TRPM6:n keskeiset roolit verenpaineen vuorokausisäätelyssä

Ottaa yhteyttä:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Munuaisten ionikanavan TRPM6 merkitys reniinin vuorokausierittymisessä verenpaineen nostamiseksi

Yosuke Funato, Daisuke Yamazaki, Daisuke Okuzaki, Nobuhiko Yamamoto ja Hiroaki Miki

Verenpaineon päivittäinen malli, korkeammat arvot aktiivisella jaksolla. Sen nousu aktiivisen jakson alussa lisää merkittävästi kuolemaan johtavien kardiovaskulaaristen tapahtumien riskiä. Munuaisten sympaattisten hermosolujen stimuloima reniinin eritystä pidetään välttämättömänä tälle prosessille; sen säätelymekanismi on kuitenkin suurelta osin tuntematon. Tässä osoitamme sen tärkeydenohimenevä reseptoripotentiaali, melastatiiniin liittyvä 6 (TRPM6), Mg2 plus -läpäisevä kationikanava, joka lisää reniinin eritystä aktiivisen ajanjakson aikana.TRPM6ekspressio vähenee merkittävästi hypotensiivisten Cnnm{0}}-puutoshiirten distaalisessa mutkaisessa tubuluksessa. Tuotamme munuaiskohtaisiaTRPM6-puutteellisia hiiriä ja tarkkaile niiden vähenemistäverenpaineja sen vuorokausivaihtelun katoaminen. Johdonmukaisesti reniinin eritys ei lisääntynyt aktiivisen ajanjakson aikana. Lisäksi reniinin eritys neuronistimulaation kohteena olevan -adrenoreseptorin farmakologisen aktivoinnin jälkeen lakkaa ja reseptorin ilmentyminen vähenee reniiniä erittävissä soluissa. Nämä tulokset osoittavat ratkaisevan roolinTRPM6 vuorokausisäätelyssäverenpaine.

Noin miljardilla ihmisellä maailmanlaajuisesti arvioidaan sairastavan verenpainetautia, mikä lisää merkittävästi eri sairauksien, mukaan lukien mahdollisesti kuolemaan johtavien sairauksien, kuten iskeemisen sydänsairauden ja aivohalvauksen, riskiä. Näiden verenpaineeseen liittyvien kuolemaan johtavien tapausten tiedetään tapahtuvan usein aikaisin aamulla, aktiivisen ajanjakson alussa, kunvertapainenousee jyrkästi. Munuaisten sympaattisten hermosolujen laukaiseman reniinin erityksen katsotaan olevan ratkaiseva rooli tässäverenpainekorkeus, mutta sen säätelymekanismia ei tunneta hyvin².

cistanche-kehonrakennus

On yleisesti hyväksyttyä, että joillakin ravinnon kivennäisaineilla, erityisesti natriumilla ja kaliumilla, on tärkeä roolivertapaine. Magnesium on tärkeä osa monissa biologisissa toimissa. Epidemiologiset tutkimukset ovat osoittaneet merkittävän käänteisen suhteen ravinnon magnesiumpitoisuuden ja verenpainetaudin riskin välillä3-6. Lisäksi magnesiumin erittyminen virtsaan, jonka oletetaan olevan likimäärin tasapainossa suolistossa tapahtuvan magnesiumin imeytymisen kanssa, korreloi käänteisesti verenpainetaudin riskin kanssa. Nämä havainnot viittaavat läheiseen yhteyteen organismin magnesiumhomeostaasin javerenpaineSääntelyssä korostaen Mg2 plus -kanavien ja/tai kuljettajien merkitystäverenpaine.

Suuri määrä magnesiumia imeytyy jatkuvasti takaisin munuaisissa. Suurin osa glomerulaarisen suodoksen magnesiumista imeytyy takaisin Henlen silmukan paksuun nousevaan haaraan, mutta viimeinen reabsorptiovaihe tapahtuu distaalisessa kierteisessä tubuluksessa (DCT)8. Jälkimmäinen prosessi on tiukasti säädelty uudelleenabsorption määrän säätämiseksi tasolle, joka on sopiva magnesiumin homeostaasin ylläpitämiseen. Synnynnäisten sairauksien, joissa on hypomagnesemian oireita, genomianalyysit ovat paljastaneet useita tähän prosessiin osallistuvia avainmolekyylejäTRPM6, koodausohimenevä reseptoripotentiaali, melastatiiniin liittyvä 6(TRPM6), joka on mutatoitunut potilailla, joilla on resessiivinen hypomagnesemia ja sekundaarinen hypokalsemia2,10.TRPM6muodostaa Mg2 plus -läpäisevän ionikanavan, joka on lokalisoitu DCT-solujen apikaaliseen kalvoon ja välittää Mg2 plus -ottoa putkimaisesta luumenista1. Toinen keskeinen molekyyli on sykliini M2 (CNNM2) ja Mg2 plus kuljettaja, joka on lokalisoitu DCT-solujen basolateraaliseen kalvoon12,13. Cnnm2-mutaatiot aiheuttavat familiaalista dominanttia hypomagnesemiaa, jolle on tunnusomaista magnesiumin reabsorptiovirheet munuaisissa2. Cnmm{11}}puutteellisilla hiirillä on samanlaisia ​​hypomagnesemia-oireita ja magnesiumin haihtumista munuaisissa4. CNNM2:n tarkka molekyylirooli on edelleen kiistanalainen, mutta useat todisteet viittaavat siihen, että se välittää Mg2:ta ja ulosvirtausta DCT-soluista basolateraalisen kalvon5 läpi, mikä edistää magnesiumin uudelleenabsorptiota. Cnnm{16}-puutoshiirten lisäanalyysit ovat paljastaneet, että näillä hiirillä on myös huomattavasti pienempivertapainekuin kontrollihiiret4. Kuitenkin mekaaniset yksityiskohdat ja muiden Mg2 plus -kanavien/kuljettajien osallistuminen tähänvertapainesääntely jää tuntematta.

Munuaisten DCT:llä tiedetään myös olevan kriittinen roolivertapainesäätelyä, koska se imee natriumia merkittävästi takaisin ja säätelee kehon nestetilavuutta6. Useita kationikanavia/kuljettajia, kuten Na-Cl-apukuljettaja (NCC), epiteelin natriumkanava (ENaC) ja Na plus /H plus lämmönvaihdin 2 (NHE2), ilmentyy DCT:n apikaalisessa kalvossa ja jotkin nämä proteiinit välittävät Na plus:n ottoa DCT-soluihin tubulusontelosta. Solunsisäinen Na plus ekstrudoidaan sitten soluista basolateraalisen kalvon läpi Na plus/K plus -ATPaasilla sen uudelleenabsorption suorittamiseksi. Sen lisäksi, että DCT osallistuu suoraan kehon nestetilavuuden säätelyyn, DCT sijaitsee makula densan vieressä, joka säätelee reniinin eritystä, hormonin, jolla on pääasiallinen rooli orkestroinnissa.verenpaineasetus 17,18. Aistimalla virtsan Cl-tasoja makula densa -solut stimuloivat lähellä olevia juxta-glomerulaarisia (JG) soluja erittämään reniiniä.

Tässä työssä teemme transkriptomianalyysejä hypotensiivisten Cnnm{0}}-puutoshiirten munuaisilla. Havaitsemme merkittävän laskunTrpm6, joka saa meidät luomaan munuaiskohtaisiaTrpm6- puutteelliset hiiret. Tämän hiirikannan analyysit paljastavat yllättäen fenotyypin, joka poikkeaa laadullisesti Cnnm2--puutteellisesta: vuorokausivaihtelun häviämisen.vertapaine. Havaitsemme myös, että tämä fenotyyppi johtuu heikentyneestä reniinin erittymisestä, averenpaine-kohottava hormoni, jonka veren taso on normaalisti kohonnut aktiivisen vaiheen aikana.

cistanche-kehonrakennus

Tulokset

AlassääntelyTRPM6 (ohimenevä reseptoripotentiaali, melastatiiniin liittyvä 6)ilmaisua Cnnm{0}}puutteellisilla hiirillä. Tutkiakseen molekyylimekanismiaverenpaineCnnm{0}}puutteellisista hiiristä vähennettiin, suoritimme DNA-mikrosiruanalyysejä tutkiaksemme geenin ilmentymisen muutoksia Cnnm2f/il:n munuaisissa; Kuusi2-Cre-hiirtä, joilta puuttuvat molemmat Cnnm2-alleelit munuaisista4. Erilaisesti ilmentyneiden geenien joukosta (taulukko 1) valitsimme analysoida Pvalb jaTrpm6, jotka molemmat ilmaistaan ​​DCT919:ssä. Kvantitatiiviset PCR-analyysit (qPCR) paljastivat senTrpm6ilmentyminen väheni samalla tavalla molempien Cnnm2fi:n munuaisissa; Kuusi2-Cre ja Cnnm2 plus / hiirtä. Koska sekä Cnnm2 plus /A että Cnnm2fi/; Kuusi2-Cre-hiirtä oli hypotensiivisiä4, analysoimmeTRPM6 ilmaisua tarkemmin. Munuaislysaattien immunoblottausanalyysit vahvistivat merkittävän laskunTRPM6proteiinitasolla Cnnm{0}}-puutos, kun taas NCC:n ja fosforyloidun NCC:n (aktiivinen muoto) tasot eivät vaikuttaneet merkittävästi, CNNM2:n ilmentyminen varmistettiin peräkkäisillä immunosaostus- ja immunoblottausanalyyseillä). VähennysTRPM6Cnnm2f/i:n munuaisissa; Kuusi2-Cre-hiirtä vahvistettiin myös immunofluoresenssianalyyseillä.

Tutkimme myösTRPM6ilmentyminen hiirillä, joista puuttuu CNNM4, joilla on myös hypomagnesemian oireita20, mutta ne ovat kohonneetverenpaine4. Immunoblottaus ja immunofluoresenssianalyysit osoittivat senTRPM6ilmentyminen lisääntyy Cnnm{0}}-puutoshiirten DCT-soluissa, mikä viittaa siihen, ettäTRPM6ilmaisu liittyy läheisestiverenpainearvot, mutta se ei liity suoraan veren magnesiumpitoisuuteen.

asetuksenTRPM6ekspressiota solunsisäisellä Mg2 plus:lla DCT-soluissa. Luonnehditaan molekyylimekanismiaTRPM6 Cnnm{0}-puutteellisilla hiirillä säätelyn alenemiseen käytimme DCT-peräistä solulinjaa MDCT21, joka ilmentää Cnnm-perheen geenien joukossa hallitsevasti Cnnm2:ta ja kohtalaisesti Cnnm3:a ja Cnnm4:ää. Koska CNNM2:lla ja CNNM4:llä on voimakas Mg2 plus ulosvirtausaktiivisuus, kun taas CNNM3:lla ei ole Mg2 plus ulosvirtausaktiivisuutta l5, suoritimme pientä häiritsevän RNA:n (siRNA) välittämän joko Cnnm2:n, Cnnm4:n tai molempien knockdownin. Cnnm2:n pudotus lisäsi solunsisäisiä Mg plus -tasoja ([Mg plus ]), ja samanaikainen Cnnm4:n kaatuminen johti keskiarvon [Mg2] vähäiseen nousuun; arvo, joka ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Seuraavaksi tutkimmeTrpm6ilmentymistä qPCR:llä ja havaitsi merkittävän laskun Cnnm2:n pudotuksen jälkeen ja paljon suuremman laskun Cnnm2:n ja Cnnm4:n kaksoispudotuksen jälkeen. Siksi,Trpm6ilmentymistä näyttävät säätelevän negatiivisesti solunsisäiset Mg2 plus -tasot, mikä on yhdenmukaista aiempien raporttien kanssa23. Tutkiaksemme suoraan Mg2 plus:n tärkeyttä viljelimme MDCT-soluja elatusaineissa, joissa oli erilaisia ​​pitoisuuksia Mg2 plus 0,1 h, jolloin ekstrasellulaarisen Mg2 plus -pitoisuuden pienentäminen johti solunsisäisen Mg2 plus -tason laskuun jaTrpm6ilmentymistä, mikä viittaa Mg2 plus -solujen suppressoivaan rooliin. Kaksoispudotuksen (Cnnm2/Cnnm4) tapauksessa MDCT-solut,Trpm6ilmentyminen tukahdutettiin Mg2 plus:n vähenemisellä

plus pitoisuudet alas 0,2 mm:iin, mutta lisävähennykset kumosivat tukahduttavan vaikutuksen; sekä solunsisäinen Mg2 plus ettäTrpm6tasot eivät eronneet merkittävästi kontrolli-siRNA-transfektoiduista soluista sekä 0,1 että 0,02 mM olosuhteissa. Nämä tulokset osoittavat Mg2 plus -riippuvaisen säätelymekanisminTrpm6ilmaisu, joka selittääTrpm6Cnnm{0}}puutoshiirten munuaisten säätelyn heikkeneminen.

Ehdollinen häiriöTrpm6 (ohimenevä reseptoripotentiaali, melastatiiniin liittyvä 6)munuaisessa. Seuraavaksi pyrimme luomaanTrpm6- Puutteelliset hiiret tutkimaan tarkemmin niiden tärkeyttäTRPM6asetuksessaverenpaine. Käytimme embryonaalista kantasolukloonia (ES) -kloonia, joka kantaa rekombinanttiaTrpm6alleeli (Trpm6-) joka sisältää silmukoinnin akseptorisekvenssin, joka pakottaa ennenaikaisen mRNA:n silmukoinnin ja johti eksonin 6 jälkeen typistettyyn mRNA:han. Kimeeriset heterotsygoottiset hiiret saatiin ES-solujen blastokysti-injektiolla ja rekombinaatio varmistettiin PCR:llä. Ylitimme nämäTrpm6plus /- hiiret, mutta eiTrpm6-/--off_kevät saatiin. Tämä tulos on yhdenmukainen aiempien raporttien kanssa, jotka osoittavat alkion kuolleisuuttaTrpm6-puutteelliset hiiret24,25

Siksi suoritimme munuaiskohtaisen ehdollisen häiriönTrpm6käyttämällä Six2-Crea, joka mahdollistaa GFP-fuusioituneen Cre-rekombinaasin tehokkaan ja spesifisen ilmentymisen alkion munuaisissa.Trpm6fl/, kuusi{0}}Cre-hiirtä (munuaiskohtainenTrpm6-puutteelliset hiiret) syntyivät odotetulla Mendelin suhteella. Ilmaisun määrittämiseksiTRPM6, teimme immunoblottausanalyysit käyttämällä anti-TRPM6vasta-aine.TRPM6proteiinitasot laskivat huomattavasti munuaisissaTrpm6fl/fl, kuusi2-Cre-hiirtä, mutta merkittäviä muutoksia ei havaittu muissa elimissä. Immunofluoresenssivärjäysanalyysit eivät myöskään osoittaneet ilmentymistäTRPM6NCC-positiivisissa DCT-soluissa. Emme havainneet mitään merkittävääTRPM6-positiivinen signaali yli 100 tällaisessa NCC-positiivisten solujen klusterissa, mikä viittaa siihen, ettäTRPM6ilmentyminen on lähes täysin tukahdutettu Trpmfi/:n DCT-soluissa; Kuusi{0}}Cre-hiirtä. Nämä tulokset vahvistavat onnistuneen munuaisspesifisen luomisenTrpm6- puutteelliset hiiret.

Tutkimme ensin munuaisspesifisen vaikutuksenTrpm6- magnesiumin homeostaasin puute. Pidimme hiiriä aineenvaihduntahäkeissä ja keräsimme virtsa- ja seeruminäytteitä, joille suoritettiin sitten magnesiumtasojen kolorimetrinen kvantifiointi käyttämällä Xylidyl Blue-I:tä. Seerumin magnesiumtasot olivat huomattavasti alhaisemmatTrpm6l/l; Kuusi2-Cre-hiirtä vertailussa oleviinTrpm6plus / plus ; Kuusi2-Cre-hiirtä, kun taas virtsan magnesiumtasot olivat korkeammat. Suoritimme myös induktiivisesti kytketty plasmaemissiospektroskopia (ICP-ES) -analyysejä mitataksemme useita suuria metallielementtejä seerumissa ja havaitsimme, että vain magnesiumtasot vaikuttivat merkittävästi Trpmd/; Kuusi2-Cre-hiirtä. Nämä tulokset osoittavat selvästi, että munuaisspesifisillä Trpm6-puutteellisilla hiirillä on hypomagnesemia, johon liittyy munuaisten magnesiumin haihtumista, kuten havaittiin munuaisspesifisellä Cnnm2-puutteellisella miselillä4.

Vuorokausivaihtelun puutevertapaineja reniiniaktiivisuus. Seuraavaksi alistettiinTrpm6i/l; Kuusi2-Cre-hiirtävertapainemittaukset radiotelemetrialla. Systolinen ja diastolinenverenpaineMolemmat arvot olivat huomattavasti alhaisemmatTrpm6l/; Kuusi2-Cre-hiirtä kuin vertailuhiirissä. On huomionarvoista, että tavallinen vuorokausivaihteluverenpaine, joilla oli korkeita arvoja pimeän jakson aikana ja alhaiset arvot valokauden aikana hiirillä, ei havaittuTrpm6f/l; Kuusi{0}}Cre-hiirtä. Tutkiaksemme, eteneekö vuorokausirytmi normaalisti, käytimme radiotelemetriaa hiirten liikkumisaktiivisuuden mittaamiseen ja vahvistimme hyvin selkeän vuorokausivaihtelunTrpm6l/; Kuusi{{0}}Cre-hiirtä. Tutkimme myös vasopressiinin (AVP) ja kahden kellogeenin Bmall ja Per2 mRNA-tasoja aivoissa ja munuaisissa; kaikkien tiedetään osoittavan tyypillistä vuorokausivaihtelua27,28. Analysoimme kuudessa eri ajankohdassa (0,4,8 Zeitgeber Times (ZT) valossa ja 12,16,20 ZT pimeässä). Kontrollihiirillä on selkeät vuorokausivaihtelut ilmentymisessä, kuten aiemmin on raportoitu28, ja jälleen kerran, emme löytäneet merkittäviä poikkeavuuksiaTrpm6/il; Kuusi{0}}Cre-hiirtä. Tarkistimme myös Trpm7:n ilmentymistason, joka koodaa Mg2 plus -läpäisevää kanavaa, joka liittyy läheisestiTRPM6, munuaisissa. Ilmaisumallit olivat hyvin samanlaisia ​​molemmissaTrpm6plus / plus ; Six{0}}Cre ja Trpm6f/; Kuusi2-Cre-hiirtä, ja niissä ei näkynyt selkeitä vuorokausikuvioita. Yhteenvetona päättelemme, että vuorokausirytmi etenee normaalistiTrpm6i; Kuusi{0}}Cre-hiirtä. Sitä on pidettyvertapainekohoaminen aktiivisen jakson aikana (hiirillä pimeä jakso ja ihmisillä valojakso) sekä ihmisillä että hiirillä tapahtuu vasteena lisääntyneelle reniinin erittymiselle vereen2. Mittasimme reniiniaktiivisuutta verinäytteistä, jotka kerättiin kuudessa eri ajankohtana, jotka on kuvattu edellä. Veren reniiniaktiivisuuden selvä nousu havaittiin pimeinä ajanjaksoina kontrollihiirten näytteissä, mutta merkittävää nousua ei havaittu näytteissäTrpm6/lKuusi{0}}Cre-hiirtä. Mittasimme myös noradrenaliinin pitoisuuden veressä, jonka vapautumisen tiedetään stimuloivan reniini-angiotensiinijärjestelmän aktivoitumisen29,30. Kuten odotettiin, myös niiden vuorokausivaihtelu katosi sisäänTrpm6, Kuusi{0}}Cre-hiirtä. Samaan aikaan veren angiotensinogeenin (AGT), toisen nopeutta rajoittavan molekyylin reniini-angiotensiinijärjestelmän aktivoimiseksi hiirillä31 proteiinitasoon ei vaikuttanutTrpm6 puute. Tulokset viittaavat siihen, että reniinin heikentynyt vuorokausivaihtelu on tärkeä vuorokausivaihtelun häviämiselle.vertapainekirjoittajaTrpm6-puute.

LäheisyysTRPM6-ekspressoivat solut reniiniä erittäviksi soluiksi. Reniini ekspressoituu munuaisen JG-soluissa ja erittyy niistä17,18. JG-solut ovat suorassa kosketuksessa makula densaan, joka sijaitsee DCT:n vieressä ja stimuloi reniinin eritystä JG-soluista vasteena virtsan Cl-pitoisuuden vähenemiseen18. Immunofluoresenssivärjäys reniinille ja hermosolujen typpioksidisyntaasille (nNOS), makula densa markkerille, ei osoittanut poikkeavuuksia positiivisten signaalien kuviossa tai intensiteetissä, jotka havaittiin lähellä glomeruluksiaTrpm6f/; Kuusi{0}}Cre-hiirtä. Siksi reniinin eritykseen ja sen säätelyyn suoraan osallistuviin soluihin ei näytä vaikuttavan merkittävästiTrpm6puute. KutenTRPM6on ilmaistu yhdessä NCC:n kanssa DCT:ssä, tutkimme seuraavaksi spatiaalista suhdettaTRPM6/NCC:tä ilmentävät solut (DCT) ja makula densa- tai JG-solut. Sagittaalisten DCT-osien konfokaaliset kuvat osoittivat lähes täydellisen päällekkäisyydenTRPM6ja NCC-signaalit kaikkialla DCT:ssä. Sitten värjäsimme nNOS:lle ja NCC:lle ja havaitsimme, että nNOS:n ja NCC:n positiiviset alueet ovat yhteydessä toisiinsa ilman signaalien päällekkäisyyttä. Lisäksi kaksoisvärjäys reniinille ja NCC:lleTRPM6/NCC paljasti, että jotkutTRPM6/NCC:tä ilmentävät solut ovat lähellä reniiniä ekspressoivia JG-soluja, mikä viittaa siihen, ettäTRPM6/NCC:tä ilmentävillä soluilla sekä makula densalla voi olla merkittävä vaikutus reniinin erittymiseen.

Heikentynyt reniinin eritysTrpm6 (ohimenevä reseptoripotentiaali, melastatiiniin liittyvä 6)puute. Yleensä autonomisella hermojärjestelmällä on ratkaiseva rooli vuorokausirytmin etenemisen ohjaamisessa. Reniinin erittymistä JG-soluista aktiivisen ajanjakson aikana uskotaan stimuloivan munuaisten sympaattisista hermosoluista erittyvän noradrenaliinin32. Sellaisen stimulaation vaikutuksen reniinin eritykseen tutkimiseksi suoraan valmistimme munuaisviipaleet ja stimuloimme niitä isoproterenolilla, -adrenoreseptorin (AR) agonistilla. Tulokset osoittivat, että viipaleeseen jäänyt reniinipositiivinen signaali väheni erittäin selvästi 30 minuutin ajan isoproterenolistimulaation jälkeen. Kvantitatiiviset analyysit osoittivat, että reniinipositiivisen signaalin ympäröimien glomerulusten prosenttiosuus pieneni noin 80 prosentista 30 prosenttiin isoproterenolistimulaation jälkeen, mikä osoittaa massiivisen reniinin erittymisen. Emme kuitenkaan havainneet isoproterenolistimulaation merkittävää vaikutusta reniinisignaaliin munuaisviipaleissaTrpm6/1; Kuusi2-Cre-hiirtä. Tuloksen vahvistamiseksi mittasimme myös veren reniiniaktiivisuuden isoproterenolin annon jälkeen. Tulokset osoittavat, että merkittävää veren reniiniaktiivisuuden nousua havaittiin vain kontrollihiirillä, kun taas sydämen sykkeen nousu havaittiin yleisesti molemmissa kannoissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että reniiniä erittävät JG-solut eivät voi reagoida munuaisten sympaattisten hermosolujen stimulaatioon, mikä on johdonmukaista vuorokausivaihtelun lisääntymisen katoamisen kanssa.vertapaineja reniinin aktiivisuusTrpm6l/fl; Kuusi{0}}Cre-hiirtä.

JG-soluja voidaan myös stimuloida erittämään reniiniä vasteena prostaglandiineille, joista prostaglandiini E2:ta (PGE2) pidetään merkittävimpänä, koska makula densa -solut erittävät sitä fysiologisesti, kun virtsan Cl-tasot laskevat17,18. Lisäksi tiedetään myös, että PGE, munuaisviipaleiden käsittely voi stimuloida reniinin eritystä tehokkaasti33. JG-solujen stimulointi PGE2:lla ja isoproterenolilla aktivoi yleensä cAMP-tuotannon, mikä lopulta aiheuttaa reniinin erittymistä. Siksi testasimme myös PGE:n ja kalvoa läpäisevän cAMP-analogin, dibutylyyli-cAMP(db-cAMP) vaikutuksen. PGE2 ja db-cAMP stimuloivat onnistuneesti reniinin eritystä Trpmdi/A:n, Sixin munuaisviipaleissa{12}} Cre-hiiret ja kontrollihiiret. Tämä osoittaa, ettäTrpm6 puute ei kumoa yleistä koneistoa, joka liittyy ulkoisten vihjeiden havaitsemiseen, solunsisäisten signaalien välittämiseen ja reniinin erityksen suorittamiseen, mutta se vaikuttaa erityisesti -AR-vasteeseen.

Vähentynyt -AR-ilmentyminen JG-soluissaTrpm6 (ohimenevä reseptoripotentiaali, melastatiiniin liittyvä 6)puute. Heikentynyt -AR-reseptorin vasteTrpm6l/l; Kuusi2-Cre-hiirtä sai meidät tutkimaan -AR-reseptorin ilmentymisen tilaa, ja näin ollen suoritimme immunofluoresenssin 1-AR:lle, joka on JG-soluissa ilmentyvä pääasiallinen -AR-alatyyppi34. Kuten aiemmin ilmoitettiin34, löysimme nauhamaisen värjäytymiskuvion sekä kontrolli- että Trpmdi/l, Six2-Cre-hiirten munuaisosista. Tiedetään, että 1-AR ekspressoituu voimakkaasti sekä verisuonissa että JG-soluissa34, ja johdonmukaisesti myös 1-AR-positiiviset solut vyöhykemäisen värjäyksen lopussa kontrollihiiren munuaisissa olivat positiivisia. reniinivärjäystä varten (näkyy nuolenpäällä). Sitä vastoin Trpm6l/fl:n värjäys; Kuusi2-Cre-hiiren munuaista osoitti pienemmän määrän 1-AR/reniini-kaksoispositiivisia soluja, mikä viittaa siihen, että 1-AR-ilmentyminen oli vähentynyt JG-soluissa. Tämän havainnon vahvistamiseksi eristimme JG-solut käyttämällä Percoll-tiheysgradienttisentrifugointimenetelmää edellisen raportin mukaisesti35. Immunoblottausanalyysit paljastivat, että reniinipositiiviset JG-solut ovat rikastuneet vyöhykkeen 3 fraktiossa, mikä on yhdenmukainen niiden raportin kanssa35, ja 1-AR-ilmentyminen tässä vyöhykkeen 3 fraktiossa oli erityisesti paljon alhaisempi Trpmdi/1:ssä; Kuusi2-Cre-hiirtä. Löysimme sen yhdessäTrpm6puutos alentaa 1-AR:n ilmentymistasoa JG-soluissa, mikä on yhdenmukainen heikentyneen reniinin erityksen kanssa.

Keinotekoisen intervention vaikutus vuorokausivaihteluunvertapainevaihtelua. Viimeisessä koesarjassa testasimme erilaisten interventioiden vaikutusta vuorokausivaihteluunvertapainevaihtelua. Reniinin tärkeyden vahvistamiseksi annoimme kliinisesti saatavilla olevaa reniini-inhibiittoria aliskireenia36 villityypin hiirille. KutenTrpm6ablaatio, aliskireenin antaminen kirurgisesti implantoimalla osmoottinen minipumppu, tukahdutti merkittävästi vuorokausivaihtelunvertapainevaihtelua. Seuraavaksi suoritimme munuaisten denervaatioleikkauksia, koska -AR:n aktivointi JG-soluissa sympaattisen hermoston kautta on tärkein reitti stimuloida reniinin eritystä vuorokaudessa2. Jälleen havaitsimme, että interventio tukahduttivertapainevaihtelua. Nämä tulokset ovat sopusoinnussa mallimme kanssa, jonka mukaan puutteet -AR-vasteessa ja reniinin erittymisessä ovat vastuussaverenpainevaihtelu Trpmdl/l; Kuusi{0}}Cre-hiirtä.

Testasimme myös ravinnon magnesiumpitoisuuden lisäämisen vaikutusta. Tätä tarkoitusta varten villityypin hiirille annettiin runsaasti Mg-ruokaa, joka sisälsi 0,6 prosenttia (normaali ruokavalio:0,3 prosenttia magnesiumia) 1 kuukauden ajan. Kuten odotettiin, näillä hiirillä oli kohonneita veren Mg-tasoja. Sitten tarkistimme ilmaisutasonTRPM6DCT:ssä; se väheni rajusti ruokkimalla korkea-Mg-ruokavaliota, ja sen laajuus väheniTRPM6ilmentyminen oli suurempi kuin munuaisten Cnnm2-ablaatio. Kun mittasimmeverenpainenäissä hiirissä havaitsimme, että korkea-Mg-ruokavaliolla ruokitut hiiret olivat huomattavasti pienempiävertapainevaihtelua kuinTrpm6-puutteelliset hiiret, mikä on yhdenmukainen käsityksemme kanssa, että munuaistenTRPM6on tärkeä vuorokaudelleverenpainevaihtelua.

Taulukko 1 Geenit, jotka olivat ylös- tai alasäädeltyjä Cnnm2flfl/flfl:n munuaisissa; Kuusi2-Cre-hiirtä.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitimme sen tärkeydenTRPM6 (ohimenevä reseptoripotentiaali, melastatiiniin liittyvä 6)asetuksessaverenpaine. Erityisesti näytämme vuorokausivaihtelun lähes täydellisen katoamisenverenpainemunuaisspesifisestiTrpm6- puutteelliset hiiret. Havaitsimme myös, että reniinin, verenpainetta ohjaavan avainhormonin, eritys lakkasi vakavastiTrpm6-puutteiset hiiret, mikä on yhdenmukainen havaitun kanssaverenpainefenotyyppi. Useat raportit ovat osoittaneet, että TRPM7, toinen Mg2 plus -läpäisevä kanava, joka on hyvin samanlainen kuinTRPM6, vaikuttaa myös verenpaineeseen37,38. TRPM7 estää lisääntymisenverenpaineAngiotensiini II:n antamisen jälkeen suppressoimalla verisuonten endoteelisolujen vastetta angiotensiini II37:lle. Päinvastoin, äskettäin raportoitiin, että TRPM7 helpottaa myös kohoamistaverenpainekun leptiiniä annettiin välittämällä Mg2:ta plus sisäänvirtausta kaulavaltimon soluihin38. Siten TRPM7:n rooli inverenpainesääntely on epäselvä. Koska munuaiset eivät kuitenkaan vaikuttaneet TRPM7:n ilmentymistasoon munuaisissaTrpm6ablaatio (täydentävä kuva 5), ​​näyttää siltä, ​​että TRPM7 ei ole suoraan mukana tässä tutkimuksessa havaittuissa fenotyypeissä.

Kuten havaittiin Cnnm{0}}puutteellisilla hiirillä,verenpainearvot pienenivätTrpm6-puutteelliset hiiret (kuvio 2)14. On kuitenkin huomattava, että näiden hiirten välillä oli selvä ero. Cnnm2-häiriöt yleensä vähenevätverenpaine, mutta vuorokausivaihtelu oli silti selvästi havaittavissa. Sitä vastoin tämä vaihtelu katosiTrpm6- puutteelliset hiiret. Tällainen laadullinen ero on myös yhdenmukainen havaintomme kanssa, että reniinin vuorokausivaihtelu säilyi Cnnm2--puutteellisissa hiirissä (täydentävä kuva 9). On huomattava, että sekä CNNM2 ettäTRPM6uskotaan olevan tärkeitä munuaisen Mg2:n plus uudelleenabsorptiolle välittämällä vektoriaalista Mg2:ta plus kuljetusta DCT:n kautta, ja todellakin hiirillä, joilla oli puutos jompikumpi geeni, oli identtinen munuaisten Mg2 plus -hävikkifenotyyppi (kuvio 1 ja viite 39). Laadullinen eroverenpainefenotyyppi Cnnm{0}}jaTrpm6-puutteelliset hiiret viittaavat siihen, että Mg2 plus kuljetus DCT:ssä, joka on näiden kahden molekyylin yhteinen tehtävä, ei ole suoraan mukana vuorokausivaihtelussa.verenpaineja reniinin eritystä, mikä viittaa siihen, että CNNM{0}}riippumaton rooliTRPM6on näiden kiehtovien fenotyyppien taustalla.

Useat mekanismit toimivat stimuloimaan reniinin eritystä JG-soluista ylläpitämäänverenpaine. Niiden joukossa munuaisten sympaattisten hermosolujen syötteen katsotaan olevan päärooli lisääntymisessä.verenpainevuorokausivaihtelun aktiivisen ajanjakson aikana32. Nämä hermosolut erittävät noradrenaliinia, joka sitoutuu ja aktivoi -AR:n JG-soluissa stimuloidakseen cAMP-tuotantoa, mikä lopulta johtaa reniinin erittymiseen1732. Kokeissamme käyttämällä munuaisviipaleita, jotka on saatuTrpm6- Puutteellisilla hiirillä, stimulaatio isoproterenolilla, -AR-agonistilla, ei osoittanut vaikutusta reniinin eritykseen, kun taas stimulaatio PGE2:lla tai db-cAMP:llä lisäsi tehokkaasti reniinin eritystä (kuvio 4). Macula densa erittää PGE2:ta vasteena virtsan alhaisille Cl-tasoille, ja se aktivoi EP2- ja EP4-reseptoreita JG-soluissa, mikä, kuten -AR-aktivaatio, lopulta stimuloi cAMP-tuotantoa40. Siksi nämä tulokset viittaavat siihen, että -AR-signalointi kumotaan selektiivisesti JG-soluissaTrpm6-puutteiset hiiret vaikuttamatta alavirran cAMP-välitteiseen signalointireittiin. Johdonmukaisesti hiiren munuaisleikkeiden immunofluoresenssi ja eristettyjen JG-solujen immunoblottaus paljasti, että -AR-ilmentyminen väheni merkittävästi JG-soluissaTrpm6-puutteiset hiiret (kuvio 5). Tällaisen vähentyneen -AR:n ilmentymisen pitäisi tehdä JG-soluista kyvyttömiä erittämään reniiniä vasteena sympaattiseen hermostimulaatioon aktiivisen jakson aikana, mikä eliminoi veren reniinitason vuorokausivaihtelun javerenpaine. On huomattava, että on olemassa tutkimus, jossa käytettiin 1/ 2-AR knockout -hiiriä, jotka osoittivat vähentyneen vuorokausiarvonverenpainevariaatio kuinTrpm6- puutteelliset hiiret41. He katsoivat sen johtuvan heikentyneestä liikkumisaktiivisuudesta, mutta on edelleen mahdollista, että reniiniaktiivisuuden vuorokausivaihtelut vähentävät vuorokausivaihtelua.verenpainee. Vaihtoehtoisesti niiden hiirten epätavallinen tausta (C57BL6/J:n, 129:n ja VFB:n sekatausta; käytimme puhdasta C57BL6/taustaa) saattaa peittää -AR:n vaikutuksenverenpainevaihtelu; geneettiset taustat ovat kriittisiä vuorokaudelleverenpainevaihtelu 42.

cistanche-kehonrakennus

Kuinka menetysTRPM6 (ohimenevä reseptoripotentiaali, melastatiiniin liittyvä 6)DCT-soluissa johtaa alentuneeseen -AR-ilmentymiseen JG-soluissa, on pysynyt vaikeasti havaittavissa. Kokeet, joissa käytettiin muun tyyppisiä soluja, ovat osoittaneet, että -AR-ilmentymistä säätelevät erilaiset molekyylit, joiden tiedetään välittävän solujen välistä signalointia: Glukokortikoidien lisääminen verisuonista johdetun solulinjan DDT1 MF-2 viljelyväliaineeseen lisää -AR-ilmentymistä43. Lisäksi raportoitiin, että typpioksidi (NO) tukahdutti -AR:n hajoamista sydänsoluissa GRK24:n S-nitrosylaation kautta. Näistä molekyyleistä on huomionarvoista, että NO:ta erittyy munuaisten makula densa -soluista, mikä stimuloi JG-soluja parakriinisella tavalla lisäämään reniinin eritystä45. Vaikka nNOS:n, NO:ta tuottavan entsyymin, ilmentyminen munuaisissa rajoittuu makula densa -soluihin, ne ovat suorassa kosketuksessa DCT-soluihin, jotka ovat munuaistiehyen seuraava segmentti6. Näin ollen on mahdollista, ettäTrpm6-puutos DCT-soluissa johtaa alentuneeseen -AR-ilmentymiseen JG-soluissa vaikuttamalla NO:n tuotantoon tai vapautumiseen viereisistä makula densa -soluista.

Tiedetään, että JG-solut kommunikoivat myös muiden solujen kanssa muodostamalla aukkoliitoksia ympäröivien solujen, kuten mesangiaalisolujen, kanssa ja vastaanottavat Ca2 plus:ta reniinin erityksen tukahduttamiseksi7. Vaikka JG-solut ja DCT-solut eivät ole suoraan yhteydessä toisiinsa, ne sijaitsevat silti lähekkäin (viite 46 ja kuva 3), ja on mahdollista, että nämä solut käyttävät aukkoliitosviestintää välissä olevien solujen, kuten mesangiaalisolujen, kautta; kaikkien kolmen solutyypin kerrotaan ilmentävän Cx3747,48:aa, konneksiini-isoformia, joka oligomeroituu ja muodostaa aukkoliitoksia. Lisäanalyysi voi tunnistaa molekyylin ja reitin, joka on vastuussa solujenvälisestä signaloinnista DCT- ja JG-solujen välillä, mikä on tärkeää, jotta voidaan paljastaa häiriintyneen vuorokausivaihtelun yleismekanismi.verenpainevaihteluaTrpm6-puute.

SisäänTrpm6-puutoshiirillä, reniinin lisäksi myös noradrenaliinin veren vuorokausivaihtelu katosi. Reniini-angiotensiinijärjestelmän aktivoituminen stimuloi noradrenaliinin vapautumista verenkiertoon29,30, ja näin ollen vaikuttaa järkevältä, ettäTrpm6 (ohimenevä reseptoripotentiaali, melastatiiniin liittyvä 6)veren reniini- ja noradrenaliinitasojen ablaatio oli samanlainen. Koska noradrenaliini vaikuttaa myös JG-solujen -AR:iin reniinin erittymisen edistämiseksi, näiden kahden molekyylin oletetaan muodostavan positiivisen palautesilmukan, joka stimuloi toistensa eritystä. On kuitenkin huomattava, että isoproterenolin antokokeiden tulokset osoittavat eksplisiittisesti reniinin erittymisen puutteen (kuvio 4), ja näin ollen se näyttää olevan ensisijainen syy sekä reniinin että noradrenaliinin vuorokausivaihtelun häviämiseen.

Tähän mennessä on kehitetty useita tehokkaita lääkkeitä, joita on käytetty hypertensiivisten potilaiden hoitoon. Merkittävä osa potilaista osoittaa kuitenkin vastustuskykyä tavanomaisille hoidoille, joissa käytetään yhdistelmää merkittäviä verenpainetta alentavia lääkkeitä, joilla on eri toimintamekanismit4. Munuaisten sympaattisten hermosolujen kirurginen denervaatio endovaskulaarisia katetria käyttäen on suoritettu kokeessa tällaisen resistentin hypertension hoitamiseksi50. Sen käytännön tehokkuus parantaaverenpainevalvonta on ollut kiistanalainen51,52, mutta äskettäin julkaistut tutkimukset ovat osoittaneet merkittävän vähenemisenverenpaineverrattuna valekontrolliin53,54. On myös ristiriitaisia ​​tuloksia munuaisten denervaation vaikutuksesta vuorokausivaihteluunverenpaine. Jotkut raportit osoittivat, että laajuusverenpainemunuaisten denervaation aiheuttama väheneminen oli suurempi aktiivisina jaksoina53, mutta toiset eivät raportoineet muutosta vuorokausivaihtelussaverenpaine55,56. Laboratorio-eläimillä tehdyssä analyysissä hiiriä vastaan ​​tehdyt munuaisten denervaatiotoimenpiteet tukahduttivat vuorokausivaihtelunverenpaine(Kuva 6). Samanlaisia ​​leikkauksia tehtiin myös rotille, mutta jopa kontrollivillityypin rotilla ei ole juuri mitään vuorokausioireitaverenpaineEnsinnäkin vaihtelu57,58, mikä vaikeuttaa toimenpiteen vaikutuksen arvioimista. Lisää tutkimuksia tarvitaan selventämään munuaisten denervaation vaikutusta vuorokausivaihteluunverenpainevaihtelua, mikä auttaisi meitä myös ymmärtämään yksityiskohtaisemman mekanisminverenpainesäätelyhäiriöTrpm6-puute.

Telemetriset mittauksetverenpaine, syke ja liikuntatoiminta. Telemetriset mittauksetverenpainesuoritettiin seuraavasti4.Verenpaineanturit (TAl1PA-C10, Data Sciences International) asetettiin kirurgisesti 2- - 3-kuukauden ikäisten hiirten vasempaan yhteiseen kaulavaltimoon nukutuksessa (intraperitoneaalisesti 0,3 mg/ kg medetomidiinia, 4 mg/kg midatsolaamia ja 5 mg/kg butorfanolia). 3 viikon toipumisen jälkeen systolinen ja diastolinenverenpainearvot tallennettiin 2-min ajoitetulla näytteenotolla 60 minuutin välein käyttämällä Dataquest ART -ohjelmistoa (Data Sciences International). Tietueita saatiin vähintään viideltä peräkkäiseltä päivältä, ja samaan aikaan joka päivä tehtyjen mittausten keskiarvot määritettiin kullekin hiirelle ja niitä käytettiin lisätilastollisiin analyyseihin, lukuun ottamatta lisäkuvaa 4. Nakamori et al.68:n perusteella munuaisten denervaatio tehtiin 2 viikkoa ennen asettamistaverenpainemuuntimet seuraavasti. Munuaiset paljastettiin vatsan viillolla ja munuaissuonien ympärillä oleva sidekudos leikattiin. Sitten munuaissuonet upotettiin 95-prosenttiseen etanoliin 2 minuutiksi ja sen jälkeen PBS:ään 2 minuutiksi. Valeleikkaus suoritettiin käyttämällä vastaavaa menettelyä ilman etanoliin upottamista. Aliskireenia annettiin 25 mg/kg/vrk upottamalla ihon alle osmoottinen pumppu (1004, ALZET), ja tallennus aloitettiin pumpun käyttöönoton jälkeisestä päivästä. Magnesiumilisänä hiirille annettiin 0,6 prosenttia magnesiumia sisältävää ravintoa (CLEA Japan) 1 kuukauden ajan ennenverenpainemittaus.

Syke mitattiin samalla radiotelemetriajärjestelmällä, paitsi että tallennus suoritettiin 30-s ajoitetulla näytteenotolla joka minuutti, ja jatkoanalyysiin käytettiin yhtä mittausta.

Liikuntaaktiivisuutta arvioitiin samalla radiotelemetrialla, tarkkailemalla eläimen liikkumisesta johtuvia muutoksia signaalin voimakkuudessa. Tässä tapauksessa anturit asetettiin kirurgisesti oikean kyljen ihonalaiseen tilaan. Tallenteet tehtiin samoilla aikaväleillä kuin edellä on kuvattu.

cistanche-kehonrakennus

Viitteet

1. Giles, TDCirkadiaaninen rytmiverenpaineja suhde sydän- ja verisuonitapahtumiin.J. Hypertensistä. 24, S11-S16 (2006).

2. Smolensky, MH, Portaluppi, F.& Hermida, RC inVerenpaineMonitoring in Cardiovascular Medicine and Therapeutics, 3rd EDT. (toim. White, WB) Osa II, Ch.6, 105-128(Springer, 2016).

3. Witteman, JCet ai. Prospektiivinen tutkimus ravitsemuksellisista tekijöistä ja verenpaineesta yhdysvaltalaisten naisten keskuudessa. Levikki 80, 1320-1327(1989).

4. Ascherio, A. et ai. Prospektiivinen tutkimus ravitsemuksellisista tekijöistä ja verenpaineesta yhdysvaltalaisten miesten keskuudessa. Levikki 86,1475-1484(1992).

5. Ascherio, A. et ai. Prospektiivinen tutkimus ravitsemuksellisista tekijöistä,verenpaineja kohonnut verenpaine yhdysvaltalaisten naisten keskuudessa. Hypertension 27,1065-1072(1996).

merkintä:yllä oleva ei ole täydellinen viiteluettelo