Proteiinien toiminnallisia ominaisuuksia voidaan parantaa tiettyjen proteaasien hydrolyysin avulla

Ota yhteyttäoscar.xiao@wecistanche.comLisätietoja

Abstrakti:Sikojen jätteiden käsittelyn parantamismenetelmien tutkimiseksi sian ihoa hydrolysoitiin käyttämällä erilaisia kaupallisesti saatavia proteaaseja (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Bromelain, Protamex ja Papain) useissa optimaalisissa olosuhteissa. Entsymaattisen hydrolyysin jälkeen kollageenihydrolysaatit (CH:t) fraktioitiin molekyylipainon (3 kDa) mukaan kalvoultrasuodatuksella. CHS analysoitiin fysikaalisten ominaisuuksien (pH, proteiinin talteenotto, vapaiden aminoryhmien pitoisuus, molekyylipainojakautuma ja aminokoostumus) sekä toiminnallisten ominaisuuksien (antioksidanttiaktiivisuus ja ikääntymistä estävä vaikutus). CH:ista Alcalasella (CH-Alcalase) hydrolysoiduilla CH:illa oli korkein hydrolyysiaste verrattuna muihin CH:ihin. Sekä "CH-Alcalase" että "CH-Alcalase".<3 kda"="" fractions="" showed="" a="" considerably="" high="" antioxidant="" activity="" and="" collagenase="" inhibition="" activity.="" therefore,="" resulting="" bioactive="" have="" the="" potential="" for="" development="" as="" antioxidants="" and="" anti-aging="" ingredients="" in="" the="" food,="" cosmetics,="" and="" pharmaceuticals,="" from="" animal="">

Avainsanat:hydrolyysi; kaupalliset proteaasit; kollageenihydrolysaatti; antioksidantti; ikääntymistä vastaan

KSL29

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja

1. Esittely

Elinajan pidentyessä ihon ikääntymistä estävät toimenpiteet saavat paljon huomiota. Kollageenia, jota käytetään ihonhoitotuotteissa kosmeettisena ainesosana ikääntymisen estämiseen, käytetään laajalti kosmetiikkamarkkinoilla. Kollageeni on suurimolekyylipainoinen, kuitumainen eläinperäinen proteiini, jota löytyy runsaasti ihmisten ja eläinten sidekudoksesta, ihosta, jänteistä, rustoista, nivelsiteistä, hampaista, kynsistä ja hiuksista. Karja on edelleen tärkein teollisen kollageenin lähde[1]. Elintarvike- ja lihateollisuus hävittää vuosittain suuria määriä karjan sivutuotteita maailmanlaajuisesti jätteenä. Näitä voidaan kuitenkin hyödyntää tärkeinä proteiiniresursseina uusissa elintarvikemateriaaleissa tai muuntaa lisäarvotuotteiksi hydrolyysin avulla, jota käytetään laajalti proteiinien toiminnallisten ja ravitsemuksellisten ominaisuuksien parantamiseen ja parantamiseen [2,3]. Kollageenia pidetään myös yhä enemmän bioaktiivisten peptidien lähteenä, jotka ovat osoittautuneet lupaaviksi hyödyllisinä yhdisteinä käytettäväksi ravitsemus- tai farmaseuttisissa sovelluksissa.vesisäiliön edut,Siksi kollageenin hydrolyysillä voi olla tärkeä rooli sen biologisen hyötyosuuden ja soveltuvuuden parantamisessa erilaisissa kaupallisissa prosesseissa.

Bioaktiivisten peptidien fysiologiset aktiivisuudet, jotka tavallisesti sisältävät 2-20 aminohappotähdettä (<6000 da),="" are="" based="" on="" the="" composition="" and="" sequence="" of="" their="" amino="" acids="" [2,4].="" due="" to="" their="" structural="" properties="" such="" as="" molecular="" weight,="" bioactive="" peptides="" may="" possess="" specific="" characteristics="" that="" affect="" numerous="" physiological="" processes="" related="" to="" antimicrobial,="" antioxidant,="" emulsifying,="" antihypertensive,="" antidiabetic,="" and="" immunomodulatory="" functions="" in="" organisms[1,5,6].="" generally,="" low="" molecular="" weight="" hydrolysates="" display="" lower="" viscosity,="" better="" dispersion,="" higher="" hydrophobicity,="" and="" smaller="" particle="" size="" [7].="">cistanche-kolesteroliHydrolyysiaste vaikuttaa suoraan hydrolysaattien molekyylipainoon ja aminohappokoostumukseen [8]. Siksi hydrolyysiprosessi voi olla tarpeen uusien bioaktiivisten peptidien tuottamiseksi.

KSL30

Cistanche voi estää ikääntymistä

Proteiinihydrolyysi, joka johtaa peptidisidosten katkeamiseen, voidaan suorittaa entsymaattisten tai kemiallisten prosessien avulla [9]. Kemialliset prosessit, mukaan lukien emäksinen tai happohydrolyysi liuotinuutolla, ovat haitallisia paitsi ympäristölle myös ihmisille, jotka kuluttavat syntyviä tuotteita [4,10]. Kemialliset prosessit, joita on vaikea hallita, tuottavat modifioituja aminohappoja sisältäviä tuotteita [9]. Sitä vastoin entsymaattinen hydrolyysi voidaan suorittaa miedoissa olosuhteissa, jolloin vältetään äärimmäiset ympäristöt, joita kemialliset käsittelyt vaativat. Lisäksi prosessit eivät aiheuta sivureaktioita eivätkä vähennä proteiinilähteen ravintoarvoa [8]. Useita proteaaseja, mukaan lukien Alcalase, pepsiini, Protamex, trypsiini ja Neutrase, käytetään yleisesti proteiinien hydrolysoimiseen, mikä johtaa erityyppisiin proteiinihydrolysaatteihin ja peptideihin, joilla on erilaisia biofunktionaalisia aktiivisuuksia. Eräässä tutkimuksessa kerrottiin, että sian ihon gelatiinista tuotettiin antioksidanttisesti vaikuttavia kollageenihydrolysaatteja käyttämällä pepsiinin ja pankreatiinin entsymaattista hydrolyysiä [11].cistanche deserticolan sivuvaikutuksetLohen sivutuotteet hydrolysoitiin peptisten hydrolysaattien tuottamiseksi käyttämällä erilaisia proteaaseja, joissa lopullisilla peptideillä oli erinomaisia antioksidanttisia ja anti-inflammatorisia ominaisuuksia [12].

Tutkimuksen tavoitteena oli:(a) tunnistaa aktiivisimmat kollageenihydrolysaatit, jotka on tuotettu entsymaattisella hydrolyysillä käyttämällä erilaisia kaupallisesti saatavilla olevia proteaaseja (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Protamex, Bromelain ja Papain);(b) vahvistaa fraktiointivaikutus entsymaattisesta hydrolyysistä saadut kollageenihydrolysaatit ja (c) niiden in vitro antioksidantti- ja ikääntymistä ehkäisevien vaikutusten määrittämiseksi.

2. Tulokset ja keskustelu

2.1. Entsymaattisen hydrolyysin vaikutus kollageenihydrolysaatteihin

2.1.1.pH

Proteiinien toiminnallisia ominaisuuksia voidaan parantaa tiettyjen proteaasien aiheuttaman hydrolyysin avulla. Tässä tutkimuksessa käytettiin kuutta eri proteaasia (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Bromelain, Protamex ja Papain) kollageenin hydrolysoimiseen sian ihosta, jotta saatiin aktiivisia kollageenihydrolysaatteja, joilla on pieni molekyylipaino.cistanche annostus redditKollageenihydrolysaattien (CH) pH:n muutos on esitetty kuvassa 1. Kollageenisuspension (5 % sian nahkaseos) pH oli alun perin 6.39-6,55 (0 tunnin kohdalla). CH-Alcalase ja CH-Flavorzyme saavuttivat optimaalisen pH:n (pH 8.0) 12 tunnin inkubaatiossa. CH-Protamex, CH-Bromelain ja CH-Papain saavuttivat optimaalisen pH:n (pH7.0) 6 tunnin inkuboinnin jälkeen, kun taas CH-Flavorzyme jatkoi laskemista pH:sta 6,39:stä pH 5,69:ään 24 tunnin inkuboinnin ajan (kuva) 1). Proteiinihydrolysaatin pH on tärkeä tekijä, joka säätelee entsymaattisia hydrolyysireaktioita[13]. Siksi kollageenihydrolysaattien muodostuminen erilaisissa pH-olosuhteissa voi johtua pH-riippuvaisista muutoksista entsyymin konformaatiossa, mikä voi vaikuttaa niiden bioaktivaatioon ja fysikaalis-kemiallisiin ominaisuuksiin.

2.1.2. Natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE)

Eri proteaaseilla 24 tunnin ajan käsiteltyjen CH:iden natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) -profiilit esitetään (kuva 2). Kollageenisuspension peptidiprofiili (0 h) osoitti näkyvän vyöhykkeen molekyylipainoltaan alhaisesta korkeaan. Tulokset osoittivat nopean hydrolyysin CH-Alcalase-, CH-Neutrase-, CH-Bronneline- ja CH-Protamex-yhdisteissä, koska vyöhykkeitä ei ollut 3 tunnin inkubaation jälkeen. CH-Alcalase-, CH-Neutrase- ja CH-Protamex-suuren molekyylipainon alueen vyöhykkeet pienenivät ajasta riippuvaisella inkubaatiotavalla. CH-bromeliini ei kuitenkaan vaihdellut inkubaatioajan mukaan, koska se on hydrolysoitunut täysin jo 1 tunnin inkuboinnin jälkeen. Mielenkiintoista on, että CH:t katosivat kokonaan, kun näyte reagoi Alcalasen tai Neutraasin kanssa 6 tunnin ajan, mikä osoittaa, että kollageeni toimi sopivana substraattina joillekin muille testatuille entsyymeille.cistanche-uutteen edut,CH-Flavorzyme- ja CH-Papain-juovia ilmestyi kuitenkin molekyylipainoltaan alhaisesta korkeaan 24 tunnin kuluttua. Proteiinit voidaan osittain hydrolysoida peptideiksi tai aminohapoiksi entsymaattisella hydrolyysillä riippuen proteaasityypistä, inkubaatioajasta ja proteaasi-substraattisuhteesta (proteiinimäärä)[14]. Entsymaattinen hydrolyysiprosessi määräytyy pääasiassa sen mukaan, onko kyseessä oleva proteaasityyppi endopeptidaasi vai eksopeptidaasi [15,16]. Koska Alcalase, Neutrase ja Protamex ovat endopeptidaaseja, niiden hydrolyysiprosessien voidaan olettaa katkaisevan peptidisidoksia ei-terminaalisista aminohapoista satunnaisesti, mikä helpottaa proteiinien edelleen hydrolyysiä. Toisaalta Flavorzyme on sekä endo- että eksopeptidaasi, joka katkaisee peptidiketjujen ei- tai N-terminaalin. Tässä tutkimuksessa kollageeniproteiini sisälsi sitoutumiskohtia, jotka olivat herkempiä eksopeptidaasiaktiivisuudelle kuin Flavorzymen endopeptidaasiaktiivisuudelle. Siten eksopeptidaasiaktiivisuuden vuoksi kollageeniproteiinien hydrolyysi Flavorzymella sisälsi peptidisidosten vaiheittaisen katkeamisen aminohappojen N-päästä, mikä hidasti proteiinin hydrolyysiä.

2.1.3. Proteiinien palautus ja ilmainen aminoryhmäsisältö

Eri kaupallisten proteaasien kautta saatujen CH:iden proteiinien talteenotto on esitetty (kuvio 3A). Kontrollin (kollageenisuspensio) proteiinin talteenottopitoisuus oli 1,19 mg/ml. Proteiinin talteenotto on entsymaattisen hydrolyysin tehokkuuden parametri. CH:n alhainen proteiinin talteenottopitoisuus on osoitus lisääntyneestä proteiinin hajoamisesta. Lisäksi proteiinin talteenotto korreloi hyvin proteiinin liukoisuuden kanssa. Suurempi hydrolyyttinen aktiivisuus voi johtua paljastuneiden hydrofobisten sivuketjujen lisääntymisestä, mikä johtaa lisääntyneisiin hydrofobisiin vuorovaikutuksiin proteiinien ja/tai peptidien välillä. Nämä hydrofobiset sivuketjut voivat johtaa heikentyneeseen proteiinien liukoisuuteen, mikä johtaa hydrolysaattien lisääntyneeseen proteiinien talteenottoon. Tutkimuksessamme proteiinin talteenottopitoisuus korreloi hyvin SDS-PAGE-kuvioiden muutosten kanssa. Alkalaasin ja Flavorzyme-hydrolyysin proteiinien talteenottopitoisuus oli alhaisin ja korkein. Inkubointiaikaan liittyvän hydrolyysin tehokkuuden osalta CH-Alcalase, CH-Bromelain ja CH-Protamex vähenivät rajusti yhden tunnin sisällä inkuboinnista kontrolliin verrattuna. Proteiinihydrolyysistä johtuva proteiinin talteenottopitoisuuden lasku osoitti käänteisen suhteen aminoryhmäpitoisuuteen. Lisäksi useimmilla CH:illa CH-neutraasia lukuun ottamatta oli alhainen proteiinipitoisuus 3 tunnin ja 12 tunnin välillä. 24 inkubaation jälkeen niiden proteiinipitoisuus nousi jälleen CH-Alcalase-, CH-Flavorzyme-, CH-Neutrase-, CH-Bromeline-, CH-Protamex- ja CH-Papain-yhdisteissä seuraavasti:0.83 mg/ml, 1,29 mg/ ml, 0,75 mg/ml, 0,97 mg/ml, 0,77 mg/ml ja 1,11 mg/ml, vastaavasti. Jotkut raportit osoittavat, että optimaalinen hydrolyysiaika riippuu useista tekijöistä, kuten valitusta lajista, raaka-aineesta, käytetystä entsyymistä, raaka-aineen/entsyymin nopeudesta, entsyymin pitoisuudesta ja halutusta hydrolyysiasteesta jne. [16 ]. Jotkut raportit osoittavat, että pitkittynyt entsymaattinen hydrolyysi (yli 24 tuntia) voi johtaa proteaasiaktiivisuuden vähenemiseen; siksi entsymaattinen hydrolyysi tulisi suorittaa 24 tunnin sisällä entsymaattisesta hydrolyysistä [17,18].

KSL19

The free amino group content of CH, which is an indicator of enzymatic hydrolysis efficiency, was estimated(Figure 3B). The expected outcome of protein breakdown is that protein may be hydrolyzed into shorter peptide products. The free amino group content of the control was initially 0.14 mg/mL. The free amino group content of all CHs dramatically increased with increasing incubation time. After 24 h incubation, the free amino group content by descending order was: CH-Alcalase (1.00 mg/mL)>CH-Protamex(0.70 mg/mL)> CH-Neutrase(0.68 mg/mL)>CH-Bromeline (0.67 mg/mL)>CH-Flavorzyme (0.53 mg/mL)>CH-papaiini(0.40 mg/ml).Yleiset erot entsymaattisesti hydrolysoitujen näytteiden kokonaisproteiini- tai vapaan aminoryhmän pitoisuudessa voivat liittyä entsyymispesifisyyteen. Se riippuu entsyymin ominaisuuksista entsymaattisen hydrolyysiprosessin aikana [16,17]. Esimerkiksi alkalisilla proteaaseilla (kuten Alcalase) on korkeampi hydrolyyttinen aktiivisuus verrattuna happamiin tai neutraaleihin proteaaseihin.

2.2. Ultrasuodatusvaikutus kollageenihydrolysaatin ominaisuuksiin

Ultrasuodatusprosessi voi olla käyttökelpoinen, teollisesti edullinen menetelmä pienten peptidifraktioiden tuottamiseksi, joilla on haluttu molekyylikoko ja korkea bioaktiivisuus, riippuen lähtöhydrolysaatin koostumuksesta ja tutkittavasta aktiivisuudesta [19]. Liukoisuus, vapaiden aminoryhmien pitoisuus ja CH:iden saanto lyofilisoinnin jälkeen esitetään (taulukko 1). Kontrollin liukoisuus ja vapaan aminoryhmän pitoisuus olivat 11,95 prosenttia ja vastaavasti 0,79 prosenttia. Entsymaattisen hydrolyysin ja ultrasuodatuksen jälkeen 3 kDa:n molekyylipainorajalla suurin liukoisuus (21,17 prosenttia) ja vapaiden aminoryhmien pitoisuus (14,17 prosenttia) havaittiin CH-alkalaasissa.<3 kda.="" however,=""><3kda was="" the="" lowest="" field="" (12.42%)observed.="" therefore,="" although="" ultrafiltration="" is="" useful="" in="" separating="" chs="" with="" low="" molecular="" weight,="" it="" may="" cause="" a="" reduction="" in="">

Proteiinihydrolysaattien keskimääräinen molekyylipaino on tärkeä tekijä, joka määrittää niiden biologiset ominaisuudet [19]. Yleensä keskimääräinen murto-osa, jolla on MW<3 kda="" represents="" a="" collagen="" hydrolysate;="" an="" average="" fraction="" with="" mw=""> 50 kDa represents gelatin, and an average fraction with MW>300 kDa edustaa kollageenia [20,21]. Kontrollin (esikäsittelynäyte), CH-Alcalasin ja CH-Alcalasin suhteellinen molekyylipainojakauma<3 kda="" is="" depicted="" in="" figure="" 4.="" the="" molecular="" weight="" distribution="" was="" over="" 20,100="" da="" for="" the="" control,="" which="" did="" not="" include="" the="" collagen="" hydrolysate=""><3 kda).="" this="" could="" not="" be="" numerically="" provided="" in="" this="" study,="" as="" the="" detection="" limit="" of="" the="" index="" detector="" system="" only="" ranged="" from="" 106="" to="" 20,100="" da.="" however,="" ch-alcalase="" showed="" detectable="" values="" in="" a="" higher="" range="" of="" relative="" molecular="" weight="" distribution,="" which="" ranged="" from="" 20,100="" da="" to="" 4270="" da="" (maximum="" peak:12,600="" da).in="" ch-alcalase=""><3 kda,="" the="" molecular="" weight="" distribution="" mainly="" showed="" three="" peaks:="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 4270="" da(maximum="" peak),="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 424="" da,="" and="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 222="" da="" and="" 102="" da.="" ultrafiltration="" is="" an="" effective="" purification="" method="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight="" peptides="" from="" crude="" hydrolysates.="" results="" indicated="" that="" enzymatic="" hydrolysis="" by="" alcalase="" clearly="" reduced="" the="" high="" mw="" of="" the="" control="" (either="" collagen="" or="" gelatin),="" and="" that="" ultrafiltration="" was="" an="" effective="" purification="" method="" that="" can="" be="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight=""><3 kda)="" from="" crude="" collagen="" hydrolysates.="" reportedly,="" low="" molecular="" weight="" peptides="" (2-20="" amino="" acids)="" are="" more="" biologically="" active="" compared="" to="" their="" parent="" polypeptide/="" proteins,="" which="" are="" larger="">

KSL20

CH:iden aminohappokoostumus esitetään (taulukko 2). Eri proteaasien CHS:llä oli erilaiset aminohappokoostumukset ja antioksidanttiset ominaisuudet [23]. Kollageenin aminohappokoostumus sisälsi runsaasti glysiiniä (Gly), proliinia (Pro) ja glutamiinihappoa (Glu). CH:iden aminohappopitoisuus (CH-Alcalase ja CH-Alcalase<3 kda)="" increased="" more="" than="" that="" of="" the="" control,="" following="" enzymatic="" hydrolysis="" with="" or="" without="" ultrafiltration.="" in="" particular,="" the="" content="" of="" gly,="" pro,="" and="" glu="" was="" much="" higher="" in=""><3 kda(gly="" 218="" mg/g,="" pro="" 152="" mg/g,="" and="" glu="" 120="" mg/g)="" than="" ch-alcalase(gly149="" mg/g,="" pro="" 95mg/g,="" and="" glu78="" mg/g).="" an="" increase="" in="" the="" content="" of="" these="" amino="" acids="" is="" strongly="" related="" to="" enhanced="" antioxidant="" capabilities="" 16,20].="" gly="" and="" pro="" contain="" hydrophobic="" amino="" acid="" groups,="" and="" glu="" contains="" negatively="" charged="" amino="" acid="" groups.="" these="" amino="" acids="" have="" been="" reported="" to="" enhance="" antioxidant="" activity="" because="" of="" their="" increased="" solubilities="" in="" lipids="" or="" via="" free="" radical="" reactions="">