Proteiinista riippumaton fosfaatin rooli kroonisen munuaissairauden etenemisessä

Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com

Irene Faria Duayer¹ et ai

Abstrakti:Useat tekijät vaikuttavat siihenmunuaisten toimintaCKD-potilaiden väheneminen, ja fosfaattipitoisuuden rooli ruokavaliossa on edelleen keskustelunaihe. Tämän tutkimuksen tarkoituksena on analysoida mekanismia, jolla fosfaatti, proteiinista riippumaton, liittyy kroonisen taudin etenemiseen. Aikuisille Munich-Wistar-rotille tehtiin 5/6 nefrektomia (Nx), ruokittiin vähäproteiinisella ruokavaliolla ja jaettiin kahteen ryhmään. Vain fosfaattipitoisuudet (vähäfosfaatti, LoP, 0,2 prosenttia ; korkea fosfaatti, HiP, 0,95 prosenttia ) erottivat ruokavaliot. Kuudenkymmenen päivän kuluttua biokemialliset parametrit jamunuainenhistologia analysoitiin. HiP-ryhmällä oli huonompi munuaisten toiminta, korkeammat PTH-, FGF-23-tasot ja fosfaatin osaeritys. Munuaiskudoksen histologisessa analyysissä ne osoittivat myös suuremman prosenttiosuuden interstitiaalista fibroosia, -aktiinin, PCNA:n jamunuaistenmakrofagien tunkeutuminen. LoP-ryhmässä bekliinin-1 ilmentyminen oli korkeampi munuaistiehyissä, mikä on autofagisen ulosvirtauksen merkkiaine verrattuna HiP-ryhmään. Havaintomme korostavat fosfaatin vaikutusta fosfaatin induktiossamunuaineninterstitiaalinen tulehdus ja fibroosi, mikä edistää munuaissairauden etenemistä. Fosfaatin mahdollinen vaikutus munuaissolujen autofagiamekanismin häiriöihin vaatii lisätutkimuksia kliinisillä tutkimuksilla.

Avainsanat:fosfaatti;ruokavalio; CKDeteneminen;munuaistenfibroosi; autofagia;apoptoosi

Keskeinen panos:Munuaisten suojamekanismit rajoittamalla fosfaattiruokavaliota ovat vielä selvittämättä. Tässä tutkimuksessa fosfaatin ylikuormitus vaikutti CKD:n etenemiseen aktivoimalla tulehdusreittejä ja indusoimallamunuaineninterstitiaalinen fibroosi. Hyperfosfatemian vaikutus munuaissolujen apoptoosiin ja autofagiseen stipendiin vaatii lisätutkimuksia.

Cistanche tubulosa ehkäisee munuaissairauksia, napsauta tästä saadaksesi näytteen

1. Esittely

Krooninenmunuainensairaus (CKD) pidetään kansanterveysongelmana. Sen esiintyvyys lisääntyy iän myötä ja vaihtelee 11-13 prosentin välillä maailmanlaajuisesti [1]. Vaikka CKD on yleensä peruuttamaton tila, taudin etenemisen hidastamiseen voidaan käyttää useita lähestymistapoja, kuten verenpaineen, dyslipidemian ja hyperglykemian hallintaa, angiotensiinikonvertaasientsyymin estäjien käyttöä ja vähäproteiinista ruokavaliota [2–7] . Näistä strategioista vähäproteiininen ruokavalio on suurin kiistanalainen ehdotus viivästymiseenmunuainentoiminta heikkenee sen vaatimustenmukaisuudesta, turvallisuudesta ja tehokkuudesta liittyvistä huolenaiheista. Yksimielisyyden puute proteiinin vähentämisen eduista ruokavaliossa perustuu proteiini- ja fosfaattipitoisuuden päällekkäisyyteen ruokavaliossa. Koska proteiinilähteet sisältävät runsaasti fosfaattia, proteiinin saannin vähentämistä suositellaan fosfaatin rajoittamisen saavuttamiseksi. On mahdollista rajoittaa proteiinia rajoittamatta fosfaattia, vaikka päinvastoin on vaikeaa.

Kokeellisissa tutkimuksissa vähäproteiinisen ruokavalion vaikutus suojasi CKD-malleja glomerulusvaurioilta ja proteinurialta [8], mikä edisti glomerulusten suodatusnopeuden parempaa säilymistä [9]. On huomattava, että ravinnon proteiini ja fosfaatti korreloivat voimakkaasti. Siksi, vaikka jotkin kokeelliset tutkimukset ovat keskittyneet arvioimaan proteiinirajoituksen eristettyä vaikutusta, ne ovat saattaneet myös olla puolueellisia tahattoman fosfaattirajoituksen vuoksi. Toisaalta fosfaattipitoisen ruokavalion yksilöllinen vaikutus kroonisen munuaisten vajaatoiminnan kehittymiseen on osoitettu selvästi [10,11]. Runsaasti fosfaattia sisältävän ruokavalion osoitettiin aiheuttavan lisää interstitiaaliamunuainenfibroosi ja tubulusatrofia, minimaalisella glomeruloskleroosilla, ureemisilla rotilla. Mielenkiintoista on, että vahinko tasaantui fosfaattirajoituksen jälkeen [12]. On huomattava, että ruokavalion proteiinipitoisuutta ei mainittu tässä tutkimuksessa.

Kliinisessä skenaariossa vähäproteiininen ruokavalio vähensi ureemisten toksiinien pitoisuutta ja säilytti munuaisten jäännöstoiminnan jopa siirryttäessä konservatiivisesta hoidosta asteittaiseen dialyysihoitoon [13].RuokavalioproteiiniaViimeaikaisessa meta-analyysissä [14] on myös viivästynyt CKD:n eteneminen. Koska proteiinirajoitus kuitenkin korreloi seerumin alhaisempien fosfaattitasojen kanssa, tämä ruokavalion edullinen vaikutus olisi voitu selittää osittain fosfaattirajoituksella. Tähän mennessä suurin prospektiivinen tutkimus, MDRD [15], osoitti vain pienen hyödyn vähäproteiinista ruokavaliota potilailla, joilla oli kohtalainen munuaisten vajaatoiminta, kun taas munuaissairauden eteneminen ei vaikuttanut potilailla, joilla oli vaikea munuaisten vajaatoiminta. Tästä huolimatta ruokavalion fosfaattipitoisuutta ei käsitelty tässä tutkimuksessa eikä sen yksittäisen vaikutuksen hidastamiseen.CKDeteneminen jää tuntemattomaksi.

Tiedetään, että fosfaatti voi alentaa munuaisten ja verenkierrossa kiertävää Klothoa [16], ikääntymistä estävää proteiinia, joka osallistuu sytosuojaukseen ja antifibroosiin ja jolla on antioksidanttisia ja antiapoptoottisia vaikutuksia [17]. Lisäksi Klothon puutteesta johtuva viallinen autofagia munuaissoluissa on jo osoitettu [18]. Autofagia on katabolinen prosessi, jolla on kriittisiä toimintoja solujen homeostaasin ylläpitämisessä ja solujen elinkelpoisuuden säilyttämisessä stressiolosuhteissa. Jotkut todisteet viittaavat siihen, että autofagian ja CKD:n etenemisen välillä on yhteys eri reittien kautta, mukaan lukien TGF-signalointi [19], joka on voimakas fibrogeeninen tekijä munuaisfibroosin kehittymiselle. TGF- vaikuttaa useisiin biologisiin prosesseihin, sääteleen solujen lisääntymistä ja erilaistumista, apoptoosia ja toimii sitoutumalla spesifisiin transmembraanireseptoreihin, jotka indusoivat SMAD-proteiinien välittämää solunsisäistä signalointia [20]. Apoptoosi on ohjelmoidun solukuoleman mekanismi, joka eroaa nekroosista. Fosfaattia on kuvattu apoptoosin välittäjänä endoteelisolujen [21], osteoblastisten [22] ja peritoneaalisten mesotelisolujen [23] kokeellisissa malleissa. On näyttöä apoptoottisen solukuoleman osallistumisesta taudin etenemiseenmunuainenvaurio [24], mutta fosfaatin vaikutusta munuaissolujen apoptoosiin ei ole vielä selvitetty.

Koska mekanismia, jolla runsaasti fosfaattia sisältävä ruokavalio nopeuttaa kroonisen munuaistautien etenemistä, ei ole vielä täysin selvitetty, oletimme, että se saattaa liittyä häiriöttömään autofagiseen kaveriin. Siksi tässä tutkimuksessa arvioimme kahta München-Wistar-rottaryhmää niiden ruokavalion fosfaattipitoisuuden mukaan (matala 0,2 prosenttia vs. korkea0,95 prosenttia) ja testasimme vähäfosfaattinen ruokavaliomunuaisethistologiset ja immunohistokemialliset muutokset, mukaan lukien autofagiamarkkeri, beclin{0}}.

2. Tulokset

Hemodynaamiset, morfologiset ja biokemialliset parametrit, jotka on saatu matalan (LoP) ja korkean fosfaatin (HiP) ruokavalion (HiP) ryhmistä, on annettu taulukossa 1. Kuten odotettiin, 5/6- nefrektomia aiheutti kreatiniinipuhdistuman vähenemisen ja lisääntymisen seerumin ureassa ja kreatiniinissa molemmissa ryhmissä. HiP-ryhmän eläimillä oli heikompi munuaisten toiminta, mistä on osoituksena korkeampi kreatiniini ja pienempi kreatiniinipuhdistuma; niillä oli myös pienempi hematokriitti ja pienempi lopullinen paino. HiP-ryhmässä havaittiin lisääntynyttä seerumin ja fosfaatin erittymisen sekä lisäkilpirauhashormonin (PTH) ja fibroblastien kasvutekijän -23 (FGF-23) määrä. On huomattava, että kaudaalinen paine, alkupaino ja albumiinin erittyminen virtsaan olivat samanlaisia ​​ryhmien välillä.

Histologiset löydökset on esitetty kuvissa 1–3. Glomeruloskleroosia (GS) havaittiin tuskin molemmissa ryhmissä. Interstitiaalisen fibroosin prosenttiosuus oli kuitenkin merkittävästi korkeampi rotilla HiP-ryhmässä. Vastaavasti näillä eläimillä oli myös suurempi prosenttiosuus - sileän lihaksen aktiinilla värjäytyneestä alueesta ja suurempi makrofagien munuaisinfiltraatio, arvioituna ED-1-ilmentymällä, kuten taulukossa 2 esitetään. Fosforyloitu SMAD (p-SMAD) -ilmentyminen, TGF-beeta-reitin aktivaation merkkiaine, ei eronnut ryhmien välillä.

Proliferatiivisten solujen ydinantigeeni (PCNA) -positiiviset solut olivat vallitsevia HiP-ryhmässä, mikä viittaa siihen, että fosfaatin ylikuormitus edisti munuaissolujen lisääntymistä. Sitä vastoin apoptoottisten solujen määrällä oli taipumus olla suurempi LoP-ryhmässä. Samoin beclin-1-positiiviset solut olivat merkittävästi korkeampia tubulointerstitiaalisissa vaurioissa LoP-ryhmässä, mikä viittaa korkeamman fosfaatin mahdolliseen vaikutukseen regeneratiivisen autofagisen prosessin estämisessä.munuainenkudosta.

3. Keskustelu

Tässä kokeellisessa tutkimuksessa tutkittiin, onko ruokavalion fosfaattirajoitus tehokas askel kroonisen taudin etenemisen hidastamisessa riippumatta samanaikaisesta ruokavalion proteiinirajoituksesta. Tutkimme eri fosfaattipitoisuuksien ({{0}},2 vs. 0,95 prosenttia) ruokavalioiden vaikutusta 5/6-nefrektomia-eläinmallissa, jossa kaikki eläimet saivat vähäproteiinista ruokavaliota. (12 prosenttia). Tuloksemme osoittivat, että runsasfosfaattinen ruokavalio liittyi hyperfosfatemiaan huolimatta PTH:n, FGF-23:n ja sen seurauksena fosfaatin murtoerityksen lisääntymisestä. Lisäksi HiP aiheutti munuaisten toiminnan heikkenemistä ja interstitiaalisen fibroosin lisääntymistä, mikä liittyi korkeampaan aktiiniekspressioon, makrofagien infiltraatioon ja solujen lisääntymiseen sekä autofagian estoon.

Meta-analyysi 12 kohorttitutkimuksesta, joihin osallistui 25 546 kroonista kroonista sairautta ei-dialyysipotilasta, osoitti riippumattoman yhteyden seerumin fosfaattitasojen välillä.munuainenepäonnistuminen ja kuolleisuus [25]. Lisäksi retrospektiivinen kohorttitutkimus, johon osallistui 13 772 dialyysipotilasta, on paljastanut yhteyden hyperfosfatemian ja muiden CKD-mineraali- ja luusairauden poikkeavuuksien välillä ja jäännösarvojen jyrkempään laskuun.munuainentoiminto [26]. Mekanismia, jolla fosfaattirajoitus viivästyttää CKD:n etenemistä, ei ole vielä selvitetty. Kokeellisessa tutkimuksessa osoitimme, että fosfaatilla rikastettu ruokavalio liittyi heikompaan munuaisten toimintaan verrattuna vähäfosfaattiseen ruokavalioon Wistar-rotilla, joille tehtiin lisäkilpirauhasen poisto ja 5/6-nefrektomia käyttämällä kiinteää lisäkilpirauhasta. hormoni (PTH) -lisä [11]. Kusano et ai. [10] osoitti, että munuaisten toiminnan suojaaminen liittyi vähäfosfaattiseen (0,3 prosenttia) ruokavalioon ureemisten rottien ruokavalion proteiinipitoisuudesta riippumatta. Rotat, jotka käyttivät normaalia fosfaattiruokavaliota (0,5 prosenttia), saivat nämä edut kuitenkin vain, jos niitä ruokittiin erittäin vähäproteiiniisella (8,4 prosenttia) ruokavaliolla. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että ravinnon fosfaatin rooli saattaa olla tehokkaampi kuin ravinnon proteiini. Kumpikaan edellä mainituista tutkimuksista ei kuitenkaan yrittänyt tutkia mahdollisia reittejä, jotka voisivat olla osallisena fosfaattiin liittyvissä munuaisvaurioissa.

Fosfaattien ylikuormituksen vaikutus CKD:n etenemiseen on ollut useiden tutkimusten kohteena. Labels et ai. ehdotti tätä mahdollisuutta ensin eläinmallissa, mutta ravinnon [27] proteiinia ei valvottu, mikä mahdollisesti peitti fosfaatin eristetyn vaikutuksen. Fosfaatista riippumattoman rajoituksen oletettu hyöty CKD-skenaariossa proteiinirajoituksen sijaan on erittäin kiinnostava, koska riski seerumin fosfaatin hallinnasta yhdessä rajoitetun proteiinin saannin kanssa voi johtaa aliravitsemukseen ja aiheuttaa korkeampaa kuolleisuutta.

Fosfaattiruokavalion pitoisuus ei välttämättä määritä seerumin fosfaattipitoisuutta kroonisesta munuaista kärsivillä potilailla [28], mikä korostaa ruokavalion rajoittamisen tärkeyttä riippumatta tämän alkuaineen seerumipitoisuudesta. Fosfaatin patologiset vaikutukset luihin ja sydän- ja verisuonijärjestelmään motivoivat interventioita hyperfosfatemian hoitoon. Kliinisessä käytännössä interventiot fosfaattipitoisuuden alentamiseksi koostuvat ruokavaliorajoituksista ja fosfaatin sitojista. Vaikka tämän lähestymistavan hyödyt kliinisissä päätepisteissä olivat kyseenalaisia ​​pienikokoisessa tutkimuksessa [29], kun tiedettiin, että fosfaattiylimäärä on vastuussa PTH:n ja FGF:n-23 ylituotannosta, on järkevää säilyttää fosfaattipitoisuudet mahdollisimman alhaiset kroonista munuaistautia sairastavilla potilailla [30].

Vähäproteiininen ruokavalio indusoi fosfaatin alhaisen biologisen hyötyosuuden ja alentaa seerumin FGF-23 [31,32]-arvoa, joka on natriumista riippuvaisen fosfaatin uudelleenabsorption välittäjä munuaistiehyissä. Tämä viittaa siihen, että fosfaatin säätelymekanismi pitkälle edenneessä kroonisessa munuaissairaudessa voi jollain tapaa vaikuttaa fosfaatin saannilla täysin riippumattomasti proteiinipitoisuudesta ruokavaliossa. Tästä syystä olemme arvioineet fosfaattiruokavalion vaikutuksen CKD:n etenemiseen 5/6-nefrektomiamallissa. Aiempi kokeellinen tutkimus on jo osoittanut, että fosfaatti voi muuttaa antiproteinuurista vastetta erittäin vähäproteiiniselle ruokavaliolle (0,3 g/kg), mikä osoittaa korrelaation seerumin fosfaattitasojen ja fosfaturian välillä antiproteinuurisen vasteen kanssa rajoitettu proteiiniruokavalio, riippumaton munuaisten toiminnasta [33]. Crossover-tutkimuksessa, johon osallistui 11 kroonista munuaistautia (eGFR 30–55 ml/min/m2) sairastavaa potilasta, seerumin fosfaatin vuorokausirytmiä muutettiin runsaasti fosfaattia sisältävällä ruokavaliolla, mikä ei selittynyt virtsan fosfaatin erittymisellä, PTH:lla tai FGF:llä. -23 [34]. Tämä tulos vahvistaa fosfaattiruokavalion rajoittamisen merkitystä CKD-potilailla itsenäisenä terapeuttisena kohteena.

Hemodynaaminen tila ei näytä liittyvän munuaisten toiminnan heikkenemiseen HiP-ryhmässä, koska valtimopaine oli samanlainen molemmissa ryhmissä. Lisäksi emme löytäneet mallissamme merkittäviä munuaiskerästen vaurioita, mikä voisi selittää proteiinirajoituksella. Huomasimme kuitenkin enemmän interstitiaalista fibroosia HiP-ruokavalioryhmässä.

Interstitiaalinen fibroosi korreloi hyvin ihmisten ja rottien munuaisten toiminnan menetyksen kanssa.

Aikaisempi tutkimus on liittänyt peptidyyliprolyyli-isomeraasin Pin 1:n kautta aiheuttaman munuaisfibroosin kehittymisen peptidyyliprolyyli-isomeraasi Pin 1:n kautta [35], kun taas muut tutkimukset ovat osoittaneet Klotho-puutoksen haitallisen roolinmunuainenkudosfibroosi [36,37]. Klothon geneettinen deleetio kokeellisissa malleissa aiheuttaa ikääntymistä, kasvun hidastumista ja kalkkiutumia [38]. FGF23-Klotho-signalointi estää munuaisfosfaatin reabsorptiota. CKD-asetuksissa Klotho-ekspressio vähenee munuaistiehyissä [39]. Lisäksi fosfaattirikas ruokavalio on pahentanut klothon puutetta iskemia-reperfuusio akuutin munuaisvaurion mallissa ja edistänyt entisestään lisääntynyttämunuainenkudosfibroosi, joka kiihdyttää CKD:n etenemistä [18]. Fosfaattiruokavalion vaikutus Klothon munuaisekspressioon osoitettiin jo hiirimalleissa [40]. Mahdollisesti muiden reittien ohella fosfaatin ylikuormitus pahentaa munuaisten toimintaa moduloimalla Klothon ekspressiota tubulussoluissa; sitä pitäisi tutkia tarkemmin tulevissa tutkimuksissa.

Apoptoosia ja fibroosia välittävät sytokiinit, kuten TGF- [41,42]. Olemme kuvanneet sekundaarisen hyperparatyreoosin ja siitä johtuvan korkeamman TGF-ekspression yhteyden sydämen uusiutumisprosessiin [43]. Oletetaan, että PTH-aktivaation ja TGF-signaloinnin välillä on yhteys, mikä stimuloi fibroblastien lisääntymistä, kollageenisynteesiä ja fibroosia. On jopa kokeellista näyttöä TGF- ja PTH-reseptorien integroidusta vaikutuksesta luusoluihin, mikä säätelee luun uudelleenmuotoilun signalointia [44]. TGF-/Smad-signaloinnin roolimunuainensairaus on jo kuvattu. TGF- sitoo kalvon läpäisevää reseptoria, laukaisee Smads-proteiinien fosforylaation ja edistää niiden siirtymistä ytimeen transkriptiovaikutusten aikaansaamiseksi. Siksi ne ovat välttämättömiä TGF-perheen jäsenten signaalinsiirrolle. Itse asiassa Smad2- ja Smad3-proteiinien yli-ilmentyminen fibroottisessa munuaisissa eläinmalleissa, joilla on krooninen munuainen, on jo osoitettu [45]. Mielenkiintoista on, että on olemassa todisteita Smadsin aktivoinnista muiden TGF-:sta riippumattomien välittäjien toimesta, kuten edistyneen glykaation lopputuotteet [46] ja angiotensiini II [47]. Koska PTH:n korvaaminen ei kokeellisessa mallissa vaikuttanut hyperfosfatemian vaikutukseen kroonisen taudin etenemiseen [11], mietimme, olisiko fosfaatilla suoraa roolia munuaisten Smad-signalointiin. Mallissamme hyperfosfatemialla ei ollut vaikutusta p-Smadin ilmentymiseen munuaistiehyissä.

Tämä ei kuitenkaan sulje pois mahdollisuutta TGF-reitin aktivaatioon Smadsin fosforylaatiosta riippumatta. Lisätutkimuksia tarvitaan tämän vaihtoehtoisen reitin tutkimiseksi.

Luukudoksen arvioinnissa fosfaatin ylikuormitus on indusoinut osteoblastin kaltaisten solujen apoptoosia [22]. Rojas et ai. osoittivat siirrettyjen potilaiden luubiopsioissa, että apoptoottisten solujen määrä oli suurempi niillä, joilla on vähän fosfaattia ja PTH:ta, sillä olisi vaikutusta osteoblastien lisääntymiseen ja apoptoosin estämiseen [48]. Tämä PTH:n estävä vaikutus luusolujen apoptoosiin on osoitettu aiemmin [49]. Luukudokseen kohdistuvien vaikutusten lisäksi apoptoottiset reitit liittyvät myös akuuttiin munuaisten vajaatoimintaan [48] ja voivat olla mahdollista välittäjänä kroonisen munuaisen taudin etenemisessä. Mallissamme havaitsimme ylivoimaisen osuuden soluista, jotka läpikäyvät apoptoosin LoP-ryhmässä, ilman tilastollista merkitystä. Nämä huomiot viittaavat heikentyneeseen apoptoosimekanismiin, jonka aiheuttaa hyperfosfatemia. Meidän on kuitenkin pidettävä mielessä, että fosfaatin yksinomaista vaikutusta ei voitu arvioidamunuainenkudosapoptoosin, kun myös eläimille on kehittynyt PTH:n ja FGF{0}} nousu.

Tässä tutkimuksessa käsittelimme toista mahdollista runsasfosfaattisen ruokavalion aiheuttamaa munuaisten vajaatoiminnan mekanismia, autofagian toimintahäiriötä, mittaamalla proteiinin beclin-1, säätelyproteiinin, jota tarvitaan autofagosomaalisen kalvon nukleaatioon [50]. Autofagia on katabolinen reitti, johon liittyy solukomponenttien hajoaminen lysosomien kautta [51,52]. Beclin-1-fosforylaatiota on pidetty autofagiaspesifisenä signaalina fosfatidyyli-inositoli-3-fosfaattikinaasikompleksin aktivoitumiselle ja rekrytoitumiselle autofagosomin biogeneesin kalvokohtiin [53]. Beclin{9}}:n kaatuminen suppressoi autofagiaa [54] ja iskemia-reperfuusio lisää sen tasoa [55]. Bekliinin- 1 väheneminen ja samanaikainen mTOR:n lisääntyminen vähentävät pahanlaatuisten solujen kasvua, mikä korostaa autofagian eloonjäämistä edistävää vaikutusta [52].

Klothon antifibroottiset vaikutukset liittyivät myös lisääntyneeseen autofagiaprosessiin, joka on reitti, jonka kautta iskeeminen vaurio heikkeni AKI-mallissa ja heikensi korkeat fosfaattitasot [18]. Kokeelliset tutkimukset ovat osoittaneet, että autofagivirta lieventää makrofagien infiltraatiota ja fosfaatin aiheuttamaa munuaisfibroosia. Lisäksi fosfaattirikas ympäristö indusoi mitofagiaa tubulussoluissa in vitro [56]. Tietomme osoittivat, että ruokavalion fosfaattipitoisuus moduloi myös bekliinin-1 ilmentymistä munuaistiehyissä in vivo. HiP-ruokavalio yhdistettiin myös lisääntyneeseen solujen lisääntymiseen ja suuntaukseen kohti alhaisempaa apoptoottista nopeutta, kuten PCNA- ja TUNEL-analyysit osoittavat. Mallissamme ei kuitenkaan ollut mahdollista tunnistaa, tapahtuiko tämä fosfaattiylimäärän suorana vaikutuksena vai hyperfosfatemian aiheuttamista poikkeavuuksista PTH- ja FGF{6}}-tasoissa. Tämä havainto on vahvistettava kliinisessä skenaariossa.

Tämän tutkimuksen keskeinen etu oli arvioida fosfaattirajoituksen vaikutusta vähäproteiinisessa ruokavaliossa CKD:n etenemiseen, mikä sisälsi sen vaikutuksen tutkimisen histologisiin malleihin ja molekyylifenotyyppeihin.munuainenkudosta. Sikäli kuin tiedämme, tämä on ensimmäinen tutkimus, joka osoittaa beclin{0}}-ilmentymän, autofagiamarkkerin, munuaistiehyissä olevien solujen muokkaamisen fosfaattiruokavaliolla in vivo. Suurin rajoitus oli mahdottomuus erottaa hyperfosfatemian vaikutusta muista CKD-MBD:hen liittyvistä poikkeavuuksista, kuten PTH:n ja FGF:n noususta-23. Emme myöskään pystyneet arvioimaan ruokavaliota, jolla on keskimääräinen fosfaattipitoisuus tai munuaisten Klotho-ekspressio. Mallimme kuitenkin toistaa tosielämän tilan, jossa HiP-ruokavalioon liittyy yleensä hyperparatyreoosi ja korkea FGF-23.

4. Johtopäätökset

Yhteenvetona tämä tutkimus antoi todisteita siitä, että fosfaattiruokavaliolla on rooli kroonisen taudin etenemisessä, mikä mahdollisesti lisää interstitiaalista fibroosia. Lisäksi fosfaattirikas ruokavalio saattaa muuttaamunuainenautofagiaprosessi. Proteiinista riippumattoman reitin tunnistaminen, jonka kautta fosfaatti pahentaa munuaisten toimintaa, voi avata tärkeän tien uusien lähestymistapojen kehittämiseen, joilla pyritään estämään tai vähentämään kroonisen taudin etenemistä kliinisissä olosuhteissa.

5. Materiaalit ja menetelmät

Tähän tutkimukseen sisällytettiin paikallisesta laitoksesta saadut aikuiset urospuoliset Munich-Wistar-rotat. Rottia pidettiin 23 ± 1 ◦C:ssa ilman kosteuden ollessa 60 ± 5 prosenttia 12:12-h valo-pimeä-jaksolla. Kaikilla eläimillä oli vapaa pääsy vesijohtoveteen, ja niille annettiin vähäproteiinista ruokavaliota (12 prosenttia proteiinia). Eläimet lopetettiin kaksi kuukautta myöhemmin, kun veri, virtsa ja munuaiskudos analysoitiin. Häntämansetin paine, kreatiniinipuhdistuma ja päivittäinen albumiinin erittyminen virtsaan määritettiin kaikista rotista. Koesuunnitelma on esitetty liitteessä A (kuva A1).

5.1. Analyyttiset tekniikat

Kuusikymmentä päivää Nx:n jälkeen eläimet nukutettiin natriumtiopentaalilla (50 mg/kg BW) ja kerättiin verinäytteitä. Seerumin kreatiniinipitoisuus määritettiin kolorimetrisellä menetelmällä. Seerumin albumiini, fosfaatti, urea, kalsium ja hematokriitti mitattiin standardimenetelmillä. PTH mitattiin ELISA:lla (Immutopics, San Clemente, CA, USA). FGF-23 mitattiin käyttämällä ELISA-sarjaa (KAINOS, Japani) valmistajan protokollan mukaisesti. Laskemme glomerulussuodatuksen kreatiniinipuhdistuman perusteella seerumin ja virtsan kreatiniinitasojen perusteella ja ilmaistuna ml/min, laskettuna kaavalla: virtsan kreatiniini (mg/dL) × virtsan stipendiaatti (ml/min)/seerumin kreatiniini (mg/dl). Virtsan albumiini määritettiin radiaalisella immunodiffuusiolla.

- kolmasosa vasemmastamunuainensulkemalla kaksi tai kolme vasemman munuaisvaltimon haaraa. Valeleikkauksille rotille tehtiin anestesia ja munuaisten pedicles manipulointi ilman munuaisten massan vähentymistä. Anestesiasta toipumisen jälkeen eläimet palautettiin alkuperäisiin häkkeihinsä, joita lämmitettiin seuraavan 24 tunnin aikana.

Fosfaatin (FEP) jakoeritys saatiin virtsan ja seerumifosfaatin (mg/dl), virtsan ja seerumin kreatiniinin (mg/dl) kautta ja ilmaistuna prosentteina seuraavalla kaavalla: (virtsa/seerumin fosfaatti)/ (virtsa/seerumi) kreatiniini) × 100.

5.2. Kokeelliset ryhmät

Eläimet jaettiin kahteen ryhmään ruokavalion fosfaattipitoisuuden mukaan, kuten alla: Vähäfosfaattinen ruokavalio (LoP): n=20; eläimet saivat TD-90016, 12 prosentin proteiinia sisältävää ruokavaliota, modifioitu 0,2 prosentin fosfaattipitoisuuteen.Ruokaa fosfaattia sisältävä ruokavalio (HiP): n=19; eläimet saivat TD-90016, 12 prosentin proteiiniruokavaliota, joka oli muunnettu 0,95 prosentin fosfaattipitoisuuteen.

5.3. Histologiset tekniikat

Jäännösmunuainenperfusoitiin in situ havaittuun MAP:iin suolaliuoksella ja sitten Duboscq-Brasil-liuoksella kiinnitystä varten. Punnituksen jälkeen kaksi keskikoronaalista munuaisviipaletta kiinnitettiin puskuroituun 4-prosenttiseen formaldehydiin. Munuaiskudos upotettiin sitten parafiiniin ja valmistettiin histomorfometriaa ja immunohistokemiaa varten, kuten aiemmin on kuvattu [57].

Kaikki morfometriset arvioinnit suoritettiin 4-µm:n paksuisissa osissa yhden ryhmien sokeutuneen tarkkailijan toimesta. Kullekin rotalle arvioitiin glomeruloskleroosin (GS) vakavuus jaksoissa, jotka oli värjätty Schiff-periodisella hapolla (PAS) antamalla jokaiselle glomerulukselle (vähintään 120 per rotta tutkittiin) pistemäärä, jolla arvioitiin kimppualueen sklerosoitunut osuus. ja GS-indeksin (GSI) johtaminen kullekin rotalle, kuten aiemmin on kuvattu [58]. Interstitiaalisen laajenemisasteen arvioimiseksi interstitiaalisen fibroosin miehittämä munuaiskuoren alueen prosenttiosuus (prosentti IF) arvioitiin Massonin värjätyissä leikkeissä pistelaskentatekniikalla [59].

5.4. Immunohistokemia

Neljä um:n paksuisia, parafiiniin upotettuja munuaisleikkeitä asennettiin lasilevyille, jotka oli päällystetty 6 prosentilla silaanilla. Leikkeistä poistettiin parafiini, ne hydratoitiin ja kuumennettiin sitten sitraattipuskurissa antigeenin haun tehostamiseksi. Niitä esi-inkuboitiin 5 prosentin normaalin kanin (ED-1) tai hevosen (-aktiinin) seerumin kanssa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS) tai kaseiinipohjaisessa Protein Block -liuoksessa (Protein Block; DAKO Corporation, Santa Clara, CA, USA (PCNA, pSmad ja Beclin)) epäspesifisen sitoutumisen estämiseksi. Inkubointi primaarisen vasta-aineen kanssa suoritettiin yön yli 4 °C:ssa. Negatiiviset kontrollit suoritettiin jättämällä pois primaarinen vasta-aine.

Seuraavia primäärisiä vasta-aineita käytettiin: monoklonaalinen hiiren anti-rotta ED-1 -vasta-aine (Serotec, Oxford, UK) makrofagien havaitsemiseen; hiiren monoklonaalinen anti-alfa sileä (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA), -aktiinin havaitsemiseen; polyklonaalinen anti-Beclin 1 -vasta-aine (Boster, Pleasanton, CA, USA), autofagia-analyysiä varten. Pesun jälkeen leikkeitä inkuboitiin biotinyloidun anti-hiiri-IgG:n (H plus L) kanssa (Vector, Burlingame, CA, USA) 45 minuuttia, mitä seurasi VECTASTAIN® ABC-AP Kit, Vector® Red (Vector, Burlingame, CA) , USA) 30 min. Leikkeet kehitettiin sitten nopeasti punaisella väriaineliuoksella.

Hiiren monoklonaaliselle proliferaatiota estävälle solun ydinantigeenille (Dako, Tanska) ja fosfori-smad2 (Ser465/467) -vasta-aineelle (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) endogeeninen peroksidaasin esto suoritettiin 3-prosenttisella vetyperoksidiliuoksella ja metanolilla 30 °C:n ajan. min. Sitten leikkeitä inkuboitiin yön yli primaarisen vasta-aineen kanssa kostutetussa kammiossa 4 °C:ssa. Seuraavana päivänä leikkeitä inkuboitiin biotinyloidun anti-hiiri-IgG:n (H plus L) tai biotinyloidun anti-rotan IgG:n (H plus L) kanssa (Vector, Burlingame, CA, USA) 45 minuutin ajan, minkä jälkeen inkuboitiin VECTASTAIN® ABC- HRP Kit (Vector, Burlingame, CA, USA) 30 min. Leikkeet kehitettiin sitten käyttämällä 3-amino-9-etyylikarbatsolisubstraattikromogeenia (AEC) (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA). Kaikki osat huuhdeltiin tislatulla vedellä, vastavärjättiin Mayerin Hemalum-liuoksella (Merck, Darmstadt, Saksa), joka oli peitetty Kaiserin glyseriinigelatiinilla (Merck, Darmstadt, Saksa).

ED-1:n, p-Smadin, Beclinin ja PCNA:n interstitiaalisen munuaistiheyden arvioimiseksi positiivisten solujen lukumäärä/mm2 arvioitiin sokkomenetelmällä 400-kertaisella suurennuksella. -aktiinin arvioimiseksi käytimme pistelaskentatekniikkaa käyttämällä mikroskooppia, jossa oli 100-pistesilmä, joka oli kytketty videomonitoriin. Analysoimme 25 kenttää 3200 suurennuksella. Tulokset ilmaistiin prosentteina kokonaispinta-alaan nähden.

5.5. Apoptoosi

Apoptoosi määritettiin munuaistiehyissä TUNEL-tekniikalla (TdT-välitteinen X-dUTP Nick-pään leimaus) käyttämällä Apoptag plusPeroxidase in Situ Apoptosis Detection Kitin (S7101, Millipore Sigma, MA, USA) antamia ohjeita. Apoptoottiset solut analysoitiin 25 kentässä 1000-kertaisella suurennuksella lopullisen arvon saamiseksi soluina/mm2.

5.6. Tilastollinen analyysi

Erot LoP- ja HiP-ryhmien välillä testattiin käyttämällä riippumatonta Studentin testiä tai vastaavasti Mann-Whitney-testiä. Muuttujien välisiä suhteita tutkittiin Spearman-korrelaatiokertoimella. Tiedot esitetään keskiarvona ± SE, ellei toisin mainita. p-arvo<0.05 was="" considered="" significant.="" analyses="" were="" performed="" using="" ibm="" spss="" statistics,="" version="" 20.0.1="" (ibm="" corp.,="" armonk,="" ny,="" usa)="" and="" graphpad="" prism9.1.2="" statistical="" software="" (graphpad,="" san="" diego,="" ca,="">

Rahoitus:Tätä tutkimusta tuki Sáo Paulon tutkimussäätiö (FAPESP-Grant #. 2010/05409-6). Moyses, Jorgetti, Zatz ja Elias ovat CNPq:n (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnol6gico) tukemia, mutta tällä taloudellisella tuella ei ollut merkitystä tämän artikkelin kirjoittamisessa.

Institutionaalisen tarkastuslautakunnan lausunto:Tämä tutkimus tehtiin paikallisen eettisen arviointilautakunnan suositusten mukaisesti. Protokollan hyväksyi Comite detica em Pesquisa do Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina da USP (CEUA, prosessi #090/10 ja hyväksymispäivämäärä 10. elokuuta 2010). Kaikissa kokeellisissa menettelyissä noudatettiin tiukasti kansainvälisiä laboratorio-eläinten käsittelyä ja hoitoa koskevia standardeja.

Tietojen saatavuusilmoitus:Tässä tutkimuksessa esitetyt tiedot ovat saatavilla pyynnöstä vastaavalta kirjoittajalta.

Kiitokset:Kirjoittajat kiittävät Wagner Dominguezia hänen asiantuntevasta teknisestä avusta. Eturistiriidat: Kirjoittajat eivät ilmoittaneet eturistiriitoja.

Viitteet

1. Hill, NR; Fatoba, ST; Ok, JL; Hirst, JA; O'Callaghan, CA; Lasserson, DS; Hobbs, FD Kroonisen taudin maailmanlaajuinen esiintyvyysmunuainensairaus – Systemaattinen katsaus ja meta-analyysi. PLoS ONE 2016, 11, e0158765.

2. Wen, CP; Chang, CH; Tsai, MK; Lee, JH; Lu, PJ; Tsai, SP; Wen, C.; Chen, CH; Kao, CW; Tsao, CK; et ai. Diabetes aikaisinmunuainenosallistuminen voi lyhentää elinikää 16 vuodella. Kidney Int. 2017, 92, 388–396.

3. Kakinuma, Y.; Kawamura, T.; Bills, T.; Yoshioka, T.; Ichikawa, I.; Fogo, A. Angiotensiinin eston verenpaineesta riippumaton vaikutus kroonisen munuaisten vajaatoiminnan verisuonivaurioihin.MunuainenInt. 1992, 42, 46–55.

4. Paistettu, LF; Orchard, TJ; Kasiske, BL Lipidien vähentämisen vaikutus munuaissairauden etenemiseen: meta-analyysi.MunuainenInt. 2001, 59, 260–269.

5. Ishidoya, S.; Morrissey, J.; McCracken, R.; Reyes, A.; Klahr, S. Angiotensiini II -reseptorin antagonisti parantaa munuaisten tubulointerstitiaalista fibroosia, jonka aiheuttaa yksipuolinen virtsanjohtimen tukos.MunuainenInt. 1995, 47, 1285–1294.

6. Audigier, JC; Kanjanbuch, T.; Ma, LJ; Brown, NJ; Fogo, AB Olemassa olevan glomeruloskleroosin regressio aldosteronin estämisellä. J. Am. Soc. Nephrol. 2005, 16, 3306–3314.

7. Nath, KA; Kren, SM; Hostetter, TH Ruokavalion proteiinirajoitus todetussa munuaisvauriossa rotalla. Kerästen kapillaaripaineen selektiivinen rooli progressiivisessa glomerulaarisessa toimintahäiriössä. J. Clin. Tutki. 1986, 78, 1199-1205.

8. Brenner, BM; Meyer, TW; Hostetter, TH Ruokavalioiden saanti ja sen progressiivinen luonnemunuainensairaus: Hemodynaamisesti välittämän glomerulaarisen vaurion rooli progressiivisen glomerulaarisen skleroosin patogeneesissä ikääntymisessä, munuaisten ablaatiossa ja sisäisessä munuaissairaudessa. N. Engl. J. Med. 1982, 307, 652-659.

9. Bellizzi, V. Vähäproteiininen ruokavalio tai ravitsemushoito kroonisessamunuainensairaus? Blood Purif. 2013, 36, 41–46.

10. Kusano, K.; Segawa, H.; Ohnishi, R.; Fukushima, N.; Miyamoto, K. Vähäproteiinisen ja vähäfosforisen ruokavalion rooli kroonisen taudin etenemisessämunuainenureemisten rottien sairaus. J. Nutr. Sci. Vitam. 2008, 54, 237–243.

11. Neves, KR; Graciolli, FG; dos Reis, LM; Pasqualucci, CA; Moyses, RM; Jorgetti, V. Hyperfosfatemian haitalliset vaikutukset sydänlihaksen liikakasvuun, munuaisten toimintaan ja luuhun rotilla, joilla on munuaisten vajaatoiminta.MunuainenInt. 2004, 66, 2237–2244. [CrossRef] [PubMed]

12. Finch, JL; Lee, DH; Liapis, H.; Ritter, C.; Zhang, S.; Suarez, E.; Ferder, L.; Slatopolsky, E. Fosfaattirajoitus vähentää merkittävästi kuolleisuutta ureemisissa rotissa, joilla on todettu verisuonten kalkkiutuminen. Kidney Int. 2013, 84, 1145–1153.

13. Cupisti, A.; Blasco, P.; D'Alessandro, C.; Giannese, D.; Sabatino, A.; Fiaccadori, E. Munuaisten jäännöstoiminnan suojaaminen ja ravitsemushoito: Ensimmäinen vaihe strategia ureemisten toksiinien vähentämiseksi loppuvaiheen munuaissairauspotilailla. Toksiinit 2021, 13, 289.

14. Yan, B.; Su, X.; Xu, B.; Qiao, X.; Wang, L. Ravinnon proteiinirajoituksen vaikutus kroonisen taudin etenemiseenmunuainensairaus: Systemaattinen katsaus ja meta-analyysi. PLoS ONE 2018, 13, e0206134. [CrossRef] [PubMed]

15. Klahr, S.; Levey, AS; Beck, GJ; Caggiula, AW; Hunsicker, L.; Kusek, JW; Striker, G. Ravinnon proteiinirajoituksen ja verenpaineen hallinnan vaikutukset kroonisen munuaissairauden etenemiseen. Ruokavalion muuttaminen munuaissairaustutkimusryhmässä. N. Engl.

J. Med. 1994, 330, 877-884. [CrossRef]

16. Hu, MC; Shi, M.; Cho, HJ; Adams-Huet, B.; Paek, J.; Hill, K.; Shelton, J.; Amaral, AP; Faul, C.; Taniguchi, M.; et ai. Klotho ja fosfaatti ovat patologisen ureemisen sydämen uudelleenmuodostumisen modulaattoreita. J. Am. Soc. Nephrol. 2015, 26, 1290–1302.

17. Hu, MC; Shi, M.; Cho, HJ; Zhang, J.; Pavlenco, A.; Liu, S.; Sidhu, S.; Huang, LJ; Moe, OW Erytropoietiinireseptori on Klotho-indusoidun sytosuojauksen alavirran efektori. Kidney Int. 2013, 84, 468–481.

18. Shi, M.; Flores, B.; Gillings, N.; Bian, A.; Cho, HJ; Yan, S.; Liu, Y.; Levine, B.; Moe, OW; Hu, MC alphaKlotho vähentää AKI:n etenemistä CKD:ksi aktivoimalla autofagiaa. J. Am. Soc. Nephrol. 2016, 27, 2331–2345.

19. Ding, Y.; Kim, S.; Lee, SY; Koo, JK; Wang, Z.; Choi, ME Autofagia säätelee TGF-beeta-ekspressiota ja vaimentaamunuainenyksipuolisen virtsanjohtimen tukkeuman aiheuttama fibroosi. J. Am. Soc. Nephrol. 2014, 25, 2835–2846.

20. Moustakas, A.; Souchelnytskyi, S.; Heldin, CH Smad-sääntely TGF-beeta-signaalin transduktiossa. J. Cell Sei. 2001, 114, 4359–4369.