Epigeneettinen säätelijä BRD4 on osallisena kadmiumin laukaisemassa tulehdusvasteessa rotan munuaisissa

lisätietoja:ali.ma@wecistanche.com

Zhongguo Gong et ai

Cistanche tubulosa ehkäisee munuaissairauksia, napsauta tästä saadaksesituotteet ja Cistanche DHT

ABSTRAKTI

Kadmiumia (Cd) on kuvattu mahdolliseksi tulehduksen indusoijaksi, kun taas lisääntyvä näyttö osoittaa, että sopimaton tulehdus on myötävaikuttava tekijämunuaisvaurio. Siksi Cd:n laukaiseman tulehdusvasteen tutkimuksella on suuri merkitys Cd:n aiheuttaman nefrotoksisuuden mekanismin selvittämisessä. Bromodomeenia sisältävä 4(BRD4) on tärkeä epigeneettinen säätelijä, joka osallistuu monien tulehdussairauksien kehittymiseen, mutta sen säätelyroolit Cd-laukaisemassatulehduksellinenvastausta on vielä selvennettävä. Tässä havaitsimme, että Cd-hoito Sprague-Dawley-rotilla (2 mg/kg BW, ip, 5 peräkkäistä päivää) ja rotallamunuaissolulinja (NRK{{0}}E, 0–10 μM, 12 h) indusoi tulehduksellisten sytokiinien transkription, jota JQ1 (BRD4-estäjä, 25 mg/kg BW, ip) voi vähentää , 3 peräkkäistä päivää in vivo; 0,5 μM, 12 tuntia in vitro) tai BRD4:n pieni häiritsevä RNA (siRNA, in vitro), mikä viittaa siihen, että BRD4 osallistuu Cd:n laukaisemaan tulehdusvasteeseen. Seuraavaksi tutkimuksemme selvensi BRD4:n roolia Cd:n laukaisemassa tulehdusvasteessa. BRD4:n esto vähensi Cd:n edistämää NF-KB:n tuman translokaatiota ja aktivaatiota in vivo ja in vitro. Cd lisäsi RelA K310:n asetylaatiotasoa ja tehosti BRD4:n sitoutumista asetyloituun NF-KB RelA:han in vivo ja in vitro, jotka kumottiin inhiboimalla BRD4:ää. Yhteenvetona tutkimuksemme viittaa siihen, että BRD4 osallistuu tulehduksellisten sytokiinien Cd-laukaisemaan transkriptioon välittämällä NF-KB-signalointireitin aktivaatiota ja lisäämällä itsensä sitoutumista asetyloituun NF-kB RelA:han rotalla.munuainen,siksi BRD4 voisi olla mahdollinen terapeuttinen kohde Cd:n aiheuttamille munuaissairauksille.

Avainsanat: BRD4KadmiumMunuaisten tulehduksellinensytokiinit NF-KB JQ1

1. Esittely

Kadmium (Cd) on raskasmetallisaaste, jolla on korkea myrkyllisyys ja pitkä puoliintumisaika. Teollisen tuotannon kehittyessä Cd-saasteiden lisääntynyt uhka ympäristön turvallisuudelle ja ihmisten terveydelle on herättänyt huolta (Wang et al., 2020; Horiguchi ja Oguma, 2016). Kun Cd on imeytynyt elimistöön, se aiheuttaa useiden elinten vaurioita jamunuainenon tärkein kohde-elin (Fernando et al., 2020; Zhao et al., 2021). Aiemmin vahvistimme systemaattisesti, että autofagian esto, oksidatiivinen stressi ja apoptoosi vaikuttavat synergistisesti Cd:n aiheuttamaan nefrotoksisuuteen rotilla (Liu et al., 2017; Wang et al., 2017). Tulehdus on fysiologinen reaktio, joka toimii puolustusreaktiona infektiota tai vammaa vastaan, mutta Cd:n aiheuttamat hallitsemattomat ja sopimattomat tulehdusvasteet voivat aiheuttaa haittaa, kuten vahingoittaa sivullisen normaalia kudosta ja edistää autoimmuunisairauksia (Hossein-Khannazer et al., 2020; Zhang et al. al., 2020). Cd:n laukaisema tulehdusvaste pahensi sydän- ja verisuonisairauksia ja maksavaurioita, mikä viittaa siihen, että tulehduksella voi olla tärkeä rooli Cd-välitteisessämunuainenpatologiset prosessit (Fagerberg et al., 2017; Almeer et al., 2019).

Epigenetiikka viittaa perinnöllisiin modifikaatioihin geenin ilmentymisessä, joka perustuu ei-DNA-sekvenssin muutoksiin, ja näiden modifikaatioiden palautuvuus mahdollistaa uusien terapeuttisten kohteiden löytämisen (Vendetti ja Rudin, 2013). Bromodomain and extra-terminal domain (BET) -perheeseen kuuluvat bromodomaiinia sisältävät 2 (BRD2), BRD3, BRD4 ja bromodomain kivesspesifiset (BRDT), joille on tunnusomaista kaksi bromodomeenia ja sitoutuminen histonien ja ei-histonin asetyloituihin lysiineihin ( Lochrin et ai., 2014; Chatterjee ja Bohmann, 2018). BET-proteiinit toimivat monien geenien transkription yhteisaktivaattorina sääteleen siten solusykliä, tulehdusvastetta, oksidatiivista stressiä ja muita fysiologisia prosesseja erilaisissa patologisissa malleissa (Jiao et al., 2020; Wang et al., 2019b). BRD4 on erityisen hyvin tutkittu BET-proteiiniperheen jäsen, ja kertyvät tutkimukset ovat raportoineet sen uudeksi epigeneettiseksi kohteena monien erilaisten proteiinien säätelyssä.munuaisten sairaudet, mukaan lukien krooninen nefriitti, diabeettinen nefropatia ja kokeellinen munuaisvaurio (Zeng ja Zhou, 2002; Morgado-Pascual et al., 2019). BRD4:n on vahvistettu osallistuvan ydintekijä-κB (NF-κB) riippuvaiseen transkriptioprosessiin säätelemään tulehdusvasteita monissa sairauksissa (Xu ja Vakoc, 2014; Suarez-Alvarez et al., 2017). BRD4 voidaan värvätä asetyloidulla RelA:lla (NF-KB-alayksikkö, proteiinia koodaava geeni) lysiinissä 310 (RelA-K310ac) sen bromodomeenien kautta, mikä aktivoi sykliiniriippuvaisen kinaasi 9:n (CDK9) ja fosforyloi RNA-polymeraasi II:n edistämiseksi. NF-κB-kohdegeenien transkriptio (Hajmirza et al., 2018). Äskettäiset tutkimukset viittaavat siihen, että BRD4-estäjät voisivat olla mahdollinen terapeuttinen vaihtoehto tulehdussairauksille. Rotan selkäydinvauriomalleissa BRD4:n estäminen heikensi tulehdusvastetta ja edisti mikroglian toiminnallista palautumista (Dey et al., 2019). Lisäksi BRD4:n esto kumosi kokeellisen munuaistulehduksen hiirimalleissa, joissa oli yksipuolinen virtsanjohtimen tukkeuma, kalvonvastainen perus-GN ja angiotensiini II -infuusio (Suarez-Alvarez et al., 2017).

Ottaen huomioon Cd:n mahdolliset tulehdusta edistävät vaikutukset ja BRD4:n säätelevät vaikutukset tulehdukseen, oletimme, että BRD4 osallistuu Cd:n laukaisemaan tulehdusvasteeseen. Kuten odotettiin, BRD4 välittää tulehduksellisten sytokiinien transkriptioprosessia Cd-altistuneissa rotan munuaismalleissa. Tutkimuksemme paljastaa mahdollisen mekanismin Cd:n laukaisemassa tulehdusvasteessa ja tarjoaa uusia näkemyksiä Cd:n aiheuttaman nefrotoksisuuden hoidosta.

2. Materiaalit ja metodit

2.1. Kemikaalit ja vasta-aineet

Kadmiumkloridi (CdCl2, vedetön, 439800) ostettiin Sigma-Aldrichilta (Carlsbad, CA, USA). (plus )-JQ1 (HY-13030) saatiin MedChemExpressiltä (Monmouth Junction, NJ, USA). Ydinproteiinien uuttosarja ostettiin Beyotime Institute of Biotechnologysta (Shanghai, Kiina, P0027). Tehokas kemiluminesenssipakkaus (ECL, 32209) ja bikinkoniinihappoproteiinimääritysreagenssi (BCA, 23225) saatiin Thermo Fisher Scientificilta (Madison, WI, USA). Ensisijaisia ​​vasta-aineita seuraavia proteiineja vastaan ​​käytettiin: NF-κB p65 (10745-1- AP), IL-1 (26048-1-AP), TNF- (17590-1-AP) ostettiin Proteintech Group (Wuhan, Kiina); -aktiini (3700 s), Histoni H3 (His3, 4499), Sirtuin 1 (Sirt1, 8469), normaali kanin IgG (IgG, 4394) ostettiin Cell Signaling Technologylta (Danvers, MA, USA); BRD4 (ab128874), K (lysiini)asetyylitransferaasi 3 (KAT3B/Ep300, ab14984), NF-κB RelA (asetyyli K310) (RelA-K310ac, ab19870), Alexa Fluor® 488 ostettu0 aasin anti-konjugoitu Abcamilta (Cambridge, Iso-Britannia). Toiset vasta-aineet: Goat Anti-Mouse IgG (H plus L) (115-035-003) ja Goat Anti-Rabbit IgG (H plus L) (111-035-003) ostettiin Jackson ImmunoResearchilta (West Grove, PA, USA) ).

2.2. Eläimet ja kokeet

24 Sprague-Dawley-rottaa (uros, 6 viikkoa vanha, 110-120 g) ostettiin Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd:ltä (Jinan, Shandong, Kiina). Rotille annettiin vapaa pääsy ruokaan ja veteen ympäristöllisesti kontrolloidussa huoneessa (24 ± 5 ​​astetta, 12 tunnin valo/pimeä-sykli). Koemenettelyjä sovellettiin Euroopan yhteisöjen neuvoston eläinkokeiden direktiiviin 2010/63/EU, ja kaikki menettelyt hyväksyttiin Yangzhoun yliopiston eläinten hoito- ja käyttökomiteassa. Yhden viikon totuttelun jälkeen rotat jaettiin satunnaisesti neljään ryhmään: (1) Kontrolliryhmä: injektoitiin intraperitoneaalisesti vastaavaa liuotinta (fysiologista suolaliuosta tai 2-hydroksipropyyli- -syklodekstriiniliuosta). (2) Cd-ryhmä: CdCl2 (2 mg/kg ruumiinpainoa, liuotettuna fysiologiseen suolaliuokseen) injektoituna vatsaonteloon 5 peräkkäisenä päivänä Cd-myrkytysmallin luomiseksi. (3) Cd plus JQ1-ryhmä: CdCl2 (2 mg/kg ruumiinpainoa) injektoituna vatsaonteloon 5 peräkkäisenä päivänä Cd-myrkytysmallin luomiseksi, ja JQ1 (25 mg/kg ruumiinpainoa, liuotettuna 2-hydroksipropyyliin{{ 25}}syklodekstriiniliuos) ruiskutetaan vatsaonteloon päivänä 6–8. (4) JQ1-ryhmä: JQ1 (25 mg/kg ruumiinpainoa) injektoituna vatsaonteloon päivinä 6–8. Cd-pitoisuuden tilastot rotan seerumeissa ja munuaiskudoksissa lueteltiin taulukossa S1, mikä kuvastaa Cd-altistuneiden rottamallien onnistunutta perustamista.

8 päivän hoidon jälkeen rotat tapettiin kohdunkaulan dislokaatiolla syvässä anestesiassa 12 tunnin paaston jälkeen. Munuaiskudokset leikattiin ja 1 g kudosta kustakin munuaisesta säilytettiin nopeasti -80 ◦C:ssa Western blot -analyysin ja kvantitatiivisen PCR-analyysin (qPCR) jälkeen. Jäljelle jäänyt määrä kudosta kiinnitettiin nopeasti 4-prosenttisessa paraformaldehydissä (PFA) immunohistokemiallista (IHC) värjäystä varten.

2.3. Soluviljely ja hoito

Rotan munuaissolulinja (NRK{{0}}E) hankittiin Kiinan tiedeakatemian Shanghai Cell Bankista. NRK-52E-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidulla Eagle-elatusaineella (DMEM, Gibco, 12800-017), joka sisälsi 5 prosenttia naudan sikiön seerumia (FBS, Gibco, 10437-028), penisilliiniä ja streptomysiiniä (1 00 U/mL) kostutetussa tilassa, jossa on 5 prosenttia CO2:ta ja 95 prosenttia ilmaa 37 asteessa. CdCl2 (ultrapuhdas veteen liuotettu) ja JQ1 (dimetyylisulfoksidiliuotettu) säilytettiin erikseen 4 asteessa ja -20 asteessa ja laimennettiin työliuoksiksi ennen käyttöä. Kokeellinen suunnittelu oli seuraava: (1) Soluja käsiteltiin 0, 2,5, 5, 10 µM Cd:llä 12 tunnin ajan tai 5 µM Cd:llä 0, 6, 12, 24 tunnin ajan seuraavien määritysten suorittamiseksi. (2) Soluja käsiteltiin 5 µM Cd:llä ja/tai 0,5 µM JQ1:llä 12 tunnin ajan seuraavien määritysten suorittamiseksi. (3) Solut transfektoitiin siBRD4:llä ja/tai niitä käsiteltiin 5 µM Cd:llä vielä 12 tunnin ajan seuraavien määritysten suorittamiseksi.

2.4. Pieni häiritsevä RNA-transfektio

Transfektoimme 20 nM pientä BRD4:n häiritsevää RNA:ta (siBRD4, Invitrogen, CA, USA) NRK-52E-soluihin Lipofectamine RNAiMAX -transfektioreagenssilla (Thermo Fisher Scientific, luettelonumero 13778150) 24 tunnin ajan tuoteoppaiden mukaisesti. Käytettiin seuraavia sense-siRNA:ita:

siBRD4, jonka kohdesekvenssi on 5'-CCGTCAAGCTGAACCTCCCTGATTA-3';

siCt (siRNA-negatiivinen kontrolli), jonka kohdesekvenssi on 5′- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′.

2.5. Western blottaus

Munuaiskudosnäytteet ja NRK{0}}E-solut hajotettiin proteaasi-inhibiittoreita sisältävässä RIPA-puskurissa kokonaisproteiinin uuttamiseksi. Tumaproteiini valmistettiin etukäteen tuoreista kudoksista ja soluista ja säilytettiin -80 asteessa. Proteiininäytteet (20–30 ug näytettä kohti) erotettiin SDS-PAGE-elektroforeesilla ja siirrettiin sitten polyvinylideenifluoridikalvoille (Millipore, ISEQ00010). Kalvot estettiin 5-prosenttisella rasvattomalla maidolla 90 minuutin ajan ja inkuboitiin 12 tuntia 4 asteessa seuraavien primääristen vasta-aineiden kanssa: -aktiini (1:5000), NF-κB p65 (1:1000), IL-1 ( 1:600), TNF- (1:600), BRD4 (1:1000), Ep300 (1:1000), Sirt1 (1:1000), His3 (1:1000), RelA-K310ac (1:1000). Sitten kalvot pestiin TBST:llä ja inkuboitiin vastaavien sekundaaristen vasta-aineiden kanssa (1:10000) 90 minuuttia huoneenlämpötilassa (RT). Kalvoja inkuboitiin sähkökemiluminesenssilla (ECL, ThermoFisher Scientific) ja määritettiin Chemidoc XRS:llä (Bio-Rad, Marnes-La Coquette, Ranska), ja optinen tiheys analysoitiin käyttämällä ImageJ:tä (NIH, Bethesda, MD, USA).

2.6. Immunofluoresenssivärjäys (IF).

NRK{{0}}E-solut, jotka oli ympätty 24-kuoppalevylle, kasvatettiin noin 60 prosentin konfluenssiin. Soluja käsiteltiin 5 μM Cd:llä ja/tai 0,5 μM JQ1:llä 12 tuntia, sitten ne kiinnitettiin PFA:lla (4 prosenttia , 10 min), permeabilisoitiin Triton X- 100:lla (0,1 prosenttia, 15 min), estettiin BSA:lla. (2 prosenttia, 90 min) huoneenlämpötilassa ja inkuboitiin primaarisen vasta-aineen (NF-KB p65, 1:50 laimennus) kanssa yön yli 4 °C:ssa. Sen jälkeen, kun soluja oli pesty PBS:llä kolme kertaa, niitä inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen kanssa (1:500 laimennus) 90 minuuttia ja DAPI:n kanssa 5 minuuttia huoneenlämpötilassa, sitten soluja tarkkailtiin konfokaalimikroskoopilla. NF-κB tuman translokaatio analysoitiin kolmessa riippumattomassa tutkimuksessa.

2.7. qPCR

Munuaiskudosten kokonais-RNA ja NRK{0}}E-solut uutettiin RNAiso Plus -pakkauksella (Takara Bio, Shiga, Japani). 1 ug kokonais-RNA:ta käytettiin 1. ketjun cDNA:n syntetisoimiseen valmistajan ohjeen mukaisesti (Roche, Basel, Sveitsi). 2 µl komplementaarista DNA:ta (cDNA) kuoppaa kohti otettiin suhteellisten mRNA-tasojen havaitsemiseksi käyttämällä LightCycler® 96 Real-Time PCR System -järjestelmää (Roche). Laske suhteelliset mRNA-tasot yhtälön 2-△△CT mukaan. Alukkeet lueteltiin taulukossa S2. -aktiini oli rotan referenssigeeni.

2.8. Yhteisimmunosaostus (Co-IP)

Munuaiskudokset ja NRK-52E-solut hajotettiin tuoreessa solulyysipuskurissa (20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 150 mmol/L NaCl, 2 mmol/L EDTA, 1 prosentti Triton X{{8} }), joka sisältää PMSF:ää. Proteiini G -helmiä (100 µl näytettä kohti, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) sekoitettiin 2 ug:n kanssa BRD4-, RelA-K310ac- tai IgG-vasta-ainetta näytettä kohti ja pyöritettiin 10 minuuttia huoneenlämpötilassa. Sitten kokonaisproteiinilysaatteja inkuboitiin helmien ja vasta-ainekompleksin kanssa yön yli 4 asteessa. Sen jälkeen, kun immunosakka oli pesty solulyysipuskurilla kolme kertaa, ne suspendoitiin uudelleen 1 x SDS PAGE -näytepuskurilla näytteiden konfiguroimiseksi. Kohdeproteiinit havaittiin käyttämällä Western blot -menetelmää anti-BRD4- ja anti-RelA-K310ac-primaarisilla vasta-aineilla.

2.9. Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot saatiin vähintään kolmesta riippumattomasta kokeesta ja ilmaistiin keskiarvona ± SEM, ellei toisin mainita. Koeryhmiä verrattiin parittomalla kaksisuuntaisella Studentin t-testillä tai yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA) käyttäen SPSS 22:ta.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Merkitykseksi asetettiin p <>

3. Tulokset

3.1. Cd indusoi tulehduksellisten sytokiinien ilmentymistä in vivo ja in vitro

Cd:n on osoitettu aiheuttavan ympäristön saasteita säätelemällä useita biologisia prosesseja (Wang et al., 2019c). Tässä tutkimuksessa tutkittiin muutoksia tulehduksellisten sytokiinien transkriptiotasoissa Cd-altistuksen jälkeen sen tutkimiseksi, liittyykö tulehdus Cd:n aiheuttamaan nefrotoksisuuteen. Tiedot osoittivat, että Cd-altistus lisäsi merkittävästi interleukiini (IL)-1 ja tuumorinekroositekijä (TNF) -proteiinitasoja NRK-52E-soluissa (kuvat 1A-B) ja rotan munuaiskudoksissa (kuva 1C). -D). Sillä välin, kuten kuvista 1E-F näkyy, Cd-altistus paransi tulehduksellisten sytokiinien (IL-1, IL-6, TNF- ja (monosyyttien kemoattraktanttiproteiini-1) MCP:n transkriptiotasoja -1) in vivo ja in vitro. Nämä havainnot viittaavat siihen, että Cd indusoi tulehduksellisten sytokiinien ilmentymistä rotan munuaisissa.

3.2. BRD4 osallistuu tulehduksellisten sytokiinien Cd-indusoituun transkriptioprosessiin

BRD4 on äskettäin kuvattu epigeneettinen säätelijä, joka sitoutuu asetyloituihin histoneihin tai ei-histoneihin säätelemään tulehdusprosesseja monissa sairauksissa. Tässä BRD4-estäjää JQ1 ja BRD4-siRNA:ta käytettiin tutkimaan BRD4:n roolia Cd-laukaisemassa tulehdusvasteessa. Tiedot osoittivat, että Cd-kohonneet IL-1- ja TNF-proteiinitasot vähensivät JQ1-hoitoa in vivo ja in vitro (kuvat 2A-D) ja BRD4-knockdown in vitro (kuva S1A-B). Samaan aikaan JQ1-hoito esti merkittävästi IL-1, IL-6, TNF- ja MCP-1 Cd-tehostettuja transkriptiotasoja NRK-52E-soluissa (kuva 2E) ja rotan munuaiskudokset (kuvio 2F). Myös BRD4-knockdown vähensi merkittävästi tulehdussytokiinien Cd-lisättyjä transkriptiotasoja NRK-52E-soluissa (kuva S1C). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että BRD4 on Cd:n laukaiseman tulehdusvasteen kriittinen säätelijä rotan munuaisissa.

3.3. BRD4-ekspressiotasot pysyvät muuttumattomina Cd-altistuksen jälkeen

Seuraavaksi BRD4:n ilmentymistasojen muutokset havaittiin Cd-altistuksen jälkeen. NRK-52E-soluja käsiteltiin Cd:llä pitoisuusgradientissa, ja rotille injektoitiin intraperitoneaalisesti Cd:tä 5 päivän ajan Cd:n vaikutuksen selvittämiseksi BRD4:n ilmentymiseen munuaisissa in vivo ja in vitro. Tulokset osoittivat, että BRD4-proteiinitasot olivat muuttumattomia sekä Cd-altistuneissa NRK-52E-soluissa (kuvat 3A-B) että rotan munuaiskudoksissa (kuvio 3C-D). Myös BRD4-mRNA-tasot pysyivät muuttumattomina Cd-altistuksen jälkeen (kuvio 3E-F). Nämä tulokset osoittavat, että BRD4 välittää Cd-laukaiseman tulehdusvasteen, joka ei riipu ekspressiotason muutoksista.

3.4. BRD4 säätelee Cd:n edistämää NF-KB-ytimen translokaatiota

Tutkimuksessamme selvitettiin BRD4:n rooleja Cd:n laukaisemassa tulehdusvasteessa. NF-κB-signalointireitin muutos liittyy läheisesti tulehduksellisten sytokiinien transkriptioon (Chi et al., 2021). Tutkimuksemme havaitsi, että BRD4 osallistuu Cd:n säätelemään ydintranslokaatioon ja NF-κB:n aktivaatioon. Ensinnäkin NF-KB:n subsellulaarinen sijainti määritettiin IF-värjäyksellä ja IHC-värjäyksellä. Kuvien 4A ja D tiedot osoittivat, että JQ1 estää Cd:n edistämää NF-KB:n tuman translokaatiota NRK-52E-soluissa ja rotan munuaiskudoksissa. Sillä välin Western blot -tulokset osoittivat, että JQ1 vähensi merkittävästi NF-KB:n Cd-lisättyjä tumaproteiinitasoja in vivo (kuvio 4B-C) ja in vitro (kuvio 4E-F). Samoin BRD4 knockdown esti myös merkittävästi Cd-edistämää NF-KB:n tuman translokaatiota (kuva S2A) ja vähensi NF-kB:n Cd-lisääntyneitä tumaproteiinitasoja (kuva S2B-C) NRK-52E-soluissa. Kaiken kaikkiaan BRD4:n estäminen voi vähentää Cd:n edistämää NF-KB:n tuman translokaatiota, mikä viittaa siihen, että BRD4 välittää NF-KB-signalointireitin aktivaatiota munuaisissa Cd-altistuksen jälkeen.

3.5. Cd lisää RelA K310:n asetylaatiotasoja

Tutkimukset ovat vahvistaneet, että BRD4 sitoutuu asetyloituun RelA K310:een bromidomeenien kautta säätelemään NF-κB-riippuvaista transkriptiota (Morgado-Pascual et al., 2019; Zhong et al., 2018). Siten RelA K310:n asetylaatiotaso ja kahden entsyymin ilmentyminen havaittiin. Tiedot osoittivat, että RelA-K310ac- ja asetylaasi Ep300 -proteiinitasot laskivat jatkuvasti Cd-pitoisuuden kasvaessa, kun taas deasetylaasi Sirt1 -proteiinin taso nousi asteittain NRK-52E-soluissa (kuvat 5A-B) ja rotan munuaiskudoksissa (kuva 3). 5C-D). Myös Ep300- ja Sirt1-mRNA-tasot osoittivat samoja suuntauksia (kuvio 5E-F). Nämä tulokset viittaavat siihen, että Cd edistää RelA K310:n asetylaatiotasoa, joten BRD4 voi olla osallisena Cd:n laukaisemassa tulehduksellisten sytokiinien transkriptiossa munuaisissa.

3.6. Cd lisää BRD4:n sitoutumista RelA-K310ac:iin parantaakseen sen transkriptiotoimintoa

Asetylaatiokohtiin sitoutuminen on perusta BRD4:n transkription säätelylle (Huang et al., 2009). Sen varmistamiseksi, sääteleekö Cd BRD4:n toimintaa lisäämällä BRD4:n sitoutumista RelA-K310ac:iin, RelA-K310acin ja BRD4:n välinen vuorovaikutus havaittiin Co-IP:n kautta. Kuvan 6A tiedot osoittivat, että Cd paransi merkittävästi RelA-K310ac:n ja BRD4:n välistä vuorovaikutusta NRK-52E-soluissa, mitä helpotti JQ1-käsittely tai BRD4-knockdown. Sama suuntaus havaittiin myös rotan munuaiskudoksissa (kuvio 6B). Nämä tulokset osoittavat, että Cd lisää BRD4:n sitoutumista RelA-K310ac:iin, mikä edistää NF-KB-riippuvaista transkriptiota ja myötävaikuttaa myöhemmin Cd:n laukaisemaan tulehdusvasteeseen.

4. Keskustelu

Cd:n on raportoitu olevan mahdollinen tulehduksen laukaisin sen korkean toksisuuden vuoksi, mutta tarkkaa mekanismia ei vieläkään täysin ymmärretä (Arab-Nozari et al., 2020; Ghosh, 2018). Tutkimuksemme vahvisti, että Cd indusoi tulehduksellisten sytokiinien ilmentymistä rotan munuaissoluissa, ja havaitsi, että BRD4, epigeneettinen kohde, jolla on kriittisiä toimintoja useissa soluprosesseissa, mukaan lukien tulehdus, myötävaikuttaa Cd:n laukaisemaan tulehdusvasteeseen. Lisäkokeet osoittivat, että BRD4 osallistuu Cd:n edistämään NF-KB-signalointireitin aktivaatioon. Myös Cd lisäsi RelA K310:n asetylaatiotasoa, mikä lisäsi BRD4:n sitoutumista asetyloituun NF-kB RelA:han edistäen NF-KB-riippuvaisten tulehdussytokiinien transkriptiota.

Tulehdus on yksi luonnollisista puolustusmekanismeista ulkoisia kemikaaleja vastaan, kun taas hallitsematon ja sopimaton tulehdusreaktio voi vahingoittaa normaaleja kudoksia ja aiheuttaa autoimmuunisairauksia (Jian et al., 2018). Cd:n lisäämät tulehduksen biologiset merkkiaineet yhdistettiin usein erilaisiin sairauksiin. Tutkimukset ovat osoittaneet, että Cd:n aiheuttama tulehdus on osallisena aterogeneesissä (Tinkov et al., 2018). Lisäksi Cd edisti tulehduksellisten sytokiinien ilmentymistä, mikä vaikutti keuhkojen ja kivesten kudosvaurioihin ja indusoi maksatoksisuutta (Koopsamy Naidoo et al., 2019; Arafa et al., 2014). Nämä haitalliset vaikutukset ovat yhdenmukaisia ​​tulostemme kanssa, että tulehdusvaste liittyy Cd:n aiheuttamaan munuaisvaurioon. Yhä useammat tutkimukset ovat keskittyneet Cd:n aiheuttaman tulehduksen esiintymismekanismeihin. Hyvin tutkitun BET-proteiiniperheen jäsenenä BRD4:llä on kriittinen rooli monissa biologisissa prosesseissa, mukaan lukien tulehduksissa. Tässä käytettiin JQ1:tä (BRD4:n estäjä) ja siRNA:ta BRD4:n toiminnallisen aktiivisuuden purkamiseen ja havaittiin, että BRD4:n esto vähensi Cd:n aiheuttamaa tulehdussytokiinien transkriptiota rotan munuaisissa, mikä viittaa siihen, että BRD4 osallistuu Cd:n laukaisemaan tulehdusvasteeseen. . Yleisesti uskotaan, että BRD4:n ilmentymisen säätelyhäiriö on ratkaiseva tapahtuma tulehdusvasteen esiintymisessä. Selkäydinvauriossa, patologisessa sydämen liikakasvussa ja muissa tulehdukseen liittyvissä sairauksissa BRD4-ilmentymisen häiriintyminen vaikutti tulehduksellisten sytokiinien ilmentymiseen (Zhu et al., 2020; Marazzi et ai., 2018; Ren et al., 2019). Cd:llä ei kuitenkaan ollut vaikutusta BRD4:n ilmentymistasoihin nykyisissä koeolosuhteissa, mikä sai meidät pohtimaan, välittääkö BRD4 Cd:n laukaisemaa tulehdusvastetta muiden reittien kautta.

NF-κB on tärkeä säätelytekijä tulehdusprosesseissa ja on vastuussa monien tulehdusvälittäjien ilmentymisen säätelystä (Lawrence, 2009). Tutkimusten on raportoitu, että BRD4 osallistuu NF-KB-signalointireitin säätelyyn. Huang et ai. (2017) ehdotti, että BRD4 sääteli IKK-välitteistä NF-KB-aktivaatiota p38- ja JNK-MAPK-reittien kautta. Wang et ai. (2019a) havaitsivat, että BRD4 knockdown tai JQ1-hoito esti lipopolysakkaridi (LPS) aktivoiman NF-KB-signalointireitin mikrogliassa. Meng et ai. (2014) osoittivat, että JQ1-hoito esti tulehduksellisten sytokiinien ilmentymisen estämällä NF-KB:n aktivaatiota LPS-käsitellyissä RAW 264.7 -soluissa. Nämä raportit osoittivat, että BRD4 välittää NF-KB:n aktivaatiota monissa tulehdusmalleissa, kun taas BRD4:n estäminen on tehokas terapeuttinen lähestymistapa tulehdusta ehkäisevästi. Tässä tutkimuksessa BRD4:n esto esti NF-κB:n tuman translokaation Cd-altistuneissa rotan munuaiskudoksissa ja NRK-52E-soluissa, mikä viittaa siihen, että BRD4 välittää Cd-aktivoitua NF-KB-signalointireittiä.

Tyypillisesti sen jälkeen, kun NF-kB on aktivoitu eri ärsykkeillä ja siirtynyt tumaan, BRD4 sitoutuu asetyloituun NF-kB RelA:han K310-kohdassa, mikä lisää sen stabiilisuutta ja transkription aktiivisuutta ytimessä (Hajmirza et al., 2018). Siten RelA K310:n asetylaatiotaso vaikuttaa BRD4:n säätelytoimintoon tulehdusvasteessa. Hippokampuksen neuroneissa deasetylaasi Sirt1 välitti RelA K310 -deasetylaatiota säätelemään BACE1:n ilmentymistä, mikä vaikutti hermosolujen amyloidin tuotantoon (Flores-Leon et al., 2019). Glioblastoomasoluissa fotodynaaminen hoitostressi vähensi deasetylaasi Sirt1:tä ja aktivoi asetylaasi Ep300:n, mikä nosti RelA-K310ac-tasoja ja johti kohonneeseen eloonjäämistä edistävän typpioksidin tuotantoon (Fahey et al., 2019). Tutkimuksemme havaitsi, että Cd edistää RelA K310:n asetylaatiotasoa lisäämällä Ep300:n ilmentymistä ja vähentämällä Sirt1-ekspressiota, mikä osoittaa, että Cd vaikuttaa säätelytoimintoon BRD4 nostamalla RelA K310:n asetylaatiotasoja.

Erityisesti tuloksemme osoittivat, että JQ1-hoito oli tehokkaampi kuin BRD4-knockdown Cd-laukaiseman tulehdusvasteen lievittämisessä. JQ1:llä on korkea sitoutumisaffiniteetti BRD4:n kanssa ja se voi melkein kokonaan estää BRD4:n sitoutumisen kromosomiin, kun taas siBRD4 voi vain häiritä BRD4-proteiinin ilmentymistä vähentääkseen BRD4:n sitoutumista kohdekohtaan, mikä viittaa siihen, että BRD4 välittää Cd-laukaiseman tulehdusvasteen, joka voi riippua sitoutuminen asetyloidun NF-kB RelA:n kanssa. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet samanlaisen säätelymekanismin: NF-kB:n tuman translokaation ja aktivaation jälkeen BRD4 oli sitten vuorovaikutuksessa asetyloidun RelA:n kanssa aktivoidakseen NF-KB:n transkriptionaalisen aktivoitumisen (Huang et al., 2009). RelA-BRD4 värvättiin NF-κB-kohdepromoottoreiksi erilaisissa tulehduksellisissa stimulaatioolosuhteissa, kun taas JQ1-hoito esti BRD4:n sitoutumisen asetyloituun NF-kB RelA:han, mikä vähensi NF-kB:n transkriptioaktiivisuutta (Zou et al., 2014). Tuloksemme osoittivat, että BRD4:n esto estää Cd:llä tehostetun vuorovaikutuksen BRD4:n ja RelA-K310acin välillä rotan munuaisissa, mikä tukee edellä olevia tuloksiamme, joiden mukaan BRD4:n estäminen vaimentaa NF-KB:n Cd:n aiheuttamaa transkriptioaktiivisuutta, mikä osoittaa, että Cd lisää BRD4:n sitoutumista asetyloituun. NF-κB RelA lisäämään tulehduksellisten sytokiinien transkriptiota.

Yhteenvetona tutkimuksemme paljasti BRD4:n säätelymekanismit Cd:n laukaisemassa tulehdusvasteessa rotan munuaisissa: (1) BRD4 välittää Cd:n aiheuttamaa NF-KB:n tuman translokaatiota ja aktivaatiota. (2) Cd lisää RelA K310:n asetylaatiotasoja ja tehostaa BRD4:n sitoutumista asetyloituun NF-κB RelA:han, mikä edistää NF-κB-riippuvaisten tulehdussytokiinien transkriptiota. Lisäksi BRD4:n esto helpotti merkittävästi Cd:n kohonneita tulehduksellisia sytokiinitasoja, mikä viittaa siihen, että kohdennettua BRD4:ää voidaan kehittää tehokkaaksi keinoksi hoitaa tulehdussairauksia, mukaan lukien Cd:n aiheuttama nefriitti.

CRediT-tekijän panosilmoitus

Zhongguo Gong: käsitteellisyys, metodologia, visualisointi, muodollinen analyysi, validointi, tutkiminen, muodollinen analyysi, tietojen kuratointi, kirjoittaminen – alkuperäinen luonnos. Gang Liu: käsitteellisyys, metodologia, visualisointi, tietojen kuratointi, kirjoittaminen – alkuperäinen luonnos, projektinhallinta, rahoituksen hankinta. Wenjing Liu: Ohjelmistot, resurssit, metodologia, muodollinen analyysi. Hui Zou: Projektin hallinto, valvonta. Ruilong Song: Ohjelmisto, Muodollinen analyysi, Valvonta. Hongyan Zhao: Ohjelmisto, muodollinen analyysi, valvonta. Yan Yuan: Valvonta. Jianhong Gu: Valvonta. Jianchun Bian: Rahoituksen hankinta, valvonta. Jiaqiao Zhu: Kirjoittaminen – arvostelu ja editointi, valvonta. Zongping Liu: Kirjoittaminen – arvostelu ja editointi, valvonta,

Hankkeen hallinto, rahoituksen hankinta, konseptointi.

Ilmoitus kilpailevista eduista

Kirjoittajat ilmoittavat, että heillä ei ole tiedossa kilpailevia taloudellisia etuja tai henkilökohtaisia ​​suhteita, jotka olisivat voineet vaikuttaa tässä artikkelissa raportoituun työhön.

Tunnustus

Tätä työtä ovat tukeneet Kiinan kansallinen luonnontieteellinen säätiö (nro 31872533, 31902329, 32072933), Kiinan kansallinen tutkimus- ja kehitysohjelma (nro 2016YFD0501208) ja Jiangsun korkea-asteen koulutuksen ensisijaisen akateemisen ohjelman kehitysprojekti. laitos (PADP). Käsikirjoituksen on muokannut oikean englannin kielen, kieliopin, välimerkkien, oikeinkirjoituksen ja yleisen tyylin mukaisesti yksi tai useampi korkeasti pätevä englanninkielinen toimittaja ELIXIGENissa.

Viitteet

Almeer, RS, AlBasher, GI, Alarifi, S., Alkahtani, S., Ali, D., Abdel Moneim, AE, 2019. Kuninkaallinen hyytelö heikentää kadmiumin aiheuttamaa nefrotoksisuutta uroshiirissä. Sci. Rep. 9 (1), 5825.

Arab-Nozari, M., Mohammadi, E., Shokrzadeh, M., Ahangar, N., Amiri, FT, Shaki, F., 2020. Samanaikainen altistuminen myrkyttömälle kadmiumin ja fluorin tasolle aiheuttaa maksatoksisuutta rotissa laukaisee mitokondrioiden oksidatiivisia vaurioita, apoptoosia ja NF-kB-reittejä. Ympäristö. Sci. Saastuta. Res. Int. 27 (19), 24048–24058.

Arafa, MH, Mohammad, NS, Atteia, HH, 2014. Sarviapilan siemenjauhe lievittää kadmiumin aiheuttamaa kivesvauriota ja maksatoksisuutta urosrotilla. Exp. Toxicol. Pathol. 66 (7), 293–300.

Chatterjee, N., Bohmann, D., 2018. BET-ting on Nrf2: kuinka Nrf2-signalointi voi vaikuttaa BET-proteiinin estäjien terapeuttisiin aktiivisuuksiin. Bioesseys 40 (5), 1800007.

Chi, Q., Zhang, Q., Lu, Y., Zhang, Y., Xu, S., Li, S., 2021. Selenoprotein S:n roolit reaktiivisissa happilajeista riippuvaisessa neutrofiilien ekstrasellulaarisessa ansan muodostumisessa seleeni- puutteellinen arteriiitti. Redox Biol. 44, 102003 Dey, A., Yang, W., Gegonne, A., Nishiyama, A., Pan, R., Yagi, R., Grinberg, A., Finkelman, FD, Pfeifer, K., Zhu, J ., Singer, D., Zhu, J., Ozato, K., 2019. BRD4 ohjaa hematopoieettisten kantasolujen kehitystä ja moduloi makrofagien tulehdusvasteita. EMBO J. 38 (7)

Fagerberg, B., Synt, Y., Barregard, L., Sallsten, G., Forsgard, N., Hedblad, B., Persson, M., Engstrm, G., 2017. Kadmiumialtistus liittyy liukoiseen urokinaasiplasminogeeniaktivaattorireseptoriin, joka on tulehduksen ja tulevaisuuden sydän- ja verisuonitautien kiertävä merkkiaine. Ympäristö. Res. 152, 185–191.

Fahey, JM, Korytowski, W., Girotti, AW, 2019. Ylävirran signalointitapahtumat johtavat kohonneeseen eloonjäämistä edistävän typpioksidin tuotantoon fotodynaamisesti altistetuissa glioblastoomasoluissa. Vapaa Radic. Biol. Med. 137, 37–45.

Fernando, TD, Jayawardena, BM, Mathota Arachchige, YLN, 2020. Eri metaboliittien ja raskasmetallien vaihtelu Oryza sativa L.:ssä, joka liittyy tuntemattoman etiologian krooniseen munuaissairauteen Sri Lankassa. Chemosphere 247, 125836.

Flores-Leon, M., Perez-Dominguez, M., Gonzalez-Barrios, R., Arias, C., 2019. Palmitiinihapon aiheuttama NAD(plus)-häviö liittyy SIRT1:n vähentyneeseen toimintaan ja lisääntyneeseen BACE1:n ilmentymiseen hippokampuksen hermosoluissa. Neurochem. Res. 44 (7), 1745–1754.

Ghosh, KNI, 2018. Kadmiumkäsittely indusoi ekinokokkoosia, DNA-vaurioita, tulehdusta ja apoptoosia albiino Wistar-rottien sydänkudoksessa. Ympäristö. Toxicol. Pharmacol. 59, 43–52. tulehdus ja syöpä. Biolääketiede 6 (1), 16.

Horiguchi, H., Oguma, E., 2016. Akuutti altistuminen kadmiumille indusoi pitkittynyttä neutrofiilia sekä viivästynyttä granulosyyttipesäkkeitä stimuloivan tekijän induktiota hiirten maksassa. Kaari. Toxicol. 90 (12), 3005–3015.

Hossein-Khannazer, N., Azizi, G., Eslami, S., Alhassan Mohammed, H., Fayyaz, F., Hosseinzadeh, R., Usman, AB, Kamali, AN, Mohammadi, H., Jadidi-Niaragh, F., Dehghanifard, E., Noorisepehr, M., 2020. Kadmiumaltistuksen vaikutukset tulehduksen induktioon. Immunopharmacol. Immunotoksikoli. 42 (1), 1–8.