Kurkumiinijohdannaisen J147 estävä vaikutus melanogeneesiin ja melanosomien kuljetukseen helpottamalla ERK-välitteistä MITF:n hajoamista, osa 1

Kurkumiinin ja kemiallisesti modifioidun kurkumiinin (CMC) terapeuttinen käyttö melanogeneesin ja tyrosinaasiaktiivisuuden tukahduttamiseen on tunnustettu. J147 on muunneltu versio kurkumiinista, jolla on erinomainen hyötyosuus ja stabiilisuus. Kuitenkaan ei ole raportoitu J147:n vaikutuksista pigmentaatioon in vitro ja in vivo. Tutkimuksissamme tutkimme J147-hoidon hypopigmentaarisia vaikutuksia melanosyytteihin ja selvitimme taustalla olevaa mekanismia. Nykyiset tutkimukset ehdottivat, että J147 tukahdutti sekä perus- että -MSH-indusoidun melanogeneesin sekä vähensi melanosyyttien dendriitin laajenemista ja melanosomin kuljetusta. J147 näytteli näitä rooleja pääasiassa aktivoimalla solunulkoisen signaalin säätelemän proteiinikinaasireitin (ERK). Kun se oli aktivoitu, se johti MITF:n hajoamiseen ja vähensi edelleen tyrosinaasin, TRP-1, TRP-2, Myosin Va:n, Rab27a:n ja Cdc42:n ilmentymistä, mikä lopulta esti melaniinin synteesiä ja melanosomin kuljetusta. Lisäksi J147:n hypopigmentaariset vaikutukset osoitettiin in vivo seeprakalamallissa ja UVB-indusoidussa hyperpigmentaatiomallissa ruskeissa marsuissa. Havaintomme viittasivat myös siihen, että J147 ei osoittanut sytotoksisuutta in vitro ja in vivo. Yhdessä nämä tiedot vahvistivat, että J147 voi osoittautua varsin hyödylliseksi turvallisempana luonnollisena ihonvalkaisuaineena.

Cistancheon myös tehtäväedistää kollageenin tuotantoa, joka voi lisätä ihon kimmoisuutta ja kiiltoa sekä auttaa korjaamaan vaurioituneita ihosoluja. CistancheFenyylietanoliglykosiditniillä on merkittävä alasäätävä vaikutustyrosinaasityrosinaasin vaikutuksen on osoitettu olevan kompetitiivista ja palautuvaa estoa, mikä voi tarjota tieteellisen perustanvalkaisevia ainesosiaCistancessa. Siksi cistanchella on keskeinen rooli ihon valkaisussa. Se voiestää melaniinin tuotantoavähentää värjäytymistä ja sameutta; ja edistää kollageenin tuotantoaparantaa ihon joustavuuttaja säteilyä. Koska nämä cistanchen vaikutukset tunnetaan laajasti, monetihon valkaisuuntuotteet ovat alkaneet infusoida kasviperäisiä ainesosia, kuten Cistanchea, vastatakseen kuluttajien kysyntään, mikä lisää Cistanchen kaupallista arvoa ihonvalkaisutuotteissa. Yhteenvetona voidaan todeta, että cistanchen rooli ihon valkaisussa on ratkaiseva. Sen antioksidanttinen vaikutus ja kollageenia tuottava vaikutus voivat vähentää värjäytymistä ja sameutta, parantaa ihon joustavuutta ja kiiltoa ja siten saavuttaa valkaisevan vaikutuksen. Myös Cistanchen laaja käyttö ihonvalkaisutuotteissa osoittaa, että sen roolia kaupallisessa arvossa ei voida aliarvioida.

Avainsanat: J147, hypopigmenttivaikutukset, melanosomin kuljetus, ERK-reitti, MITF:n hajoaminen

Napsauta Cistanche Tubulosaa valkaisua varten

Lisätietoja: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

JOHDANTO

Ihon pigmentaatio riippuu sekä melaniinin synteesistä että jakautumisesta orvaskeden kerroksessa. Melaniinia tuotetaan pääasiassa melanosyyttien ytimen ympärillä ja varastoituu melanosomeihin (Tian et al., 2021). Kypsymisen jälkeen melanosomit vaelsivat mikrotubuluksia ja aktiinifilamentteja pitkin solujen dendriittikärkiin ja lopuksi viereisiin keratinosyytteihin leviämisprosessin päättämiseksi (Beaumont et al., 2011; Ohbayashi ja Fukuda, 2012). Normaalissa fysiologisessa tilassa melaniini suojaa ihmisen ihoa ultraviolettisäteilyn (UV) vaurioilta, myrkyllisiltä kemikaaleilta ja muilta ympäristötekijöiltä (Slominski et al., 2004; Yousaf et al., 2020). Liiallinen tuotanto ja kertyminen indusoivat kuitenkin hyperpigmentaatiota ja liittyvät ihosairauksiin, kuten tulehduksen jälkeiseen melanodermaan, melasmaan ja auringon lentigiiniin, mikä johtaa huomattavaan psykososiaaliseen taakkaan (Pillaiyar et al., 2017). Siksi on välttämätöntä kehittää tehokkaita ja turvallisia ihonvalkaisuaineita.

Viime vuosina melaniinisolubiologiasta on tullut laajempi tutkimusala ja useita tärkeitä melanogeneesiin ja melanosomien kuljetuksiin vaikuttavia proteiineja on selvitetty, mikä mahdollistaa melaniinin synteesin estäjien tunnistamisen. Tyrosinaasi on yksinomaan välttämätön melanogeneesille ja tyrosinaasin katalyyttisen vaikutuksen estäminen on yleisin menetelmä melaniinin tuotannon vähentämiseksi (D'Mello et al., 2016). Useita tunnettuja tyrosinaasiestäjiä, mukaan lukien arbutiini ja kojiinihappo, on jo kehitetty kosmeettisiksi lisäaineiksi (Ding et al., 2020). KIF5b- ja Rab27A-Melanophilin-Myosin Va -kompleksi edistävät melanosomin kulkeutumista ulospäin (Ohbayashi ja Fukuda, 2012; Noguchi et al., 2014). Cdc42 säätelee dendriitin venymistä, mikä on välttämätöntä melanosomin siirtymiselle (Luo, 2000). Näiden yllä olevien proteiinien esto voi merkittävästi tukahduttaa melanosomin kuljetusta, joka on tärkeä mekanismi ihon valkaisuaineiden kehittämisessä. Mikroftalmiaan liittyvä transkriptiotekijä (MITF) on melanogeneesin päätranskriptiotekijä. Lisäksi MITF säätelee myös melanosomin kuljetusta indusoimalla Rab27a:n ja Cdc42:n ilmentymistä (Noguchi et al., 2016). Useat signalointireitit osallistuvat pigmentaatioon säätelemällä MITF:n ilmentymistasoa. cAMP-proteiinikinaasi A:n (PKA) aktivoituminen stimuloi pigmentaatiota cAMP-vasteelementtiä sitovan proteiinin (CREB) riippuvaisen MITF-ilmentymisen lisääntymisen kautta (Rodríguez ja Setaluri, 2014). Sitä vastoin solunulkoisen signaalin säätelemän proteiinikinaasin (ERK) aktivaatio estää melanogeneesiä kiihdyttämällä MITF:n hajoamista (Lv et al., 2020a). On kehitetty lukuisia anti-melanogeenisiä aineita, jotka kohdistuvat tyrosinaasiaktiivisuuteen, melanosomin siirtoon tai melanogeenisuuteen liittyviin signalointireitteihin. Kuitenkin harvat inhibiittorit kävivät tutkimuksissa in vivo ja osoittivat hyviä tuloksia (Pillaiyar et al., 2017).

Kurkumiini on diaryyliheptanoidiyhdiste, joka on eristetty Curcuma longan (Zingiberaceae) juurakosta ja jota käytetään keltaisena makuaineena tai pigmenttinä elintarvikkeissa (Zheng J. et al., 2018). Tutkimukset ovat osoittaneet sen erilaisia ​​fysiologisia toimintoja, mukaan lukien anti-inflammatoriset, antioksidanttiset, anti-amyloidit ja kasvaimia estävät vaikutukset (Liu et al., 2016; Zheng Y. et al., 2018). Näiden lisäksi kurkumiini estää tyrosinaasiaktiivisuutta ja estää melanogeneesiä melanosyyteissä (Lee et al., 2010; Tu et al., 2012). Mutta kurkumiinin huono biologinen hyötyosuus rajoittaa sen käyttöä (Karthikeyan et al., 2020). Tämän ongelman ratkaisemiseksi J147 on kehitetty tehokkaaksi kurkumiinijohdannaisen yhdisteeksi, jolla on suurempi stabiilisuus ja biologinen hyötyosuus (Li et al., 2020). J147:llä on hermostoa suojaava vaikutus, ja se on tällä hetkellä Alzheimerin taudin vaiheen I kliinisissä tutkimuksissa. Kuitenkaan vielä ei ole raportoitu J147:n vaikutuksista pigmentaatioon in vitro ja in vivo.

MATERIAALIT JA MENETELMÄT

Reagenssit

J147 (J302241), -MSH (M118985) ja tyrosinaasi sienestä (T128536) saatiin Aladdinilta (Shanghai, Kiina). Saimme vasta-aineita Myosin Va (sc-365986), KIF5b (sc-133184), GP100 (sc-393094), Cdc42 (sc-8401), Rab27a (sc{{) 13}}), p-JNK (sc-6254), JNK (sc-7345), p-p38 MAPK (sc-166182) ja p38 MAPK (sc-398546) Santa Cruzista (CA, USA). Vasta-aineet MITF:ää (97800), p-MEK:ää (2338), MEK:tä (4694), p-ERK:tä (4370) ja ERK:ta (4695) vastaan ​​saatiin Cell Signaling Technologylta (MA, USA). Vasta-aineet tyrosinaasia (ab180753), TRP-1 (ab235447), TRP-2 (ab221144), sytokeratiinia (ab7753) ja S100 (ab133519) vastaan ​​hankittiin Abcamilta (Cambridge, UK). p38-inhibiittori SB203580 (S1863), ERK-inhibiittori PD98059 (S1805), BCA-proteiinimäärityspakkaus (P0012), solulyysipuskuri (P0013) ja -aktiini (AF5001) saatiin Beyotimelta (Shanghai, Kiina). RT-qPCR-sarjat (RR036A) ostettiin Takara Biomedical Technologylta (Peking, Kiina).

Soluviljely

MTT-määritys

Solujen elinkelpoisuutta tutkittiin MTT-määrityksellä (Yun et ai., 2020). Lyhyesti sanottuna solut kylvettiin 96-kuoppalevyille ja niitä käsiteltiin J147:llä (1–8 μM) 48 tunnin ajan. Sitten solut pestiin PBS:llä ja korvattiin MTT-liuoksella (20 µl). 4 tunnin lisäinkuboinnin jälkeen supernatanttiliuos poistettiin ja DMSO:ta (200 µl) lisättiin jokaiseen kuoppaan. Lopuksi määritettiin optinen absorbanssi 570 nm:ssä.

Melaniinipitoisuuden mittaus

Solut, joiden tiheys oli 2 × 105 solua/ml, kylvettiin 6-kuoppaviljelylevyille. 24 tunnin inkubaation jälkeen soluja viljeltiin eri annoksilla J147:ää (1, 2, 4 µM) ja -MSH:n (60 nM) stimulaation kanssa tai ilman sitä. 48 tunnin käsittelyn jälkeen solut kerättiin ja solupelletissä oleva melaniinin kokonaismäärä liuotettiin 100 µl:aan NaOH-työliuosta (1 mol/L, 10 % DMSO) 80 °C:ssa 1 tunnin ajan, ja absorbanssi mitattiin arvossa 405 nm (Lv et ai., 2015; Lv et ai., 2019).

Tyrosinaasin aktiivisuusmääritys

Solujen tyrosinaasiaktiivisuutta tutkittiin aiemmin kuvatulla tavalla (Liao et ai., 2017; Lv et ai., 2020a). Lyhyesti sanottuna solut hajotettiin solulyysipuskurilla kolmen pesun jälkeen, ja sitten supernatantti tyrosinaasiaktiivisuusmääritykseen saatiin sentrifugoimalla lysaatit. 100 µl PBS:ää (0,1 M, pH 6,5), joka sisältää 10 ug proteiineja sekoitettuna 100 µl:aan 0,1-prosenttista L-DOPAa. Levyä inkuboitiin 37 asteessa 1 tunti, ja sitten tarkkailtiin optista absorbanssia 475 nm:ssä.

J147:n suora vaikutus tyrosinaasiaktiivisuuteen testattiin soluttomalla järjestelmällä, kuten aiemmin on kuvattu (Lv et ai., 2020a). Lyhyesti sanottuna reaktio sienten tyrosinaasin aktiivisuuden määrittämiseksi suoritettiin 96-kuoppalevyllä ja reaktioseos sisälsi sienityrosinaasia (10 yksikköä), L-tyrosiinia (0,03 prosenttia, 50 µl) ja 100 µl PBS:ää. (0,1 M, pH 6,5) lisäämällä eri konsentraatioilla J147:ää. Kun oli inkuboitu 37 asteessa 10 minuuttia, absorbanssi 475 nm:ssä mitattiin käyttämällä mikrolevyspektrofotometriä.

Masson-Fontana ammoniakkihopeavärjäys

Melaniinipigmentin havaitsemiseksi ihopalat ja melanosyytit kiinnitettiin formaliiniin ja värjättiin standardiprotokollan mukaisesti (Gu et al., 2018; Lv et al., 2020b). Lyhyesti sanottuna objektilasit pestiin 3 kertaa deionisoidulla vedellä ja inkuboitiin sitten ammoniakkihopealiuoksessa huoneenlämpötilassa 12 tuntia. Hyvin deionisoidussa vedessä huuhtelun jälkeen objektilaseja inkuboitiin hypoliuoksessa 5 minuuttia. Seuraavaksi objektilasit huuhdeltiin uudelleen ja vastavärjättiin neutraalilla punaisella tahralla vielä 5 minuuttia. Lopuksi, perusteellisen huuhtelun jälkeen objektilaseja tarkkailtiin Nikon-Eclipse-Ti-mikroskoopilla.

Immunofluoresenssi melanosomin siirtoa varten

B16F10- ja HaCaT-solujen yhteisviljelyjärjestelmä perustettiin konfokaalimaljalle, kuten aiemmin on kuvattu (Lee et al., 2015; Lv et al., 2020c). J147-käsittelyn jälkeen solut immunovärjättiin anti-GP100:lla ja anti-sytokeratiinilla standardiprotokollan mukaisesti. Kuvat on otettu Nikon-Eclipse-Ti-mikroskoopilla.

S{0}}:n immunohistokemia

S-100:n immunohistokemia suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla (Lee et al., 2013; Lv et al., 2020b). Lyhyt kuvaus oli seuraava: objektilasit estettiin 5-prosenttisella BSA:lla 25 °C:ssa 1 tunnin ajan ja inkuboitiin sitten anti-S-100 primaarisen vasta-aineen kanssa 4 °C:ssa yön yli. Seuraavana päivänä objektilasit pestiin 3 kertaa TBST-liuoksella ja inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen kanssa. Sitten objektilasit käsiteltiin aminoetyylikarbatsolilla leikkeiden kehittämiseksi ja niitä tarkkailtiin mikroskoopilla.

Käänteinen transkriptio-PCR

Solujen kokonais-RNA uutettiin TRIzol-reagenssilla ja kvantifioitiin spektrofotometrisesti. Sitten SuperScript II -käänteistranskriptaasia käytettiin yksijuosteisen syntetisoimiseencDNA valmistusohjeiden mukaisesti.Oligonukleotidialukkeet ostettiin GenScriptiltä(Nanjing, Kiina). SekvenssejäMITFgeenialukkeet ovat 5′- AGAGCAGGGCAGAGAGTGAGTG -3′, 5′-AACTTGATTCCAGGCTGATGATGTC -3′. SekvenssejäGAPDHgeenialukkeet ovat 5′- AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′, 5′- TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA -3′. PCR-tuotteet olivaterotettiin elektroforeesilla 1-prosenttisilla agaroosigeeleillä ja havaittiinultraviolettivalossa (Lee ym., 2013).

Western Blotting

Proteiinit (40 ug) erotettiin SDS-PAGE-geeleillä ja siirrettiin nitroselluloosasuodatin (NC) -kalvoille elektroforeettisella siirtojärjestelmällä (Bio-Rad). NC-kalvot estettiin 3-prosenttisella BSA:lla TBST-liuoksessa huoneenlämpötilassa 1,5 tunnin ajan. Sitten kalvoja inkuboitiin primääristen vasta-aineiden kanssa 4 asteessa yön yli. Seuraavana päivänä blotit pestiin 3 kertaa TBST-liuoksella ja inkuboitiin sitten peroksidaasiin konjugoitujen sekundaaristen vasta-aineiden kanssa 25 asteessa 1 tunnin ajan ja visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssia (Lv et ai., 2020d).

Melaniinipitoisuuden määritys seeprakalamallissa

Lyhyesti sanottuna synkronoidut alkiot kerättiin ja järjestettiin pipetillä (kolmesta neljään alkiota kuoppaa kohden 200 μL alkioelatusaineella 96-kuoppalevyillä). Sitten J147 ja PTU liuotettiin 0,1-prosenttiseen DMSO:hon ja lisättiin alkioalustaan ​​35 - 60 tuntia (25 tunnin altistus). J147:n vaikutus seeprakalan melanogeneesiin havaittiin stereomikroskoopilla (Zheng J. et al., 2018).

Fenotyyppiin perustuva arviointi ja UVB-indusoitu hyperpigmentaatio marsumalli

8 ruskeaa marsua (6 viikkoa, noin 250–300 g) ostettiin Institute of Laboratory Animal Science -instituutista (Peking, Kiina). Näitä marsuja pidettiin yksin vakiolämpötila- ja kosteushuoneessa 12-h valo/pimeä-jakson alla. Jokaisen eläimen selän erilliset alueet (1 cm halkaisijaltaan ympyrä) altistettiin 500 mJ/cm2 UVB:lle (Sigma SH-4, Shanghai, Kiina) kerran päivässä 1 viikon ajan hyperpigmentaatiomallin luomiseksi. Sitten vehikkeliä (PEG400/EtOH=7:3) ja J147:ää (1 prosentti) annettiin hyperpigmentoituneille alueille (20 µl liuosta ympyrää kohti) kahdesti päivässä 3 viikon ajan. Pigmentaatioaste arvioitiin laskemalla ΔL-arvo spektrofotometrillä mitatun L-arvon mukaan (YS3010, 3nh, Shenzhen, Kiina) seuraavasti: ΔL=L (jokaisena mitattuna päivänä)-L (päivänä 0) (Lee et al., 2013; Lv et ai., 2020b). Kaikki tämän tutkimuksen eläintoimenpiteet hyväksyttiin Changzhoun yliopiston eläinten hoito- ja käyttökomiteassa.

Tilastollinen analyysi

TULOKSET

J147 Vähentynyt melanogeneesi ja dendriittien määrä B16F10-soluissa

J147:n rakenne on esitetty kuvassa 1A. Ensin suoritettiin solujen elinkelpoisuuskoe sen tutkimiseksi, oliko J147 sytotoksinen B16F10-soluille. Kuten kuvasta 1B näkyy, J147:n sytotoksisia vaikutuksia ei havaittu annosalueella 1–8 μM 48 tunnin jälkeen. Sitten tutkimme J147:n vaikutusta melaniinin synteesiin. Kuten kuviossa 1C esitetään, J147 esti melaniinin perussynteesiä. -MSH edistää merkittävästi melanogeneesiä melanosyyteissä. -MSH:n indusoima melanogeneesin lisääntyminen kääntyi päinvastaiseksi J147-hoidon jälkeen. Johdonmukaisesti Masson-Fontana ammoniakkihopeavärjäys osoitti, että J147 vähensi huomattavasti melaniinipitoisuutta B16F10-soluissa -MSH:n kanssa tai ilman sitä (kuva 1D). Lisäksi dendriittien lukumäärä ja pituus sekä melaniinipitoisuus dendriiteissä laskivat myös verrattuna käsittelemättömiin soluihin (kuva 1D). Tulokset viittasivat siihen, että J147 vähensi melanogeneesiä ja dendriitin muodostumista ilman sytotoksisia vaikutuksia.

J147 esti solujen tyrosinaasin aktiivisuutta ja tyrosinaasin ilmentymistä, TRP-1, TRP-2

Proteiinien tyrosinaasiperhe (tyrosinaasi, TRP-1 ja TRP-2) osallistui melanogeneesiin. Näiden joukossa tyrosinaasit ovat avainentsyymejä, jotka säätelevät melaniinin biosynteesireittiä (D'Mello et al., 2016). Sen määrittämiseksi, vaikuttaako J147 tyrosinaasiaktiivisuuteen, käytimme ensin L-DOPA-hapetusmenetelmää määrittääksemme J147:n vaikutukset solujen tyrosinaasiaktiivisuuteen. J147:n (1–4 µM) osoitettiin olevan syvästi estäviä vaikutuksia solujen tyrosinaasiaktiivisuuteen annosriippuvaisella tavalla B16F10-soluissa (kuva 2A). Seuraavaksi suoritettiin sienityrosinaasiaktiivisuusmääritys J147:n suorien vaikutusten määrittämiseksi tyrosinaasiaktiivisuuteen. Kuten kuviossa 2B esitetään, estäviä vaikutuksia ei havaittu, mikä osoittaa, että J147 ei vaikuttanut sienityrosinaasin entsymaattisiin aktiivisuuksiin (kuvio 2B). Kuten tiedämme, melanogeneesiä säätelee näiden tyrosinaasien aktiivisuus ja määrät. Sen tutkimiseksi, korreloivatko J147:n anti-melanogeeniset vaikutukset tyrosinaasin ilmentymisen kanssa, suoritettiin Western blot -analyysi. Kuten kuvassa 2C esitetään, tyrosinaasin ilmentymistasot vähenivät merkittävästi J147-käsittelyn jälkeen -MSH:lla tai ilman sitä, ja samat tulokset havaittiin TRP-1- ja TRP-2-ilmentymisessä. Nämä havainnot osoittivat, että J147 esti solujen tyrosinaasin aktiivisuutta ja melanogeneesiä alentamalla tyrosinaasin, TRP-1 ja TRP-2 ilmentymistasoja.

J147 esti melanosomikuljetusta säätelemällä myosiini Va:n, Rab27a:n ja Cdc42:n ilmentymistä

Ihmisen ihon pigmentaatio määräytyy melaniinin synteesin sekä melaniinin jakautumisen perusteella. Nisäkkään melanosyyteissä melaniinia valmistetaan pääasiassa solurungossa jakulkeutuu aktiinifilamentteja pitkinja mikrotubulukset dendriiteiksi ja lopuksiviereisiin keratinosyytteihin loppuunjakelukäsitellä asiaa (Ohbayashi ja Fukuda, 2012). Kuten näkyyKuva 1D, J147 vähensi huomattavasti dendriitin muodostumista.Lisäksi melaniinipitoisuus dendriiteissä oli myösvähentynyt, kun melaniinipigmentti aggregoitui perinukleaariseenalueilla. Seuraavaksi viljelimme yhdessä B16F10- ja HaCaT-solujatutkia, vaikuttaako J147melanosomin siirtyminenkeratinosyytit konfokaalimikroskopialla. Jakelumelaniinia nähtiin HaCaT-soluissa yhteisviljelmässämalli (Kuvio 3A). Sitä vastoin kun yhteiskulttuurimalli olikäsitelty J147:llä 48 tunnin ajan, melanosomi rakeiset signaalit sisäänHaCaT-solut olivat merkittävästivähennetty (Kuvio 3A).

Selvittääksemme edelleen J147:n melanosominsiirron estovaikutusten taustalla olevaa mekanismia, tutkimme useita melanosomin kuljetukseen liittyviä keskeisiä tekijöitä. KIF5b välittää melanosomin kuljetusta ulospäin mikrotubuluksia pitkin, ja Rab27a Melanophilin-Myosin Va -kompleksi myötävaikuttaa melanosomin kuljetukseen melanosyyttien aktiinifilamentteja pitkin (Reiner et al., 2020). Lisäksi Cdc42 stimuloi dendriittien muodostumista melanosyyteissä, jolla on myös olennainen rooli melanosomin kuljetuksessa. Kuten kuviossa 3B esitetään, Cdc42:n, Myosin Va:n ja Rab27a:n, mutta ei KIF5b:n, ilmentyminen väheni merkittävästi J147-käsittelyn jälkeen tilassa, jossa oli tai ei -MSH:ta. Tuloksemme osoittivat, että J147 esti melanosomin kuljetusta vähentämällä Myosin Va:n, Rab27a:n ja Cdc42:n ilmentymistä.

J147 Nopeutettu MITF:n hajoaminen

MITF on yksi tärkeimmistä melanogeneesin säätelijöistä ja se säätelee tyrosinaasin, TRP-1, TRP-2, Cdc42 ja Rab27a:n geenitranskriptiota (Noguchi et al., 2016; Kim et al., 2019). ). Tutkimme ensin J147:n vaikutusta MITF-transkripteihin. Kuten kuviossa 4A esitetään, -MSH lisäsi huomattavasti MITF-transkriptiota, mutta mitään muutosta ei havaittu J147-hoidon jälkeen, mikä osoittaa, että J147 ei vähennä MITF-ilmentymistä. Seuraavaksi tutkimme, vaikuttaako J147 MITF:n käännökseen. Kuten kuviossa 4B esitetään, -MSH-käsittelyn jälkeen MITF-proteiinitasot nousivat, saavuttivat huippunsa 4 tunnin kohdalla ja alkoivat laskea 8 tunnin kohdalla (kuvio 4B). Erilailla MITF:n proteiinitasot eivät laskeneet 4 tunnin kuluttua J147-käsittelystä, mutta 8 tunnin kohdalla MITF-proteiinitasot laskivat nopeasti havaitsemattomille tasoille, mikä osoittaa, että J147 ei vaikuta MITF:n translaatioon, mutta kiihdyttää huomattavasti MITF-proteiinin hajoamista.

J147 tukahdutti melanogeneesin MEK/ERK-signalointireitin kautta

Mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasit (MAPK), mukaan lukien solunulkoinen signaalin säätelemä proteiinikinaasi (ERK), p38 ja c-jun N-terminaalinen kinaasi (JNK), näyttelevät ratkaisevaa roolia pigmentaatiossa (Lee et al., 2013). ERK-fosforylaation tiedetään helpottavan MITF:n hajoamista ja lopulta hajottavan melanogeenisiä ärsykkeitä, mikä edustaa suurta negatiivista palautemekanismia (Kwon et al., 2017). P38:n ja JNK-reitin toiminta on kuitenkin edelleen kiistanalaista. Siksi tutkimme J147:n vaikutusta MAPK-signalointireitteihin. Kuten kuviossa 5A esitetään, J147 aktivoi MEK/ERK:n ja p38:n, kun taas JNK-signalointireitin fosforylaatiossa ei havaittu mitään vaikutusta.

Lisätietoja: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501