Abstrakti

Tausta: On raportoitu, että emoaine vähentää melaniinin synteesiä ja estää melanogeneesiin liittyvien proteiinien ja geenien ilmentymistä. Tässä tutkimuksessa arvioimme Apis melliferan emoaineesta peräisin olevan 10-hydroksi-2-dekaanihapon (10-HDA) melanogeenista ja pigmenttiä poistavaa aktiivisuutta.

Jotkut tutkimukset ovat ehdottaneet sitäcistanchevoi auttaa estämään ihon ikääntymistävähentää oksidatiivista stressiäjatulehdus, jotka molemmat voivat edistäärypyt, tummia kohtiaja muita ikääntymisen merkkejä. On kuitenkin epäselvää, onkocistanchevoivaalentaa ihoataivähentää pigmentaatiota. Lyhyesti sanottuna, vaikka cistanchella voi olla joitakin hyödyllisiä vaikutuksia ihoon, ei ole selvää, voidaanko sitä käyttää luotettavanaihon valkaisuunagentti. On aina parasta kysyä ihotautilääkäriltä neuvoja turvallisista ja tehokkaista tavoista hoitaa ihoasi.

Napsauta Cistanche Tubulosaa valkaisua varten

Lisätietoja:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Menetelmät:Tässä tutkimuksessa arvioimme {{0}}HDA:n valkaisuaktiivisuutta verrattuna muutoksiin solunsisäisessä tyrosinaasiaktiivisuudessa, melaniinipitoisuudessa ja melaniinin tuotantoon liittyvissä proteiinitasoissa B16F1-melanoomasoluissa {{4-hoidon jälkeen. }}HDA. Lisäksi ihoa valkaiseva vaikutus arvioitiin levittämällä hiirten iholle (C57BL/6 J) voidetuotetta, joka sisälsi 0,5 prosenttia, 1 prosenttia ja 2 prosenttia 10-HDA:ta 3 viikon ajan DL:n vaikutuksen havaitsemiseksi. *-arvot.

Tulokset:Tulokset osoittivat, että 10-HDA esti MITF-proteiinin ilmentymistä (IC50 0.86 mM) B16F1-melanoomasoluissa. Western blot -analyysi paljasti, että 10-HDA esti tyrosinaasin aktiivisuutta ja tyrosinaasiin liittyvän proteiini 1:n (TRP-1), TRP-2:n ja mikroftalmiaan liittyvän transkriptiotekijän (MITF) ilmentymistä B16F1-melanoomasoluissa. Lisäksi hiirien iholle levitetyllä 10-HDA:lla on huomattavasti kohonnut keskimääräinen ihon valkaisuindeksi (L-arvo).

Johtopäätökset:Validointitiedot osoittivat 10-HDA:n potentiaalin käyttää ihon pigmentaation estämisessä. 10-HDA:ta ehdotetaan estämään melanogeneesiä, joten sitä voitaisiin kehittää kosmeettiseksi ihonhoitotuotteeksi.

Avainsanat:Kuninkaallinen hyytelö, 10-hydroksi-2-dekaanihappo, melanogeneesi, ihon valkaisu, melanogeneesin estäjä

Tausta

Kuninkaallinen hyytelö (RJ) on nuoren työmehiläisen (Apis mellifera) erite, jota tuottavat hypofaryngeaaliset ja alaleuan rauhaset, ja kehittyvä mehiläinen ruoki sitä yksinomaan hänen elinaikansa [1]. RJ tarjoaa korkeat ravintoarvot, koska niissä on runsaasti proteiineja, vapaita aminohappoja, lipidejä, vitamiineja ja sokereita [2, 3]. RJ:n bioaktiiviset proteiinit ovat tärkeimmät emoaineproteiinit (MRJP), apisimiini ja royalisointi, jotka ovat osoittaneet immunosäätelyä ja antibakteerisia vaikutuksia useissa tutkimuksissa [4–6]. 10-hydroksi-2--dekaanihappo (10-HDA) oli RJ:n tärkein rasvahappo, jolla on useita terveydelle myönteisiä vaikutuksia ihmisille. Se on osoittanut kasvaintenvastaista, antibakteerista ja immunomoduloivaa vaikutusta [7 –9]. 10-HDA löytyy vain RJ:stä, joten sitä on käytetty emoainetuotteiden laatumerkkinä [10, 11]. Useat RJ:n farmakologiset aktiivisuudet on jo vahvistettu eläinkokeissa, ja farmakologiset aktiivisuudet mukaan lukien antioksidantti [12, 13], anti-inflammatorinen [14], kasvainten vastainen [15, 16], anti-agenees [17], antibakteerinen [18–20], verisuonia laajentava [21, 22], hypertensiivinen [21, 22], antihyperkolesteroleeminen [23], munuaisia ​​suojaava [24] ja ihoa valkaiseva vaikutus [25]. Sen ravintoarvon ja ihmisten terveydellisen hyödyn perusteella markkinoilla on yhä enemmän kaupallisia RJ-tuotteita.

Eläinten ja ihmisten ihon väri liittyy ihon melaniinipigmentin pitoisuuteen. Melaniinin tehtävänä on suojata ihoa UV-valon aiheuttamilta vaurioilta, mutta melaniinin liiallinen kerääntyminen aiheuttaa vakavia ihosairauksia, kuten värjäytymistä sekä pigmentoitunutta ja kiihtynyttä ihon ikääntymistä [26]. Melaniini syntetisoitui epidermiksen sisimmän kerroksen melanosyyteissä melanogeneesimekanismien kautta [27]. Melanogeneesi on monimutkainen biosynteesireitti, jota kontrolloivat tyrosinaasi, tyrosinaaseihin liittyvät proteiinit 1 ja 2 (TRP-1 ja TRP-2) ja mikroftalmiaan liittyvä transkriptiotekijä (MITF) [28, 29]. Tyrosinaasi on nopeutta rajoittava entsyymi, joka säätelee melaniinin synteesiä. Melaniinin tuotannon ensimmäinen vaihe on L-tyrosiinin hydroksylaatio L-3,4-dihydroksifenyylialaniiniksi (L-DOPA) ja L-DOPA:n muuntaminen dopakinoniksi [30]. TRP-2 katalysoi dopakromista muunnetun 5,6--dihydroksi-indolikarboksyylihapon ja TRP-2-tuotteen, 5,6--dihydroksi-indolikarboksyylihapon tuotantoa. TRP-1-substraatti muuttuu indoli-5,6-kinonikarboksyylihapoksi, mikä lopulta johtaa melaniinin synteesiin [31, 32]. Melaniinin synteesin estäminen melanogeneesin hajoamisen kautta olisi tärkein tapa ehkäistä tai parantaa hyperpigmentoituneita häiriöitä, kuten melasmaa ja ikääntymistä. Siksi potentiaalisen, turvallisen ja tehokkaan yhdisteen etsiminen melanogeneesin näiden tekijöiden säätelemiseksi olisi huomionarvoista lääketieteellisessä ja kosmeettisessa teollisuudessa [25, 33, 34].

Kuninkaallisen hyytelön on osoitettu vähentävän melaniinin synteesiä [22], mutta tärkein aktiivinen yhdiste tai näiden RJ:n vaikutusten taustalla oleva mekanismi on edelleen tuntematon. Aiemmassa tutkimuksessamme havaitsimme, että 10-HDA voi estää tyrosinaasiaktiivisuutta (julkaisematon data). Tässä tutkimuksessa 10-HDA:n tyrosinaasia estävää vaikutusta arvioitiin edelleen. Melaniinin biosynteesi in vitro -malleja käyttäen B16F10-melanoomasoluviljelmää ja eläinmallia hiirestä iholle levitettäessä suoritettiin molemmat 10-HDA:n melanogeneesiä estävän vaikutuksen tutkimiseksi.

menetelmät

10-HDA:n valmistus emoaineesta

Kuninkaallisen hyytelön valmisti Fu-Chang Beekeeping Hualienissa Taiwanissa. 3-päiväikäiset toukat siirrettiin kehyksissä oleviin kuningatarsolukuppeihin, ja jokainen kehys sisälsi 30 kuningatarkuppia. Kehykset siirrettiin mehiläispesäihin ja RJ kerättiin 72 tuntia toukkien siirtämisen jälkeen. Jokainen pesä sisältää noin 25,000 mehiläistä [35]. Kerätyt RJ-näytteet pidettiin -20 asteessa jatkoanalyysiin asti. Kuningatarhyytelöä (40 g) refluksoitiin metanolin kanssa (400 ml x 4 x 30 min), ja supernatantti kerättiin sentrifugoimalla 4500 x g 30 minuutin ajan. Supernatantti konsentroitiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin raakauute (10,76 g), jonka nimi oli RJM. Metanoliin suspendoitu RJM puhdistettiin silikageelipylväskromatografialla (Si02CC) ja eluoitiin sitten kloroformi- ja metanoligradienteilla (300:1 - 1:1), jolloin saatiin kymmenen TLC:llä analysoitua fraktiota. Fraktioissa 4 ja 5 oli merkittäviä täpliä, ja siksi ne alistettiin lisäpuhdistukselle ja -analyysille. Fraktiot 4 ja 5 puhdistettiin toistuvasti SiO2 CC:llä (eluoitiin kloroformilla/metanolilla, 300:1 - 1:1) ja kiteytettiin edelleen asetonilla, jolloin saatiin 10-hydroksi-2-dekaanihappoa ({{32} } HDA). Puhdistetun tuotteen kemiallinen rakenne varmistettiin NMR- ja GC-massaspektrianalyysillä. 10-HDA-kvantitatiivinen analyysi määritettiin korkean suorituskyvyn nestekromatografialla (HPLC) Waters 1525 -pumppujärjestelmällä, joka oli varustettu Water 2489 -detektorilla, RP-8 GP250 -kolonnilla (4,6 mm) ja Waters-kolonnilla. 717plus automaattinen näytteenottolaite. Liikkuva faasi oli metanoliliuos (60:40 v/v ultrapuhdas ja deionisoitu vesi), jonka pH säädettiin fosforihapolla arvoon 2,5, suodatettiin kalvon läpi (0,45 μm) ja siitä poistettiin kaasut 5 minuuttia. Liikkuvan faasin virtausnopeus säädettiin arvoon 1,0 ml/min, ja havaitseminen suoritettiin aallonpituudella 225 nm. 10HDA:n pitoisuus lopullisessa puhdistetussa näytteessä on 90 prosenttia, jota käytetään jatkoanalyysiin.

Soluviljely ja 10-HDA-hoidot

B16F10-melanoomasoluja (BCRC-numero: 60 031) viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle's -elatusaineessa (DMEM), johon oli lisätty 10 prosenttia (tilavuus/tilavuus) naudan sikiön seerumia, 37 asteessa kostutetussa, CO2--kontrolloidussa (5 prosenttia) inkubaattorissa. . Solut kylvettiin sopivalla solutiheydellä 24-kuoppa- tai 6-kuoppalevyyn. Yhden päivän inkubaation jälkeen soluja käsiteltiin erilaisilla 10-HDA-pitoisuuksilla. Välinettä käytettiin kontrolliryhmässä 10-HDA:n sijaan. Sen jälkeen solut kerättiin ja niitä käytettiin erilaisiin määrityksiin.

Solujen elinkyvyn mittaus

Solujen elinkelpoisuus mitattiin {{0}}(4,5-dimetyylitiatsol-2--yyli)-2,5 -difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) -määrityksellä menetelmä, jonka ovat raportoineet Carmichael et ai. [36]. B16F10 melanoomasoluja viljeltiin DMEM:ssä, joka sisälsi 10 % FBS:ää ja 1 % L-glutamiinia (4 mM) 5 % C02-inkubaattorissa 37 asteessa. Viljellyt solut (1 × 104 solua/kuoppa) kylvettiin 96-kuoppalevylle, 10-HDA (liuotettu dimetyylisulfoksidiin (DMSO)) laimennettiin elatusaineella pitoisuudella 1, 0,5, 0,1 mM ja kojiinihappoa 1 mM lisättiin kuoppiin. Elatusainetta käytettiin tyhjänä. 24-h inkubaation jälkeen 37 asteessa alle 5 prosentin CO2:ssa elatusaine poistettiin kustakin kuopasta, sitten kuopat pestiin PBS:llä (1 M fosfaattipuskurisuolaliuos) kahdesti. 200 ul MTT-liuosta (2 mg/ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan. Reaktio lopetettiin lisäämällä 100 µl DMSO:ta 4- tunnin inkubaation jälkeen. Kunkin kuopan absorbanssi mitattiin aallonpituudella 540 nm käyttämällä immunoanalyysilukijaa (BIO-TEK, Winooski, VT) [20–23]. Solujen elinkelpoisuus määritettiin seuraavalla yhtälöllä: Solujen elinkelpoisuus (prosentti)=[(AB)/C] × 100 prosenttia, A: näytteen absorbanssitilavuus, B: nollanäytteen absorbanssitilavuus, C: kontrolliabsorbanssitilavuus.

Solujen melaniinipitoisuuden mittaus

B16F10-melanoomasolujen solunsisäinen melaniinipitoisuus mitattiin käyttämällä modifioitua menetelmää, jonka ovat kuvanneet Bilodeau et ai., [37]. B16F10-melanoomasoluviljelyn lopussa solut kerättiin ja pestiin PBS:llä. Kerätyt solut hajotettiin kylmässä lyysipuskurissa (20 mM natriumfosfaattia (pH 6,8), 1 % Triton X-100, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF), 1 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA)). Kun oli sentrifugoitu 15,000 x g 30 minuutin ajan, pelletit liuotettiin 1 N NaOH:hon, joka sisälsi 20 % DMSO:ta, 1 tunnin ajan 60 asteessa. Supernatantin proteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä Bradford-määritystä. Absorbanssi aallonpituudella 405 nm mitattiin ja melaniinipitoisuus laskettiin synteettisen melaniinin tunnettua standardia vastaan. Melaniinitaso (prosenttia)=[(AB)/C] × 100 prosenttia ; A: näytteen absorbanssitilavuus; B: nollanäytteen absorbanssitilavuus; C: säädä absorbanssitilavuutta.

Solujen tyrosinaasin aktiivisuuden mittaus

Tyrosinaasiaktiivisuusmääritys suoritettiin Martinez-Esparzan et ai. [38] aiemmin kuvaaman menetelmän mukaisesti pienin muutoksin. B16F10-melanoomasolut hajotettiin 20 mM natriumfosfaatissa (pH 6,8), 1 prosentissa Triton X-100:ssa ja 1 mM fenyylimetaanisulfonyylifluoridissa tai PMSF:ssä ja sentrifugoitiin 14, 000 rpm 15 minuuttia. Kunkin supernatantin proteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä Bradford-määritystä, jossa oli naudan seerumialbumiini (BSA) proteiinistandardina. Tyrosinaasiaktiivisuus määritettiin reaktioseoksessa (1 ml), joka sisälsi 50 mM fosfaattipuskuria (pH 6,8), 2 mM L DOPA:ta ja 300 ug supernatanttiproteiineja. Kun oli inkuboitu 37 asteessa 15 minuuttia, absorbanssi 475 nm:ssä mitattiin käyttämällä mikrolevylukijaa. Tyrosinaasiaktiivisuus (prosenttia)=[(AB)/C] × 100 prosenttia ; A: näytteen absorbanssitilavuus; B: nollanäytteen absorbanssitilavuus; C: säädä absorbanssitilavuutta.

Western blot -analyysi

Solut pestiin 3 kertaa jääkylmässä PBS:ssä ja hajotettiin RIPA-puskurissa (pH 7,4, 50 mM tris, 0,1 % SDS, 50 mM NaCl, 1 % NP-40, 1 mM PMSF, 10 ug/ml aprotiniinia ja 10 ug/ml leupeptiinia). Lysaatin alikvoottia käytettiin proteiinipitoisuuden määrittämiseen Bradford-määrityksen menetelmällä käyttäen naudan seerumin albumiinia standardina. Proteiinit (40 ug) erotettiin 10-prosenttisella SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja blotattiin Hybond-C Extra -nitroselluloosakalvolle (Amersham Bioscience, UK). Kalvot suojattiin 5-prosenttisella rasvattomalla maidolla Tris-puskurisuolaliuoksessa (TBS), joka sisälsi 10 mM Tris-HCl:a, pH 7,5 ja 150 mM NaCl:a, 30 minuutin ajan. MITF, tyrosinaasi, dopakromitautomeraasi 2 (TRP-2), TRP-1 ja -aktiini (sisäisenä kontrollina) havaittiin käyttämällä kanin polyklonaalisia vasta-aineita, vastaavasti. Kalvoja inkuboitiin edelleen vuohen polyklonaalisen sekundaarisen vasta-aineen kanssa kanin IgG-H&L:lle (HRP). Kaikki sitoutuneet vasta-aineet havaittiin sitten käyttämällä Super Signal® West Pico Chemiluminescent Substratea (ECL) (Thermo Scientific). Kunkin kaistan signaalin intensiteetti kvantifioitiin densitometrijärjestelmällä Gel Doc TM / Chemi Doc TM Universal hood II (Bio-Rad), joka oli varustettu integraattorilla ja normalisoitiin sisäisen kontrollin intensiteetillä.

Depigmentointiaktiivisuuden määrittäminen hiirillä

Depigmentointiaktiivisuus määritettiin hiirimallijärjestelmän kautta Tai et al.:n modifioidulla protokollalla. [39]. Tutkimuksen hyväksyi National Formosa Universityn eettinen komitea (hyväksyntänumero: 10,401). Viiden viikon ikäiset naaraspuoliset mustat hiiret (C57BL/6 J), jotka painoivat 20-25 g, ostettiin National Animal Laboratory Centeristä Taipeista. Kaikkien kokeiden ajan eläimiä pidettiin ilmastoidussa huoneessa, jonka lämpötila oli vakio (25 ± 2 astetta), ja niitä pidettiin 12 tunnin valo:pimeä-syklissä. Eläimet sopeutuivat 7 päivää ennen koetta. Karvan ajelun jälkeen eläimet saivat 1-päivälepoa. 10-HDA:ta sisältävät geelinäytteet valmistettiin dispergoimalla lääkkeet vaseliiniin. Yhteensä neljäkymmentä hiirtä jaettiin tasan viiteen ryhmään ja jokaiselle ryhmälle levitettiin kahdesti päivässä 0,1 g vaseliinia (kontrolli), 1 % kojiinihappoa vaseliinissa, 0,5 % , 1 % tai 2 % 10-HDA vaseliinissa . Levityksiä jatkettiin 3 viikkoa, ja ihon valkaisuindeksi (L-arvo) mitattiin samalta ihoalueelta joka päivä DermaLab® Combolla (Cotex Technology, Tanska), joka on kolorimetrinen instrumentti, joka käyttää korkean intensiteetin valkoista väriä. LED valonlähteenä. Kolorimetrinen instrumentti on kytketty tietokoneeseen [40]. Otimme huomioon vain L-parametrin, ja L-arvo oli suhteellinen kirkkaus, joka vaihteli kokonaismustasta (L=0) kokonaisvalkoiseen (L=100). Alkuperäinen ihon valkaisuindeksin L-arvo määritettiin kunkin hiiren iholta ennen testattujen aineiden levittämistä.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tämän tutkimuksen tulokset analysoitiin käyttämällä yleistä lineaarista mallimenettelyä, joka on saatavilla Statistical Analysis System -ohjelmistopaketin versiosta 9.1 (Statistical Analysis System Institute, 2002). Duncanin monialuetestiä [41] käytettiin havaitsemaan eroja hoitojen keskiarvojen välillä. Jokainen koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Tulokset

10-HDA:n vaikutus B16F1-melanoomasolujen elinkelpoisuuteen

Optimaalinen annos solujen elinkelpoisuusmäärityksestä MTT:llä B16F1-melanoomasoluissa on esitetty kuvassa 1. Se osoitti selvästi, että 10-HDA ei ollut sytotoksinen B16F1-melanoomasoluille pitoisuuksilla 0,1, { {8}},5 ja 1 mM, ja kojiinihappo ei ollut sytotoksinen melanoomasoluille pitoisuudella 1 mM. Solujen elinkelpoisuus laski merkittävästi (20 prosentin lasku) melanoomasoluissa, jotka altistettiin 1,5 mM 10-HDA:lle (P < 0.05) (tietoja ei näy) ja 5 mM kojiinihappoa. Siksi seuraavissa kokeissa käytettiin pitoisuuksia 0,1, 0,5, 1 mM 10-HDA:ta ja 1 mM kojiinihappoa.

Tyrosinaasiaktiivisuuden ja melaniinin synteesin estäminen B16F10-melanoomasoluissa 10-HDA:lla

Kojihappo on tehokas ja hyvin tunnettu melanogeneesiä estävä aine, ja sitä käytettiin positiivisena kontrollina tässä tutkimuksessa. 10-HDA vähensi merkittävästi (p < 0.05) melaniinin synteesiä ja tyrosinaasin aktiivisuutta verrattuna hoitamattomien B16F1-melanoomasolujen kontrolliin. Annoksella 1 mM 10- HDA indusoi 28 ± 2,4 prosentin laskun solujen tyrosinaasiaktiivisuudessa (P < 0.01) ja 40,4 ± 3 .0 prosentin väheneminen solujen melaniinin synteesissä (P < 0,001), kun taas kojiinihappo (1 mM) vähensi myös merkittävästi tyrosinaasin aktiivisuutta ja melaniinin synteesiä 14,4 ± 3,7 prosenttia (P < 0,05) ja 19,3 ± 1,5 prosenttia (P) < 0,001) (kuviot 2 ja 3).

Tyrosinaasin, TRP-1 ja TRP-2 proteiinin ilmentymisen estäminen B16F10-melanoomasoluissa 10-HDA:lla

Sen tutkimiseksi, voiko 10-HDA vaikuttaa melanogeeniseen proteiinin ilmentymiseen, suoritettiin Western blot -analyysi käyttämällä 10-HDA:lla käsiteltyjen B16F10-melanoomasolujen lysaattia (kuva 4). 10-HDA esti dramaattisesti tyrosinaasin, TRP-1 ja TRP-2 ilmentymistä B16F1-melanoomasoluissa verrattuna käsittelemättömien solujen ilmenemiseen (kuviot 4b–d). -aktiini, kodinhoitoproteiini, jota käytettiin sisäisenä kontrollina, ei osoittanut muutosta. 10-HDA esti kojiinihappoa muistuttavien melanogeenisten entsyymien proteiinien ilmentymistasoja.

10-HDA:n estävä vaikutus B16F10-solujen melanogeenisiin tekijöihin liittyvään proteiinitasoon

Nisäkässoluissa tapahtuvan melanogeneesin aikana MITF:llä on tärkein säätelijärooli TRP-reitin synteesissä, mukaan lukien TYR, TRP{0}} ja TRP-2 [25, 26]. 10-HDA:n vaikutus MITF-ilmentymiseen arvioitiin Western blot -menetelmällä. B16F1{{10}} melanoomasolut altistettiin erilaisille 10- HDA:n pitoisuuksille (0,1, 0,5 ja 1 mM), mikä johti 10-HAD:n aiheuttamaan MITF:n ilmentymisen heikkenemiseen ( kuva 4e). IC50-arvon 10-MITF-ilmentymisen HDA-suppression arvoksi arvioitiin 0.{18}} mM. Nykyiset tulokset viittaavat siihen, että 10-HDA alentaa MITF-proteiinitasoja. 10-HDA:n hypopigmentaatiovaikutus voi johtua vähentyneestä MITF-geenin ilmentymisestä, mikä sitten tukahduttaisi tyrosinaasin, TRP-1 ja TRP-2 proteiini- ja geeniekspression.

10-HDA:n depigmentointiaktiivisuuden arviointi in vivo hiirillä

Ihmisen annostuksen spekuloimiseksi käytimme hiiriä eläinmallina tutkiaksemme {{0}}HDA:n depigmentointiaktiivisuutta. Parranajon jälkeen hiiriä käsiteltiin 1 prosentilla kojiinihapolla vaseliinissa, 0,5 prosentilla, 1 prosentilla tai 2 prosentilla 10-HDA:lla vaseliinissa, ja ihon vaalenemisindeksi mitattiin ja kirjattiin. Tässä in vivo -tutkimuksessa käytimme kojiinihappoa positiivisena kontrollina. Kojic-happoa käytetään laajasti ihon pigmentin poistohoitona ympäri maailmaa. Ensimmäisen hoitoviikon jälkeen ihon valkaisuaste lisääntyi merkittävästi 10- HDA:lla hoidetuilla hiirillä verrattuna kontrolliin, ja kasvu jatkui kokeen loppuun asti. 0,5, 1 ja 2 prosentin 10-HDA:n pigmentinpoistoaktiivisuus oli verrattavissa 1 prosentin kojiinihapon vastaavaan aktiivisuuteen. Tuloksemme paljastivat, että 10-HDA pystyi merkittävästi edistämään ihon valkaisua hiirten iholla jopa 0,5 prosentin pitoisuudella (kuva 5). Siksi 10-HDA näyttää olevan hyvä ehdokas ihon valkaisuaineeksi ihon hyperpigmentaation hoitoon.

Keskustelu

Melaniinin synteesiä säätelee tyrosinaasin, TRP1:n ja TRP2:n monimutkainen entsymaattinen kaskadi. Melanogeneesiin liittyvän geenin ja proteiinin eston aste on tärkeä rooli depigmentoivan aineen tehokkuudessa, jota yleensä käytetään hyperpigmentaation hoidossa tai kosmeettisissa tuotteissa [28]. 10-HDA:n todellisen melanogeneesin estävän vaikutuksen selvittämiseksi B16F10-solujen melaniinipitoisuus ja solunsisäinen tyrosinaasiaktiivisuus määritettiin samalla pitoisuusalueella. Tulokset kuvioissa 2 ja 3 osoittivat, että 10-HDA osoitti korkeampaa estoaktiivisuutta melaniinin synteesiä kohtaan B16F10-soluissa kuin kojiinihappo. Tiedot paljastivat, että 10- HDA estää melanogeneesin B16F10-melanoomasoluissa.

Melanogeneesiä hallitsee ainakin kolme säätelyproteiinia, tyrosinaasi, TRP1 ja TRP2 nisäkkään melanosyyteissä [29]. TRP-1, TRP-2 ja MITF:n ilmentyminen estyi kaikki B16F10-melanoomasoluissa, joita käsiteltiin 10-HDA:lla. MITF on tärkeä transkriptiotekijä, joka säätelee melanogeenisten entsyymien, kuten tyrosinaasin, TRP-1 ja TRP-2, ilmentymistä [42, 43]. Western blot -tietojemme mukaan (kuva 4) 10-HDA:lla käsitellyt nisäkässolut vähentäisivät kaikkien nopeutta rajoittavien entsyymien, mukaan lukien tyrosinaasin, TRP-1 ja TRP-2, ekspressiota. ja estää melaniinin epänormaalia kertymistä melanogeneesiprosessin aikana. Nämä tiedot viittaavat siihen, että 10- HDA voisi estää melanogeneesiprosessia estämällä MITF:n ilmentymisen. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että 10-HDA estää melanogeneesiä heikentämällä MITF-proteiinin, tyrosinaasin ja melaniinin tuotantoa. 10-HDA:n MITF:n ilmentymistä estävä reitti erosi muista melanogeneesin estäjistä, kuten kojiinihaposta, arbutiinista ja askorbiinihaposta, jotka eivät vaikuttaneet MITF:n ilmentymiseen [44, 45]. Tämä viittaa siihen, että 10-HDA:lla on erinomaiset mahdollisuudet käyttää turvallisena ja luonnollisena ihonvalkaisuaineena funktionaalisessa kosmetiikassa [46].

Melanooma, ihosyöpä, syntyy melanosyyttien muodostamasta pahanlaatuisesta trans-muodosta. Kroonisesti auringon vaurioittamassa ihossa, limakalvon pinnoissa ja akraaliihossa syntyneet melanoomat johtuivat BRAF:n ja NRAS:n yliaktivoinnista [47], CDKN2A-lokuksen häviämisestä [48], MITF:n yli-ilmentymisestä [49], yliaktivoinnista Kit [50]. ], yliaktivoi mGluR1 [51, 52]…et ai. Tässä tutkimuksessa 10-HDA saattoi estää MITF:n ilmentymisen B16F10-melanoomasoluissa. Tämä osoitti, että 10-HDA voi olla ainesosa iholääkkeissä tai syövän vastaisessa melanoomassa.

RJ:tä on käytetty monissa dermatologisissa valmisteissa, mukaan lukien ihon virkistys, ihon uudistaminen, nuorentaminen, parantuvan palamisen tai haavan paraneminen [53, 54]. Lisäksi raportoitiin, että jotkin tyydyttymättömät rasvahapot RJ:ssä voivat estää melaniinin synteesiä ja tyrosinaasin aktiivisuutta, mikä johtaa melanogeneesin heikkenemiseen [55], ja osoitimme, että RJ:n depigmentaatiovaikutus saattaa johtua {{3 }}HDA. Koska hiirten iho on samanlainen kuin ihmisten, käytimme hiiriä in vivo -eläinmallina tutkittaessa 10-HAD:n depigmentointiaktiivisuutta. Kuten kuvasta 5 näkyy, ihon värin ihon valkaisuindeksi kasvoi merkittävästi 10-HAD:lla hoidetuilla hiirillä verrattuna kontrolliin. Lisäksi Koya-Miyata et ai. arvioitiin 10-HDA:n kollageenin tuotantoa edistävää aktiivisuutta fibroblastisolulinjoissa, jotka tuottavat trans-muodostavan kasvutekijän- 1 (TGF- 1), joka on tärkeä tekijä kollageenin tuotannossa [55] . Siksi 10-HDA näyttää olevan erittäin lupaava luonnollinen yhdiste ihon uudistamiseen ja hyperpigmentaation hoitoon.

Johtopäätös

10-HDA esti tyrosinaasin aktiivisuuden lisäksi myös melanogeenisten entsyymien ilmentymiä, mukaan lukien tyrosinaasin, TRP-1 ja TRP-2, estämällä MITF:n B16F10-melanoomasoluissa. Tämän seurauksena melaniinin pigmentti väheni B16F10-melanoomasoluissa. Lisäksi in vivo -eläinmalli osoitti 10-HDA:n depigmentoivan aktiivisuuden paikallisessa käytössä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että 10-HDA:lla on ehdokas, joka voisi olla turvallinen ja luonnollinen melanogeneesin estäjä kosmetiikkateollisuudelle, jossa luonnollisen ja tehokkaan yhdisteen etsiminen on yksi erittäin tärkeistä tavoitteista paremman ihonhoitotuotteen kehittämisessä. .

Lyhenteet

10-HDA: 10-hydroksi-2-dekaanihappo; BSA: naudan seerumialbumiini; DMEM: Dulbeccon modifioitu Eagle's medium; DMSO: dimetyylisulfoksidi; EDTA: etyleenidiamiinitetraetikkahappo; L-DOPA: L-3,4- dihydroksifenyylialaniini; MITF: mikroftalmiaan liittyvä transkriptiotekijä; MRJP: tärkeimmät emoaineproteiinit; MTT: 3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5--difenyylitetratsoliumbromidi; PBS: fosfaattipuskurisuolaliuos; PMSF: fenyylimetaanisulfonyylifluoridi tai fenyylimetyylisulfonyylifluoridi; TLC: ohutkerroskromatografia; TRP-1: tyrosinaasiin liittyvä proteiini 1; TRP- 2: tyrosinaasiin liittyvä proteiini 2

Kiitokset

Kiitämme Li-Yu Leetä Fu-Chang Beekeepingistä emoaineen valmistamisesta

Rahoitus

Tätä työtä tuki Taiwanin tiede- ja teknologiaministeriön apuraha (MOST102–2622-B-150-002-CC2 ja MOST 103–2313-B-150 -001 -MY2 CC Peng).

Tietojen ja materiaalien saatavuus

Kaikki tämän tutkimuksen aikana tuotetut tai analysoidut tiedot sisältyvät tähän julkaistuun artikkeliin ja sen lisätietotiedostoihin.

Tekijöiden panokset

CCP suunnitteli ja suunnitteli kokeet. HZS ja IPL suorittivat kokeet. CCP ja PCK analysoivat tiedot. CCP, PCK ja JCL tarjosivat reagensseja/materiaaleja/analyysityökaluja. CCP ja IPL kirjoittivat ja korjasivat paperin. Kaikki kirjoittajat hyväksyivät käsikirjoituksen lopullisen version.

Tekijöiden tiedot

CCP, biotekniikan tohtori, apulaisprofessori Biotekniikan laitoksella, National Formosa University. HZS, biotekniikan maisteri, valmistunut National Formosa Universityn biotekniikan laitokselta. IPL, biotekniikan tohtori, tutkimus- ja kehitysosaston johtaja, Challenge Bioproducts Co., Ltd. PCK, kemian tohtori, apulaisprofessori Biotekniikan laitoksella, National Formosa University. JCL, Honey Bee Town Co., Ltd:n pääjohtaja.

Eettinen hyväksyntä

Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin National Formosa Universityn eettisessä komiteassa (hyväksyntänumero: 10 401) ja ne vastasivat laboratorioeläinten hoitoa ja käyttöä koskevia ohjeita.

Suostumus julkaisuun

Ei sovelleta tässä osiossa. Tämä artikkeli ei ole kliininen tutkimus, johon osallistuu ihmisiä, eikä tämä käsikirjoitus sisällä yksittäisiä kliinisiä tietoja.

Kilpailevat kiinnostuksen kohteet

Kirjoittajat ilmoittavat, että heillä ei ole kilpailevia etuja

Kustantajan huomautus

Springer Nature pysyy neutraalina julkaistujen karttojen ja institutionaalisten yhteyksien suhteen.

Tekijän tiedot

1 Biotekniikan laitos, National Formosa University, Huwei, Yunlin, Taiwan. 2 Tutkimus- ja kehitysosasto, Challenge Bioproducts Co., Ltd., Douliou, Yunlin, Taiwan. 3 Honey Bee Town Co., Ltd., nro.{3}} Huaxi, 970 Hualien City, Taiwan.

Vastaanotettu: 9. maaliskuuta 2017 Hyväksytty: 21. heinäkuuta 2017

Julkaistu verkossa: 9. elokuuta 2017

Viitteet

1. Chen C, Chen S. Muutokset proteiinikomponenteissa ja Royal Jellyn varastointistabiilisuudessa eri olosuhteissa. Food Chem. 1995;54:195–200.

2. Takenaka T. Kuninkaallisen hyytelön kemiallinen koostumus. Honeybee Sci. 1982; 3:69–74.

3. Schmitzova J, Klaudiny J, Albert S, Schroder W, Schreckengost W, Hanes J, Judova J, Simuth J. Mehiläisen Apis Mellifera L. Cell Mol Life Sci. 1998;54:1020–30.

4. Okamoto I, Taniguchi Y, Kunikita T, Kohno K, Iwaki K, Ikeda M. Major royal hyytelöproteiini 3 moduloi immuunivasteita in vitro ja in vivo. Life Sci. 2003;1:2029–45.

5. Fujiwara S, Imai J, Fujiwara M, Yaeshima T, Kawashima T, Kobayashi K. Tehokas antibakteerinen proteiini emoaineessa. J Biol Chem. 1990;265:11333–7.

6. Bilikova J, Hanes J, Nordhoff E, Saenger W, Klaudiny J, Simuth J. Apisimin, uusi seriini-valiinirikas peptidi mehiläisestä (Apis Mellifera L.) emoaineesta: puhdistus ja molekyylien karakterisointi. FEBS Lett. 2002;528:125–9.

7. Townsend GF, Brown WH, Felauer EE, Hazlett B. Tutkimukset rasvahappojen kasvainten vastaisesta vaikutuksesta in vitro. IV. Happojen esterit, jotka ovat läheisesti sukua 10- hydroksi-2-dekaanihapoille emoaineesta siirrettävän hiiren leukemiaa vastaan. Can J Biochem Physiol. 1961;39:1765–70.

8. Blum MS, Novak AF, Taber S. 10-Hydroksi-2Δ-dekaanihappo, emoaineesta löytyvä antibiootti. Sci. 1959; 130:452–3.

9. Vucevic D, Melliou E, Vasilijic S, Gasic S, Ivanovski P, Chinou I, Colic M. Kuninkaallisen hyytelöstä eristetyt rasvahapot moduloivat dendriittisoluvälitteistä immuunivastetta in vitro. Int Immunopharmacol. 2007;7:1211–20.

10. Weaver N, Law JH. Kuninkaallisen hyytelön rasvahappojen heterogeenisyys. Luonto. 1960; 188:938–9.

11. Antinelli JF, Zeggane S, Davico R, Rognone C, Faucon JP, Lizzani L. (E)-10-hydroksidien ja eenihapon arviointi emoaineen tuoreusparametrina. Food Chem. 2003;80:85–9.

12. Takeshi N, Reiji I. Kuninkaallisen hyytelön vesiuutteen ja alkalisen uutteen valmistus ja toiminnalliset ominaisuudet. Food Chem. 2004;84:181–6.

13. Takeshi N, Mizuho S, Rriji I, Hachiro I, Nobutaka S. Joidenkin kaupallisten hunajan, emoaineen ja propolisin antioksidanttivaikutus. Food Chem. 2001;75: 237–40.

14. Martos MV, Navajas YR, López JF. Hunajan, propolisin ja kuninkaallisen hyytelön toiminnalliset ominaisuudet. J Food Sci. 2008;73:117–24.

15. Hiroshi I, Masamitsu S, Kazuhiro T, Yoko A, Satoshi M, Hideaki H. Mehiläistuotteet estävät VEGF:n aiheuttaman angiogeneesin ihmisen napalaskimon endoteelisoluissa. BMC Complement Altern Med. 2009; 9:1–10.

16. Tamura T, Fujii A, Kuboyama N. Antitumor Effects of Royal Jelly (RJ). Nippon Yakurigaku Zasshi. 1987;89:73–80.

17. Park HM, Cho MH, Cho Y, Kim SY. Kuninkaallinen hyytelö lisää kollageenin tuotantoa rotan ihossa munasarjojen poiston jälkeen. J Med Food. 2012;15:568–75. doi: 10.1089/jmf. 2011/1888.

18. Izuta H, Shimazawa M, Tsuruma K, Araki Y, Mishima S, Hara H. Mehiläistuotteet estävät VEGF:n aiheuttaman angiogeneesin ihmisen napalaskimon endoteelisoluissa. BMC Complement Altern Med. 2009; 6:489–94.

19. Tseng JM, Huang JR, Huang HC, Tzen JTC, Chou WM, Peng CC. Antimikrobisen peptidin-Royalisinin ja sen vasta-aineen helpottava tuotanto keinotekoisen öljyrunkojärjestelmän kautta. Biotechnol Prog. 2011;27:153–61.

20. Bílikova K, Huang SC, Lin IP, Šimuth J, Peng CC. Apis Melliferan emoaineesta peräisin olevan antimikrobisen peptidin, royalisoinnin, rakenne ja antimikrobinen vaikutus. Peptidit. 2015; 68:190–6.

21. Okuda H, Kameda K, Morimoto C, Matsuura Y, Chikaki M, Jiang M. Tutkimukset insuliinin kaltaisista aineista ja estoaineista angiotensiiniä muuntavaa entsyymiä vastaan ​​emoaineessa. Mitsubachi Kagaku. 1998;19:9–14.

22. Shinoda M, Nakajin S, Oikawa T, Sato K, Kamogawa A, Akiyama Y. Biokemialliset tutkimukset vasodilatatiivisesta tekijästä emoaineessa. Yakugaku Zasshi. 1978;98:139–45. 23. Vittek J. Kuninkaallisen hyytelön vaikutus seerumin lipideihin koe-eläimillä ja ihmisillä, joilla on ateroskleroosi. Kokemus. 1995;51:927–35.

24. Ibrahim A, Eldaim MA, Abdel-Daim MM. Mehiläishunajan ja emoaineen munuaisia ​​suojaava vaikutus subkroonista sisplatiinimyrkyllisyyttä vastaan ​​rotilla. Sytoteknologia. 2016; 68:1039–48.

25. Han SM, Yeo JH, Cho YH, Pak SC. Royal Jelly vähentää melaniinin synteesiä säätelemällä tyrosinaasin ekspressiota. Am J Chin Med. 2011; 39:1253–60.

26. Gilchrest BA, Eller MS. DNA:n valovaurio stimuloi melanogeneesiä ja muita valolta suojaavia vasteita. J Investig Dermatol Symp Proc. 1999;4:35–40.

27. D'Mello SAN, Finlay GJ, Baguley BC, Askarian-Amiri ME. Signalointireitit melanogeneesissä. Int J Mol Sei. 2016; 17:1144. doi: 10.3390/ijms17071144.

28. Kobayashi T, Vieira WD, Potter B, Sakai C, Imokawa G, kuuleva VJ. Melanogeenisen proteiinin ilmentymisen modulaatio EU:sta feomelanogeneesiin siirtymisen aikana. J Cell Sei. 1995; 108:2301–9.

29. Kim SS, Kim MJ, Choi YH, Kim BK, Kim KS, Park KJ, Park SM, Lee NH, Hyun G. Tyrosinaasin, TRP-1, TRP-2 ja MITF:n heikkeneminen Sitruspuristekakkujen ilmentymät hiiren B16 F10 -melanoomassa. Asian Pac J Trop Biomed. 2013;3: 617–22.

30. Land EJ, Ito S, Wakamatsu K, Riley PA. Eumelanogeneesin kahden ensimmäisen kemiallisen vaiheen nopeusvakiot. Pigment Cell Res. 2003;16:487–93.

31. Yen FL, Wang MC, Liang CJ, Ko HH, Lee CW. Melanogeneesin estäjät Phyla nodiflora -uutteesta. Evid Based Complement Alternative Med 2012; Tunnus: 867494. doi 10.1155/2012/867494.

32. Tachibana M. MITF: pigmenttisoluille virtaava virta. Pigment Cell Res. 2000; 3:230–40.

33. Jung SO, Kim DH, Son JH, Nam KC, Ahn DU, Jo CR. Munankeltuaisen fosfitiinin toiminnallinen ominaisuus melanogeneesin estäjänä. Food Chem. 2012; 135: 993–8.

34. Yeon HK, Youn OJ, Cho CW, Son DW, Park SJ, Rho JH, Sang YC. Kanelihapon estävät vaikutukset melaniinin biosynteesiin ihossa. Biol Pharm Bull. 2008;31:946–8.

35. Liu JR, Yang YC, Shi LS, Peng CC. Kuninkaallisen hyytelön antioksidanttiset ominaisuudet liittyvät toukkien ikään ja sadonkorjuuaikaan. J Agri Food Chem. 2007;56: 11447–52.

36. Carmichael J, DeGraff WG, Gazdar AF, Minna JD, Mitchell JB. Tetratsoliumiin perustuvan puoliautomaattisen kolorimetrisen määrityksen arviointi: kemosensitiivisyyden testauksen arviointi. Cancer Res. 1987;47:936–42.

37. Bilodeau ML, Greulich JD, Hullinger RL, Bertolotto C, Ballotti R, Andrisani O. MP-2 stimuloi tyrosinaasigeenin ilmentymistä ja melanogeneesiä erilaistuneissa melanosyyteissä. Pigment Cell Res. 2001;14:328–36.

38. Martinez-Esparza M, Jimenez-Cervantes D, Solano F, Lonzano JA, JC CB. Tuumorinekroositekijä-alfan melanogeneesin estomekanismi hiiren B16/F10-melanoomasoluissa. Eur J Biochem. 1998; 255:139–46.

39. Ding HY, Chang TS, Shen HC, Tai SK. Hiiren tyrosinaasi-inhibiittorit Cynanchum Bungeista ja depigmentointiaktiivisuuden arviointi in vitro ja in vivo. Exp Ihotauti. 2011;20:720–4.

40. Takiwaki H, Serup J. Psoriaattisten plakkien väriparametrien mittaus kapeakaistaisella reflektanssispektrofotometrialla ja tristimuluskolorimetrialla. Skin Pharmacol. 1994;7:145–50.

41. Montgomery DC. Kokeet yhdellä tekijällä: Varianssianalyysi. Kokeiden suunnittelussa ja analysoinnissa. Montgomery, DC, toim., John Wiley and Sons, New York, 1991; 75–77.

42. Park HY, Wu C, Yonemoto L, Murphy-Smith M, Wu H, Stachur CM. MITF välittää cAMP:n indusoimaa proteiinikinaasi Cb:n ilmentymistä ihmisen melanosyyteissä. Biochem J. 2006;395:571-8.

43. Goding CR. Mitf hermoharjasta melanoomaan: signaalin transduktio ja transkriptio melanosyyttilinjassa. Genes Dev. 2000;14:1712–28.

44. Kim DS, Park SH, Kwon SB, Li K, Youn SW, Park KC. (−)-epigallokatekiini-3- gallaatti ja hinokitioli vähentävät melaniinin synteesiä vähentämällä MITF-tuotantoa. Arch Pharm Res. 2004;27:334–9.

45. Choi YK, RhoYK, Yoo KH, Lim YY, Li K, Kim BJ. C-vitamiinin ja monivitamiinin vaikutukset melanogeneesiin: Vertaileva tutkimus in vitro ja in vivo. Harjoittelija J Dermatol. 2011;49:218–26.

46. ​​Dynek JN, Chan SM, Liu J, Zha J, Fairbrother WJ, Vucic D. Mikroftalmiaan liittyvä transkriptiotekijä on melanooman apoptoosin estäjän kriittinen transkription säätelijä. Cancer Res. 2008;68:3124–32.

47. Curtin JA, Fridlyand J, Kageshita T, Patel HN, Busam KJ, Kutzner H, Cho KH, Aiba S, Bröcker EB, LeBoit PE, Pinkel D, Bastian BC. Selkeät joukot geneettisiä muutoksia melanoomassa. N Engl J Med. 2005;353(20):2135–47.

48. Chan SH, Lim WK, Scott T Michalski ST, Lim JQ, NDB, Met-Domestici M, Young CNC, Vikstrom K, Esplin ED, Fulbright J, Ang MK, Wee J, Sittampalam K, Farid M, Lincoln SE, Itahana K, Abdullah S, The BT, Ngeow J. CDKN2A-CDKN2B-lokuksen sukusolujen hemitsygoottinen deleetio potilaalla, jolla on Li-Fraumenin oireyhtymä. npj Genominen lääketiede. 2016; doi:10.1038/ npjgenmed.2016.15

49. Hartman ML, Czyz M. MITF melanoomassa: sen ilmentymisen ja aktiivisuuden takana olevat mekanismit. Cell Mol Life Sei. 2015;72:1249–60. doi:10.1007/s00018-014- 1791-0.

50. Antonescu CR, Busam KJ, Francone TD, Wong GC, Guo T, Agaram NP, Besmer P, Jungbluth A, Gimbel M, Chen CT, Veach D, Clarkson BD, Paty PB, Weiser MR. L576P KIT -mutaatio anaalimelanoomissa korreloi KIT-proteiinin ilmentymisen kanssa ja on herkkä spesifiselle kinaasi-inhibitiolle. Int J Cancer. 2007; 121:257–64.

51. Abdel-Daim M, Funasaka Y, Komoto M, Nakagawa Y, Yanagita E, et ai. Metabotrooppisen glutamaattireseptorin alatyypin 1 farmakogenomiikka ja pahanlaatuisen melanooman muodostuminen in vivo. J Dermatol. 2010;37:635–46.

52. Ohtani Y, Harada T, Funasaka Y, Nakao K, Takahara C, et ai. Metabotrooppinen glutamaattireseptorin alatyyppi-1 on välttämätön melanooman in vivo -kasvulle. Onkogeeni. 2008;27:7162–70.

53. Kim J, Kim Y, Yun H, Park H, Kim SY, Lee KG, Han SM, Cho Y. Kuninkaallinen hyytelö tehostaa ihmisen ihon fibroblastien kulkeutumista ja muuttaa kolesterolin ja sfinganiinin tasoja in vitro -haavojen paranemismallissa. Nutr Res Pract. 2010;4:362–8.

54. Fujii A, Kobayashi S, Kuboyama N, Furukawa Y, Kaneko Y, Ishihama S, Yamamoto H, Tamura T. Haavojen paranemisen lisääminen emoaineella (RJ) streptotsotosiinidiabeettisilla rotilla. Jpn J Pharmacol. 1990;53:331–7.

55. Koya-Miyata S, Okamoto I, Ushio S, Iwaki K, Ikeda M, Kurimoto M. Kollageenin tuotantoa edistävän tekijän tunnistaminen emoaineuutteesta ja sen mahdollinen mekanismi. Biosci Biotechnol Biochem. 2004; 68:767–73.

Lisätietoja: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501