikutuksia, joita seuraa prooksidanttivaikutus korkealla happipaineella, mikä saattaa liittyä sen haitallisiin vaikutuksiin [42]. Lisäksi tutkimus osoitti, että karoteenin lisäyksellä ei ollut suojaavaa vaikutusta diabeettisten miesten tupakoitsijoiden kokonaiskuolleisuuteen verrattuna lumelääkkeeseen [43]. Toinen arvioitu karotenoidi oli astaksantiini; se on ksantofylli karotenoidi, jota löytyy levistä, hiivasta, lohesta, taimenesta, krilleistä, katkarapuista ja rapuista. Se on punainen, rasvaliukoinen antioksidanttipigmentti, jolla ei ole A-vitamiinia edistävää aktiivisuutta [44]. Tutkimuksessamme astaksantiinilla oli suojaava vaikutus kuolleisuutta vastaan, mutta vaikutusta dysmorfogeneesiä vastaan ​​ei havaittu.

Yhteenvetona voidaan todeta, että kahdeksan yhdeksästä arvioidusta molekyylistä osoitti antioksidanttiaktiivisuutta ja suojaava vaikutus ZF:n alkion kuolleisuutta vastaan. Vain apigeniini (10 µM), rutiini (10 µM) ja kurkumiini (15 µM) osoittivat lisäksi suojaavia vaikutuksia tBOOH:n aiheuttamasta oksidatiivisesta stressistä johtuvaa dysmorfogeneesiä vastaan. Sitä vastoin havaittiin, että -karoteeni tuotti päinvastaisen vaikutuksen, lisäten kuolleisuutta ja dysmorfogeneesin määrää, koska se alensi LC50- ja EC50-arvoja. Oksidatiivisten ja antioksidatiivisten voimien tasapaino ja ajoitus ovat avainasemassa alkion kehityksen asianmukaisessa säätelyssä ja ajoituksessa [45]. Erot näiden antioksidanttien kinetiikassa tai vaikutusmekanismissa voivat olla johtava syy erilaisiin suojakykyihin dysmorfogeneesiä vastaan. Lisää tutkimuksia tarvitaan sen selvittämiseksi, miksi vain joillakin yhdisteillä oli suojaavia vaikutuksia morfogeneesiin alkionkehityksen aikana. Tässä tutkimuksessa yritettiin erottaa alkiotoksinen vaikutus (kuolleisuus) ja dysmorfogeneesivaikutus (teratogeenisuus). Joissakin tapauksissa epämuodostumat todennäköisesti edeltävät ja johtavat kuolemaan. Muissa tapauksissa kuolleisuus ja epämuodostumat voivat johtua eri syistä. Näiden kahden ilmentymän riippumattomuutta epäillään, jos yhdiste lisäisi eroa letaalin ja dysmorfogeneesin pitoisuus-vastekäyrän välillä. Kaikki tutkimuksessamme testatut antioksidanttiyhdisteet eivät lisänneet teratogeenista vaikutusta tappavaan annokseen enempää kuin kaksinkertaisesti; siksi minkään antioksidanttiyhdisteen teratogeenisen potentiaalin lisääntymistä ei havaittu [46].

Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että tämä ZF-alkiomalli on arvokas työkalu, jolla analysoidaan ravinnon muodostavien antioksidanttimolekyylien suojaavia vaikutuksia. Lisäanalyysit ovat tarpeen sellaisten kemiallis-rakenteellisten syiden määrittämiseksi, joiden vuoksi apigeniini, rutiini ja kurkumiini osoittivat eniten suojaavia vaikutuksia tutkimuksessamme. esimerkiksi kvantitatiivisten rakenne-aktiivisuussuhteiden (QSAR) määrittämiseen.

4. Materiaalit ja menetelmät

4.1. Eettinen lausunto

Seeprakalan toukkia ja alkioita koskeville toimenpiteille antoi luvan Barcelonan yliopiston eläinten eettinen komitea, lupanumero tai pöytäkirja 7971 Katalonian hallituksen karja- ja kalastusosastolta (ProcedureDAAM 7971).

4.2. Kemikaalit ja liuos

Valmistus Tert-butyylihydroperoksidi (tBOOH, CAS-numero: 75-91-2) ja antioksidanttiyhdisteet hankittiin TCI Europelta. tBOOH liuotettiin 0,3X Danieaun puskuriin (17,4 mM NaCl; 0,23 mM KCl; 0,12 mM MgSO4·7 H2O; 0,18 mM Ca (NO3)2; 1,5 mM HEPES(N-(2-hydroksietyyli)piperatsiini-N0 -(2-etaanisulfonihappo); pH 7,4).

Naringeniini (20 µM) (CAS-numero: 67604-48-2), oleuropeiini (15 µM) (CAS-numero:32619-42-4), rutiini (10 µM) (CAS-numero) : 207671-50-9), klorogeenihappo (20 µM) (CAS-numero: 327-97-9), apigeniini (10 µM) (CAS-numero: 520-36-5), kurkumiini (15 µM) (CAS-numero: 458-37-7), lykopeeni (20 µM) (CAS-numero: 502-65-8), astaksantiini (20 µM) (CAS-numero: 472-61-7) ja -karoteeni (25 µM) (CAS-numero: 7235-40-7) hankittiin Sigmar-Aldrich®:ltä. Antioksidantit liuotettiin 100-prosenttiseen dimetyylisulfoksidiin (DMSO, Sigma Aldrich, Madrid, Espanja) ja laimennettiin sen jälkeen 0,3 x Danieaun puskuriin lopulliseen DMSO-pitoisuuteen 0,05 % (v/v). Antioksidantteja käytettiin eri pitoisuuksina riippuen korkeimmasta pitoisuudesta, jolla ei havaittu vaikutusta kuolleisuuteen tai alkionkehitykseen (maksimi siedettävä pitoisuus, MTC)

4.3. Seeprakalan huolto ja kananmunien tuotanto

Aikuisia villityypin seeprakaloja pidettiin standardoiduissa olosuhteissa. Alkiot kerättiin, puhdistettiin ja valittiin niiden elinkelpoisuuden mukaan. Hedelmöitetyt alkiot käsiteltiin Kansainvälisen standardointijärjestön (ISO) standardien 7346-1 ja 7346-2 (ISO, 1998; 2 mM CaCl2·2H2O, 0,5 mM MgSO4) mukaisesti standardoidulla vedellä. ·7H2O, 0,75 mM NaHC03 ja 0,07 mM KCl). Hedelmöitetyt munat lavastettiin Kimmelin et al.:n, 1995 [47] aikaisempien tutkimusten mukaisesti, ja valikoitiin myöhempää altistamista varten dissektoivalla stereomikroskoopilla (Motic SMZ168, Motic China Group, LTD., Luwan, Shanghai, Kiina). Kalan alkioita pidettiin lasipulloissa kontrolloidussa lämpötilassa 27 ± 1 ◦C.

4.4. Seeprakalan alkioiden altistuminen oksidatiiviselle stressille (tert-butyylihydroperoksidi)

tBOOH-käyrän laatimisessa noudatettiin Boixin metodologiaa, 2020. Tämä menetelmä perustuu pitoisuus-kuolleisuusvaste (LC50) -käyrän ja dysmorfogeneesin (EC50) saamiseen altistamalla ZF-alkiot oksidatiivisen stressin indusoijalle, tertbutyylihydroperoksidille (tBOOH). Kun seeprakalan alkioita on saatu, niitä säilytetään 0,3X Danieau's -elatusaineessa 0 - 24 hpf. Alkiot altistetaan 24–48 hpf tBOOH-liuoksille eri pitoisuuksilla, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 ja 3,5 mM. Käytettiin alkioita kolmesta eri seeprakalan kytkimestä kolmena rinnakkaisena (kuvio 5A).

4.5. Antioksidanttiyhdisteiden suojaavien vaikutusten määrittäminen

Sen selvittämiseksi, oliko yhdisteellä suojaava vaikutus oksidatiivista stressiä vastaan, seeprakalan alkiot altistettiin ensin antioksidanttiyhdisteelle teholla 0 - 24 hevosvoimaa. Konsentraatiot laskettiin suurimman siedettävän pitoisuuden määrityksistä riippuen. Sitten alkiot altistettiin 24–48 hevosvoiman teholle stressin indusoijalle, tBOOH:lle. Tämän jälkeen jokainen alkioryhmä arvioitiin kullakin tBOOH-pitoisuudella (kuvio 5B). Sen määrittämiseksi, oliko merkittävää eroa, verrattiin pelkän tBOOH-altistuksen käyrää ja hapettumisenestoaineyhdisteelle esialtistuksen käyrää.

Kymmenen hedelmöitettyä munaa altistettiin 2,5 ml:lle kutakin ainetta ja pitoisuutta kohti. Suoritettiin kolme itsenäistä replikaatiota käyttämällä eri kututapahtumien munia. ZF-alkiot esialtistettiin antioksidanttiyhdisteille 24 tunnin ajan, sitten antioksidanttiliuos poistettiin, pesu suoritettiin Danieaun alustalla ja ZF-alkiot altistettiin erilaisille tBOOH-pitoisuuksille. Kuolleisuus arvioitiin 48 tunnin kuluttua, ja kuolleiden alkioiden keskiarvo laskettiin asianmukaisten määritysten jälkeen. Dysmorfogeneesin arvioimiseksi noudatimme Teixido et ai. kuvaamaa pisteytysjärjestelmää. [48] ​​alkioiden dysmorfogeneesin laskemiseksi noin 48 hpf:ssä. Valitsimme yhdeksän morfologista ominaisuutta, jotka on kuvattu taulukossa 2. Epänormaalien alkioiden esiintymistiheys laskettiin (määritelty alkioksi, joiden pistemäärä on 1 missä tahansa morfologisessa ominaisuudessa) kullekin pitoisuudelle ja käsitellylle ryhmälle.

Konsentraatio-vaste-käyrän siirtyminen oikealle johtuen esialtistumisesta antioksidanteille osoittaa suojaavan vaikutuksen oksidatiivisen stressin indusoijaa vastaan, koska indusoijan korkeampi pitoisuus vaaditaan samojen tulosten saamiseksi kuin pelkällä tBOOH-altistuksella. Antioksidanteille ennakkoaltistumisesta johtuen pitoisuus-vastekäyrän siirtyminen vasemmalle merkitsee oksidatiivisen stressin lisääntymistä.

4.6. Tilastollinen analyysi

Kuolleisuuden ja dysmorfogeneesin pitoisuus-vastekäyrät laskettiin ja arvioitiin GraphPad 7.02 Software Inc:n avulla. Neliöiden ylimääräisen summan F-testiä käytettiin vertaamaan käyrän kunkin tietoryhmän parametrien yhteensopivuutta. Luottamusväli säädettiin 95 prosenttiin.

5. Johtopäätökset

Tässä tutkimuksessa käytettiin seeprakalan alkioita malli-organismina, jolla testattiin kuuden elintarvikkeissa yleisesti esiintyvän fenoliyhdisteen ja kolmen karotenoidin suojakykyä. Kaikki yhdisteet, paitsi -karoteeni, osoittivat suojaavia vaikutuksia oksidatiivisen stressin aiheuttamaa kuolleisuutta vastaan. Lisäksi apigeniini, rutiini ja kurkumiini osoittivat myös suojaavia vaikutuksia tBOOH:n aiheuttamaa dysmorfogeneesiä vastaan. Ehdotamme, että tässä esitettyä seeprakalan alkiotestiä voitaisiin soveltaa arvioimaan uusien bioaktiivisten elintarvikekomponenttien, joilla on potentiaalinen antioksidanttikapasiteetti, suojaavia vaikutuksia in vivo.

Cristina Arteaga 1,20, Nuria Boix 13, Elisabet Teixido 13⑤, Fernanda Marizande 2, Santiago Cadena 4 ja Alberto Bustillos 5,*

1 Toksikologian yksikkö, Farmakologian, Toksikologian ja terapeuttisen kemian osasto, Apteekkikoulu,

Barcelonan yliopisto, Avda Joan XXIIs/n, 08028Barcelona, ​​Espanja;

2 Terveystieteiden, ravitsemus- ja dietetiikan tiedekunta, Ambaton teknillinen yliopisto, Ambato 180207, Ecuador;

3 INSA-UB Nutrition and FoodSafety Research Institute, Food and Nutrition Torriberan kampus,

Barcelonan yliopisto, Prat de la Riba 171, 08921 Santa Coloma de Gramenet, Espanja

4 Ammattitieteiden tiedekunta, International SEK University, Quito 170134, Ecuador;

5 Terveystieteellinen tiedekunta, lääketiede, Ambaton teknillinen yliopisto, Ambato 180207

Viitteet

1. Tan, BL; Norhaizan, ME; Liew, W.-P.-P. Ravinteet ja oksidatiivinen stressi: ystävä vai vihollinen? Oksid. Med. Cell. Longev. 2018, 2018, 9719584. [CrossRef] [PubMed]
2. Sies, H. Biochemistry of Oxidative Stress. Angew. Chemie Int. Ed. Eng. 1986, 25, 1058–1071. [CrossRef]
3. Dröge, W. Vapaat radikaalit solutoiminnan fysiologisessa säätelyssä. Physiol. Rev. 2002, 82, 47–95. [CrossRef] [PubMed]
4. Rendra, E.; Riabov, V.; Mossel, DM; Sevastyanova, T.; Harmsen, MC; Kzhyshkowska, J. Reaktiiviset happilajit (ROS) makrofagien aktivoinnissa ja toiminnassa diabeteksessa. Immunobiology 2019, 224, 242–253. [CrossRef]
5. Lin, MT; Beal, MF Mitokondrioiden toimintahäiriö ja oksidatiivinen stressi neurodegeneratiivisissa sairauksissa. Nature 2006, 443, 787–795. [CrossRef] [PubMed]
6. Therond, P. Oksidatiivinen stressi ja vauriot biomolekyyleille (lipidit, proteiinit, DNA). Ann. Pharm. Fr. 2006, 64, 383–389. [CrossRef]
7. Ermak, G.; Davies, KJA Kalsium ja oksidatiivinen stressi: solujen signaloinnista solukuolemaan. Mol. Immunol. 2002, 38, 713–721. [CrossRef]
8. Wadhwa, R.; Gupta, R.; Maurya, PK Oksidatiivinen stressi ja nopeutunut ikääntyminen neurodegeneratiivisessa ja neuropsykiatrisessa häiriössä. Curr. Pharm. Des. 2018, 24, 4711–4725. [CrossRef]
9. Maritim, AC; Sanders, RA; Watkins, JB Diabetes, oksidatiivinen stressi ja antioksidantit: Katsaus. J. Biochem. Mol. Toxicol. 2003, 17, 24–38. [CrossRef]
10. Sinha, N.; Dabla, PK Oksidatiivinen stressi ja antioksidantit verenpainetaudissa - nykyinen katsaus. Curr. Hypertensistä. Rev. 2015, 11, 132–142. [CrossRef]
11. Klaunig, JE Oksidatiivinen stressi ja syöpä. Curr. Pharm. Des. 2018, 24, 4771–4778. [CrossRef] [PubMed]
12. Sies, H. Oksidatiivinen stressi: Käsite redoksibiologiassa ja lääketieteessä. Redox Biol. 2015, 4, 180–183. [CrossRef]
13. Pietta, P.-G. Flavonoidit antioksidantteina. J. Nat. Tuot. 2000, 63, 1035–1042. [CrossRef]
14. Halliwell, B.; Gutteridge, JMC Free Radicals in Biology and Medicine, 5. painos; Oxford University Press: Oxford, Iso-Britannia, 2015; ISBN 9780198717478.
15. Hollman, PC; Katan, MB Ruokavalion flavonoidit: saanti, terveysvaikutukset ja hyötyosuus. Food Chem. Toxicol. Int. J. Publ. Br. Ind. Biol. Res. Assoc. 1999, 37, 937-942. [CrossRef]
16. Hertog, MG; Hollman, PC; Katan, MB; Kromhout, D. Mahdollisesti karsinogeenisten flavonoidien saanti ja niiden määräävät tekijät aikuisilla Alankomaissa. Nutr. Cancer 1993, 20, 21–29. [CrossRef]
17. Martínez, S.; González, J.; Culebras, J.; Tuñón, M. Flavonoides: Propiedades y acciones antioxidantes. Nutr. Hosp. 2002, 17, 271–278.
18. Arteaga, C.; Bustillos, A.; Gómez, J. Migración de neutrófifilos en larvas de pez cebra expuestos a extractos de sofrito de tomate. Kaari. Latinoam. Nutr. 2021, 70, 216–224. [CrossRef]
19. Young, AJ; Lowe, GL karotenoidit – antioksidanttisia ominaisuuksia. Antioksidantit 2018, 7, 28. [CrossRef] [PubMed]
20. Xavier, AAO; Pérez-Gálvez, A. Karotenoidit antioksidanttien lähteenä ruokavaliossa. Alisolu. Biochem. 2016, 79, 359–375. [CrossRef] [PubMed]
21. Stahl, W.; Sies, H. Karotenoidien antioksidanttiaktiivisuus. Mol. Asp. Med. 2003, 24, 345–351. [CrossRef]
22. Boix, N.; Teixido, E.; Pique, E.; Llobet, JM; Gomez-Catalan, J. Antioksidanttiyhdisteiden modulaatio- ja suojavaikutukset hapettimien aiheuttamaa kehitysmyrkyllisyyttä vastaan ​​seeprakalassa. Antioksidantit 2020, 9, 721. [CrossRef]
23. Fenton, HJH Viinihapon hapettuminen raudan läsnä ollessa. J. Chem. Soc. Trans. 1894, 65, 899–910. [CrossRef]
24. Phaniendra, A.; Jestadi, DB; Periyasamy, L. Vapaat radikaalit: ominaisuudet, lähteet, kohteet ja niiden vaikutus erilaisiin sairauksiin. Intialainen J. Clin. Biochem. 2015, 30, 11–26. [CrossRef] [PubMed]
25. Fernández-Pachón, MS; Villaño, D.; Troncoso, AM; García-Parrilla, MC Revisión de los métodos de evaluación de la actividad antioxidante in vitro del vino y valoración de sus efectos in vivo. Kaari. Latinoam. Nutr. 2006, 56, 110–122. [PubMed] 26. Cavia-Saiz, M.; Busto, MD; Pilar-Izquierdo, MC; Ortega, N.; Perez-Mateos, M.; Muñiz, P. Flavonoidin naringeniinin ja sen glykosidin naringinin antioksidanttiset ominaisuudet, radikaalien poistoaktiivisuus ja biomolekyylien suojakyky: vertaileva tutkimus. J. Sei. Food Agric. 2010, 90, 1238–1244. [CrossRef] [PubMed]
27. Patel, K.; Singh, GK; Patel, DK Katsaus naringeniinin farmakologisista ja analyyttisista näkökohdista. Leuka. J. Integr. Med. 2014, 24, 551–560. [CrossRef]
28. Rashmi, R.; Magesh, SB; Ramkumar, KM; Suryanarayanan, S.; Subbarao, MV Naringeniinin antioksidanttipotentiaali auttaa suojaamaan maksakudosta streptotsotosiinin aiheuttamilta vaurioilta. Rep. Biochem. Mol. Biol. 2017, 7, 76–84.
29. Shukla, R.; Pandey, V.; Vadnere, GP; Lodhi, S. Luku 18 – Flavonoidien rooli tulehdussairauksien hoidossa. Bioaktiivisessa ruoassa niveltulehduksen ja siihen liittyvien tulehdussairauksien ruokavaliointerventioissa; Watson, RR, Preedy, VR, toim.; Academic Press: Lontoo, Iso-Britannia, 2019; s. 293–322; ISBN 978-0-12-813820-5.
30. Chen, YH; Yang, ZS; Wen, CC; Chang, YS; Wang, BC; Hsiao, CA; Shih, TL Flavonoidien rakenne-aktiivisuussuhteen arviointi seeprakalan toukkien antioksidantteina ja myrkyllisinä aineina. Food Chem. 2012, 134, 717–724. [CrossRef]
31. Cushman, M.; Zhu, H.; Geahlen, RL; Kraker, AJ Synthesis and Biochemical Evaluation of a Series of Aminoflavones as Potential Inhibitors of Protein-Tyrosine Kinases p56lck, EGFr ja p60v-src. J. Med. Chem. 1994, 37, 3353-3362. [CrossRef]
32. Cioffi, G.; Pesca, MS; De Caprariis, P.; Braca, A.; Severino, L.; De Tommasi, N. Fenoliyhdisteet oliiviöljyssä ja oliivin puristemassassa Cilentosta (Campania, Italia) ja niiden antioksidanttiaktiivisuus. Food Chem. 2010, 121, 105–111. [CrossRef]

33. Bulotta, S.; Corradino, R.; Celano, M.; D'Agostino, M.; Maiuolo, J.; Oliverio, M.; Procopio, A.; Iannone, M.; Rotiroti, D.; Russo, D. Antiproliferatiiviset ja antioksidanttiset vaikutukset oleuropeiinin ja sen puolisynteettisten hyperasetyloitujen johdannaisten rintasyöpäsoluihin. Food Chem. 2011, 127, 1609–1614. [CrossRef]
34. Han, J.; Talorete, TPN; Yamada, P.; Isoda, H. Oleuropeiinin ja hydroksityrosolin antiproliferatiiviset ja apoptoottiset vaikutukset ihmisen rintasyövän MCF-7-soluihin. Cytotechnology 2009, 59, 45–53. [CrossRef] [PubMed]
35. Liang, N.; Kitts, DD Klorogeenihappojen rooli oksidatiivisten ja tulehduksellisten stressitilojen hallinnassa. Nutrients 2015, 8, 16. [CrossRef] [PubMed]
36. Park, S.-Y.; Freedman, ND; Haiman, CA; Le Marchand, L.; Wilkens, LR; Setiawan, VW:n kahvinkulutuksen liitto ei-valkoisten väestön kokonais- ja syykohtaiseen kuolleisuuteen. Ann. Harjoittelija. Med. 2017, 167, 228–235. [CrossRef] [PubMed]
37. Tajik, N.; Tadžik, M.; Mack, I.; Enck, P. Klorogeenihapon, kahvin tärkeimpien fenolikomponenttien, mahdolliset vaikutukset terveyteen: kattava katsaus kirjallisuuteen. euroa J. Nutr. 2017, 56, 2215–2244. [CrossRef] [PubMed]
38. Poole, R.; Kennedy, EYVL; Roderick, P.; Fallowfifield, JA; Hayes, PC; Parkes, J. Kahvin kulutus ja terveys: kattokatsaus useiden terveysvaikutusten meta-analyyseihin. BMJ 2017, 359, j5024. [CrossRef] [PubMed]
39. Tanvir, EM; Hossen, MS; Hossain, MF; Afroz, R.; Gan, SH; Khalil, MI; Karim, N. Bangladeshista peräisin olevien suosittujen kurkuma- (Curcuma longa) -lajikkeiden antioksidanttiset ominaisuudet. J. Food Qual. 2017, 2017, 8471785. [CrossRef]
40. Fiedor, J.; Burda, K. Karotenoidien mahdollinen rooli antioksidantteina ihmisten terveydelle ja sairauksille. Nutrients 2014, 6, 466–488. [CrossRef]
41. Eggersdorfer, M.; Wyss, A. Karotenoidit ihmisten ravitsemuksessa ja terveydessä. Kaari. Biochem. Biophys. 2018, 652, 18–26. [CrossRef]
42. Padmanabhan, P.; Cheema, A.; Paliyath, G. Solanaceous Fruits, mukaan lukien tomaatti, munakoiso ja paprikat, 1. painos; Elsevier Ltd: Lontoo, Iso-Britannia, 2015.
43. Kataja-Tuomola, MK; Kontto, JP; Männistö, S.; Albanes, D.; Virtamo, JR Alfa-tokoferolin ja beetakaroteenin lisäyksen vaikutus makrovaskulaarisiin komplikaatioihin ja diabeteksen kokonaiskuolleisuuteen: ATBC-tutkimuksen tulokset. Ann. Med. 2010, 42, 178–186. [CrossRef]
44. Ambati, RR; Moi, PS; Ravi, S.; Aswathanarayana, RG Astaksantiini: Lähteet, uuttaminen, stabiilisuus, biologiset toiminnot ja sen kaupalliset sovellukset - Katsaus. Mar. Drugs 2014, 12, 128–152. [CrossRef] [PubMed]
45. Dennery, PA Oksidatiivisen stressin vaikutukset alkionkehitykseen. Syntymävauriot Res. C Embryo Today 2007, 81, 155–162. [CrossRef] [PubMed]
46. ​​Selderslaghs, sisävesiliikenne; Blust, R.; Witters, HE Seeprakalamäärityksen toteutettavuustutkimus vaihtoehtoisena menetelmänä kehitysmyrkyllisyyden ja alkiotoksisuuden seulomiseksi käyttämällä 27 yhdisteen harjoitussarjaa. Reprod. Toxicol. 2012, 33, 142–154. [CrossRef]
47. Kimmel, CB; Ballard, WW; Kimmel, SR; Ullmann, B.; Schilling, TF Seeprakalan alkionkehityksen vaiheet. Dev. Dyn. 1995, 203, 253–310. [CrossRef] [PubMed]
48. Teixidó, E.; Piqué, E.; Gómez-Catalán, J.; Llobet, JM Kehitysviiveen arviointi seeprakalan alkion teratogeenisuusmäärityksessä. Toxicol. In Vitro 2013, 27, 469–478. [CrossRef] [PubMed]