Onkogeenisen kinaasin PAK1:n seerumista/PDGF-riippuvainen melanogeeninen rooli melanoomasoluissa, joka on todistettu erittäin herkällä kinaasimäärityksellä

Ottaa yhteyttä:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Yhteenveto:Olemme aiemmin osoittaneet, että onkogeeninen kinaasi PAK4, jota sekä melanoomat että normaalit melanosyytit ekspressoivat erittäin korkealla tasolla, on välttämätön heidänmelanogeneesi. Tässä tutkimuksessa tutkimme erittäin herkkää "Macaroni-Western" (IP-ATP-Glo) kinaasimääritystä käyttämällä toisen onkogeenisen kinaasin PAK1 melanogeenista potentiaalia, jota melanoomasolut (B16F10) ilmentävät vain hyvin pienellä tasolla. Kun melanoomasolut on transfektoitu PAK1-shRNA:lla PAK1-geenin hiljentämiseksi, melaniinipitoisuustyrosinaasiPAK1:n aktiivisuutta ja kinaasiaktiivisuutta verrattiin villityypin ja transfektanttien välillä. Havaitsimme, että (i) melanogeeniset hormonit, kuten IBMX (3-isobutyyli-1-metyyliksantiini) ja -MSH (melanosyyttejä stimuloiva hormoni), aktivoivat merkittävästi PAK1:tä, (ii) vaimentavat endogeenisen PAK1-geenin melanoomasolut PAK{8}}spesifisen shRNA:n kautta vähentää sekä melaniinipitoisuutta ettätyrosinaasiaktiivisuus sekä seerumin että melanogeenisten hormonien läsnä ollessa perustasolle asti, (iii) melanoomasoluissa ulkoisesti lisätty villityypin PAK1 nostaa -MSH-indusoituvaa melaniinitasoa useita kertoja vaikuttamatta perustasoon, ja (iv) - MSH/IBMX-indusoitua melanogeneesiä tuskin tapahtuu seerumin tai PAK1:n puuttuessa, mikä osoittaa selvästi, että PAK1 on välttämätön pääasiassa seerumi- ja -MSH/IBMX-riippuvaisellemelanogeneesi, mutta ei basaalista, melanoomasoluissa. Tämän tutkimuksen tulos saattaa tarjota ensimmäisen tieteellisen perustan selittää, miksi monet kasviperäiset PAK{0}}salpaajat, kuten CAPE (kofeiinihapon fenetyyliesteri), kurkumiini ja šikoniini kosmetiikassa, ovat hyödyllisiäihon valkaisuun.

Avainsanat:PAK1,melanogeneesi, melanoomat,tyrosinaasi, MITF,ihon valkaisuun, seerumi

valkaisevia ihonhoitotuotteita

Johdanto

Karvojen, silmän iiristen ja ihon väriä säätelee pigmenttiperhe, jota kutsutaan melaniiniksi. Solunsisäinen melaniinin lähde on tyrosiini, joka muuttuu melaniiniksi sarjan entsymaattisen hapettumisen (hydroksylaation) kautta, johon liittyytyrosinaasi, TRP (tyrosinaasiin liittyvä proteiini) 1 ja TRP2. Näitä melanogeenisiä entsyymejä koodaavien geenien ilmentyminen vaatii vähintään kahta onkogeenista/melanogeenistä transkriptiotekijää (MTF): beeta-kateniini ja MITF (mikroftalmiaan liittyvä transkriptiotekijä). Suurin osa kasviperäisistä yhdisteistäihon valkaisuunkosmetiikka joko inhiboi suoraan näitä melanogeenisiä entsyymejä tai säätelee MTF:itä. Tyrosiinianalogit, kuten kojiinihappo, kuuluvat ensimmäiseen luokkaan (tyrosinaasiestäjät), kun taas suurin osa jäämistä, kuten CAPE (kahvihapon fenetyyliesteri), kurkumiini ja shikoniini kuuluvat toiseen luokkaan (MTF-säätelijät) (1,2). Mielenkiintoista on, että monien näistä MTF-säätelijöistä, mukaan lukien CAPE, kurkumiini, shikoniini ja cucurbitasiini, tiedetään estävän onkogeenista/ikääntymistä aiheuttavaa kinaasi PAK1 (RAC/CDC42-aktivoitu kinaasi 1) (3-5). Siten on todennäköisintä, että PAK1 osallistuu näiden melanogeenisten/onkogeenisten transkriptiotekijöiden aktivaatioon karvasoluissa, silmän iiriksissä tai ihon melanosyyteissä. Itse asiassa ainakin beeta-kateniini on PAK1:n suorien substraattien joukossa (6). PAK1 fosforyloi beeta-kateniinia Ser 675:ssä aktivoitumista varten, mikä johtaa pahanlaatuiseen transformaatioon. Lisäksi beeta-kateniini on välttämätön MITF:n aktivoimiseksi, mikä johtaamelanogeneesitai/ja melanosyyttien onkogeneesi (7).

Mielenkiintoista on kuitenkin, että hiljattain paljastettiin, että PAK1-geenin poistaminen pigmentoituneista hiiristä sinänsä ei tuota albiinohiiriä (Hong He et al., julkaisematon havainto), mikä osoittaa selvästi, että ainakin perusmelanogeneesi sekä karvasoluissa että silmässä Irises on riippumaton PAK1:stä, vaikka PAK1:n vaikutus ihoonmelanogeneesion vielä selvitettävää.

Olemme aiemmin osoittaneet, että onkogeeninen kinaasi PAK4 (CDC42-riippuvainen kinaasi 4) ilmentyy voimakkaasti sekä melanoomassa että normaaleissa melanosyyttisolulinjoissa ja on vastuussa niiden melanogeneesistä aktivoiden CREB/beeta-kateniini-MIFT-tyrosinaasiPAK2 (RAC/CDC42-aktivoitu kinaasi 2), toinen PAK-perheen erittäin ilmentynyt jäsen, ei näytä roolia niiden melanogeneesissä (8).

Tässä tutkimuksessa tarjoamme ensimmäiset biokemialliset todisteet toisen onkogeenisen kinaasin, PAK1:n, erityisestä roolista ihossa.melanogeneesihuolimatta siitä, että sen ilmentymistaso on pieni: shRNA-indusoitu PAK1-geenin hiljentäminen melanosyyteissä (B16F10), joka oli peräisin hiiren melanoomasta, vähensi merkittävästi -MSH/IBMX-indusoituvaamelanogeneesiperustasolle, kun taas PAK1-geenin yli-ilmentyminen tehosti -MSH-indusoituvaa melanogeneesiä vaikuttamatta basaaliin. Lisäksi havaitsimme, että -MSH/IBMX-indusoituva melanogeneesi vaatii seerumitekijän, joka on todennäköisimmin PDGF (verihiutaleperäinen kasvutekijä). Seerumittomassa elatusaineessa vain perusmelanogeneesitapahtuu.

cistanchevähentää tyrosinaasin aktiivisuutta

2. Materiaalit ja metodit

2.1. Materiaalit

B16F10-melanoomasolut ostettiin American Type Culture Collectionilta (Rockville, MD, USA). PAK1-SureSilencing-plasmidit, houkutteleva transfektio, endofree®-plasmidi maxi -pakkaus ostettiin Qiagenilta (Valencia, CA 91355, USA). Primääriset PAK1--vasta-aineet, biotinyloidut sekundaariset vasta-aineet, signalfireTM ECL-reagenssi saatiin Cell Signaling Technologylta (Danvers, MA, USA). Kinase Glo -reagenssi ja ATP (ATP_Glo kinase kit) ostettiin Promegalta (Madison, Wisconsin, USA). Lipofektamiini ja JM109 kompetentit solut ostettiin yhtiöltä Invitrogen and Life Technology. AG1295 ja AG1478 ostettiin Calbiochemilta (San Diego, CA, USA). Kaikki muut kemikaalit, mukaan lukien ihmisen PDGF-bb, ostettiin Sigma-Aldrichilta (St. Louis, MO, USA).

2.2. PAK1-geenin vaimentaminen hiiren melanosyyteissä (B16F10) stabiililla transfektiolla hiiren PAK{5}}spesifisellä shRNA:lla

2.2.1. Soluviljely

B16F10-melanoomasoluja viljeltiin DMEM:ssä, jota oli täydennetty 10 prosentilla lämpöaktivoidulla FBS:llä ja 1 prosentilla penisilliini/streptomysiinillä (10, 000 U/ml ja 100 µg/ml) 37 asteessa kosteassa ilmakehässä, joka sisälsi 5 prosenttia CO2:ta.

2.2.2. Stabiili transfektio hiiren PAK{3}}spesifisellä shRNA:lla

B16F10-solulinjan ShRNA-transfektio suoritettiin periaatteessa samalla menetelmällä, joka on kuvattu aiemmin (9), mutta hiiren PAK{3}}spesifisillä shRNA:illa (# KM04553, Qiagen). Seuraavia neljää erillistä shRNA-kloonia käytettiin transfektioon: klooni 1 (CCAGAGAAGTTGTCAGCTATT), klooni 2 (CATCAAGAGTGACAATATTCT), klooni 3 (GTACACACGGTTCGAGAAGAT) ja klooni 4 (GTACCACCAGTGTCAGAAGAT) sekä shCONTROL kuin negatiivinen kontrolli (ShWRNAT) . Tässä tutkimuksessa kloonit 1 ja 2 osoittautuivat kuitenkin tehokkaammiksi kuin kloonit 3 ja 4 hiiren PAK1-geenin hiljentämisessä tässä melanosyyttilinjassa (tietoja ei näytetä). Stabiilit transfektantit valittiin G418:n (1 mg/ml) läsnä ollessa, joka tappaa yli 99 prosenttia ei-transfektoiduista soluista.

2.2.3. PAK1-proteiinitason Western-blot-analyysi ja PAK1:n kinaasiaktiivisuuden in vitro -määritys transfektanteissa

2.2.3.1. Western blot -analyysi

Jotta voitaisiin kvantifioida PAK1:n äärimmäisen alhainen taso sekä kontrollisolulinjassa (WT) että PAK1-hiljennetyissä transfektanteissa (G418-resistenteissä) minimoimalla "epäspesifiset melutasot" suoritimme länsimaisen tutkimuksen. blot-analyysi käyttäen kanin polyklonaalista vasta-ainetta PAK1:tä vastaan ​​(#2062, Cell Signaling Technology) ensisijaisena vasta-aineena. Lyhyesti sanottuna jokainen klooni ympättiin pitoisuudella 2 x 105 solua/kuoppa 6-kuoppaiselle levylle, esiviljeltiin 48 tuntia ja solulysaatteja keitettiin 25 ul:ssa SDS-PAGE-puskuria 5 minuuttia. Kahdeksan ui (sisältää 15 ug kokonaisproteiinia) kutakin supernatanttia rakoa kohti käytettiin SDS-PAGE:hen. Nitroselluloosa blotattiin anti-PAK1 IgG:llä (1:1, 000 laimennus primaarisena vasta-aineena) ja sekundaarisina vasta-aineina HRP-kytketty anti-kanin IgG ja anti-biotiini IgG (#7074, # 7075, Cell Signaling) käytettiin havaitsemaan sekä PAK1- että -aktiinijuovia, jotka lopulta visualisoitiin Amershamin ECL-järjestelmällä. Western blot -määritykset edustivat kolmea riippumatonta koetta.

2.2.3.2. "Macaroni-Western" (IP-ATP_Glo) kinaasimääritys PAK1:lle melanoomasoluissa

PAK1:n kinaasiaktiivisuus WT-melanosyyteissä ja shRNA-transfektanteissa (SH:t) mitattiin merkittävällä modifikaatiolla (5) vuosikymmeniä vanhassa menetelmässä (josta loimme "Macaroni-Western"), jonka italialainen ryhmä oli kehittänyt (1{{39). }}). Lyhyesti sanottuna B16F10-melanoomasolulinjoja (WT tai SH:t, 2 × 105 solua/ml) esiviljeltiin 6-kuoppalevyllä 24 tuntia. Sitten soluja käsiteltiin 100 nM -MSH:lla tai 100 uM IBMX:llä 48 tunnin ajan. Solut hajotettiin lyysipuskurilla, joka sisälsi 50 mM Tris HCl pH 7,5 ja 150 mM NaCl ja 1 % Triton-X. PAK1:n immunosaostusta (IP) varten puhdistettuja solulysaatteja inkuboitiin anti-PAK1 IgG:n (1:50 laimennus) ja proteiini A-agaroosihelmien kanssa 1-2 tuntia kylmähuoneessa jatkuvasti ravistellen pyörivällä sekoittimella. (Nissin, Suginami-ku, Tokio, Japani). Saatua IP:tä (PAK1) kustakin lysaatista inkuboitiin ATP Glo -kinaasimäärityssarjan (Promega) kanssa ATP:n ja MBP:n (myeliinin perusproteiinin) läsnä ollessa 1 tunti 37 asteessa, ja jäljellä oleva ATP-taso mitattiin ATP- riippuvainen lusiferiini-lusiferaasireaktio, joka lopulta tuottaa luminesenssin (10). Lopullinen suspensio sentrifugoitiin ja supernatantti siirrettiin 96-kuoppalevylle lukemista varten. Luminesenssi tallennettiin MTP-880Lab-mikrolevylukijalla (Corona, Hitachinaka-ku, Ibaraki, Japani) integraatioajalla 0,5 s per kuoppa.

2.3. Melaniinipitoisuuden ja tyrosinaasiaktiivisuuden mittaaminen transfektanteissa

2.3.1. Melaniinipitoisuuden mittaus

Melaniinipitoisuus määritettiin aiemmin kuvatulla tavalla (11). Lyhyesti sanottuna B16F10-solut (villin tyypin tai PAK{4}}spesifiset shRNA-transfektantit) maljattiin tiheydellä 2 × 104 solua/kuoppa 24-kuoppalevylle. 24 tunnin viljelyn jälkeen lisättiin 100 uM isobutyyli-1-metyyliksantiinia (IBMX) tai 100 nM -MSH:ta ja inkuboitiin vielä 72 tuntia 37 asteessa. Solut pestiin kahdesti fosfaattipuskurilla, sitten lysoitiin 500 ul:lla liuosta, joka sisälsi 1 M NaOH:ta ja 10 prosenttia DMSO:ta, ja inkuboitiin 80 asteessa 1 tunti melaniinin liuottamiseksi, ja melaniinipitoisuus mitattiin 490 nm:ssä. Villityypin ja transfektoitujen solujen melaniinipitoisuuden vertailemiseksi villityypin melanosyyttien tuottaman melaniinin kokonaismäärää pidettiin kontrollina (100 prosenttia), ja transfektanttien tuottamat melaniinin määrät laskettiin vastaavasti.

2.3.2. Solunsisäisen tyrosinaasiaktiivisuuden määritys

Tyrosinaasiaktiivisuus määritettiin kuten aiemmin on kuvattu (12), pienellä modifikaatiolla. B16F10-solut (villityyppiset tai transfektantit) maljattiin tiheydellä 2 × 104 solua/kuoppa, ja 24 tunnin viljelyn jälkeen lisättiin 100 uM IBMX tai 100 nM -MSH ja inkuboitiin vielä 72 tuntia 37 asteessa. . Sitten solut pestiin jääkylmällä fosfaattipuskurilla ja hajotettiin fosfaattipuskurilla (pH 6,8), joka sisälsi 1 % Triton-X:ää (500 ui/kuoppa). Levyt pakastettiin -80 asteessa 30 minuuttia. Sulatuksen jälkeen kuhunkin kuoppaan lisättiin 100 ui 1-prosenttista L-DOPA:ta. 37 asteessa 2 tunnin inkuboinnin jälkeen absorbanssi mitattiin aallonpituudella 490 nm.

2.4. Melaniinipitoisuuden mittaaminen villityypin ja PAK1-yliekspressoivissa melanosyyteissä -MSH-hoidon jälkeen

Käyttämällä Myc-vektoria (2 ug) melanosyytit (B16F10) transfektoitiin väliaikaisesti joko villityypin (WT) PAK1:llä tai niin kutsutulla "konstitutiivisesti aktivoidulla" (CA) PAK1:llä, joka kantaa T423E-mutaatiota. 3 päivän viljelyn jälkeen kukin transfektoitu klooni kerättiin lisäkoetta varten. PAK1-yli-ilmentymisen vaikutus melaniinipitoisuuteen mitattiin samoilla menetelmillä, jotka on kuvattu aiemmin (8). Lyhyesti sanottuna melanosyyttejä, joko villityypin tai PAK{12}}yliekspressiota, jotka ilmentävät joko villityypin PAK1:tä tai sen CA-mutanttia, inkuboitiin 100 nM -MSH:n kanssa 3 päivää. Solut hajotettiin liuoksella, joka sisälsi 1 M NaOH:ta ja 20 % DMSO:ta melaniinin liuottamiseksi, ja sen pitoisuus määritettiin 405 nm:ssä.

2.5. Melanogeneesi seerumittomassa väliaineessa

B16F10-solut (villin tyypin tai PAK{3}}spesifiset shRNA-transfektantit) maljattiin tiheydellä 2 x 104 solua/kuoppa 24-kuoppalevylle 10 prosentin FBS:n läsnä ollessa. 24 tunnin inkubaation jälkeen elatusaine korvataan seerumittomalla alustalla ja viljellään vielä 72 tuntia 100 uM IBMX:n tai 100 nM -MSH:n kanssa tai ilman melaniinipitoisuuden mittaamiseksi.

2.6. PDGF/EGF-reseptorin estäjien vaikutus seerumiriippuvaiseen melanogeneesiin

2 × 104 B16F10-solua kylvettiin kuhunkin kuoppaan 24 tunnin ajan 10 % FBS:ää sisältävässä elatusaineessa ja viljeltiin sitten vielä 72 tuntia tuoreessa alustassa, joka sisälsi 100 nM -MSH:ta ja seuraavia: (1) ei seerumia, (2) 10 % FBS yksinään, (3) 10 % FBS plus 2 uM AG1295 (PDGF-reseptorin estäjä) ja (4) 10 % FBS plus 400 nM AG1478 (EGF-reseptorin estäjä) melaniinipitoisuuden mittaamiseksi.

2.7. Tilastollinen analyysi

Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina standardivirheineen. Tilastolliset vertailut suoritettiin yksisuuntaisella ANOVA:lla, jota seurasi Duncanin monialuetesti. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä SAS:ää (julkaisu 9.2; SAS Institute, Cary, NC, USA), ja p:tä pienempi tai yhtä suuri kuin 0,05 pidettiin merkitsevänä.

maca ginseng cistanche

3. Tulokset

3.1. PAK1:n aktivointi melanoomasolulinjassa (B16F10) melanogeenisten hormonien toimesta

Kaksi melanogeenista hormonia, -MSH (melanosyyttejä stimuloiva hormoni) ja IBMX (3-isobutyyli-1-metyyliksantiini), käytetään usein stimuloimaan.melanogeneesimelanosyyteissä, kuten melanoomasolulinjassa B16F10. Näin ollen tutkimme ensin, voivatko nämä hormonit aktivoida PAK1:n tässä solulinjassa, vaikka PAK1:n proteiinitaso siellä on erittäin alhainen verrattuna PAK2:een ja PAK4:ään (8). Seurataksemme muutoksia PAK1:n kinaasiaktiivisuudessa soluissa kehitimme äskettäin erittäin herkän/spesifisen kinaasimäärityksen nimeltä "Macaroni-Western" (IP ATP-Glo) kinaasimääritysprotokollan yhdistämällä PAK1:n immunosaostuksen (IP) solusta. lysaatit ja Promegan ATP{12}}Glo-kinaasipakkaus (5). Tätä kinaasimääritystä käyttämällä havaitsimme, että sekä -MSH (100 nM) että IBMX (100 uM) aktivoivat PAK1:n melanoomasoluissa, jolloin -MSH on tehokkaampi kuin IBMX (katso kuvio 1). Meidän tulee kuitenkin muistuttaa lukijoita siitä, että tässä esitetty PAK1:n kertaiseksi aktivoituminen on vain näennäistä, koska tämän aikaa vievän koeputken IP- ja kinaasimäärityksen aikana (yhteensä yli 3 tuntia) ilman näitä melanogeenisia hormoneja PAK1 normalisoituisi vähitellen. aika. Toisin sanoen emme voi jäädyttää PAK1:n tarkkaa kinaasitilaa näillä stimulaattoreilla käsitellyn soluviljelyn lopussa, ja laskosaktivaatio on vain aliarvioitu heijastus PAK1-aktivaatiosta, joka tapahtui näiden simulaattoreiden soluviljelyn aikana.

3.2. PAK1-geenin hiljentäminen shRNA:illa hiiren melanoomasolulinjassa

Jotta voidaan tutkia lisää biokemiallisesti, vaikuttaako PAK1melanogeneesiihosoluissa (melanosyyteissä) transfektoimme stabiilisti melanoomasolulinjan B16F10 hiiren PAK1-spesifisellä shRNA:lla hiljentämään PAK1-geenin selektiivisesti.

3.2.1. PAK1-geenin hiljentäminen melanosyyteissä

Alustava Western blot -analyysimme viittasi siihen, että kahdessa erillisessä PAK1-hiljennetyssä kloonissa (SH1 ja 2) PAK1-proteiinitasot ovat merkittävästi (noin 75 prosenttia) alentuneet, mutta tämän melanoomasolulinjan kasvunopeus sinänsä ei ollut vaikuttaa merkittävästi PAK1-vaimennus (tietoja ei näy). PAK1-proteiinitasojen tarkka kvantifiointi skannaamalla tämä Western blot oli kuitenkin melko vaikeaa, pääasiassa korkean taustamelun vuoksi PAK1-kaistan ympärillä sen äärimmäisen alhaisten ilmentymistasojen visualisoinnissa. Sen sijaan "Macaroni-Western" -kinaasimääritystä (5, 10) käyttämällä varmistimme, että PAK1:n kinaasiaktiivisuus sekä SH1- että 2-klooneissa on vain noin 25-30 prosenttia kontrollisolujen (WT) tasosta ( katso kuva 2A).

3.2.2. Melanogeneesin vähentäminen hiljentämällä PAK1-geeni

Seuraava kriittinen kysymyksemme oli, vaikuttaako tällainen PAK1:n kinaasiaktiivisuuden väheneminenmelanogeneesi. Siten näiden kloonien (SH1 ja 2) melaniinipitoisuutta verrattiin villityypin (WT) melanoomasoluihin sen jälkeen, kun kaikkia näitä soluja oli käsitelty -MSH:lla, melanogeenisellä indusoijalla, 72 tunnin ajan. Kuten kuvasta 2B näkyy, melaniinipitoisuus näissä PAK1--puutteellisissa melanosyyteissä (SH1 ja 2) vähenee noin 50 prosenttia (51-55 prosenttia), mikä saavuttaa perustason WT:ssä ilman melanogeenista hormonia. Sen selvittämiseksi, liittyykö tämä melaniinipitoisuuden väheneminen tyrosinaasiaktiivisuuden suppressioon, mittasimmetyrosinaasiaktiivisuus PAK{0}}puutteellisissa soluissa (kloonit SH1 ja 2) verrattuna WT:hen. Kuten kuvasta 2C näkyy, tyrosinaasiaktiivisuus PAK1-puutteellisissa soluissa on vain noin 45 prosenttia (33-58 prosenttia) WT:n aktiivisuudesta, saavuttaen jälleen perustason (ei-stimuloidun), mikä osoittaa selvästi. että PAK1 on välttämätön -MSH-indusoidulle melaniinin tuotannolletyrosinaasimelanosyyteissä. Lisäksi hyvin samalla tavalla IBMX:n indusoima melanogeneesi väheni myös vaimentamalla PAK1-geeni tässä melanoomasolulinjassa (tietoja ei ole esitetty). Kun kuitenkin otetaan huomioon seuraavat kaksi tekijää, on todennäköisimmin vain puoletmelanogeneesimelanosyyteissä on PAK1-riippuvainen, ja loput (enimmäkseen "perus") on PAK4-riippuvaisia: (i) PAK4 on myös välttämätön -MSH-indusoidulle melanogeneesille melanosyyteissä (8), ja (ii) noin 25 prosenttia PAK1-geenistä näyttää edelleen ilmentyvän näissä transfektanteissa (SH1 ja 2). Vielä on kuitenkin selvitettävä voimakkaasti, onko PAK1 vastuussa hormonin indusoinnista vai perusmelanogeneesi.

Lisäksi olemme vahvistaneet, että melanogeeniset indusoijat, kuten IBMX ja -MSH, aktivoivat merkittävästi endogeenisen PAK1:n tässä melanoomasolulinjassa (katso kuva 1), mutta ilman merkittävää muutosta sen autofosforylaatiossa Thr 423:ssa anti-pPAK1:n perusteella arvioituna. vasta-aine (tietoja ei esitetty).

3.3. Yli-ilmentynyt PAK1 lisää -MSH-indusoituvaa melanogeneesiä

Villityypin (WT) PAK1-geenin yli-ilmentymisellä melanosyyteissä (B16F10-solulinja) transfektiolla paljastimme, että eksogeenisesti lisätty PAK1-geeni lisää -MSH-indusoituvaa melaniinitasoa useita kertoja (katso kuvion 3 vasen puoli, vertaa). kaistat 2 ja 4), vaikka se tuskin vaikuttaa itsenäiseen "perus" melaniinitasoon sinänsä (vertaa kaistat 1 ja 3 kuvan 3 vasemmassa paneelissa), mikä viittaa siihen, että PAK1 vaikuttaa pääasiassa -MSH/IBMX-riippuvaiseen.melanogeneesi, eikä perusmelanogeneesiä ilman eksogeenisiä stimulaattoreita.

3.4. Seerumin vaikutus -MSH/IBMX-indusoituvaan melanogeneesiin

Mielenkiintoisempaa on, että havaitsimme, että melanogeneesin induktio -MSH/IBMX:llä vaatii 10 prosenttia FBS:ää (naudan sikiön seerumi) PAK1:n lisäksi. Kuten kuvasta 4A näkyy, seerumittomassa alustassa joko -MSH tai IBMX tuskin indusoivatmelanogeneesiWT-soluissa, vaikka pelkkä 10 prosentin FBS (ilman -MSH/IBMX:tä) aiheuttimelanogeneesimerkittävästi (noin 60 prosenttia). Mielenkiintoista on, että melanogeneesi SH-transfektanteissa (PAK1-puutteellisissa soluissa) seerumin läsnä ollessa tai ilman sitä oli samaa tasoa kuin WT-soluissa seerumin puuttuessa (katso kuva 4B), mikä viittaa siihen, että seerumista riippuvainen melanogeneesi vaatii myös PAK1:n. Tukeakseen tätä käsitystä, seerumi yksin aktivoi merkittävästi PAK1:n kinaasiaktiivisuutta WT-soluissa, mutta -MSH-riippuvainen PAK1:n aktivaatio WT-soluissa vaatii seerumia (katso kuvio 4C).

Mitä tulee melanogeenisen seerumitekijän kemialliseen luonteeseen, joka yksin aktivoi PAK1:n, oletamme, että se on PDGF (verihiutaleperäinen kasvutekijä) seuraavista syistä: (i) Yli kymmenen vuotta sitten olemme osoittaneet, että PDGF on ainoa kasvutekijä seerumi, joka aktivoi PAK1:n transaktivoimalla EGF-reseptorin (epidermaalinen kasvutekijä) PDGF-reseptorin toimesta (13,14), ja aivan äskettäin muut ovat osoittaneet, että joko PDGF tai EGF yksin todellakin stimuloimelanogeneesimelanosyyttejä (15, 16).

3.5. Seerumi/PDGF-riippuvainen melanogeneesi vaatii EGF-reseptorin

Yrittääksemme tunnistaa tämän melanogeenisen seerumitekijän spesifisen kemiallisen luonteen olemme testanneet joko AG1295:n (PDGF-reseptorille spesifinen inhibiittori) tai AG1478:n (EGF-reseptorille spesifinen inhibiittori) vaikutusta seerumiriippuvaiseen.melanogeneesimelanosyyteissä. Kuten kuvasta 5 näkyy, joko 2 µM AG1295 tai 400 nM AG1478 vähensi voimakkaasti seerumiriippuvaistamelanogeneesitasolle, joka vastaa emäksistä (seerumitonta) melanogeneesiä. Koska PDGF on runsaasti seerumissa, mutta ei EGF ja AG1295 ei estä EGF-reseptoria, kun taas AG1478 ei estä PDGF-reseptoria (13), on todennäköisimmin, että seerumin PDGF aktivoi reseptorinsa, joka puolestaan ​​​​trans-aktivoi EGF-reseptorin. lopulta aktivoi PAK1:n, joka on välttämätön seerumiriippuvaiselle melanogeneesille (katso yksityiskohtia kuvasta 6). Tämän oletuksen perusteella keskustelemme myöhemmin todennäköisimmästä mekanismista, joka on ilmeisen synergian taustalla -MSH:n ja seerumin/PDGF:n välillä PAK1:n aktivoimiseksi, mikä johtaa vahvaan melanogeneesiin.

Lopuksi on syytä huomauttaa, että "perus" melaniinipitoisuus ilman -MSH:ta ei muuttanut merkittävästi PAK1:n yli-ilmentynyt CA (konstitutiivisesti aktiivinen) mutantti, joka kantaa T423E-mutaatiota (katso kuvion 3 vasen paneeli, kaista 5). jos se olisi joko DN (dominantti negatiivinen) tai inaktiivinen mutantti. Itse asiassa -MSH ei indusoinut WT PAK1:n fosforylaatiota Thr 423:ssa ollenkaan (tietoja ei esitetä). Siten voidaan päätellä, että PAK1:n autofosforylaatiolla Thr 423:ssa ei ole mitään tekemistä -MSH-indusoidun PAK1:n aktivaation kanssa, mikä johtaa vahvaanmelanogeneesimelanoomasoluissa. Koska PAK1:n T423E-mutantin tiedetään hyvin olevan erittäin onkogeeninen (6), Thr 423:n autofosforylaatio saattaa toimia vaihtamisena "melanogeenisestä" "onkogeeniseen" signalointiin.

4. Keskustelu

Havaintomme sekä PAK{0}}- että PAK4--riippuvaisesta melanogeneesistä melanosyytti-/melanoomasoluissa nostaa esiin kaksi mahdollisesti mielenkiintoista seikkaa: (i) PAK1:n "spesifinen" melanogeeninen aktiivisuus. vain vähäisessä määrin ilmentyvän) on oltava paljon korkeampi kuin PAK4:n (erittäin ilmentynyt) melanoomasoluissa. (ii) Näyttää siltä, ​​​​että PAK1 on pääasiassa vastuussa seerumin aiheuttamasta melanogeneesistä, kun taas PAK4 on pääasiassa vastuussa sisäisestä (perus)melanogeneesi. Toisin sanoen, vaikka PAK{0}}puutos on alkiossa tappava hiirillä, kun taas PAK1-puutos yksin ei tuota "albiino"-hiiriä, ilmeinen ero alkuperäisessä ihonvärissä (perus)melanogeneesi) esimerkiksi mustien ja valkoisten ihmisten välillä saattaa ainakin osittain heijastaa eroa PAK4:n ilmentymistasoissa sekä erosta melanogeenisuuden tasossa.tyrosinaasis.

Olemme äskettäin osoittaneet in vivo HRM-2 (pigmentoituja mutta karvattomia) hiirillä, että voide, joka sisältää 10 μM PF3758309:ää (PAK1/PAK4-estäjä), vähentää UV-säteilyn aiheuttamaa melanogeneesiä heidän ihossaan. perustasolla, vaikka on vielä selvitettävä, onko PAK4 vai PAK1 vastuussa melanogeneesin UV-induktiosta (8). Koska PAK1 on vastuussa indusoituvasta, mutta ei perusmelanogeneesistä, kannattaa testata, vaikuttaako PAK1 merkittävästi UV-indusoituvaan.melanogeneesi(auringonrusketus) myös käyttämällä harvinaista PAK1 KO (knock out) -mutanttia, joka on johdettu tummia karvoja ja silmiä kantavien hiirten C57B16-kannasta (Hong He et al., julkaisematon havainto), jotta voidaan ymmärtää, onko PAK1:n eri yrtti Kosmetiikan salpaajat ovat hyödyllisiä auringonsuoja-aineina vai eivät. Mielenkiintoista on, että PAK1:n raportoitiin aktivoituvan UV-säteilyn ja muiden DNA:ta vaurioittavien aineiden vaikutuksesta (17).

On osoitettu, että -MSH aktivoi Tyr-kinaasin JAK2 (18), joka puolestaan ​​aktivoi PAK1:n fosforylaatiolla Tyr 285:ssä (Thr 423:n sijaan), mikä johtaa PIX-PAK1-vuorovaikutukseen (19). Tämä saattaa selittää, miksi PAK1:n -MSH-riippuvainen aktivaatio tai melanogeneesi eivät sisällä PAK1:n autofosforylaatiota Thr 423:ssa. Siksi tutkimme äskettäin, estääkö voimakas yrtti JAK{14}} PAK1-riippuvaisen melanogeneesin. katkerasta melonista (Goya) peräisin oleva cucurbitasiini I (CBI) -inhibiittori, joka estää suoraan JAK2:ta (20), ja havaitsi, että CBI estäämelanogeneesimelanogeenisten hormonien läsnä ollessa yli 70 prosenttia, mikä viittaa mahdollisuuteen, että CBI ei estä vain PAK1:tä vaan myös PAK4:ää (5). Tässä yhteydessä olisi erittäin mielenkiintoista huomata, että kasviperäiset PAK{4}}-salpaajat, kuten CAPE, kurkumiini, šikoniini ja FTY 720, voivat estää -MSH:n aiheuttamaa melanogeneesiä hiiren tai ihmisen ihosoluissa vain noin 50 prosenttia jopa niiden pitoisuuksilla, joissa PAK1 on lähes kokonaan estetty (1,2), kun taas synteettinen pan-PAK-salpaaja PF3758309, joka estää sekä PAK1:n että PAK4:n, poistaamelanogeneesiihosoluissa noin 90 prosenttia pitoisuudella 300 nM (8). Toisin sanoen -MSH:n aiheuttama melanogeeninen järjestelmä melanosyyteissä voisi erottaa PAK{5}}-spesifiset salpaajat pan-PAK-salpaajista. Toistaiseksi ei ole tunnistettu kasviperäisiä PAK{7}}spesifisiä estäjiä (muita kuin PAK4-spesifisiä siRNA:ita). Äskettäin Amazonin viidakoissa kasvatetusta katkerasta puusta peräisin olevan erittäin voimakkaan kvassinoidin, nimeltä glaukarubinoni, on kuitenkin osoitettu estävän sekä PAK1:n että PAK4:n ja estää haimasyöpäsolujen kasvua sekä in vitro että in vivo (21). Siksi olisi erittäin mielenkiintoista testata, estääkö tämä kasviperäinen PAK-salpaaja ihosolujen melanogeneesiä lähes kokonaan, kuten PF3758309.

Tämän tutkimuksen päätavoitteena oli keskittyä PAK1:n spesifiseen melanogeeniseen rooliin, eikä tutkia yksityiskohtaisesti, kuinka PAK1 aktivoi melanogeenisen signaalireitin, mukaan lukien melanogeeniset entsyymit ja MTF:t. On kuitenkin todennäköisintä, että PAK1 aktivoi suoraan beeta-kateniinia fosforyloimalla Ser 675:ssä, mikä johtaa MITF:n aktivoitumiseen, mikä on välttämätöntä melanogeenisiä entsyymejä koodaavien geenien, kuten esim.tyrosinaasi(Tyr).

Äskettäin havaitsimme, että PAK4 (CDC42-riippuvainen kinaasi 4) on myös mukanamelanogeneesisamasta melanoomasolulinjasta aktivoimalla kaksi transkriptiotekijää, CREB ja beeta-kateniini, jotka molemmat ovat välttämättömiä MIFT-aktivaatiolle (8). Koska CREB:n tiedetään aktivoivan LIM-kinaasin (22,23) toimesta, joka beeta-kateniinin tapaan kuuluu sekä PAK1:n että PAK4:n yhteisiin suoriin substraatteihin (6,18), on todennäköisintä, että PAK1:llä ja PAK4:llä on sama CREB. /beta-catenin-MITF-signalointireitit melanogeenisten entsyymien geenien aktivoimiseksi.

Yksityiskohtaiset signaalireitit, jotka johtavat PAK1:n -MSH/IBMX-riippuvaiseen aktivaatioon, voivat kuitenkin poiketa merkittävästi niistä, jotka johtavat PAK4:n aktivaatioon, pääasiassa siksi, että ensimmäiseen liittyy seerumitekijä (PDGF). Seerumi yksin kykenee aktivoimaan PAK1:n (13) ja tehostaa myös PAK1:n -MSH/IBMX-riippuvaista aktivaatiota. Toisin sanoen seerumin ja näiden melanogeenisten hormonien välillä on selkeä synergia sekä PAK1-aktivaatiossa ettämelanogeneesi.

Seuraava on työhypoteesimme siitä, kuinka tämä synergia voisi tapahtua. Pääasiallinen PAK1-aktivaatioon johtava signalointireitti on onkogeeninen EGFR (epidermaalinen kasvutekijäreseptori)-RAS-PI 3 -kinaasi-RAC/CDC42-PAK1-kaskadi. Tämä kaskadi ei kuitenkaan yksin riitä täydelliseen aktivointiin. Se tarvitsee toisen tekijän nimeltä PIX, SH3-adapteriproteiinin, joka sitoutuu suoraan PAK1:een Pro-rikkaan 18 aminohapon, nimeltään PAK18, kautta. PIX-PAK1-vuorovaikutus tarvitsee kolmannen proteiinin nimeltä JAK2, Tyr-kinaasin, joka fosforyloi PAK1:n Tyr 285:ssä. RAS lisää JAK2:ta prolaktiinin kautta. Muutamien aikaisempien meidän ja muiden havaintojen mukaan (13-16), PDGF (verihiutaleperäinen kasvutekijä) on tärkein melanogeeninen seerumitekijä (-tekijät), joka on välttämätön -MSH/IBMX-indusoidullemelanogeneesi, koska se aktivoi reseptorinsa (PDGFR) Tyr-kinaasin, joka puolestaan ​​transaktivoi EGFR:n (epidermaalisen kasvutekijän reseptori=ErbB1) Tyr-kinaasin, mikä johtaa PAK1:n aktivaatioon onkogeenisen RAS-PI3-kinaasi-RAC:n kautta. /CDC42-reitti (13). Siten PDGF seerumissa yksin voi aktivoida PAK1:n ja indusoida melanogeneesin jopa puoliväliin. PAK1-riippuvaisen melanogeneesin täysimääräinen aktivointi edellyttää kuitenkin -MSH/IBMX:tä JAK2:n aktivoimiseksi cAMP-riippuvaisen reitin kautta (johon saattaa liittyä PKA), joka lopulta varmistaa PIX-PAK1-vuorovaikutuksen (yksityiskohtaisesti, katso kuva 6).

Lopuksi esittelemme tässä ensimmäiset biokemialliset todisteet, jotka saattavat selittää, kuinka monet kasviperäiset PAK{0}}salpaajat, kuten CAPE, kurkumiini ja shikoniini kosmeettisissa voiteessa, voivat edistää "ihon valkaisuunSarja analogisia tutkimuksia ihmisen melanosyyteillä odotetaan lisätodisteita tai vahvistusta varten.

maca ginseng cistanche

Viitteet

1. Lee JH, Jang JY, Park C, Kim BW, Choi YH, Choi BT. Kurkumiini estää alfa-melanosyyttejä stimuloivan hormonin stimuloiman melanogeneesin B16F10-soluissa. Int J Mol Med. 2010; 26:101-106.

2. Lee JY, Choi HJ, Chung TW, Kim CH, Jeong HS, Ha KT. Kofeiinihapon fenetyyliesteri estää alfa-melanosyyttejä stimuloivan hormonin indusoimaa melaniinin synteesiä estämällä mikroftalmiaan liittyvän transkriptiotekijän transaktivaatioaktiivisuutta. J Nat Prod. 2013; 76:1399-1405.

3. Maruta H. Kasviperäiset lääkkeet, jotka estävät onkogeenisen kinaasin PAK1:n: Käytännön lähestymistapa PAK1-riippuvaisiin sairauksiin ja pitkäikäisyyteen. Phytother Res. 2014; 28:656-672.

4. Nguyen BCQ, Taira N, Tawata S. Useat yrttiyhdisteet Okinawa-kasveissa estävät suoraan onkogeenista/ikääntymistä aiheuttavaa kinaasia PAK1. Drug Discov Ther. 2014; 8:238-244.

5. Nguyen BCQ, Be Tu PT, Tawata S, Maruta H. Immunosaostuksen (IP)-ATP_Glokinaasimäärityksen ja melanogeneesin yhdistelmä tehokkaiden ja turvallisten PAK1--salpaajien arvioimiseksi soluviljelmässä . Drug Discov Ther. 2015; 9:289-295.

6. He H, Maruta H. PAK:ien ja niiden substraattien onkogeenisyys. Julkaisussa: PAKs, RAC/CDC42 (p21)-aktivoidut kinaasit: Kohti syöpien ja muiden PAK:sta riippuvaisten sairauksien parantamista (Maruta H, toim.). Elsevier, Oxford, 2013; s. 23-51.

7. Widlund HR, Horstmann MA, Price ER, Cui J, Lessnick SL, Wu M, He X, Fisher DE. -Kateniinin aiheuttama melanooman kasvu vaatii alavirran kohteena olevaa mikroftalmiaan liittyvää transkriptiotekijää. J Cell Biol. 2002; 158:1079-1087.

8. Yun CY, You ST, Kim JH, Chung JH, Han SB, Shin EY, Kim EG. p21-aktivoitu kinaasi 4 säätelee kriittisesti melanogeneesiä aktivoimalla CREB/MITF- ja -kateniini/MITF-reittejä. J Invest Dermatol. 2015; 135:1385-1394.

9. Huynh N, Liu KH, Baldwin GS, He H. P21-aktivoitu kinaasi 1 stimuloi paksusuolensyöpäsolujen kasvua ja migraatiota/invaasiota ERK- ja AKT-riippuvaisten reittien kautta. Biochim Biophys Acta. 2010; 1803:1106-1113.

10. Tagliati F, Bottoni A, Bosetti A, Zatelli MC, degli Uberti EC. Luminesenssiteknologian käyttö kinaasimäärityksen kehittämiseen: Cdk4 mallijärjestelmänä. J Pharm Biomed Anal. 2005; 39:811-814.11. Yoon NY, Eom TK, Kim MM, Kim SK. Ecklonia cavasta eristettyjen florotaniinien estävä vaikutus sienten tyrosinaasiaktiivisuuteen ja melaniinin muodostumiseen hiiren B16F10-melanoomasoluissa. J Agric Food Chem. 2009; 57:4124-4129.

12. Li X, Guo L, Sun Y, Zhou J, Gu Y, Li Y. Bicalein estää melanogeneesiä aktivoimalla ERK-signalointireitin. Int J Mol Med. 2010; 25:923-927.

13. He H, Levitzki A, Zhu HJ, Walker F, Burgess A, Maruta H. Verihiutaleperäinen kasvutekijä vaatii epidermaalisen kasvutekijän reseptorin aktivoimaan p21-aktivoidun kinaasiperheen kinaasit. J Biol Chem. 2001; 276:26741-26744.

14. Saito Y, Haendeler J, Hojo Y, Yamamoto K, Berk BC. Reseptorin heterodimerointi: Olennainen mekanismi verihiutaleperäisen kasvutekijän aiheuttaman epidermaalisen kasvutekijän reseptorin transaktivaatiossa. Mol Cell Biol. 2001; 21:6387-6394.

15. Hirobe T, Shibata T, Fujiwara R, Sato K. Verihiutaleperäinen kasvutekijä säätelee ihmisen melanosyyttien lisääntymistä ja erilaistumista erilaistumisvaihekohtaisella tavalla. J Dermatol Sei. 2016; 83:200-209.

16. Garcez RC, Teixeira BL, Schmitt Sdos S, Alvarez-Silva M, Trentin AG. Epidermaalinen kasvutekijä (EGF) edistää hermosolujen erilaistumista in vitro hermosoluiksi ja melanosyyteiksi. Cell Mol Neurobiol. 2009; 29:1087-1091.

17. Roig J, Traugh JA. p21-aktivoitu proteiinikinaasi gamma PAK aktivoituu ionisoivan säteilyn ja muiden DNA:ta vahingoittavien aineiden vaikutuksesta. Yhtäläisyyksiä ja eroja alfa PAK:iin. J Biol Chem. 1999; 274:31119-31122.

18. Buggy JJ. Alfa-melanosyyttejä stimuloivan hormonin sitoutuminen B-lymfosyyteissä olevaan G-proteiiniin kytkettyyn reseptoriinsa aktivoi Jak/STAT-reitin. Biochem J. 1998; 331:211-216.

19. Hammer A, Oladimeji P, De Las Casas LE, Diakonova M. PAK1:n tyrosiinin 285 fosforylaatio helpottaa PIX/GIT1:n sitoutumista ja adheesion vaihtuvuutta. FASEB J. 2015; 29:943-959.

20. Blaskovich MA, Sun J, Cantor A, Turkson J, Jove R, Sebti SM. JSI-124 (cucurbitasiini I), selektiivinen Janus-kinaasi/signaalimuunnin ja transkription 3 signaalireitin estäjän aktivaattori, jolla on voimakas kasvaimia estävä vaikutus ihmisen ja hiiren syöpäsoluja vastaan, löydettiin hiirissä. Cancer Res. 2003; 63:1270-1279.

21. Yeo D, Huynh N, Beutler JA, Christophi C, Shulkes A, Baldwin GS, Nikfarjam M, He H. Glaukarubinoni ja gemsitabiini vähentävät synergistisesti haimasyövän kasvua säätelemällä p21--aktivoituja kinaaseja. Cancer Lett. 2014; 346:264-272.

22. Dan C, Kelly A, Bernard O, Minden A. PAK4-seriini/treoniinikinaasin säätelemät sytoskeletaaliset muutokset ovat LIM-kinaasi 1:n ja kofiliinin välittämiä. J Biol Chem. 2001; 276:32115-32121.

23. Yang EJ, Yoon JH, Min DS, Chung KC. LIM-kinaasi 1 aktivoi cAMP-responsiivisen elementtiä sitovan proteiinin immortalisoituneiden aivoturso-progenitorisolujen hermosolujen erilaistumisen aikana. J Biol Chem. 2004; 279:8903-8910.