Suun hypoksian aiheuttama tekijä Prolyylihydroksylaasi-inhibiittori Enarodustat torjuu munuaisenergian aineenvaihdunnan muutoksia diabeettisen munuaissairauden varhaisissa vaiheissa

Ota yhteyttä: emily.li@wecistanche.com

Johdanto

Nefrologian ja endokrinologian osasto, Tokion yliopiston Graduate School of Medicine, Tokio, Japani; Research Fellowship for Young Scientists, Japan Society for the Promotion of Science, Tokio, Japani; Biologiset ja farmakologiset tutkimuslaboratoriot,

Central Pharmaceutical Research Institute, Japan Tobacco Inc., Takatsuki, Japani; Systeemifarmakologian laitos, Tokion yliopisto Graduate School of Medicine, Tokio, Japani; Laboratory for Synthetic Biology, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, Suita, Japani; ja WPI International Research Center for Neurointelligence, University of Tokyo Institutes for Advanced Study (UTIAS), Tokion yliopisto, Tokio, Japani.

Hypoksian indusoivan tekijän (HIF) prolyylihydroksylaasin estäjät, jotka tunnetaan myös HIF-stabilisaattoreina, lisäävät endogeenisen erytropoietiinin tuotantoa ja toimivat uusina terapeuttisina aineina anemiaa vastaankrooninenmunuainensairaus. HIF indusoi erilaisten energia-aineenvaihduntaan liittyvien geenien ilmentymistä adaptiivisena vasteena hypoksialle. On kuitenkin epäselvää, kuinka HIF-stabiloinnin aiheuttama metabolinen uudelleenohjelmointi sisäinen kudos vaikuttaa kudoksen patofysiologiaan.munuainen sairaudet. Aiemmat tutkimukset viittaavat siihen, että systeemiset aineenvaihduntahäiriöt, kuten hyperglykemia ja dyslipidemia, aiheuttavat muutoksia munuaisaineenvaihdunnassa, mikä johtaa munuaisten vajaatoimintaan, mukaan lukien diabeettinen munuaissairaus. Tässä analysoimme enarodustatin (JTZ-951), suun kautta otettavan HIF-stabilisaattorin, vaikutuksia munuaisenergian aineenvaihduntaan diabeettisen munuaissairauden alkuvaiheessa käyttämällä streptotsotosiinin aiheuttamia diabeettisia rottia ja alloksaanin aiheuttamia diabeettisia hiiriä. Transkriptioanalyysi paljasti, että enarodustat vastustaa muutoksia diabeettisen munuaisaineenvaihdunnassa. Transkriptioanalyysi osoitti, että rasvahappojen ja aminohappojen aineenvaihdunta nopeutui diabeettisessa munuaiskudoksessa ja vähentyi enarodustaatilla, kun taas glukoosiaineenvaihdunta lisääntyi. Nämä symmetriset muutokset vahvistettiin metabolomianalyysillä. Vaikka glykolyysin ja trikarboksyylihapposyklin metaboliitteja kertyi ja aminohapot vähenivät diabeettisten eläinten munuaiskudokseen, enarodustaatti lievensi näitä aineenvaihduntahäiriöitä. Lisäksi enarodustatiini lisäsi glutationin ja glutationin disulfidin suhdetta ja lievitti oksidatiivista stressiä diabeettisten eläinten munuaiskudoksessa. Siten HIF-stabilointi estää munuaisten energia-aineenvaihdunnan muutoksia, joita esiintyy alussadiabeetikkomunuainensairaus.

Cistanche on erittäin hyvä munuaisten toiminnalle

Käännöslausunto

Hypoksiaa indusoivan tekijän (HIF) prolyylihydroksylaasin estäjät (tunnetaan myös HIF-stabilisaattoreina) lisäävät endogeenisen erytropoietiinin tuotantoa ja toimivat uusina terapeuttisina aineina anemiaa vastaankrooninenmunuainensairaus. Munuaiskudoksen transkriptio- ja metabolomianalyysimme rotan ja hiiren diabeettisissa malleissa ovat paljastaneet, että enarodustaatti (JTZ-951), suun kautta otettava HIF-stabilisaattori, estää munuaisten energia-aineenvaihdunnan muutoksia diabeettisen munuaissairauden alkuvaiheessa. Tulokset tarjoavat tärkeitä tietoja HIF-stabilisaattoreiden vaikutusten ekstrapoloimiseksi munuaisten energian aineenvaihduntaan kliinisissä olosuhteissa, vaikka lisätutkimuksia tarvitaan sen selvittämiseksi, kuinka tämä munuaisaineenvaihdunnan uudelleenohjelmointi HIF-stabilisaattoreiden avulla vaikuttaa sairauden etenemiseen.diabeetikkomunuainensairaus.

Esittely

Hypoksian indusoivan tekijän (HIF) prolyylihydroksylaasin estäjät lisäävät endogeenisen erytropoietiinin tuotantoa ja toimivat uusina terapeuttisina aineina anemiaa vastaan ​​kroonisessamunuainensairaus. Soluilla on puolustusmekanismi hypoksiaa vastaan, ja HIF on tämän puolustuksen pääsäätelijä. Munuaiset ovat fysiologisesti alttiina hypoksialle, ja krooninen hypoksia tunnustetaan viimeiseksi yleiseksi reitiksi, joka johtaa loppuvaiheen munuaissairauteen. Ottaen huomioon, että HIF indusoi erilaisten hypoksiavasteisiin liittyvien geenien ilmentymistä, HIF-stabilisaattoreilla saattaa olla pleiotrooppisia vaikutuksia taudin etenemiseen.munuainensairaudetsekä anemian paraneminen kroonisessamunuainensairaus. Mielenkiintoista on, että HIF indusoi glykolyyttisten geenien ja pyruvaattidehydrogenaasikinaasin ilmentymistä, mikä estää pyruvaattidehydrogenaasia käyttämästä pyruvaattia mitokondrion trikarboksyylihapon (TCA) syklin ruokkimiseen.6,7 Tämä metabolinen uudelleenohjelmointi TCA-syklistä glykolyysiksi tukahduttaa hapenkulutuksen ja on kriittinen hypoksisille ympäristöille alttiina olevien solujen mukauttamiseen. On kuitenkin epäselvää, kuinka munuaiskudoksen metabolinen uudelleenohjelmointi HIF-stabiloinnin avulla vaikuttaa munuaiskudoksen patofysiologiaan.munuainen sairaudet. Diabeettinen munuaissairaus (DKD) on pääasiallinen loppuvaiheen munuaissairauden syy. Systeemiset aineenvaihduntahäiriöt, kuten hyperglykemia ja dyslipidemia, aiheuttavat munuaisten aineenvaihdunnan muutoksia, mikä johtaa munuaisten vajaatoimintaan, mukaan lukien DKD. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet lisääntynyttä aineenvaihduntavirtaa ja glukoosin ja TCA-syklin metaboliittien kertymistä diabeettiseen munuaisten aivokuoren kudokseen, mikä saattaa liittyä mitokondrioiden toimintahäiriöihin ja DKD:n etenemiseen. Oletimme, että HIF-stabilisaattorit saattavat kääntää aineenvaihduntamuutokset diabeettisessa munuaiskuoren kudoksessa, koska HIF adaptiivisena vasteena hypoksiaan vähentää aineenvaihduntavirtaa soluissa hapenkulutuksen hillitsemiseksi. Näin ollen teimme transkripti- ja metabolomianalyysejä hyödyntäen proof-of-concept-tutkimuksen ymmärtääksemme kattavasti, kuinka enarodustaatti (JTZ-951), suun kautta otettava HIF-stabilisaattori, vaikuttaa munuaisaineenvaihdunnan muutoksiin DKD:n alkuvaiheessa.

TULOKSET: Enarodustat indusoi metabolisen uudelleenohjelmoinnin TCA-syklistä glykolyysiin munuaisten proksimaalisissa tubulussoluissa

Koska munuaiskuori koostuu pääasiassa proksimaalisista tubuluksista, tutkimme ensin enarodustaatin vaikutuksia munuaisten proksimaalisten tubulussolujen aineenvaihduntaan in vitro. Ensin Mito Stress Test (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) ja Glycolytic Rate Assay (Agilent) suoritettiin viljellyissä HK-2-soluissa, ihmisen proksimaalisessa tubulusepiteelisolulinjassa (kuva 1a). Enarodustat vähensi merkittävästi mitokondrioiden hengitystä (TCA-sykli) ja lisäsi perusglykolyysiä, mikä osoittaa metabolisen uudelleenohjelmoinnin TCA-syklistä glykolyysiin (kuva 1; täydentävä kuva S1). Teimme myös kokeen käyttämällä pientä häiritsevää RNA:ta (siRNA) HIF-1:lle (kuva 2; täydentävä kuva S2). siRNA:n aiheuttama HIF-1 tyrmäys kumosi enarodustaatin aiheuttamat metaboliset muutokset (perushengitys, maksimaalinen hengitys, ylimääräinen hengityskapasiteetti ja adenosiinitrifosfaatin [ATP] tuotanto), mikä osoitti, että metabolinen uudelleenohjelmointi tapahtui pääasiassa HIF-1 stabilointi (kuva 2; lisäkuva S2). Pyruvaattidehydrogenaasiaktiivisuutta, joka on tärkeä tekijä soluille, jotka käyttävät pyruvaattia TCA-syklin polttoaineena, vähensi myös enarodustat (kuva 2f), joka oli yhteensopiva aiemmin julkaistujen havaintojen kanssa.

Taustatiedot streptotsotosiinin aiheuttamista diabeettisista rotista

In vitro -kokeiden tulosten perusteella oletimme, että HIF-stabilisaattorit saattavat lievittää aineenvaihdunnan muutoksia diabeettisessa munuaisten aivokuoren kudoksessa metabolisen uudelleenohjelmoinnin kautta TCA-syklistä glykolyysiin. Valitsimme ensin streptotsotosiinin (STZ) indusoimat diabeettiset rotat malliksi konseptikokeelle testataksemme edellä mainittua hypoteesia. Tässä mallissa diabetes indusoituu nopeasti, jolloin voimme tarkkailla diabeteksen ja HIF-stabilisaattoreiden nettovaikutuksia munuaiskudoksen energia-aineenvaihduntaan lyhyessä ajassa. Tutkimusprotokolla ja perustiedot kokeista STZ-indusoiduilla diabeettisilla rotilla on esitetty kuvassa 3a. Jaoimme rotat 3 ryhmään: ryhmä A (huijaus), ryhmä B (DKD) ja ryhmä C (DKD þ enarodustat). Veren plasman glukoosi-, glykosyloitunut hemoglobiini-HbA1c-, triglyseridi- ja kokonaiskolesterolitasot päivänä 14 nousivat merkitsevästi diabeetikkoryhmissä A-ryhmään verrattuna, kun taas ryhmien B ja C välillä ei ollut merkittäviä eroja (kuva 3d-g). Vaikka plasman kreatiniinitasot eivät eronneet ryhmien välillä, albumiinin erittyminen virtsaan lisääntyi merkittävästi ja glomerulomegalia oli havaittavissa ryhmässä B verrattuna ryhmään A, ja enarodustaatilla oli taipumus kumota nämä muutokset (kuva 4). Veren ureatyppitasot olivat korkeammat diabeetikoilla, mikä heijastaa diabeteksen aiheuttamaa kuivumista. Yhteenvetona voidaan todeta, että tutkimuksessamme STZ-käsiteltyjen rottien munuaiset edustavat DKD:n alkuvaiheita. Transkriptomi- ja metabolomianalyysit suoritettiin käyttämällä näiden rottien munuaiskuoren kudosta.

Munuaisten aivokuoren kudoksen transkriptioanalyysi

Munuaisen aivokuoren kudoksen transkriptioanalyysin tulokset on esitetty kuvissa 5 ja 6. Pääkomponenttianalyysi ja hierarkkinen klusterointianalyysi osoittivat, että ryhmät A, B ja C erotettiin eri klustereiksi, vastaavasti (kuvio 5a ja b). Differentiaalisesti ilmentyvät geenit valittiin │log2-kertaisella muutoksella (FC) │ suurempi tai yhtä suuri kuin 0,5 ja Q-arvo < 0,05.="" geeniontologia="" ja="" kanoniset="" polkuanalyysit="" paljastivat,="" että="" rasvahappojen="" aineenvaihduntaan="" liittyvät="" geenit="" lisääntyivät="" ryhmässä="" b="" verrattuna="" ryhmään="" a.="" sitä="" vastoin="" glukoosin="" aineenvaihduntaan="" ja="" hypoksiavasteeseen="" liittyvät="" geenit,="" mukaan="" lukien="" hif-1-verkosto,="" olivat="" tehostettuja="" ryhmässä="" c="" verrattuna.="" ryhmän="" b="" kanssa="" (kuvat="" 5c="" ja="" d).="" suoritimme="" myös="" geenisarjan="" rikastusanalyysin="" (gsea)="" käyttämällä="" transkriptomisia="" tietoja="" (kuva="" 6,="" taulukot="" 1="" ja="" 2).="" rasvahappo-="" ja="" aminohappo-aineenvaihdunnan="" geenisarjat="" lisääntyivät="" ryhmässä="" b="" verrattuna="" ryhmään="" a="" (kuvio="" 6).="" sitä="" vastoin="" näitä="" geenisarjoja="" säädettiin="" alaspäin="" ja="" glukoosin="" aineenvaihdunnan="" geenisarjat="" lisääntyivät="" ryhmässä="" c="" verrattuna="" ryhmään="" b,="" mikä="" osoittaa,="" että="" enarodustaatti="" käänsi="" diabeteksen="" aiheuttamat="" aineenvaihduntamuutokset="" (kuvio="" 6).="" lisäksi="" tca-syklin="" geenisarjat="" vähenivät="" ryhmässä="" c="" verrattuna="" ryhmään="" b="" (taulukko="" 2),="" mikä="" on="" yhteensopiva="" in="" vitro="" -tutkimuksessamme="" havaitun="" enarodustatin="" aiheuttaman="" metabolisen="" uudelleenohjelmoinnin="" kanssa="" proksimaalisissa="" tubuluksissa.="" yhteenvetona="" voidaan="" todeta,="" että="" enarodustaatti="" torjui="" diabeettisia="" munuaisaineenvaihdunnan="" muutoksia="" transkriptomista="">

Munuaisten aivokuoren kudoksen metabolomianalyysi

Mittasimme 116 energiaan liittyvän metaboliitin absoluuttiset pitoisuudet rottien munuaiskuoren kudoksesta (n =4, kullekin ryhmälle), jotka valittiin satunnaisesti kustakin ryhmästä (lisätaulukko S1; täydentävä kuva S3). Luokkasyrjinnän merkityksen arvioimiseksi suoritettiin osittaisen pienimmän neliösumman erotteluanalyysi (PLS-DA) (kuva 7). Suoritimme metaboliittisarjan rikastusanalyysin (MSEA) käyttämällä metaboliitteja, joiden PLS-DA:n merkitys projektiopisteissä (VIP) oli 1 $. Aminohappojen, kuten glysiinin, seriinin, metioniinin, aspartaatin, glutamaatin, arginiinin, proliinin, aineenvaihdunnan erot, ja b-alaniini ryhmien A ja B välillä havaittiin. Aminohappometaboliassa havaittiin myös eroja ryhmien B ja C välillä. Lisäksi glukoosin aineenvaihduntaprosessit, kuten glykolyysi ja glukoneogeneesi, osoittivat erilaisia ​​suuntauksia ryhmien B ja C välillä (kuva 7).

Transkripti- ja metabolomitietojen visualisointi energiametabolian reittikartalla

Visualisoimme transkriptio- ja metabolomidataa energia-aineenvaihdunnan muutoksien kattavan ymmärtämiseksi (kuva 8). Glykolyysi- ja TCA-syklin metaboliitteja havaittiin kerääntyvän ryhmään B verrattuna ryhmään A, mikä saattaa johtua liiallisesta glukoosin virtauksesta ja rasvahappometabolian lisääntymisestä DKD:ssä. Aminohappopitoisuus pieneni ryhmässä B verrattuna ryhmään A, mikä kuvastaa aminohappoaineenvaihdunnan lisääntymistä (kuvio 8a). Sitä vastoin enarodustaatti helpotti glykolyysin metaboliittien kertymistä helpotetun glykolyysin virtauksen ansiosta. Enarodustaatti kumosi myös diabeteksen aiheuttamat muutokset TCA-syklin metaboliiteissa ja aminohapoissa (kuva 8b). Lisäksi enarodustaatti lievitti glutationidisulfidin (GSSG) kertymistä diabeettiseen munuaiskudokseen ja osoitti siten korkeampaa glutationi/GSSG-suhdetta, mikä viittaa siihen, että enarodustaatti lievitti oksidatiivista stressiä DKD:ssä (kuvat 8a ja b). Oksidatiivisen stressin väheneminen vahvistettiin lipidiperoksidaatiomarkkerin malondialdehydin tasoilla munuaisten aivokuoren kudoksessa: enarodustaatti käänsi malondialdehydin kertymisen diabeettiseen munuaiskuoren kudokseen (lisäkuva S4). Yhteenvetona voidaan todeta, että transkripti- ja metabolomitietojen integrointi on osoittanut, että enarodustaatti estää munuaisten energiametabolian muutoksia, joita esiintyy DKD:n alkuvaiheessa.

Symmetriset aineenvaihduntamuutokset (diabetes vs. enarodustaatti) vahvistetaan vaihtoehtoisessa mallissa

Teimme transkriptioanalyysin alloksaanin aiheuttamissa diabeettisissa hiirissä, toisessa diabeteksen eläinmallissa, vahvistaaksemme havaintomme rottamallissa. Hiirimallin tutkimusprotokollat ​​ja taustatiedot on esitetty kuvassa 9. Virtsan albumiinin erittyminen lisääntyi merkittävästi ryhmässä B verrattuna ryhmään A, jonka enarodustaatti kumosi (kuva 9d). Lisäksi käytimme kattavaa 3-ulotteista analyysiä (selkeät, esteettömät aivojen/kehon kuvantamiskoktailit ja laskennallinen analyysi [CUBIC] – munuainen)16 visualisoidaksemme munuaisten glomeruluksia. Glomerulomegalia oli havaittavissa ryhmässä B verrattuna ryhmään A, jonka enarodustaatilla käännettiin (kuva 9e). Alloksaanin aiheuttamien diabeettisten hiirten munuaiskudoksen transkriptioanalyysi osoitti symmetrisiä aineenvaihduntamuutoksia (diabetes vs. enarodustatti) samalla tavalla kuin STZ-indusoidussa diabeettisessa rottamallissa (kuva 10): diabetes nosti rasvahappojen aineenvaihduntaa, kun taas glukoosi. enarodustaatti säätelee aineenvaihduntaa. Lisäksi diabetes lisäsi aminohappojen aineenvaihduntaa ja enarodustaatti vähensi. Siten enarodustaatti torjui munuaisenergian aineenvaihdunnan muutoksia, joita esiintyi DKD:n varhaisissa vaiheissa alloksaanin aiheuttamassa diabeettisessa hiirimallissa sekä STZ-indusoidussa diabeettisessa rottamallissa.

KESKUSTELU

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että enarodustaatti (JTZ-951), suun kautta otettava HIF-stabilisaattori, estää munuaisten energiametabolian muutoksia, joita esiintyy DKD:n alkuvaiheessa diabeteksen rotta- ja hiirimalleissa. Transkripti- ja metabolomianalyysit ovat osoittaneet symmetrisiä aineenvaihdunnan muutoksia munuaiskudoksessa (diabetes vs. enarodustaatti): rasvahappo- ja aminohappo-aineenvaihdunta nopeutui DKD:ssä, kun taas enarodustaatti vähensi näitä reittejä ja lisäsi glukoosiaineenvaihduntaa (kuvat 5–10).

Ei ole täysin selvitetty, onko HIF-stabiloinnilla suojaavia vaikutuksia DKD:n patofysiologiaan vai ei. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että diabeettinen munuaiskudos on alttiina hypoksialle17 ja HIF:n ilmentyminen diabeettisessa munuaiskudoksessa ei riitä reagoimaan hypoksisiin tiloihin, mikä johtuu osittain oksidatiivisesta stressistä.18 HIF:n stabilointi kobolttikloridilla paransi oksidatiivista stressiä ja vähensi proteinuriaa ja tubulointerstitiaalinen vaurio STZ-indusoidussa DKD:ssä.19 Eläintutkimustulokset osoittivat myös, että HIF:n stabilointi suojasi liikalihavuuden kehittymistä,20 paransi insuliiniherkkyyttä20 ja alensi seerumin kolesterolitasoja.21 Nämä tulokset viittaavat HIF-stabiloinnin suojaaviin vaikutuksiin. DKD. Sitä vastoin von Hippel-Lindau -deleetion aiheuttaman suprafysiologisen HIF-stabiloinnin raportoitiin indusoivan munuaisfibroosia.22 HIF-stabiloinnin rooli DKD:n etenemisessä voi olla kontekstista riippuvainen, kun otetaan huomioon HIF:n pleiotrooppiset vaikutukset ja vaihtelevien DKD-fenotyyppien olemassaolo. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää HIF-stabiloinnin nettovaikutuksia diabeettisen munuaisen energia-aineenvaihduntaan. Aiemmat raportit ovat osoittaneet, että DKD:ssä esiintyy energia-aineenvaihdunnan muutoksia. Sas et al.10 osoittivat lisääntynyttä energian aineenvaihduntaa ja glukoosin metaboliittien kertymistä diabeettiseen munuaisten aivokuoren kudokseen, mikä saattaa liittyä mitokondrioiden toimintahäiriöön. You et al.23 raportoivat, että fumaraatti, TCA-syklin metaboliitti, kertyi diabeettiseen munuaiskudokseen ja se vaikutti suoraan DKD:n etenemiseen. Olemme aiemmin osoittaneet, että TCA-syklin metaboliitit kerääntyivät diabeettiseen munuaiskudokseen, mikä kumosi natrium-glukoosi-yhteiskuljettaja 2:n estämisellä tai kalorirajoituksella.11 Lisäksi Qi et al.24 osoittivat, että entsyymit glykolyyttisissä reiteissä, mukaan lukien pyruvaattikinaasi M2 (PKM2), tyypin 1 diabeetikoilla, joilla ei ollut DKD:tä, verrattuna potilaisiin, joilla oli DKD. PKM2-aktivaatio käänsi glykolyysin metaboliittien kertymisen ja palautti mitokondrioiden toiminnan, osittain lisäämällä glykolyyttistä virtaa.24,25 Nämä aiemmat raportit viittaavat siihen, että glykolyysin ja TCA-syklin metaboliittien kertyminen saattaa vaikuttaa DKD:n etenemiseen, jota voidaan lieventää helpotetun PKM2-glykolyysin avulla. aktivointi. Tutkimuksessamme HIF-stabilointi enarodustaatilla käänsi energia-aineenvaihdunnan muutokset ja vähensi glykolyysin ja TCA-syklin metaboliittien kertymistä diabeettiseen munuaiskuoren kudokseen (kuva 8). Glykolyyttisten entsyymien, mukaan lukien PKM2, ilmentymistä säädeltiin myös enarodustatilla (lisäkuva S4B). Lisäksi enarodustaatti lievitti GSSG:n kertymistä ja lisäsi glutationi/GSSG-suhdetta, mikä viittaa siihen, että enarodustaatti lievitti oksidatiivista stressiä DKD:ssä (kuva 8). Tämän enarodustatin aiheuttaman oksidatiivisen stressin vähenemisen vahvistivat myös muutokset malondialdehyditasoissa munuaisten aivokuoren kudoksessa (lisäkuva S4A). Nämä tulokset viittaavat siihen, että HIF-stabiloinnilla pitäisi olla suojaava rooli DKD:n patofysiologiassa ainakin metabolisista näkökulmista. On varmaa, että emme voi tutkia, onko HIF-stabiloinnin aiheuttamalla aineenvaihdunnan uudelleenohjelmoinnilla suoria vaikutuksia DKD:n etenemiseen, koska aineenvaihdunnan muutosten nettovaikutuksia munuaisten tulokseen voi olla mahdotonta havaita HIF:n pleiotrooppisen roolin vuoksi. Kuitenkin tutkimuksessamme lievää albumiinin erittymistä virtsaan ja diabeteksen aiheuttamia munuaispatologisia poikkeavuuksia (glomerulomegalia ja munuaiskerästen tyvikalvon paksuuntuminen) lievensi enarodustaatti yhdessä munuaisten energia-aineenvaihdunnan normalisoitumisen kanssa. Poistimme alloksaanin aiheuttaman diabeettisen hiirimallin mikrosirutiedoista geenit, joiden ilmentymismuutokset korreloivat virtsan albumiinitasojen kanssa (257 koetinta; 232 geeniä), ja suoritimme polun rikastusanalyysin (täydentävä kuva S5). Tämän seurauksena mitokondrioiden kalvoon ja hengityselinten elektronien kuljetukseen liittyvät reitit lisääntyvät virtsan albumiinitasojen yhteydessä, mikä osoittaa, että mitokondrioiden kuormitus liittyy läheisesti virtsan albumiinin erittymiseen. Siten on mahdollista, että diabeettisen munuaiskudoksen metabolinen normalisointi HIF-stabilisaattoreiden avulla saattaa vähentää mitokondrioiden taakkaa ja lieventää DKD:n etenemistä. Tietomme viittaavat DKD:n patofysiologiaan aineenvaihdunnan näkökulmasta seuraavasti: Hyperglykemia luo energiantarpeen glukoosin reabsorptioon munuaisten proksimaalisissa tubuluksissa; siten TCA-sykli mitokondrioissa aktivoituu väkisin vastaamaan energiantarpeeseen DKD:n alkuvaiheessa (rasvahappo- ja aminohappo-aineenvaihdunnan säätely). Ja HIF-stabilisaattorit saattavat lieventää tätä mitokondrioiden taakkaa aineenvaihdunnan uudelleenohjelmoimalla TCA-syklistä glykolyysiin (rasvahappo- ja aminohappo-aineenvaihdunnan säätelyn heikkeneminen ja glykolyysin lisääntyminen), millä saattaa olla suojaavia rooleja DKD:n etenemistä vastaan. Lisätutkimuksia, mukaan lukien yksisoluinen omiikka, tarvitaan sen selvittämiseksi, kuinka munuaiskudoksessa oleva mitokondriotaakka vaikuttaa suoraan DKD:n patofysiologiaan. Toinen mielenkiintoinen kysymys on, vaikuttavatko HIF-stabilisaattorit suoraan glukoosin imeytymiseen proksimaalisissa tubuluksissa. In vitro -tietomme osoittivat, että enarodustaatti vähentää merkittävästi ATP:n tuotantoa metabolisen uudelleenohjelmoinnin kautta TCA-syklistä glykolyysiin (kuvat 1 ja 2). Ottaen huomioon, että natrium-glukoosi-kokuljettaja 2 tarvitsee ATP:tä glukoosin takaisinimeytymiseen, oletimme ensin, että enarodustaatti saattaa inaktivoida glukoosin takaisinabsorption. Virtsan glukoositasot eivät kuitenkaan eronneet merkittävästi ryhmän B ja ryhmän C välillä molemmissa eläinmalleissa (lisäkuva S6). Todennäköisesti enarodustaatin aiheuttama ATP-tuotannon väheneminen on paljon lievempää fysiologisessa tilanteessa verrattuna sen vaikutukseen in vitro; näin ollen HIF:n stabilointi ei vaikuta glukoosin imeytymiseen natrium-glukoosi-välittäjä 2:n kautta, ainakaan meidän eläinkokeissamme. Tutkimuksessamme oli 2 rajoitusta. Ensin käytimme STZ-indusoituja diabeettisia rottia ja alloksaanin aiheuttamia diabeettisia hiiriä varhaisen vaiheen DKD-malleina ja tarkkailimme diabeettisten tilojen lyhytaikaisia ​​vaikutuksia. Kliinisessä ympäristössä HIF-stabilisaattoreita annettaisiin kuitenkin potilaille, joilla on anemia myöhäisvaiheen DKD:ssä. Lisää tutkimuksia tarvitaan ymmärtääkseen HIF-stabiloinnin vaikutusta munuaisaineenvaihdunnan muutoksiin myöhäisen vaiheen DKD:ssä. Toiseksi, tutkimuksesta puuttui riittävä tilastollinen teho aineenvaihduntatuotteiden pitoisuuksien hajaantumisen suhteen metabolomitiedoissa, kun taas transkriptiodatalla oli tarpeeksi suuri tilastollinen teho selventääkseen kokonaiskuvaa energia-aineenvaihdunnasta. Koska monilla metaboliiteilla ei ollut merkittävää eroa ryhmien välillä, suoritimme PLS-DA:n ja valitsimme metaboliitit, joiden PLS-DA VIP-pistemäärä oli suurempi tai yhtä suuri kuin 1 MSEA:lle. Vaikka metabolisen muutoksen ristiintodentaminen pelkästään metabolomiikkatietojen avulla on vaikeaa, metabolomianalyysin tulokset olivat yhteensopivia transkriptomisten tietojen kanssa (kuvat 7 ja 8), mikä tarjosi lisätukea transkriptiomuutosten havaituille vaikutuksille munuaisenergian aineenvaihduntaan. Yhteenvetona voidaan todeta, että enarodustaatti (JTZ-951), suun kautta otettava HIF-stabilisaattori, ehkäisee munuaisten energiaaineenvaihdunnan muutoksia DKD:n alkuvaiheessa. Tutkimuksemme viittaa siihen, että HIF:n stabilointi voi toimia mahdollisena interventiona, joka kohdistuu DKD:n epäsäännölliseen munuaisenergian aineenvaihduntaan.

MENETELMÄT

Miton stressitesti ja glykolyyttisen nopeuden määritys

HK-2-solut kylvettiin 96-kuoppamikrolevylle tiheydellä 1 * 10⁴solut/kuoppa. Seuraavana päivänä aineenvaihduntavirta mitattiin reaaliajassa Seahorse XFe96 Analyzerilla (Agilent) käyttämällä Mito Stress Test Kit -pakkausta (103015-100; Agilent) tai Glycolytic Rate Assay Kitiä (103344- 100; Agilent). Glukoosi-, pyruvaatti- ja glutamiinipitoisuudet elatusaineissa olivat 10 mmol/l, 1 mmol/l ja 2 mmol/l.

siRNA-transfektio

HIF-1 pudotuksen suoritti Stealth RNAi ihmisen HIF1A:lle (HSS104774 [#1] ja HSS104775 [#2]; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Stealth RNAi siRNA Negative Control Med GC Duplex #2 (12935112; Thermo Fisher Scientific) käytettiin negatiivisena kontrollina.

Western blottaus

Ensisijaiset värjäykseen käytetyt vasta-aineet olivat anti-ihmis-HIF-1-vasta-aine (kanin polyklonaalinen, 1:500; Novus Biologicals, Littleton, CO) ja anti-ihmisen aktiinivasta-aine (kanin polyklonaalinen, 1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Toissijainen vasta-aine oli piparjuuriperoksidaasilla konjugoitu vuohen anti-kanin IgG-vasta-aine (170-6515, 1:5000; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

Eläinkokeet

Crl: CD (Sprague Dawley) -rotat ja Crl: CD1 (Institute of Cancer Research) -hiiret hankittiin Charles River Laboratories Japan Inc:ltä (Yokohama, Japani). Kaikki kokeet hyväksyi Tokion yliopiston instituutioiden arviointilautakunta (hyväksyntänumero P17-110). Kaikki eläintoimenpiteet suoritettiin National Institutes of Healthin ohjeiden mukaisesti (Guide for the Care and Use of the Laboratory Animals). Tutkimusprotokollat ​​on esitetty kuvissa 3 ja 9.

Transkriptioanalyysi

Kokonais-RNA munuaisten aivokuoren kudoksesta eristettiin käyttämällä GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit -pakkausta (RTN7{{10}}; Sigma-Aldrich). Kokonais-RNA (100 ng) leimattiin käyttämällä Low Input Quick Amp Labeling Kit (Agilent) ja hybridisoitiin sitten SurePrint G3 Rat GE v2 8x60K Microarray (rotalle; Agilent) ja SurePrint G3 Mouse GE v{{7 }}x60K Microarray (hiirelle). Kaikki mikrosirukokeet suoritti DNA Chip Research Inc. (Tokio, Japani). Raakadataa käsiteltiin R-paketilla limma Bioconductorissa (http://www.bioconductor.org/) taustan korjauksen ja tietojen normalisoinnin suorittamiseksi kvantiilinormalisointimenetelmällä. Erävaikutukset poistettiin ComBatilla (Bioconductor) rottakokeessa. Erilaisesti ekspressoituneet geenit määritettiin log2 FC│:lla, joka oli suurempi tai yhtä suuri kuin 0,5 ja Q-arvo < 0,05.="" geeniontologia="" ja="" kanoniset="" polkuanalyysit="" suoritettiin="" käyttäen="" basespace="" correlation="" engineä="" (illumina,="" san="" diego,="" ca).="" microarray-tiedot="" on="" tallennettu="" national="" center="" for="" biotechnology="" information="" gene="" expression="" omnibus="" -järjestelmään="" sarjoina="" gse131221="" (rotta)="" ja="" gse139317="">

Geenijoukon rikastusanalyysi

GSEA on laskennallinen menetelmä, joka määrittää, osoittaako etukäteen määritellyssä geenijoukossa tilastollisesti merkittäviä, samanlaisia ​​eroja kahden biologisen tilan välillä. GSEA suoritettiin käyttämällä GSEA v.3:a.0 (Broad Institute, Cambridge, MA). Reittejä, joiden väärien löydösten määrä oli < 0,25,="" pidettiin="">

Metabolomien analyysi

Aineenvaihduntamittaukset suoritti Human Metabolome Technologies Inc. (Tsuruoka, Japani). Metaboliitin pitoisuudet laskettiin normalisoimalla kunkin metaboliitin piikin pinta-ala suhteessa sisäisen standardin pinta-alaan ja käyttämällä standardikäyriä, jotka saatiin 3-pistekalibroinneista. Katso myös Täydentävät menetelmät.

Metaboliittisarjan rikastusanalyysi

Metabolomiikan tietojen analyysi suoritettiin integroidulla verkkopohjaisella MetaboAnalyst 4 -alustalla.0. PLS-DA suoritettiin ja siihen liittyvät VIP-pisteet laskettiin. MSEA:ssa käytettiin metaboliitteja, joiden PLS-DA VIP-pistemäärä oli suurempi tai yhtä suuri kuin 1.

Munuaispatologioiden glomerulaaristen alueiden kvantifiointi

Otimme satunnaisesti 3 patologista kuvaa kunkin näytteen periodisesta happo-Schiff-värjäyskuvasta ja mittasimme jokaisen glomerulaarisen alueen käyttämällä Fidžiä (ImageJ:n jakauma; National Institutes of Health, Bethesda, MD).

CUBIC-munuainen

Kattava 3-ulotteinen glomerulusten kuvantaminen munuaiskudoksessa suoritettiin CUBIC:lla aikaisempien julkaisujemme mukaisesti. Lyhyesti sanottuna kiinteät hiiren munuaiset upotettiin CUBIC-L:ään lipidinpoistoa varten ja sitten altistettiin immunofluoresoivalle värjäyksellä. Lopuksi taitekerroin sovitettiin näytteiden sijoittelulla CUBIC-R plus -laitteeseen. Kattavat 3D-ulotteiset kuvat läpinäkyvistä munuaisista saatiin räätälöidyllä valolevyfluoresenssimikroskopialla (MVX10-LS; Olympus, Tokio, Japani). Ensisijainen värjäykseen käytetty vasta-aine oli anti-podosiinivasta-aine (kanin polyklonaalinen, 1:100, P0372; Sigma-Aldrich). Toissijainen vasta-aine oli Alexa Flour 555- -konjugoitu aasin anti-kanin IgG (1:100, A-31572; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).

Tilastollinen analyysi

Useita vertailuja varten sovellettiin {{0}}tapavarianssin analyysiä, jota seurasi post hoc Tukeyn useiden vertailujen testejä tarvittaessa. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin GraphPad Prism 7 -ohjelmistolla (GraphPad Software, San Diego, CA). P < 0,05="" katsottiin="" tilastollisesti="" merkitseväksi.="" tiedot="" esitetään="" keskiarvona="" ±="">

ILMAISEKSI

MN on saanut palkkioita, neuvontapalkkioita tai tutkimusrahoitusta KyowaHakko-Kiriniltä, ​​Akebialta, Astellalta, Chugailta, GlaxoSmithKlinelta, Japan Tobacco Inc:ltä (JT), Toriilta, Tanabe-Mitsubishin, Daiichi-Sankyolta, Takedalta, Onolta, Bayeriltä, ​​Boehringeriltä. ja Alexion. TT on saanut tutkimusapurahaa JT:ltä. Enarodustatin (JTZ-951) toimitti JT, Tokio, Japani. EAS ja HRU ovat RIKENin omistamien patenttien yhteiskeksijöitä. Osa tutkimuksesta tehtiin yhteistyössä Olympus Corporationin ja Bitplanen tukeman ystävällisen ohjelmiston kanssa. Toinen kirjoittaja ei ilmoittanut kilpailevia etuja.

KIITOKSET

Olemme kiitollisia tohtori Shuhei Yaolle ja tohtori Shinji Tanakalle arvokkaista keskusteluista. Kiitämme myös tohtori Tsuyoshi Inoueta, tohtori Satoru Fukudaa ja rouva Kahoru Amitania teknisestä tuestaan. Tämä työ tehtiin osittain Tokion yliopiston Isotope Science Centerin tuella. Tätä työtä tuki Grant-in-Aid for Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) -tutkija (JSPS KAKENHI -apuraha 19J11928 SH:lle), Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (JSPS KAKENHI -apuraha 18H02824 MN:lle ), Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI -apuraha 17K09688 TT:lle) ja Grant-in-Aid innovatiivisten alueiden tieteelliseen tutkimukseen (KAKENHI-apuraha 26111003 MN:lle).