Syklo-oksigenaasin (COX-2) ja hypoksian aiheuttaman sairauden välinen suhde

lisätietoja:ali.ma@wecistanche.com

Solunsisäinen prostaglandiini E2 edistää hypoksian aiheuttamaa proksimaalista tubulussolukuolemaa

Coral Garcia-Pastorl, Selma Benito-Martinez, Ricardo J. Bosch1, Ana B. Fernandez-Martinez, Francisco J. Lucio-Cazana

Proksimaaliset tubulussolut (PTC) ovat erityisen herkkiä hypoksian aiheuttamalle apoptoosille, joka on tärkeä tekijämunuaissairaus. Oletimme tässä, että hypoksian aiheuttama PTC-kuolema välittyy syklo-oksigenaasista (COX{1}}) riippuvaisesta prostaglandiini E:n (PGE,) tuotannosta, mikä vahvistettiin ihmisen proksimaalisissa tubulaarisissa HK-2soluissa, koska hypoksia (1 prosentti O,)-indusoitu apoptoosi (i) esti COX-2(syklo)-oksigenaasi) estäjä ja prostaglandiini (EP) reseptorien antagonistit ja (ii) liittyi solunsisäisen PGE:n (iPGE,) nousuun, johtuen hypoksiasta indusoitavasta tekijä-1 -riippuvasta COX{{3:n transkription lisääntymisestä. }}(syklo-oksigenaasi). Apoptoosia estivät myös prostaglandiinin sisäänoton kuljettajan PGT:n estäjät, mikä osoitti, että iPGE edistää hypoksian aiheuttamaa apoptoosia (päinvastoin hypoksian/uudelleenhapetuksen aiheuttama PTC-kuolema johtui yksinomaan solunulkoisesta PGE:stä). Siten iPGE on uusi toimija hypoksian aiheuttaman tubulusvaurion patogeneesissä, ja PGT saattaa olla uusi terapeuttinen kohde hypoksiasta riippuvien leesioiden ehkäisyssä munuaissairauksissa.

On hyvin todettu, että tubulaarinen hypoksia on olennainen tekijä sekä akuutissa että kroonisessamunuaissairaus'2 Proksimaaliset tubulussolut (PTC) kuluttavat happea erittäin aktiivisesti niiden energiaa vaativien uudelleenabsorptiotoimintojensa vuoksi, ja näin ollen ne ovat herkkiä hypoksialle. On osoitettu, että apoptoosilla on olennainen rooli viljellyssä PTC:ssä, joka on alttiina hypoksialle, mutta apoptoottisen koneiston aktivoinnista vastaavia signalointireittejä ei ole tutkittu. Me ja muut olemme havainneet, että prostaglandiini E, (PGE,), tärkeä lipidivälittäjä useissa fysiologisissa ja patologisissa prosesseissamunuainen, näyttelee merkityksellistä roolia PTC-apoptoosiin johtavassa signaloinnissa sisplatiinilla 7:llä, albumiinilla 8 tai leptiinillä ja gentamysiinillä hoidettaessa. Kaikissa tapauksissa PGE:n nousun havaittiin riippuvan syklo-oksigenaasin-2(COX-2) lisääntyneestä ilmentymisestä.(syklo-oksigenaasi), indusoituva entsyymi, joka yhdessä COX-1l:n kanssa on nopeutta rajoittava vaihe prostaglandiinien synteesissä. Ihmisessämunuainen, perus-COX-2(syklo-oksigenaasi)ilmaisu on vähemmän intensiivinen kuin COX-1. COX-2(syklo-oksigenaasi)on tunnistettu podosyyteissä ja Henlen silmukan osissa ja munuaisten verisuonistoon fysiologisissa olosuhteissa10. Patologisissa tiloissa COX-2-immunoreaktiivisuutta voidaan kuitenkin havaita monissa muissa solutyypeissämunuainenmukaan lukien PTC, ja mahdollisesti edistää munuaisvaurioita. Mielenkiintoista on, että hypoksia lisää COX:n ilmentymistä-2(syklo-oksigenaasi)ja/tai PGE:n,12-i7:n tuotanto monissa solutyypeissä. Itse asiassa olemme aiemmin havainneet, että hypoksia lisää PGE:n solunsisäistä sisältöä sekä sen vapautumista solunulkoiseen väliaineeseen8. Siksi on teoriassa mahdollista, että PGE välittää hypoksian apoptoottista vaikutusta PTC:hen.

Suurin osa PGE:stä riippuvaista apoptoosista tehdyistä tutkimuksista on keskittynyt mekanismeihin, joihin liittyy solunulkoinen PGE, koska on laajalti hyväksyttyä, että PGE saa biologiset vaikutuksensa aktivoimalla plasmakalvon ylittävät G-proteiiniin kytketyt PGE-reseptorit (E-sarjan prostaglandiinireseptorit). EP1-4)1. Siitä huolimatta joissakin malleissa solunsisäinen PGE (iPGE) on merkityksellinen apoptoottisessa solukuolemassa720-22. Tämä tarkoittaa, että apoptoosin indusoimiseksi PGE:n on saavutettava uudelleen solunsisäinen väliaine ja aktivoitava EP-reseptorien osajoukko, jotka sijaitsevat solun sisällä (iEP-reseptorit). Koska PGE:n sieppaamisen suorittaa pääasiassa prostaglandiinin sisäänoton kuljettaja (PGT)23-26, PGT:n estäminen johtaa iPGE:n välittämän apoptoottisen solukuoleman estämiseen7.

Tämän taustan huomioon ottaen tutkimme tässä työssä, onko COX{0}}(syklo-oksigenaasi)-riippuvainen iPGE:n nousu, tasot välittävät hypoksian aiheuttamaa apoptoosia PTC:ssä.

Klikkaa luomu Cistanche munuaissairaus

menetelmät

Reagenssit.

AG1478, Bromocresolgreen (BG), PGE, AH6809, GW627368X, kristallivioletti, trypaaninsiniliuokset, bromisulfoftaleiini (BRS), 3-(5'-hydroksimetyyli2'-furyyli)-1-bentsyyli-indatsoli (YC1), ja aktinomysiini D ostettiin Sigmalta (St. Louis, MO, USA). Z-VAD-FMK ja selekoksibi olivat Calbiochemilta (Darmstadt, Saksa) ja Cayman Chemicalilta (Ann Arbor, MI, USA), vastaavasti. TriReagent ostettiin Vitrolta (Madrid, Espanja), ja PVDF-kalvot ja Western blot -luminolireagenssi ostettiin Santa Cruz Biotechnologylta (Santa Cruz, CA, USA). }}fenyyli-indoli (DAPI), anneksiini-V-FITC (fluoreseiini-isotiosyanaatti)/propidiumjodidi (PI) apoptoosin havaitsemispakkaus ja 2',7'-dikloorifluoreseiinidiasetaatti (DCFH-DA) -koetin ostettiin Invitrogenilta (Carlsbad, CA, USA) ja Molecular Probes (Oregon, USA), vastaavasti. Vasta-aineet saatiin seuraavista lähteistä: anti-PGE ja anti-COX-2(syklo-oksigenaasi)vasta-aineet olivat Abcamilta (Cambridge, UK); anti-Bax ja anti-Bcl-2 olivat Santa Cruz Technologiesilta (Santa Cruz, CA.USA); anti-HIF-la-vasta-aine ja -kani-Alexa-Fluor 488 olivat BD Biosciencesilta (Palo Alto, CA, USA) ja Invitrogenilta (Carlsbad, CA, USA), vastaavasti; anti- --aktiini ja kanin anti-hiiri-IgG-peroksidaasikonjugaatti ostettiin Sigmalta (St. Louis, MO, USA).

Soluviljely ja koeolosuhteet.

Ihmisen proksimaaliset tubulaariset HK-2-solut ostettiin American Type Culture Collectionilta (ATCC) (Rockville, MD, USA). Soluja pidettiin 5 prosentin CO:ssa, 37 asteen Cin DMEM/F12:lla täydennettynä 10 prosentilla naudan sikiöllä. seerumi (FBS), 1 prosentti penisilliiniä/streptomysiiniä/amfoterisiini B:tä ja 1 prosentti glutamiinia (Invitrogen. Carlsbad, CA, USA) ja 1 prosentti insuliinia-transferriini-seleeniä (ThermoFisher. Grand Island, NY, USA). Kaikissa kokeissa solut maljattiin 70-90 prosentin yhtymäkohdassa, ja kun ne ovat täysin kiinnittyneet, niitä viljeltiin hypoksisissa (1 prosentti happea) tai normoksisissa olosuhteissa (21 prosenttia happea).Hypoksiakokeet suoritettiin In vivo200:ssahypoksiatyöasema (Ruskin Technology, West Yorkshire, Iso-Britannia). vartenhypoksia/uudelleenhapetuskokeet, solut altistettiinhypoksia24 tuntia, ja sen jälkeen soluja inkuboitiin normoksisissa olosuhteissa jopa 3 tuntia (uudelleenhapetusjakso).

iPGE:n immunofluoresenssianalyysi ja COX:n Western blot -analyysi-2(syklo-oksigenaasi)ja HIF-1 .

Solut immunofluoresenssianalyysiä ja Western blot -analyysiä varten jaettiin vastaavasti lasisille peitelaseille (4 x 104 solua/lasipeitelasi) tai kuusikuoppaisille levyille (15 x 104 solua/kuoppa) ja inkuboitiin "Tulokset" -osiossa kuvatulla tavalla. Sitten immunofluoresenssi- ja immunoblottausanalyysi suoritettiin pääosin aiemmin kuvatulla tavalla. Vasta-ainelaimennokset olivat: 1/50 PGE:lle, 1/1000 COX:lle{10}}(syklo-oksigenaasi)/HIF-1a/a-rabbit-Alexa-Fluor 568 ja 1/5000 -aktiinille. Immunofluoresenssin havaitseminen suoritettiin Leica SP5 -konfokaalimikroskoopilla (Leica Microsystems, Wetzlar, Saksa) Confocal Microscopy Servicen (ICTS 'NANBIOSIS'U17) kautta Biotekniikan, biomateriaalien ja nanolääketieteen biolääketieteen tutkimusverkostokeskuksessa (CIBER-BBN). Alcalin yliopisto, Madrid, Espanja)

Ohimenevä transfektio.

Ohimenevä transfektio siRNA PGT:llä (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), nisäkäsekspressiovektorilla pcDNA3, joka sisältää villityypin ihmisen 15-hydroksiprostaglandiinidehydrogenaasin (p15-PGDH) cDNA:n tai lusiferaasireportteriplasmidikonstruktit ihmisen COX:lle-2(syklo-oksigenaasi)phPES2-Luc, ihminenhypoksiavasteelementti (HRE)p9HIF1-Luc ja R. reniformis pRL-CMV (Promega, Madison, WI) ja lusiferaasiaktiivisuuden määritys suoritettiin kuten muualla on kuvattu27,28.

Solumäärä ja solu/ytimen morfologia.

Kiinnittyneiden solujen lukumäärä määritettiin spektrofotometrisesti modifioidulla kristalliviolettivärjäysmenetelmällä2. Apoptoosin todisteiden havaitsemiseksi solumorfologiaa tarkkailtiin käyttämällä faasikontrastimikroskopiaa. Soluytimet visualisoitiin DNA-värjäyksen jälkeen DAPI:lla, kuten aiemmin on kuvattu0. Tyypillinen tutkittu apoptoottinen morfologia sisälsi solun kutistumisen, tuman kondensoitumisen ja fragmentoitumisen sekä apoptoottisten kappaleiden muodostumisen. Kvantifiointia varten kuusi kenttää tutkittiin kussakin koetilassa sokeasti apoptoosin kaltaisten ytimien prosenttiosuuden arvioimiseksi.

Virtaussytometrinen apoptoosimääritys ja solujen elinkelpoisuusmääritys trypaaninsinisen väriaineen poissulkemistestillä.

Levylle kiinnittyneet solut irrotettiin trypsinisoimalla ja yhdessä viljelyväliaineesta aiemmin talteen otettujen irrotettujen solujen kanssa käytettiin määritykseen.

Anneksiini-V-FITC/PI-apoptoosin havaitsemispakkaus mahdollisti apoptoottisten ja nekroottisten HK-2-solujen virtaussytometrisen havaitsemisen, kuten aiemmin on kuvattu7. Varhaiset ja myöhäiset apoptoottiset solut olivat positiivisia anneksiini V -värjäytymiselle ja molemmille ja anneksiini V:lle. värjäys. Nekroottiset solut olivat positiivisia vain PI:lle ja elävät HK-2 -solut eivät osoittaneet värjäytymistä.

Solujen elinkelpoisuuden arvioimiseen käytettiin trypaaninsinistä väriaineen ekskluusiotestiä. Elävät solut (valkoiset) ja kuolleet solut (siniset) laskettiin käyttämällä valomikroskooppia ja hemosytometriä.

Tilastollinen analyysi.

Jokainen koe toistettiin vähintään kolme kertaa. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. Niille tehtiin yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA), jota seurasi Bonferronin testi useiden vertailujen suorittamiseksi. Merkitystaso asetettiin arvoon P Pienempi tai yhtä suuri kuin 0.05.

Tulokset

Hypoksia aiheuttaa proksimaalisen tubulaarisen HK{0}}-solukuoleman.

Hypoksiavähensi HK-2-solujen määrää kristalliviolettimäärityksellä arvioituna (kuvio la), ja myös indusoi solujen pyöristymistä ja irtoamista levystä (kuvio lb, yläpaneeli). Odotetusti,hypoksialaukaisi solukuoleman mallin, jossa on selvät apoptoosin morfologiset ominaisuudet (katso tumavärjäys DAPI:lla kuviossa lb, alapaneeli, vasemmalla), kuten solujen kutistuminen, johon liittyy merkittävää tuman kondensaatiota, fragmentoitumista ja apoptoosin kaltaisten kappaleiden muodostumista.Hypoksia-indusoitu apoptoosi vahvistettiin edelleen anneksiini V-FITC-värjäytymisen lisääntymisellä, joka arvioitiin virtaussytometrialla, ja sen estymisellä pan-kaspaasin estäjällä Z-VAD-FMK (kuvio lc).Hypoksiamääritti myös elävien solujen lukumäärän vähenemisen, mutta ei indusoinut tilastollisesti merkitseviä muutoksia nekroottisten solujen lukumäärässä (kuvio lc, upotettu).

Kuva 1. Hypoksia aiheuttaa proksimaalisen tubulaarisen HK-2 -solukuoleman.a) Vähentynyt solumäärä (kideviolettimääritys). (b) Apoptoosin morfologiset ominaisuudet. Edustavat vaihekontrastimikrokuvat (yläpaneeli, alkuperäinen suurennus, 10×) DAPI-värjäysmikrokuvat (alapaneeli, alkuperäinen suurennus, 40×). (c) Apoptoosin lisääntyminen (virtaussytometriatutkimukset). Anneksiini V plus -solut käsittävät anneksiini V plus/propidiumjodidi-solut (eli varhaiset apoptoottiset solut, joilla on säilynyt plasmamembraanin eheys) ja anneksiini V plus/propidiumjodidi plus -solut (eli myöhäiset apoptoottiset solut). Inset: Solupopulaatiotyypit (Aneksiini V-/propidiumjodidi plus solut ovat nekroottisia soluja ja anneksiini V-/propidiumjodidi ovat eläviä soluja). Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina tapahtumien kokonaismäärästä. Yleistä tietoa:(1) Soluja inkuboitiin 24 tuntia normatoksisissa (21 % O2) tai hypoksisissa (1 % O,) olosuhteissa, kuten kohdassa "Menetelmät" on osoitettu. Pan-kaspaasin estäjä Z-VAD-FMK (25 μM) oli lisätty 1 h ennen altistuksen aloittamistahypoksia. (2) Mikrovalokuvat ovat edustavia esimerkkejä kolmesta riippumattomasta kokeesta. Pylväät ja virhepalkit kaavioissa: Jokainen pylväs edustaa 3 eri kokeen keskiarvoa ± SEM *P<0.01 vs.=""><0.01 vs="">hypoksia;**P<0.01 vs.="" normoxia="" and="">hypoksiaplus ZVAD.

COX-2(syklo-oksigenaasi)/iPGE,/EP-reseptorireitti välittää hypoksian aiheuttamaa proksimaalista tubulaarista HK{0}} -solukuolemaa.

COX:n roolin arvioimiseksi-2(syklo-oksigenaasi)/iPGE2/EP-reseptorireitti sisäänhypoksia-indusoitu HK-2-solukuolema, esi-inkuboimme ensin soluja selekoksibin kanssa, COX-2(syklo-oksigenaasi)estäjä1; AH6809, EP1-, EP2- ja EP3-reseptorien antagonisti, tai GW627368X, EP4-reseptorin33 antagonisti; tai bromikresolivihreällä tai bromosul-foftaalilla molemmissa PGT435:n estäjät. PGT kaadettiin myös transfektiolla siRNA:lla.

Kuva 2. COX-2(syklo-oksigenaasi)/iPGE,/EP-reseptorireitti välittää hypoksian aiheuttamaa proksimaalista tubulaarista HK-2 -solukuolemaa.(a) Solukuoleman estäminen reitin estäjillä. Yläpaneeli; Palkit osoittavat prosenttiosuuden kokonaissolukuolemasta (vasemmalla) tai apoptoottisten anneksiini V plus -solujen prosenttiosuuden (oikealla). Ennen kuin altistuthypoksia, soluja esi-inkuboitiin 1 tunti 3 μM selekoksibin (COX-2) kanssa(syklo-oksigenaasi)inhibiittori）; 10 µM AH6809, (EP1-3-reseptoriantagonisti), 10 µM GW627368X(EP4-reseptorin antagonisti）); tai 50 μM bromikresolivihreää (BG) tai 25 μM bromisulfoftaleiinia (BrS), kaksi PGT-estäjää. Alempi paneeli: Vasen: Solukuoleman ehkäisy kaatamalla PGT transfektoimalla siRNA:lla (trypan blue dive exclusion -testi). Inset: PGT:n pudotuksen tehokkuus (Western blot -analyysi) Oikealla: Bromikresolivihreän (BG) ehkäisevän vaikutuksen pitoisuusriippuvuus. (b) Solukuoleman ehkäisy transfektoimalla nisäkäsekspressiovektorilla, joka sisältää prostaglandiinia inaktivoivan entsyymin 15-hydroksiprostaglandiinidehydrogenaasi(15-PGDH) cDNA (trypaanisinisen väriaineen poissulkemistesti). Sisältö: {{ 11}}PGDH (Western blot -analyysi) transfektoiduissa soluissa. (c)Hypoksiaindusoi PGT-herkän lisäyksen iPGE:ssä, Vasemmalla: PGE:stä riippuvainen immunofluoresenssi yksinään tai yhdistettynä tumavärjäykseen DAPI:lla (alkuperäinen suurennus, 40×) Oikealla: Kvantitatiivinen lähestymistapa vasemmassa paneelissa esitettyihin kuviin Image J -ohjelmistolla. (d) EGFR-aktivaation estäjä AG1478 ei estä HK-2 -solukuolemaa EGFR:ää. Soluja esi-inkuboitiin 1 tunti 1 μM AG1478:n kanssa ennen kuin ne altistettiinhypoksia. (e) PGT-estäjä BG ei muuta Baxin ja Bcl{0}}:n ilmentymistä HK-2-soluissahypoksia(Western blot -analyysi). f) ehkäisyhypoksia/uudelleenhapetuksen aiheuttama solukuolema reitin estäjien toimesta (trypaanisinisen väriaineen poissulkemistesti). Soluja esi-inkuboitiin reitin estäjien kanssa ja altistettiinhypoksiakuten kohdassa (a). Sitten solut altistettiin normoksialle 3 tunnin ajan. Yleistä tietoa: (1) Soluja inkuboitiin 24 tuntia normoksisissa (21 prosenttia O,) tai hypoksisissa (1 prosentti O,) olosuhteissa, kuten kohdassa "Menetelmät" on esitetty. (2) Mikrovalokuvat ovat edustavia esimerkkejä kolmesta riippumattomasta kokeesta. (3) Inhibiittoreiden liuottimet (luL/ml väliainetta) eivät muuttaneet aineen vaikutustahypoksiasolukuolemaan (tuloksia ei näytetä). (4) Western blot -analyysi: Sama proteiini varmistettiin koettimalla anti- --aktiinilla tai anti-GAPDH-vasta-aineella. (5) Palkit ja virhepalkki kaavioissa: Jokainen pylväs edustaa 3 eri kokeen keskiarvoa ± SEM.*P<0.01><0.01>hypoksiataihypoksia/uudelleenhapetus.

Kuten kuvassa 2a näkyy,hypoksia-indusoitu proksimaalinen tubulussolukuolema estettiin kaikissa tapauksissa. Selekoksibin aiheuttama apoptoosin esto osoitti, että COX-2(syklo-oksigenaasi)on asiaankuuluva roolihypoksia-indusoitu apoptoottinen solukuolema (kuvio 2a, ylempi paneeli, oikea). Tarkemmin sanottuna se tosiasia, että apoptoosi esti EP-reseptorien antagonismilla, kertoo, että apoptoosia välittää COX-2(syklo-oksigenaasi)-riippuvainen PGE:n tuotanto. Toisaalta on todennäköisintä, että iPGE vaikuttaahypoksia-indusoitu HK-2-solukuolema, koska se esti;(i) PGT:n esto(kuva 2a) tai(i) 15-PGDH:n yli-ilmentyminen(kuvio 2b), joka inaktivoi iPGE2:n sen kautta. hapetus25(huomaa, että itse transfektiomenettely lisäsi HK-2-solujen herkkyyttähypoksia: solukuolema oli 45-55 prosenttia transfektiosta kontrolliolosuhteissa verrattuna 15-20 prosenttiin ei-transfektoiduissa soluissa). Lisätukea iPGE:n panoksellehypoksia-indusoitu HK-2-solukuolema, ovat aikaisemmat havainnothypoksiamäärittää iPGE1:n solupitoisuuden kasvun ja että PGT-estäjät estivät tämän nousun (kuvio 2c).

MAPK-signalointireitit voivat indusoida apoptoosia. Koska iEP-reseptorit transaktivoivat epidermaalisen kasvutekijäreseptorin (EGFR)36:n, mikä johtaa MAP-kinaasien ERK1/2 ja p38 aktivoitumiseen HK-2-soluissa0, kysyimme, onko ennen - HK-2-solujen inkubaatio EGFR-aktivaation estäjän AG1478 kanssa estettyhypoksia-indusoitu solukuolema. Löysimme negatiiviset tulokset (kuva 2d), ja siksi on epätodennäköistä, että EGFR:n transaktivaatio välittää HK-2 -solukuolemaahypoksia.

Useissa kokeellisissa malleissa mitokondrioista peräisin olevan ATP:n vähentäminen aikanahypoksiaaiheuttaa pro-apoptoottisen proteiinin Bax ja anti-apoptoottisen proteiinin Bcl-2 ilmentymissuhteen lisääntymisen, mikä johtaa sytokromi C:n vapautumiseen sytosoliin, kaspaasi 9:n aktivoitumiseen ja myöhempään alavirran efektorin pilkkoutumiseen ja aktivoitumiseen. kaspaasit37,38. Kuitenkin esi-inkubointi PGT-estäjän BG:n kanssa HK-2-soluissa allehypoksiaei johtanut muutoksiin, jotka ovat yhteensopivia anti-apoptoottisen muutoksen kanssa Bc-2:n ja Bax:n ilmentymisen välisessä tasapainossa (kuva 2e), mikä ei tue näiden proteiinien roolia HK-2-soluissa kuolema allahypoksia.

Hypoksisen altistuksen jälkeen uudelleenhapettumisjaksot (iskemia/reperfuusiovaurio) voivat aiheuttaa lisää soluvaurioita. Uudelleenhapetusvaurion "paradoksi" voidaan ymmärtää ottamalla huomioon, että solut käyvät läpi spesifisiä muutoksia entsyymiaktiivisuudessa, mitokondrioiden toiminnassa, sytoskeletaalin rakenteessa, kalvokuljetuksessa ja antioksidanttipuolustuksessa vasteenahypoksia, jotka sitten yhdessä altistavat uudelleenhapetusvauriolle39. Uudelleenhapetus edistää akuuttia munuaisvauriota iskeemisen aivohalvauksen, munuaisensiirron, verenkierron vajaatoiminnan tai munuais- ja sydänleikkauksen aikana. Tässä yhteydessä potentiaalinen terapeuttinen arvo estonhypoksia/uudelleenhapetuksen aiheuttama proksimaalinen tubulussolukuolema COX:iin puuttumisen vuoksi-2(syklo-oksigenaasi)/iPGE,/iEP-reseptorireitti on ilmeinen. Siksi kysyimme, välittääkö iPGE erityisestihypoksia-indusoitu solukuolema tai myös välittäähypoksia/uudelleenhapetuksen aiheuttama solukuolema (in vitro -malli, joka jäljittelee in vivo munuaisiskemiaa/reperfuusiovauriota). Kuten kuvasta 2f näkyy, COX-2 esti solukuoleman (trypaanisinisen sukellussulkutestillä arvioituna).(syklo-oksigenaasi)inhibiittori selekoksibi sekä EP-reseptoriantagonistit AH6809 tai GW627368X. Kuten kuvassa 2a, nämä tulokset viittaavat siihen, että COX-2:lla on olennainen roolihypoksia/uudelleenhapetuksen aiheuttama solukuolema ja tarkemmin sanottuna COX-välitteinen solukuolema-2(syklo-oksigenaasi)-riippuvainen PGE:n tuotanto, koska sen esti EP-reseptorien antagonismi. Koska PGT-estäjät bromikresolivihreä tai bromosulfoftaleiini (kuva 2f ja täydentävä kuva 2d) eivät kuitenkaan estäneet solukuolemaa, on todennäköisempää, ettähypoksia/uudelleenhapetuksen aiheuttama HK-2 -solukuolema välittyy yksinomaan solunulkoisen PGE:n kautta.

HIF{0}}riippuvainen COX:n transkription säätely-2(syklo-oksigenaasi)geeniekspressio edistää ahypoksia-indusoitu iPGE:n kasvu proksimaalisissa tubulaarisissa HK-2-soluissa. PGE:n biosynteesi sisältää arakidonihapon vapautumisen kalvon glyserofosfolipideistä fosfolipaasi A:n vaikutuksesta, minkä jälkeen arakidonihapon COX-isoentsyymit muuttavat prostaglandiini H:ksi ja lopuksi prostaglandiinisynteesi prostageslandiinin E:n isomeroitumisen PGE:ksi PGE:ksi. kuten mikrosomaalinen PGE-syntaasi-1 (mPGES-1)19. Olemme havainneet senhypoksia-indusoitu apoptoosi HK-2-soluissa on todennäköisimmin COX-2-välitteinen(syklo-oksigenaasi)-riippuvainen PGE:n tuotannon kasvu (kuvio 2). Koska COX-2(syklo-oksigenaasi)on entsyymi, jonka ilmentymisen voi indusoidahypoksia, oletimme, että ahypoksia-indusoitu PGE:n lisääntyminen, tuotanto HK-2-soluissa saattaa olla seurausta COX-2-ekspression lisääntymisestä(syklo-oksigenaasi). Vahvistaaksemme hypoteesimme tutkimme (i) vaikutustahypoksiaCOX:n ilmentymisestä-2(syklo-oksigenaasi)proteiini ja mRNA ja (ii) COX:n vaikutus-2(syklo-oksigenaasi)estäjä selekoksibihypoksia-indusoitu iPGE:n nousu, Tuloksemme osoittivat senhypoksiamääräytyy ohimenevästi COX:n transkription noususäätelyssä-2(syklo-oksigenaasi)lauseke(kuvat 3a,b)ja COX-2(syklo-oksigenaasi)esto heikensi iPGE:n kasvua HK{0}}-soluissahypoksia(Kuva 3c). Mielenkiintoista,hypoksiamääritti myös mPGES-1-proteiinin ilmentymisen ohimenevän noususäätelyn (kuvio 3a, upotettu), mutta se ei vaikuttanut mPGES-1-mRNA-ilmentymiseen (kuvio 3b, upotettu). Nämä tulokset osoittivat, että COX:n ilmentyminen lisääntyi-2(syklo-oksigenaasi)ja mPGES-1 on vastuussahypoksia-indusoitu iPGE:n nousu.

Kuva 3. HIF-la-riippuvainen COX:n transkription säätely-2(syklo-oksigenaasi)geenin ilmentyminen edistää hypoksian aiheuttamaa iPGE:n kasvua proksimaalisissa tubulaarisissa HK-2-soluissa.(a)COXin ilmaus-2(syklo-oksigenaasi)proteiini lisääntyy tilapäisestihypoksia(Western blot -analyysi). Inset: Expression mPGES-1 proteiinia säätelee myös tilapäisestihypoksia. (b) Lauseke COX-2(syklo-oksigenaasi)mRNA:ta kasvaa tilapäisestihypoksia. Inset: mPGES{0}} mRNA:n ilmentymiseen ei vaikutahypoksia. (c)ehkäisy selekoksibilla, COX:lla-2(syklo-oksigenaasi)indusoima iPGE:n lisääntymisen estäjähypoksia. Soluja esi-inkuboitiin 1 tunti 3 µM selekoksibin kanssa. Vasemman∶PGE-riippuvainen immunofluoresenssi yksinään tai yhdistettynä tumavärjäykseen DAPI:lla näytetään (alkuperäinen suurennus, 40×). Oikealla: Kvantitatiivinen lähestymistapa vasemmassa paneelissa esitettyihin kuviin Image J -ohjelmistolla. (d) Transkriptiomekanismien osallistuminen. Vasemmalla: transkription estäjä aktinomysiini D (laki D) estää ahypoksia-indusoitu COX-pitoisuuden nousu-2(syklo-oksigenaasi)proteiiniekspressio (Western blot -analyysi). Solut esikäsiteltiin 1 tunnin ajan 1 ug/ml Actilla. D ennen altistumistahypoksia3 tunnin ajan.Oikealla: COX-aktiivisuuden lisääntyminen-2(syklo-oksigenaasi)reportterirakennelma. (e) HIF-la YC-1:n estäjä estäähypoksia-indusoitu transkriptionaalinen COX-2(syklo-oksigenaasi)lisäsääntely. Soluja esi-inkuboitiin 1 tunti 0,5 uM YC-1 kanssa. Vasemmalla: COX-ehkäisy-2(syklo-oksigenaasi)lisäsääntely. Solut altistettiinhypoksia8 tunnin ajan. Keskus: COX-aktiivisuuden lisääntymisen estäminen-2(syklo-oksigenaasi)reportterirakennelma. Oikealla: HRE-ohjatun reportterirakenteen toiminnan esto. Solut altistettiinhypoksia8 tunnin ajan. (f) HIF-la-inhibiittori YC-1 lisää apoptoottista solukuolemaa (virtaussytometriatutkimukset). Ennen kuin altistuthypoksia, soluja esi-inkuboitiin 1 tunti 0.5 μM YC-1 kanssa. Inset∶ YC-1 estäähypoksia-indusoitu HIF-1a-ekspression lisääntyminen (Western blot -analyysi). Yleistä tietoa: (1) Soluja inkuboitiin 24 tuntia normoksisissa (21 prosenttia O,) tai hypoksisissa (1 prosentti O,) olosuhteissa, kuten on osoitettu kohdassa "Menetelmät". (2) Mikrovalokuvat ovat edustavia esimerkkejä kolmesta riippumattomasta kokeesta. (3)Western blot -analyysi: Proteiinin yhtäläisyys varmistettiin koettimalla anti- -aktiinivasta-aineella (4) Pylväät ja virhepalkit kaavioissa: Jokainen pylväs edustaa 3 eri kokeen keskiarvoa ± SEM.<0.01 vs.="" other="">

Tarkastellaan tarkemmin transkriptiomekanismien osuutta COX:n lisääntymisessä-2(syklo-oksigenaasi)proteiinin ilmentyminen allahypoksia, COX:n ilmaus-2(syklo-oksigenaasi)arvioitiin HK-2-soluissa, joita esi-inkuboitiin transkription estäjän aktinomysiini D:n kanssa ennen kuin ne altistettiinhypoksia5 tunnin ajan. Kuten kuvassa 3d näkyy,hypoksia-indusoitu COX-pitoisuuden nousu-2(syklo-oksigenaasi)proteiinin ilmentyminen esti aktinomysiini D:llä.hypoksiamääritti myös COX-aktiivisuuden lisääntymisen-2(syklo-oksigenaasi)promoottorikonstrukti, joka on aiemmin transfektoitu HK-2-soluihin (kuvio 3d oikealla). Yhdessä tarkasteltuna kuviossa 3d esitetyt tulokset viittaavat siihen, että transkriptiomekanismit edistävät ahypoksia-indusoitu COX-pitoisuuden nousu-2(syklo-oksigenaasi)proteiinin ilmentyminen. Siitä huolimatta COX-2-promoottorin aktivoinnin ajoituksen ja maksimaalisen COX-2-arvon välillä oli ristiriita.(syklo-oksigenaasi)mRNA:n ilmentyminen: COX-pitoisuuden ohimenevä lisääntyminen-2(syklo-oksigenaasi)mRNA:n ilmentyminen oli maksimaalinen 2 tunnin kuluttua (kuva 3b), COX-2-promoottori aktivoitui 3 tunnin kuluttua (kuvio 3d), mikä luultavasti heijastaa transkription jälkeisten mekanismien osuutta COX{{6:n nousuun. }}(syklo-oksigenaasi)ilmaisu 4. Näin ollen oletamme, että COX-2(syklo-oksigenaasi)mRNA on stabiloitu allehypoksia, mikä johtaisi kohonneisiin COX-tasoihin-2(syklo-oksigenaasi)mRNA:n ilmentyminen ilman lisäystä (sillä hetkellä) COX:n lisääntyneeseen aktiivisuuteen-2(syklo-oksigenaasi)promoottori. On kuitenkin myös mahdollista, että aikaviive promoottorin aktivoitumisen ja mitattavissa olevan substraatin kerääntymisen välillä voi myös myötävaikuttaa COX-2-promoottorin aktivoitumisen ajoituksen ja maksimaalisen COX{{1}-ajan välillä. }}(syklo-oksigenaasi)mRNA:n ilmentyminen.

HIF-1 on heterodimeerinen transkriptiotekijä, joka koostuu hapesta riippuvaisesta -alayksiköstä ja konstitutiivisesti ilmennetystä -alayksiköstä. Allahypoksia, HIF-l kerääntyy ja menee ytimeen, jossa se synnyttää transkriptiotekijän HIF-1 dimerisoituessaan HIF-1:lla. HIF-1 edistää sitten kohdegeeniensä ilmentymistä sitoutumallahypoksia-responsiiviset elementit (HRE:t), jotka ovat läsnä säätelyalueellaan ja järjestävät myöhemmin solujen mukautuvat vasteet torjuakseenhypoksia 3. Olettaen ettähypoksiavoi aktivoida COX:n-2(syklo-oksigenaasi)ilmentymistä HIF-1-riippuvaisella tavalla COX-2-promoottorisekvenssissä2 olevan toiminnallisen HRE:n kautta, tutkimme HIF-l:n rooliahypoksia-indusoitu COX-pitoisuuden nousu-2(syklo-oksigenaasi)ilmaisu. Tarkastelimme myös HK-2-soluihin transfektoidun COX-2-promoottorirakenteen aktiivisuutta. Kuten kuvasta 3e näkyy, esi-inkubointi HIF-1a-estäjän YC-1 kanssa, joka tylppäsihypoksia-indusoitu lisääntyminen HIF-la:n ilmentymisessä ja HRE-reportterikonstruktin aktiivisuudessa, mikä johti COX:n molempien ilmentymisen lisääntymisen estämiseen-2(syklo-oksigenaasi)ja COX:n toiminta-2(syklo-oksigenaasi)promoottorirakennelma HK-2:ssahypoksia. Yhteenvetona voidaan todeta, että tulokset on esitetty kuvissa 3a-e tukevat käsitystä, että HIF-1 -riippuvainen COX-2-transkription ylössäätely(syklo-oksigenaasi)on vastuussahypoksia-indusoitu iPGE2:n nousu.

Vaikka HIF{0}}aktivoinnin seuraukset ovat päällähypoksia-indusoitu apoptoosi ovat kiistanalaisia ​​(luultavasti koska ne voivat olla kontekstiriippuvaisia), analysoimme (alustavalla tavalla) HIF-1a:n roolia koejärjestelmässämme. Koska olemme aiemmin havainneet, että interventio COX-2(syklo-oksigenaasi)/iPGE, EP-reseptorireitti estää HIF-la:n ilmentymisen lisääntymisen, jonka laukaiseehypoksia8,56 kysyimme, johtaako HIF-la:n estäminenhypoksia-indusoitu HK-2-soluapoptoosi. Kuten kuvasta 3f näkyy, esi-inkubaatio YC-1:n, HIF-l:n estäjän kanssa, itse asiassa lisääntyihypoksia-indusoitu apoptoosi. Siksi on epätodennäköistä, että HlF-la

Keskustelu

Kudoshypoksiauskotaan olevan kriittisesti merkityksellinen sekä kroonisen munuaissairauden että akuutin munuaisvaurion patofysiologiassa, koska PTC on herkin osa munuaistiehyitä vastaanhypoksia. Tässä tarkastelimme PGE:n roolia vahingossahypoksiaihmisen PTC:lle ja havaitsi, että lisääntynyt iPGE:n tuotanto johtui HIF-la-riippuvasta COX:n lisääntymisestä-2(syklo-oksigenaasi)geenin ilmentyminen ja lisääntynyt mPGES{0}}:n ilmentyminen edistäväthypoksia-indusoitu apoptoottinen solukuolema HK-2-soluissa. Ottaen huomioon, että tubulaarinen hypoksia on olennainen tekijä sekä akuutissa että kroonisessa munuaissairaudessa-2, nämä tulokset osoittavat, että prostaglandiinin kuljettaja PGT on uusi terapeuttinen kohde munuaissairauksissa.

Hypoksiaei vain lisää iPGE:tä, vaan myös sen vapautumista solunulkoiseen väliaineeseen8, joten eritetyllä (sellunulkoisella) PGE:llä saattaa myös olla merkitystähypoksia-indusoitu apoptoosi (esimerkiksi apoptoottisten kaskadien laukaiseminen solukalvolla sijaitsevien EP-reseptorien kanonisen aktivoinnin kautta). Kaksi aikaisempaa tutkimusta ovat osoittaneet, että solukuolema allehypoksiajohtui myös COX:sta-2(syklo-oksigenaasi)-riippuvainen PGE,1345:n tuotanto. Toisaalta tietyissä solutyypeissä (fibroblastit, mikrogliat, neuronit ja akuutti lymfoblastinen leukemiasolulinjat) PGE:n aiheuttamaa apoptoosia välittää PGE:stä riippuva EP-reseptorien aktivaatio46-48. Olemme löytäneet täältä senhypoksia-indusoitu HK-2-soluapoptoosi esti myös EP-reseptorien antagonismin (kuvio 2a, ylempi paneeli, oikea). Mutta koska EP-reseptoreita on klassisesti kuvattu plasmamembraanireseptoreina – joten iPGE2- ei pääse niihin käsiksi, arvelemme, että EP-reseptorit, jotka välittävät iPGE:n apoptoottista vaikutusta, ovat hypoksisissa HK-2-soluissa solunsisäisesti (eli iEP-reseptorit).

Toisin kuin iPGE2:n roolissahypoksia-indusoitua apoptoosia HK-2-soluissa, havaitsimme, että vain solunulkoinen PGE välittäähypoksia/uudelleenhapetuksen aiheuttama HK-2-solukuolema, koska PGT:n estäjät eivät estäneet sitä (kuvio 2f). Vaikka patologiset mekanismit soluvaurion jälkeenhypoksia/uudelleenhapetusta ei täysin ymmärretä, on hyväksytty, että solukuolema tapahtuu suurelta osin liiallisten reaktiivisten happilajien (ROS) tuotannon kautta. Tämä pätee erityisesti HK-2-soluihin49,50. Kuitenkin vaikkahypoksiasaattaa myös lisätä ROS:n tuotantoa, parhaan tietomme mukaan ei ole todisteita siitä, että ROS:lla olisi merkitystähypoksia-indusoitu HK-2-solukuolema. Tämä viittaa siihen, että hypoksian ja hypoksian/uudelleenhapetuksen tappavat vaikutukset HK-2-soluissa välittyvät eri mekanismien kautta, mikä saattaa selittää, miksi BG ja BS suojaavathypoksiamutta ei vastaanhypoksia/uudelleenhapetus. Näin ollen PGT:n estäminen saattaa tarjota terapeuttisia etuja PTC:ssä hypoksian aiheuttamaa soluvauriota vastaan, mutta ei haitallista vaikutusta vastaan.hypoksia/uudelleenhapetus.

HIF-1 -riippuvainen COX-sääntely-2(syklo-oksigenaasi)oli kriittinen tapahtumahypoksia-indusoitu HK-2-soluapoptoosi (kuvio 3e). Havaintomme, jonka mukaan HIF-inhibiittori YC-1 tehosti apoptoottista solukuolemaa (kuva 3f), on kuitenkin hämmentävä, vaikka aikaisemmat raportit ovat jo osoittaneet samanlaisia ​​tuloksia1. Yksi mahdollinen selitys on hypoteettinen skenaario, jossa HIF-la ei ainoastaan ​​välitä COX:n pro-apoptoottista lisäsäätelyä-2(syklo-oksigenaasi)mutta myös suojaavien molekyylien säätelyä. HIF{1}} todellakin sääteli suojaavien molekyylien ilmentymistähypoksiakuten pitkä ei-koodaava RNA DARS-AS1' ja microRNA-2103 on löydetty spesifisesti HK-2-soluista. Vaikka nämä todisteet tukevat hypoteettista skenaariotamme, sen vahvistamiseksi tulisi suorittaa erityisiä kokeita.

Munuaissolujen vasteen tutkiminenhypoksiavoi parantaa ymmärrystämme munuaispatologiasta. Olemme tutkineet, vaikkakin alustavasti, pro-apoptoottisen proteiinin Bax ja anti-apoptoottisen proteiinin Bcl{2}} ilmentymissuhteen kasvun rooliahypoksia-indusoitu apoptoosi HK-2-soluissa. Tuloksemme osoittivat, että PGL:n estäminen ei johtanut muutoksiin, jotka ovat yhteensopivia anti-apoptoottisen muutoksen kanssa Bcl-2:n ja Bax:n ilmentymisen välisessä tasapainossa (kuva 2e), mikä ei tue näiden proteiinien roolia iPGE-riippuvainen HK-2-solukuolema allehypoksia. Tietojemme mukaan on olemassa vain kaksi tutkimusta Bcl{{0}}/Bax-akselin vaikutuksesta hypoksian aiheuttamaan apoptoosiin PTC:ssä, ja molemmissa tutkimuksissa oli mukana hapettomia" tai lähes haitattomia O-pitoisuuksia5 Kun PTC altistettiin 0,2 prosentille O.:ta, Bax-ekspressio pysyi muuttumattomana ja apoptoosi liittyi alentuneeseen Bcl-2-ilmentymisasteeseen. Kuitenkin 1 prosentti O:sta ei vaikuttanut Bcl-2:n ilmentymiseen. apoptoosin esiintyminen, mikä on yhtäpitävä tulostemme kanssa. Siksi muita mekanismeja, jotka eivät välttämättä sisällä määrällisiä muutoksia Bcl-2- tai Bax-ilmentymisessä, tulee harkita: esimerkiksi apoptoosin induktio viljellyissä glioomasoluissa iPGE2:lla vaatii vain sen fyysinen yhteys Baxiin, mikä laukaisee Baxin siirtymisen mitokondrioihin202. Siten mekanismi, jonka kautta iPGE edistää HK-2-solujen apoptoosia, ansaitsee lisätutkimuksen.

Ryhmämme on havainnut, että COX-2(syklo-oksigenaasi)-riippuvainen iPGE:n nousu, välittää apoptoottista kuolemaa HK-2-soluissa, jotka altistuvat sisplatiinille, apoptoottisille kappaleille7" jahypoksia(nykyiset tulokset). Koska PGE vapautuu nopeasti solun ulkopuolelle sen jälkeen, kun se on mitoitettu2, sen PGl:n kuljettamalla sisäänpäin on kriittinen rooli iPGE:n aiheuttamassa apoptoosissa HK-2-soluissa. Siksi aina kun iPGE välittää PTC-vaurion, hoito PGT:n estäjillä saattaa olla hyödyllinen terapeuttinen lähestymistapa mahdollisiin sovelluksiin, kuten sisplatiinin aiheuttaman PTC-vaurion ehkäisyyn, tubulusvaurion leviämisen estoon apoptoottisten kappaleiden kautta tai haitallinen vaikutushypoksiaPTC:ssä.